一、RT-PCR技术常见问题的分析（论文文献综述）
张天琛[1]（2021）在《儿童手足口病常用实验室诊断方法的评价研究》文中研究指明目的:肠道病毒A组71型（Enterovirus A71,EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）是我国儿童手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）的主要致病血清型。以临床诊疗为目的的实时荧光逆转录聚合酶链式反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR）检测粪便标本,和以现症感染病原谱监测为目的的联合RT-PCR检测咽拭子标本,是两种常用的HFMD分子实验室诊断方法,然而两者对EV-A71和CVA16感染的诊断一致性尚未知。酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清标本EV-A71免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,IgM）已广泛应用于我国HFMD临床实验室诊断,但个体因素对ELISA法诊断效能的影响尚未知。本研究的目的,一是评价联合RT-PCR检测咽拭子与商品化real-time RT-PCR检测粪便标本,对诊断HFMD病例EV-A71和CVA16感染的一致性,探索影响诊断一致性的因素;二是评价商品化的ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的血清学诊断方法,对HFMD病例EV-A71感染的诊断效能及其影响因素。方法:本研究在河南省儿童医院建立“以医院为基础的儿童HFMD住院病例前瞻性专病队列”,使用结构化问卷系统地收集病例相关信息,采集病例住院期间的临床生物标本。分别采用商品化real-time RT-PCR（检测粪便标本）和联合RT-PCR（检测咽拭子标本）两种分子实验方法诊断病例EV-A71和CVA16感染,采用商品化的ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体诊断病例EV-A71感染。使用非加权的Cohen-kappa检验,评价两种分子实验方法的诊断一致性。应用两阶段Logistic回归模型探索影响诊断一致性的相关因素,并结合bootstrap方法估算kappa系数。以EV-A71阳性检出率较高的分子诊断方法为参考标准,评估商品化ELISA法的诊断效能,构建多因素Logistic回归模型探索影响诊断效能的相关因素。结果:1)本研究共招募临床诊断的HFMD儿童住院病例1840例,中位年龄1.7岁（IQR:1.3-2.8 岁）,重症 509 例（28%）,既往接种过 EV-A71 疫苗 277 例（15%）。共检测咽拭子标本1780份（97%）、粪便标本1532份（83%）和血清标本1688份（92%）。2)1483例（81%）病例均经过联合RT-PCR及商品化real-time RT-PCR的诊断。联合RT-PCR检测咽拭子标本的肠道病毒、EV-A71和CVA16阳性检出率均低于商品化real-time RT-PCR检测粪便标本（肠道病毒:86%vs.97%,P<0.001;EV-A71:10%vs.15%,P<0.001;CVA16:15%vs.24%,P<0.001）。疾病严重程度、年龄、既往EV-A71疫苗接种史、早产、住院前发热症状以及住院至咽拭子采样时间间隔是影响EV-A71和/或CVA16阳性检出率的主要因素。联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性kappa系数分别为0.65和0.59（P<0.001）。发病至住院时间间隔≤2天、住院至粪便标本采集时间间隔≤2天和危重症病例中,联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR 诊断 EV-A71 的一致性相对更高。住院至咽拭子采集时间间隔≤1 天的病例中CVA16的诊断一致性相对更高。发病至住院时间间隔≤2天的病例中,尽早采集咽拭子和粪便标本,联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR对诊断EV-A71和CVA16感染的一致性kappa系数分别为0.82-0.91和0.65-0.77。3)1413例（77%）病例均经过商品化real-time RT-PCR及商品化ELISA法的诊断。以EV-A71阳性检出率较高的商品化real-time RT-PCR诊断结果为参考标准,商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能为:灵敏度0.61（95%CI=0.54-0.68）、特异度 0.94（95%CI=0.92-0.95）、阳性预测值 0.62（95%CI=0.55-0.69）、阴性预测值 0.94（95%CI=0.92-0.95）,非 EV-A71 感染的HFMD病例中ELISA法的假阳性率为6%（74/1212）。ELISA法的灵敏度由月龄<12个月的0.74（95%CI=0.52-0.90）逐步降至≥36个月的0.49（95%CI=0.37-0.61）。随病程的延长,灵敏度由发病0-48小时内的0.54（95%CI=0.25-0.81）逐步升至发病 144 小时后的 0.74（95%CI=0.58-0.87）,而特异度由发病0-48小时内的0.97（95%CI=0.93-0.99）逐步降至发病144小时后的0.80（95%CI=0.69-0.89）。多因素Logistic回归分析显示,发病至血标本采样时间间隔、EV-A71流行季节以及个体因素,如年龄、既往EV-A71疫苗接种史、既往HFMD或疱疹性咽峡炎病史和疾病严重程度等因素,均与商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能存在显着的关联。结论:1)针对肠道病毒、EV-A71或CVA16感染的HFMD住院病例,商品化real-time RT-PCR 检测粪便标本的阳性检出率均高于联合 RT-PCR 检测咽拭子标本;在发病2日内住院的HFMD病例中,及时采集咽拭子和粪便标本,联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染具有较高的一致性。基于本研究结果,建议临床上优先选择采集病例的粪便标本开展肠道病毒的分子实验室诊断;公共卫生监测门急诊HFMD病例EV-A71和CVA16感染,建议优先选择发病2日内就诊的病例,并尽早采集咽拭子进行联合RT-PCR的诊断实验。2)该商品化ELISA试剂盒诊断HFMD病例EV-A71感染的灵敏度一般,特异度高,假阳性为6%;ELISA法的诊断效能受个体因素、流行季节、发病至采样时间的影响较大。基于本研究结果,临床开展HFMD血清学诊断时,建议在非EV-A71流行季节优先选择以EV-A71 VP1蛋白为抗原的ELISA试剂盒检测EV-A71IgM抗体;不建议在既往有EV-A71疫苗接种史、既往有肠道病毒感染史、年龄>3岁及发病72小时内的病例中开展血清EV-A71 IgM抗体的ELISA法检测,可改用分子实验室诊断方法。
谢佳[2]（2021）在《2018年广州地区手足口病流行病学调查及柯萨奇病毒A组6型快速检测方法的建立》文中指出研究背景手足口病（Hand,foot,and mouth disease,HFMD）是一种肠道病毒感染所引起的常见儿童传染性疾病,在世界范围内曾多次出现大规模暴发流行,严重危害儿童生命健康的安全。肠道病毒71型（Enterovirus A71,EV-A71）和柯萨奇病毒A组（Coxsackievirus A,CVA）16型被认为是导致HFMD的主要病原体。然而,近些年来以CVA6和CVA10为代表的非EV-A71和非CVA16肠道病毒所引起的HFMD的报道越来越多,甚至已取代EV-A71和CVA16成为导致HFMD暴发的优势株,表明HFMD的病原学图谱正发生着剧烈的变化。广州作为HFMD的高发城市之一,近些年对其病原学调查研究的相关研究报道尚不全面,因此急需对广州地区HFMD病原学流行情况进行全面且详尽的监测。另一方面由于由CVA6所引起的HFMD的暴发越来越常见,同时,CVA6感染所导致的非典型HFMD临床表现给临床诊断也带来了挑战,使实际感染人数被低估及延误对疾病的诊疗。尽管EV-A71疫苗已被成功研制并得到运用,但它不能对CVA6感染产生交叉免疫保护,目前对于HFMD治疗并无特效药可用,早诊断早治疗是提高患儿临床预后和阻断疾病传播的重要手段。因此,本研究通过对2018年广州地区HFMD流行情况进行调查研究,阐明广州地区HFMD的流行病学特征和病原学构成情况,为HFMD的防治策略提供科学依据;同时基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术（Reverse-transcription recombinase polymerase amplification,RTRPA）与侧流层析试纸条法（Lateral flow strip,LFS）建立一种简单、快速且准确的CVA6检测方法,对HFMD诊断和防控具有重要意义。方法1.2018年广州地区HFMD流行病学调查为了解2018年广州地区HFMD流行情况,收集并分析2018年在广东省妇幼保健院收治经临床诊断为HFMD的1220例患儿的临床资料和实验室检查结果,采用逆转录实时荧光定量PCR（Real-time quantitative RT-PCR,q RT-PCR）和逆转录半巢氏PCR（Reverse transcription semi-nested PCR,RT-sn PCR）与测序结合的方法对所收集的肠道病毒临床标本进行分型鉴定,随后选取2018年广州地区HFMD的3种主要流行的病原体（CVA6、CVA10和CVA16）的VP1基因全长序列进行了遗传进化分析,分析其分子流行病学特征。2.CVA6快速检测方法的建立针对CVA6的VP1基因序列设计RPA特异性引物及探针,建立并优化CVA6的RT-RPA-LFS检测方法。制备CVA6 RNA标准品并进行连续倍比稀释,用q RT-PCR方法进行平行检测,以比较该方法的灵敏度。选用一系列非CVA6型肠道病毒（CVA2、CVA4、CVA5、CVA9、CVA10、CVA16、EV-A71、CVB2、CVB3、Echovirus3、Echovirus11、Echovirus18）对RT-RPA-LFS检测方法的特异性进行评价。收集142份经商品化肠道病毒通用型核酸检测试剂盒检测确认的肠道病毒阳性临床样本,用RT-RPA-LFS、q RT-PCR和RT-sn PCR方法对样本进行平行检测,以评价RT-RPA-LFS检测方法的临床检测性能。结果1.2018年广州地区HFMD流行病学调查通过对2018年广州地区所收集的1220例HFMD患儿的临床样本进行肠道病毒病原学图谱分析,此次共检出21种肠道病毒血清型,其中CVA6（364/1220,29.8%）、CVA10（305/1220,25.0%）和CVA16（397/1220,32.5%）是导致HFMD的三种主要病原体,占总检出率的87.3%。对肠道病毒流行季节进行调查分析发现,CVA6是导致HFMD秋季流行的优势病原体,而CVA10和CVA16夏季流行的优势病原体。CVA6、CVA10和CVA16三种病原体感染的患儿临床表现及实验室检查结果相似,三者重度HFMD的发生率分别为5.8%、5.9%和1.5%。遗传进化分析结果显示,2018年广州地区所流行的CVA6、CVA10和CVA16流行株分别属于E2、E和B1基因型。2.CVA6快速检测方法的建立本研究建立了一种简便、快速且准确的CVA6一步法RT-RPA-LFS检测方法,该方法可37℃条件下35min内完成对CVA6的检测,无需昂贵的仪器设备,用肉眼即可对结果进行判读。RT-RPA-LFS检测方法的灵敏度为10拷贝/反应,与传统的q RT-PCR检测方法无差异。在特异性实验中,只有CVA6阳性样本实验结果为阳性,其他非CVA6病原体检测结果均为阴性,RT-RPA-LFS检测方法的特异性为100%。对142例临床标本检测结果显示,RT-RPA-LFS、q RT-PCR和RT-sn PCR检测方法的结果符合率为100%。结论2018年广州地区HFMD呈现CVA6、CVA10和CVA16三种病原体共同流行的特点,且其在流行时间上呈现季节性分布,CVA6是导致HFMD秋季流行的优势病原体,而CVA10和CVA16夏季流行的优势病原体;本研究同时建立了一种简便、快速且准确的CVA6一步法RT-RPA-LFS检测方法,进一步完善了HFMD的检测方法,为HFMD的防控提供有效的措施。
张宏扬[3]（2021）在《食源性多重耐药普通变形杆菌P3M环丙沙星和多粘菌素抗性调控机制研究》文中认为普通变形杆菌（Proteus vulgaris）为环境和临床中常见的条件致病菌,在特定条件下会引起胃肠感染、尿路交叉感染等疾病。环丙沙星等抗生素广泛用于治疗该类细菌所引发的感染,但也使得耐药细菌大量出现,严重影响临床治疗效果,危及人类生命健康。本实验室前期从南美白对虾肠道中分离得到一株携带有两个内源质粒的变形杆菌（Proteus）,后经本研究鉴定为普通变形杆菌。本研究将该普通变形杆菌命名为P3M并将其作为研究对象,通过全基因组测序（Wholegenome sequencing,WGS）和一系列实验对其进行全面鉴定,明确了其作为多重耐药菌的环丙沙星和多粘菌素抗性机制。具体研究内容如下:1.通过全基因组测序对P3M基因组进行鉴定,得到包括编码基因数量及功能、GC含量、非编码RNA（non-coding RNAs,nc RNAs）、重复序列等详细信息。依据COG数据库和KEGG数据库分析将所得到的全部功能基因划分为22个功能类群以及六大类代谢通路。分析发现P3M基因组上存在分属于36个抗生素大类的218个抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）,同时最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）测定实验表明P3M对16种常见抗生素呈现出明显抗性,表明该菌为一株食源性多重耐药细菌。棋盘法MIC测定实验表明,四环素和环丙沙星抗生素联合使用时能够显着抑制P3M生长,发挥协同杀菌效果。进一步的生物信息学分析表明,P3M基因组上存在Bae S-Bae R和Cpx A-Cpx R两类可介导菌株多重耐药性的双组分系统（two-component systems,TCSs）,以及包括质粒、位点特异性重组酶、正向重复序列在内的多类可移动遗传元件（mobile genetic elements,MGEs）。本研究明确了食源性多重耐药普通变形杆菌P3M的基因组特性及耐药特点,将为深入了解环境中普通变形杆菌的抗性传播和转移规律奠定基础。2.P3M中存在两个内源质粒p3M-2A和p3M-2B,大小分别为2,656 bp和5,903 bp。p3M-2B携带一个喹诺酮抗性基因qnr D,而p3M-2A不携带抗性基因。qnr D携带质粒按照其大小可分为2.7 kb和4.3 kb两大类,但p3M-2B不满足该规律。质粒消除及qRT-PCR实验表明,p3M-2A质粒对于p3M-2B质粒上qnr D的表达具有明显的促进作用,其中ORF1起到主要的调控功能。质粒线性比对分析表明,p3M-2B上的ORF1-4为qnr D携带质粒发挥功能所必需的最保守序列,而ORF5则为通过正向重复序列DR-C同源重组而在长期进化过程中所获得的外源DNA序列。本研究提出了较大型qnr D携带质粒的形成过程模型,为抗生素抗性基因水平转移研究提供了新的思路。3.本研究在环丙沙星处理条件下鉴定得到了一个参与P3M菌株环丙沙星抗性调控的非编码RNA Csi R（ciprofloxacin stress-induced nc RNA）。生存率实验表明,Csi R缺失突变菌株的存活率相较于野生型P3M明显提升,说明该非编码RNA发挥负调控功能。通过进一步的靶标基因预测、qRT-PCR、微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）等实验,我们鉴定得到了Csi R参与环丙沙星抗性调控的靶标基因emr B,并证明了Csi R通过与emr B m RNA 5’UTR区域互作影响了emr B的翻译过程。此外,通过序列比对我们发现Csi R与emr B m RNA的互作位点在其他已测序的普通变形杆菌中高度保守,暗示这种调控机制可能普遍存在于该种细菌中。本研究揭示了非编码RNA Csi R在普通变形杆菌环丙沙星抗性调控过程中的重要作用,为今后明确普通变形杆菌多重耐药性的产生机制提供理论基础。4.本研究通过全基因组测序和qRT-PCR鉴定得到了一个能够特异响应多粘菌素压力信号的非编码RNA Psi R（polymyxin B stress-induced nc RNA）,其突变菌株Δpsi R在多粘菌素处理条件下的生存率显着低于野生型P3M,说明该非编码RNA参与到了菌株的多粘菌素抗性调控过程中。之后通过靶标基因预测、qRTPCR、MST等实验我们鉴定得到了Psi R参与P3M菌株多粘菌素抗性调控的靶标基因pgs A,并通过半衰期测定等实验明确了Psi R通过与pgs A m RNA结合打开了位于后者作用位点前端的茎环结构,从而在转录后水平提高了pgs A m RNA的稳定性,增强了菌株的多粘菌素抗性。本研究揭示了非编码RNA Psi R在P3M菌株耐药性调控过程中的重要角色及其在普通变形杆菌进化中的高度保守性,为今后进一步明确普通变形杆菌多粘菌素耐药性的产生机制奠定基础。综上,本研究揭示了普通变形杆菌P3M的多重耐药特性及其进化特点,并系统鉴定了参与P3M环丙沙星和多粘菌素抗性调控的质粒及非编码RNA,明确了其参与各抗性调控过程的作用机制及对于研究同种属内其他细菌耐药性产生和传播的重要指导意义,为今后相关领域的研究奠定基础。
刘涛[4]（2021）在《长链非编码RNA RASSF8-AS1竞争性结合miR-664b-3p调控TLE1表达影响喉鳞状细胞癌的发生发展过程》文中研究说明喉癌是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一,其主要病理类型为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）。根据其原发部位的不同,主要分为声门型、声门上型和声门下型喉癌,声门型喉癌最为常见。2018年,全世界喉癌的新发病例是177,422例,约占总的全身恶性肿瘤新发病例的1%左右,其导致的死亡病例为94,771例,且近年来,全球的喉癌发病率在逐年上升。随着人们对生活质量要求的不断提升和科学技术的发展,人们对于喉功能保留、重建有了更高的向往与追求,喉癌的治疗方案也在不断的丰富和改进。然而,最新的调查显示喉癌患者的总体生存率并没有得到明显提升,甚至有下降的趋势,晚期喉癌的预后仍不甚理想。临床上,复发和转移成为限制喉癌患者预后的主要因素,大约有60%的患者在确诊时已经到了晚期。因此,探讨研究喉鳞状细胞癌发生发展的分子机制已尤为重要。近些年来,随着科学技术的不断发展,研究人员发现在人类的RNA中只有不到2%的RNA能够进行编码蛋白质,多数RNA难以编码蛋白质,这类不能编码蛋白质的基因称为非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）。长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）是非编码RNA的一类,它的长度大于200个核苷酸,它能在转录调控层面及转录后调控层面参与调控肿瘤的发生与发展,同时它与肿瘤的浸润及转移等密切相关。本研究通过对表达谱基因芯片进行分析,筛选出了LSCC组织与其临近正常组织中具有差异性表达的lncRNAs,其中lncRNA RASSF8-AS1在喉癌组织中表达显着下调,这引起了我们的关注。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类含有18-25个核苷酸的的非编码RNA,它可以通过与它的靶向mRNA分子的3’UTR（3’untranslated region,3’非编码区）特异性的结合,抑制mRNA的合成或直接将其降解掉,在转录以及转录后水平参与基因的调控。近些年,lncRNA与miRNA相互作用的研究备受关注,特别是竞争性内源RNA（competitive endogenousRNA,ceRNA）机制尤其成为人们现在研究的热点问题,为阐明两者之间的关系提供了一种新的思路。IncRNA能够作为ceRNA分子,竞争性的结合特定的某个或多个miRNA,从而减少miRNA对其下游靶基因的调控作用。本实验旨在探讨RASSF8-AS1通过竞争性结合miR-664b-3p,进而调节I型分裂蛋白转导素样增强子（Transducin-like enhancer of split 1,TLE1）的表达,从而影响喉鳞状细胞癌的恶性生物学行为,这样的一种分子机制。主要研究内容和结果如下:第一部分RASSF8-AS1的筛选及其在喉鳞状细胞癌中的表达情况目的:运用表达谱基因芯片分析技术,筛选出LSCC癌组织与其临近正常组织中表达具有差异性的lncRNAs,选取表达下调的lncRNA RASSF8-AS1作为研究对象,分析RASSF8-AS1在喉鳞状细胞癌组织及细胞中的表达水平,并分析其表达水平与LSCC患者临床病理特征是否存在相关性。方法:1.对4例LSCC患者的喉癌组织及其对应的临近正常组织进行表达谱芯片检测,筛选出差异表达的lncRNAs。2.采用荧光定量反转录聚合酶链反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术检测RASSF8-AS1在72例LSCC患者癌组织及其对应的临近正常组织中的差异性表达情况。3.采用q RT-PCR技术检测RASSF8-AS1在4株LSCC细胞系TU686、TU177、TU212以及AMC-HN-8以及正常对照组中的差异性表达情况。4.通过基因表达谱相互作用分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析RASSF8-AS1在多种肿瘤组织及其正常对照组中的差异性表达情况。5.对RASSF8-AS1在喉癌患者组织中的的相对表达量与其临床病理学特征,如TNM临床分期、病理分化程度、颈部淋巴结有无转移、年龄、吸烟以及饮酒等进行相关性分析。结果:1.表达谱芯片分析技术筛选出（Fold change≥2）3073个差异表达的lncRNA,这其中有1967个lncRNA在LSCC组织中表达上调,有1106个在LSCC组织中表达下调。2.从上述差异基因中选择RASSF8-AS1作为研究对象,q RT-PCR结果显示在72例喉鳞状细胞癌患者癌组织中RASSF8-AS1的相对表达量显着低于其相对应的临近正常组织。（t=5.615,P<0.01）。3.RASSF8-AS1在TU686细胞系中的相对表达量显着低于正常对照组（P<0.01）,同样在TU177细胞（P<0.01）、TU212细胞（P<0.01）以及AMC-HN-8细胞中（P<0.01）也得出相同结果。4.GEPIA分析结果显示:RASSF8-AS1在多种肿瘤瘤组织中的表达量较正常组织中的显着降低。5.RASSF8-AS1在LSCC癌组织中的表达量与LSCC患者的TNM临床分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关,其在低分化组、伴有淋巴结转移组以及TNM分期的Ⅲ、Ⅳ期组中呈现低表达（P<0.05）,而与患者的年龄、有无饮酒及吸烟无明显相关性（P>0.05）。第二部分RASSF8-AS1对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响目的:通过体外实验,探讨RASSF8-AS1对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响。方法:1.构建RASSF8-AS1的过表达载体pc DNA3.1-RASSF8-AS1,并将其与空载质粒pc DNA3.1分别转染LSCC细胞系TU686和TU177细胞中去,并采用q RT-PCR的方法检测过表达效率。2.在体外细胞实验中,设置pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1两组,采用Transwell小室迁移、侵袭实验来验证以上两组对LSCC癌细胞迁移以及侵袭能力影响。3.在体外细胞实验中,设置pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1两组,采用MTS以及克隆形成实验验证以上两组对LSCC癌细胞增殖能力影响。结果:1.LSCC细胞系TU686和TU177分别转染过表达质粒pc DNA3.1-RASSF8-AS1或空载pc DNA3.1后,利用q RT-PCR检测,目的基因表达量明显高于空载质粒组（P<0.01）,过表达RASSF8-AS1的细胞株建立完成。2.体外细胞实验:Transwell小室迁移以及侵袭实验证明转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后LSCC细胞系TU686和TU177细胞的迁移以及侵袭能力均较转染pc DNA3.1组显着降低,且结果有统计学差异（P<0.01）。3.体外细胞实验:MTS以及细胞克隆实验证明转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后LSCC细胞系TU686和TU177细胞的增殖能力均较转染pc DNA3.1组显着降低,且结果有统计学差异（P<0.01）。第三部分RASSF8-AS1靶向miRNA的选择、鉴定及miR-664b-3p对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响目的:探讨RASSF8-AS1与靶向miRNA（miR-664b-3p）之间的调控关系,以及miR-664b-3p对LSCC细胞生物学功能的影响。方法:1.利用细胞浆、核RNA分离试剂盒,分别提取LSCC细胞系AMC-HN-8、TU177、TU212以及TU686的细胞核以及细胞浆RNA,用q RT-PCR的技术方法检测RASSF8-AS1的亚细胞定位。2.通过生物学信息预测软件Target Scan（http://www.targetscan.org/）以及DIANA（http://www.microrna.gr/micro TCDS）预测RASSF8-AS1的靶向miRNA,并确定其结合位点。3.构建pmir GLO-RASSF8-AS1-WT和pmir GLO-RASSF8-AS1-MUT型质粒,应用双荧光素酶报告基因实验在TU177细胞及工具细胞293T中验证RASSF8-AS1与miR-664b-3p两者之间的靶向结合关系。4.在喉癌细胞系TU177中应用基于MS2结合序列-MS2结合蛋白（MS2bs-MS2bp）的RNA免疫共沉淀技术（RIP）进一步验证RASSF8-AS1与miR-664b-3p之间的结合关系。5.通过q RT-PCR的技术方法检测在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1后miR-664b-3p表达量的变化情况。6.应用Pearson方法对72例喉癌患者癌组织中RASSF8-AS1以及miR-664b-3p的相对表达量进行相关性分析。7.通过q RT-PCR的技术方法验证miR-664b-3p在72例LSCC患者癌组织及其相对应的临近正常组织中的表达量的差异性情况。8.合成miR-664b-3p的类似物miR-664b-3p-mimic及抑制物miR-664b-3p-inhibitor,并将它们分别转染到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用q RT-PCR的技术方法检测miR-664b-3p的表达量。9.采用Transwell小室迁移、侵袭实验验证上调及下调miR-664b-3p后对LSCC癌细胞迁移以及侵袭能力的影响。采用MTS以及克隆形成实验验证上调及下调miR-664b-3p后对LSCC癌细胞增殖能力的影响。10.采用Transwell小室迁移、侵袭实验以及MTS实验、克隆形成实验检测LSCC细胞系TU686及TU77中转染miR-664b-3p-mimic,及共转染miR-664b-3p-mimic+pc DNA3.1-RASSF8-AS1后对LSCC细胞迁移、侵袭以及增殖能力的影响。结果:1.RASSF8-AS1在TU177、TU686、TU212以及AMC-HN-8,4株喉癌细胞系的细胞核、浆中都有表达,在浆中的表达量略多于核中。2.通过生物信息学预测显示miR-664b-3p与RASSF8-AS1具有潜在的结合位点,并分析出其结合位点。3.双荧光素酶报告基因实验结果显示在TU177细胞及工具细胞293T中与共转染NC质粒比较,共转染pmir GLO-RASSF8-AS1-WT质粒及miR-664b-3p-mimic可显着降低荧光素酶的活性（P<0.01）,与此相反,共转染了pmir GLO-RASSF8-AS1-WT型质粒和miR-664b-3p-inhibitor之后荧光素酶的活性得到了明显增强（P<0.01）,当对pmir GLO-RASSF8-AS1-WT进行突变后,各组的荧光素酶活性没有明显变化（P>0.05）。4.RNA免疫共沉淀技术（RIP）实验结果显示,转染了pc DNA3.1-RASSF8-AS1-MS2（12x）质粒组所富集的miR-664b-3p含量显着高于转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1-MS2（12x）-MUT质粒组,两者之间的q RT-PCR结果具有统计学差异（P<0.01）。5.q RT-PCR结果显示,在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1后对miR-664b-3p的表达量进行比较,发现过表达RASSF8-AS1后与对照组相比miR-664b-3p的表达明显降低,结果具有统计学差异（P<0.01）。6.Pearson统计分析结果显示在72例喉癌患者癌组织中RASSF8-AS1与miR-664b-3p的相对表达量密切相关,且两者成负相关（r=-0.5099,P<0.01）。7.miR-664b-3p在72例喉鳞状细胞癌患者癌组织中的表达量显着高于其相对应的临近正常组织。（t=4.542,P<0.01）。8.q RT-PCR结果显示,转染miR-664b-3p-mimic可有效上调miR-664b-3p在LSCC细胞系TU686及TU177中的表达水平,而在转染miR-664b-3p-inhibitor可显着下调miR-664b-3p在LSCC细胞系TU686及TU177中的表达水平（P<0.01）。9.体外实验证实,过表达miR-664b-3p可显着促进LSCC细胞系TU686及TU177的迁移、侵袭以及增殖的能力（P<0.01）,下调miR-664b-3p可明显抑制TU686及TU177细胞的迁移、侵袭以及增殖的能力（P<0.01）。10.在TU686及TU177细胞中,共转染RASSF8-AS1后部分逆转了过表达miR-664b-3p对TU686及TU177细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的促进作用。（P<0.01）第四部分miR-664b-3p在喉鳞癌中靶向调控的mRNA筛选、鉴定以及TLE1对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响目的:探讨miR-664b-3p与其靶向mRNA:TLE1两者之间的调控关系,以及TLE1对LSCC细胞生物学功能的影响。方法:1.通过生物学信息预测软件Target Scan（http://www.targetscan.org/）以及DIANA（http://www.microrna.gr/micro TCDS）预测miR-664b-3p的靶向mRNA,并确定其结合位点。2.分别转染miR-664b-3p-mimic以及miR-664b-3p-inhibitor到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用q RT-PCR的技术方法检测上调以及下调miR-664b-3p后TLE1在mRNA水平表达量的变化情况。3.分别转染miR-664b-3p-mimic以及miR-664b-3p-inhibitor到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用western blot的方法检测上调以及下调miR-664b-3p后TLE1的蛋白水平的变化情况。4.采用q RT-PCR技术检测TLE1在72例LSCC患者癌组织及其对应的临近正常组织中的表达情况。5.应用Pearson相关统计方法对72例喉癌患者癌组织中TLE1以及miR-664b-3p的相对表达量进行相关性分析。6.构建pmir GLO-TLE1-WT以及pmir GLO-TLE1-MUT型质粒,在TU177细胞及293T细胞中,应用双荧光素酶报告基因实验对TLE1以及miR-664b-3p两者之间的结合关系进行验证。7.通过q RT-PCR的技术方法验证上调RASSF8-AS1后TLE1在LSCC细胞系TU686及TU177细胞中的表达量的变化。8.分别转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1到LSCC细胞系TU686和TU177中,采用western blot的技术方法检测上调RASSF8-AS1后TLE1的蛋白水平的变化情况。9.采用Transwell小室迁移、侵袭实验以及MTS实验、克隆形成实验检测LSCC细胞系TU686及TU77中转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1,及共转染sh-TLE1+pc DNA3.1-RASSF8-AS1后对LSCC细胞迁移、侵袭以及增殖能力的影响。结果:1.通过生物信息学预测显示miR-664b-3p与TLE1具有潜在的结合位点,并分析出其结合位点。2.q RT-PCR结果显示,在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染miR-664b-3p-mimic及miR-664b-3p-inhibitor后对TLE1的表达量进行比较,发现上调miR-664b-3p后与正常对照组相比TLE1的表达明显下降,而下调miR-664b-3p后,TLE1的表达明显增加,且结果具有统计学差异（P<0.01）。3.Western blot结果显示,在LSCC细胞系TU686以及TU177中分别转染miR-664b-3p-mimic及miR-664b-3p-inhibitor后对TLE1的蛋白表达量进行比较,发现过上调miR-664b-3p后与正常对照组相比TLE1的蛋白表达水平明显下降,而下调miR-664b-3p后TLE1的蛋白量水平明显增加,且结果具有统计学差异（P<0.01）。4.TLE1在72例喉鳞状细胞癌患者癌组织中的表达量显着低于其相对应的临近正常组织（t=5.345,P<0.01）。5.Pearson统计分析结果显示在72例喉癌患者癌组织中TLE1与miR-664b-3p的相对表达量密切相关,且两者成负相关（r=-0.4906,P<0.01）。6.双荧光素酶报告基因实验结果显示在TU177细胞及293T细胞中,与共转染NC质粒比较,共转染pmir GLO-TLE1-WT质粒及miR-664b-3p-mimic可显着降低荧光素酶的活性（P<0.01）,与此相反,共转染了pmir GLO-TLE1-WT型质粒和miR-664b-3p-inhibitor之后荧光素酶的活性得到了明显增强（P<0.01）,当对pmir GLO-TLE1-WT进行突变后,各组的荧光素酶活性没有明显变化（P>0.05）。7.q RT-PCR结果显示:分别pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1到LSCC细胞系TU686及TU177中去,发现转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后可显着上调LSCC细胞系TU686及TU177中TLE1的mRNA水平的表达,且结果具有统计学差异（P<0.01）。8.Western blot结果显示:将pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1分别转染到TU686及TU177细胞中去,转染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后可显着提高LSCC细胞系TU686及TU177中TLE1的蛋白表达水平,且结果具有统计学差异（P<0.01）。9.在TU686及TU177细胞中,共转染sh-TLE1后部分逆转了pc DNA3.1-RASSF8-AS1对TU686及TU177细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的抑制作用。结论:1.在喉鳞状细胞癌组织以及细胞中,RASSF8-AS1表达显着下调,且RASSF8-AS1在癌组织中的表达量与LSCC患者的TNM临床分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关。2.过表达RASSF8-AS1可以抑制LSCC细胞的迁移、侵袭以及增殖能力,这提示RASSF8-AS1参与了喉鳞癌的进展过程。3.RASSF8-AS1与miR-664b-3p在LSCC中的表达呈负相关性,且过表达RASSF8-AS1会减弱miR-664b-3p的促癌作用。4.RASSF8-AS1通过miR-664b-3p调控TLE1的表达,进而抑制LSCC细胞的体外迁移、侵袭以及增殖的能力。
高海霞[5]（2021）在《弥漫大B细胞淋巴瘤信号通路相关microRNA和蛋白质的筛选及功能研究》文中进行了进一步梳理目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是成人最常见的B细胞淋巴瘤,经R-CHOP标准化疗后仍有30-40%的患者治疗欠佳短期内复发耐药甚至死亡,因此寻找新的药物靶点是提高DLBCL患者生存的迫切需要。本研究拟在微小RNA（microRNA,miRNA）、mRNA、蛋白质水平筛选和验证与DLBCL发生发展相关的可能关键因子及信号通路,并对重要信号通路相关的关键因子在细胞水平进一步进行功能研究,初步阐明人类种属（Homo sapiens,hsa）-miR-193a-3p靶向TCL1调控PI3K/AKT信号通路影响DLBCL细胞增殖、凋亡和周期的作用机制,为深入理解DLBCL的发生发展和提供新的治疗靶点奠定理论基础。方法:1)本研究选择新鲜冰冻人DLBCL组织为实验组、人淋巴结反应性增生（lymph node reactive hyperplasia,LRH）为对照组,应用miRNA表达谱芯片筛选差异mi RNA;对差异miRNA进行生物信息学分析,阐明差异mi RNA的靶基因及其生物学功能和富集的信号通路;对重要信号通路相关差异miRNA应用q RT-PCR验证其表达;2)本研究同样选择新鲜冰冻人DLBCL组织为实验组、人LRH为对照组,应用蛋白质组学筛选差异蛋白质;对差异蛋白质进行生物信息学分析,阐明其生物学功能和富集的信号通路;对重要信号通路相关差异蛋白质应用平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）和免疫组化验证其蛋白表达,并分析其蛋白表达与DLBCL患者临床病理特征和预后的相关性;将mi RNA芯片和蛋白质组学研究结果进行交叉分析,确定在细胞水平进行hsa-miR-193a-3p靶向TCL1调控PI3K/AKT信号通路影响DLBCL细胞增殖、凋亡和周期的机制研究;3)应用双荧光素酶报告基因检测hsa-mi R-193a-3p与TCL1的互作关系;选择人DLBCL细胞为实验组、正常人外周血B淋巴细胞为对照组,应用qRT-PCR检测hsa-mi R-193a-3p和TCL1的基因表达,并筛选后续实验DLBCL细胞株;将hsa-miR-193a-3p类似物（mimic）和抑制剂（inhibitor）、si RNA-TCL1、siRNA-TCL1+hsa-miR-193a-3p inhibitor分别转染DLBCL细胞,设立相应的阴性和空白对照,应用CCK8和流式观察DLBCL细胞增殖、凋亡和周期;并应用q RT-PCR和Western-blot检测DLBCL细胞中TCL1、PI3K/AKT信号通路重要调控因子AKT和磷酸化的AKT,细胞凋亡因子BCL-2和BAX的基因和蛋白表达。结果:1)本研究筛选出204个差异miRNA,54个上调,150个下调;差异miRNA预测到7522个靶基因;差异miRNA的靶基因主要富集在Pathway in cancers、MAPK、Focal adhesion、PI3K/AKT等信号通路;qRT-PCR验证PI3K/AKT信号通路相关差异miRNA发现在DLBCL中hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-490-5p的表达降低,hsa-miR-630的表达升高;2)本研究筛选出335个差异蛋白质,131个上调,204个下调;差异蛋白质主要富集在Pathway in cancers、PI3K/AKT、Alcoholism、Necroptosis等信号通路;PRM和免疫组化验证PI3K/AKT信号通路相关差异蛋白质发现在DLBCL中TCL1、HSP90、AKT、IKKβ的蛋白表达水平升高;生存分析发现TCL1蛋白高阳性表达是DLBCL患者短的总生存期和无进展生存期的独立影响因素;3)细胞水平证实TCL1是hsa-miR-193a-3p的靶基因;在DLBCL细胞中hsa-mi R-193a-3p的表达降低,而TCL1 mRNA的表达升高;hsa-miR-193a-3p在DLBCL中是一个肿瘤抑制因子,hsa-miR-193a-3p mimic使DLBCL中hsa-miR-193a-3p表达升高,其高表达使DLBCL细胞增殖降低,凋亡增加,细胞周期被阻滞在S期,DNA合成受阻,细胞在S期与后续G2/M、G0/G1期之间的转换被调控;hsa-miR-193a-3p inhibitor使DLBCL中hsa-miR-193a-3p表达降低,其低表达使DLBCL细胞增殖升高,凋亡降低,并可逆转mimic对细胞周期的调控作用;TCL1在DLBCL中是一个癌基因,TCL1-siRNA在DLBCL中可沉默TCL1的表达,沉默TCL1表达可抑制DLBCL细胞增殖、促进凋亡、细胞周期被阻滞在S期、并可抑制PI3K/AKT信号通路激活,但加入hsa-miR-193a-3p inhibitor能逆转siRNA-TCL1对PI3K/AKT信号通路的抑制效应。结论:应用miRNA表达谱芯片筛选出204个差异miRNA,54个上调,150个下调;应用蛋白质组学筛选出335个差异蛋白质,131个上调,204个下调;对已筛选重要信号通路即PI3K/AKT信号通路相关因子验证发现在DLBCL中hsa-miR-193a-3p的表达降低,TCL1的蛋白表达升高并且生存分析发现TCL1蛋白高阳性表达是DLBCL患者短的总生存期和无进展生存期的独立影响因素;hsa-miR-193a-3p通过靶基因TCL1实现对DLBCL细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为的调控,hsa-miR-193a-3p inhibitor能逆转siRNA-TCL1对PI3K/AKT信号通路的抑制效应,进而影响DLBCL发生和进展。
陈秀玲[6]（2020）在《实时荧光双重SRCA方法检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌研究》文中研究指明食源性致病菌引起的疾病是我国食品安全和公共健康关注的焦点之一。沙门氏菌和志贺氏菌是两种常见的食源性致病菌,均属于肠杆菌科革兰氏阴性菌。两种菌在形态学和生化特性方面十分相似,常同时存在于乳制品、蔬菜沙拉和禽肉等食品中,引起食物中毒。沙门氏菌可导致肠胃炎、伤寒和副伤寒,志贺氏菌可引起痢疾。因此,建立一种快速、简便的可同时检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌的方法,对于及时检出致病菌和避免食物中毒具有重要的现实意义。本研究以沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌,将跨越式滚环等温扩增（Saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术和荧光技术相结合,首次建立了同时检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌的双重实时荧光跨越式滚环等温扩增方法（Real-time fluorescent saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA）。通过比对沙门氏菌和志贺氏菌基因组序列,选择同源性好、保守性高的沙门氏菌序列（GenBank No.ALFE01000410.1）和志贺氏菌序列（GenBank No.LC111517.1）设计 RF-SRCA 引物,经过多次引物筛选及优化获得的引物具有高度特异性。通过优化反应体系,分别建立了沙门氏菌和志贺氏菌的单重RF-SRCA反应体系。在单重RF-SRCA反应体系和反应条件的基础上进行双重RF-SRCA优化,最终确定双重RF-SRCA反应体系和反应条件为:dNTPs（0.63 mM）,Mg2+（3.00 mM）,2 μL 10 × ThermoPol Reaction Buffer,沙门氏菌正反向引物浓度各0.25 μM,志贺氏菌的正反向引物浓度各0.50μM,DNA模板添加量各1.00 μL（阴性不添加）,Bst DNA聚合酶（8 U）,EvaGreen（0.8μL）,使用无菌去离子水将体系补足至20 μL。扩增反应程序为:62℃45个循环,每个循环1 min,每1 min收集一次荧光信号。扩增完成后,对其扩增产物进行熔解曲线分析,熔解程序为:95℃ 15 s,70℃ 1 min,以0.1℃/s速度升温至95℃,70℃开始收集荧光信号,绘制熔解曲线。根据两种产物熔解温度（Melting temperature,Tm）检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌。用双重RF-SRCA最终体系进行特异性和灵敏度试验。共选择44株菌包括14株沙门氏菌,7株志贺氏菌,23株非目标菌进行特异性试验,无菌去离子水作为阴性对照。试验结果显示,沙门氏菌和志贺氏菌的RF-SRCA产物具有相对稳定的Tm值,且14株沙门氏菌的Tm值统一落在88.89～89.84℃之间,7株志贺氏菌的Tm值统一落在84.24～85.34℃之间,阴性对照和非目标菌未发生扩增。对沙门氏菌和志贺氏菌的DNA模板进行10倍梯度稀释,分别进行单重RF-SRCA和双重RF-SRCA灵敏度试验,并与双重实时荧光PCR（Real-time fluorescent PCR,RT-PCR）方法进行比较。结果显示,单重RF-SRCA体系检测沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度均为2 fg/μL。双重RF-SRCA同时检测出沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度为20 fg/μL,双重RT-PCR的灵敏度为2 pg/μL。由此得出,双重RF-SRCA 比单重RF-SRCA检测灵敏度低10倍,但较双重RT-PCR的灵敏度要高100倍。在人工污染试验中,分别用沙门氏菌和志贺氏菌污染脱脂乳,用各稀释度菌液提取的DNA模板分别进行单重RF-SRCA、双重RF-SRCA和双重RT-PCR的检出限试验。结果显示,单重RF-SRCA检测沙门氏菌和志贺氏菌的检出限均为100 CFU/mL。双重RF-SRCA同时检测沙门氏菌和志贺氏菌的检出限为101 CFU/mL,双重RT-PCR检出限为103 CFU/mL。结果表明,双重RF-SRCA的检出限较单重RF-SRCA的检出限高10倍,但较双重RT-PCR的检出限低100倍。实际样品检测中,将双重RF-SRCA方法与双重RT-PCR方法和国标方法进行比较。结果显示:62个样品中双重RF-SRCA方法、双重RT-PCR方法和国标法检测沙门氏菌的阳性检出率分别为9.7%、8.0%和6.5%,检测志贺氏菌的阳性检出率分别为 6.4%、4.8%和 3.2%。综上所述,本研究成功建立了双重RF-SRCA检测方法,实现了同时对食品中沙门氏菌和志贺氏菌快速、灵敏、高效的检测。该方法与双重RT-PCR方法相比,灵敏度更高,检出限更低。在实际样品检测中,双重RF-SRCA方法的阳性检出率均较双重RT-PCR方法和国标方法高。该方法操作简便,结果可直接判定,对食品中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测具有重要意义,为食品安全检测领域提供了新方法、新思路。
高晨浩[7]（2020）在《甘蓝型油菜和拟南芥GLABRA3在花青素和种子油脂积累中的功能分析》文中研究表明油菜（Brassica napus）作为一种重要的经济作物,是我国第一大油料作物。目前,高油育种是油菜育种的主要研究方向,提高菜籽含油量一直备受关注。花青素属于植物中的一种黄酮类化合物,在植物抵御生物和非生物逆境过程中行使重要功能,目前富含花青素的健康功能性食品越来越受人们的喜爱。转录调控是种子油脂和花青素积累过程中一种重要的调控因子,已知b HLH（basic helix-loop-helix）转录因子GLABRA3（GL3）,参与调控拟南芥（Arabidopsis thaliana）花青素生物合成和表皮毛形成过程,但其在种子油脂积累过程中的功能尚不清楚。对于甘蓝型油菜同源基因BnGL3-1在表皮毛形成、花青素和油脂积累等方面的调控功能更是知之甚少。为分析拟南芥AtGL3和甘蓝型油菜BnGL3-1在花青素和油脂积累等生物学过程中的调控作用并探讨它们是否具有相似的生物学功能,本研究利用拟南芥突变体gl3-3和gl3-4,以及甘蓝型油菜品种秦优7号,初步分析了它们在花青素和种子油脂积累中的调控机制与功能异同。本研究的主要研究结果如下:（1）构建pAtGL3:GUS载体转化拟南芥野生型,通过对筛选获得的转基因植株进行GUS染色,再结合荧光定量PCR技术（q RT-PCR）检测AtGL3基因在野生型不同组织和种子不同发育时期的表达情况,分析AtGL3的时空表达模式。结果发现AtGL3广泛存在于拟南芥的营养器官和生殖器官中,并且在营养生长向生殖生长过渡初期的幼嫩茎尖和正在伸展的真叶中表达量较高,同时在种子胚胎不同发育阶段也大量表达。由此初步推测AtGL3可能参与幼苗薹期和种子的生长发育过程。（2）结合GUS染色结果和野生型、突变体之间在幼嫩茎尖和正在伸展的真叶中花青素含量和表皮毛数量的表型差异,选取拟南芥野生型和gl3-4突变体发芽20天后的幼嫩茎尖和正在伸展的真叶进行转录组测序并对差异表达基因进行生物信息学分析,在全基因组水平上调查花青素生物合成及表皮毛形成过程中AtGL3调控的下游基因。然后利用q RT-PCR技术进一步验证这些潜在靶标基因的表达水平。本研究获得了多个作用于AtGL3下游并被其显着调控的参与花青素积累和表皮毛发育的重要转录因子或结构基因。（3）通过对来自不同物种中的GL3蛋白质进行多序列比对和系统进化分析,发现:在蛋白质水平上,BnGL3-1（秦优7号）与拟南芥（AtGL3,84%）、白菜型油菜（Br GL3,98%）和甘蓝（Bo GL3,99%）中的GL3序列高度同源。推断BnGL3-1与AtGL3亲缘关系紧密,在进化上保守。烟草叶片亚细胞定位表明BnGL3-1定位在细胞核中,推测其具有转录因子特性。（4）在拟南芥突变体gl3-3背景下,过表达BnGL3-1可以恢复突变体幼嫩茎尖和正在伸展的真叶中的花青素含量和表皮毛数目均减少的表型。同时q RT-PCR检测结果显示在幼嫩茎尖和正在伸展的真叶中参与花青素合成和表皮毛形成的众多相关基因被BnGL3-1显着调控。这表明,BnGL3-1与AtGL3在调控花青素生物合成和表皮毛形成过程中功能类似。（5）观察野生型、突变体以及过表达转基因植株gl3-3 35S:BnGL3-1-6HA之间种子形态、重量等表型,测定其成熟种子中的油脂和花青素含量并检测种子发育重要时期相关基因的表达情况。结果发现BnGL3-1和AtGL3在调控种子油脂积累和花青素合成过程中的生物学功能相似,均通过调控与种子花青素和油脂积累相关的一系列基因的表达而促进种子花青素生物合成和抑制种子油脂积累。综上所述,本文较为系统地研究了BnGL3-1和AtGL3在花青素和油脂积累方面的调控机制并比较了其作用异同。该研究表明甘蓝型油菜BnGL3-1不仅有利于通过调控花青素含量与表皮毛密度而提高油菜抵御外界不利因素影响的能力,而且有利于通过增加油菜薹期叶片和嫩茎中花青素含量而开发富含花青素的功能型蔬菜—油菜薹。此外,这也为通过分子育种手段实现油菜的多功能利用和高油育种发掘了新的基因资源。
任显凤[8]（2020）在《粮油黄曲霉与毒素同步检测及木霉阻控技术研究》文中提出黄曲霉毒素（Aflatoxin）是目前发现毒性最强的一类真菌毒素,能引起肝脏的急性或慢性损害,对人和动物具有严重的致癌、致畸、致突变作用。黄曲霉毒素主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）代谢产生,在世界范围内广泛污染花生、玉米、小麦、大米、棉花、坚果等农产品,其中以花生和玉米受污染最为严重。在我国黄曲霉污染广泛,而寄生曲霉污染罕见。农产品黄曲霉及其毒素污染不仅会对人、畜的健康构成威胁,还会大大降低农产品的营养价值和经济价值,严重损害经济效益,是农产品质量与安全的重大风险隐患。本文研究建立了粮油类农产品黄曲霉及其毒素快速同步检测和基于木霉菌的高效生物防控技术,对及早发现污染并科学监管,保障粮油质量安全具有重要意义。检测技术是及时发现污染、采取有效防控的“眼睛”,目前已有许多检测农产品中黄曲霉毒素的技术方法,如高效液相色谱分析、酶联免疫吸附分析、免疫传感器分析、免疫层析等,但是多组分同步检测尤其是小分子污染物与食源性微生物同步检测技术相对十分缺乏。生物防控具有环境友好、高效、安全等特点,近年来在食物病原菌及毒素污染防控领域备受青睐。但是,现阶段粮油产品黄曲霉及其毒素污染的生物防控领域仍面临诸多挑战,如缺乏高效的生防菌剂、生防作用机理不明、缺失实践应用等。针对以上问题,本论文作了如下研究,具体研究内容和结论如下:1.建立了RT-PCR同步检测粮油产品中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的技术方法。依据免疫反应中纳米抗体V2-5和V8#分别与黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮竞争结合单克隆抗体1C11和2D3的原理;首先,依据编码纳米抗体的特异DNA序列设计引物,实现噬菌体中特异DNA序列扩增;然后,将免疫反应和PCR扩增反应相结合,建立了RT-PCR同步检测黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的技术。研究结果显示,该方法检测黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的检测限分别为0.03 ng/mL和0.09 ng/mL,加标回收率分别为80–118%和76.7–111%。最后,该检测技术被成功应用到玉米、大米、小麦、饲料中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的同步检测,且样品中毒素的检测结果与高效液相色谱法的检测结果一致。研究结果表明,通过纳米抗体噬菌体建立的两种毒素RT-PCR同步检测技术可为粮油产品污染物同步检测分析提供新的途径。2.创建了RT-PCR同步检测玉米中黄曲霉毒素及其产毒菌的技术方法。黄曲霉毒素属于剧毒、致癌的小分子物质,主要由曲霉属、黄绿组的黄曲霉和寄生曲霉代谢产生。噬菌体V2-5展示的纳米抗体可特异性识别黄曲霉毒素的单克隆抗体1C11,黄曲霉毒素合成关键基因nor-1（aflD）可作为黄曲霉、寄生曲霉的生物标志物,基于RT-PCR中Taqman检测原理并根据噬菌体V2-5和nor-1特异基因序列设计两对特异引物,最终实现黄曲霉毒素及其产毒菌的RT-PCR同步检测。结果显示该方法检测黄曲霉毒素及黄曲霉菌的检测限分别为0.02 ng/mL和8×102孢子/g。进一步用该检测方法检测了25份自然污染的玉米中黄曲霉素及其产毒菌的含量,检测结果与高效液相色谱法和平板计数法的检测结果一致。研究结果表明,以黄曲霉毒素与黄曲霉为例创建的RT-PCR同步检测技术,首次突破了粮油产品中小分子污染物与食源性微生物一直难以同步测定的瓶颈难题。3.筛选了可高效抑制黄曲霉生长和产毒的木霉菌株T60和T44,并初步探明其抑制机理。通过双重培养实验和木霉菌代谢产物的抑菌活性研究,评估了20株不同来源的木霉菌对黄曲霉的拮抗活性及其代谢产物对黄曲霉生长和产毒的抑制效果。首先,双重培养实验的研究结果发现深绿木霉（T.atroviride）T32和T50、哈茨木霉（T.harzianum）ITEM908和T61、多孢木霉（T.polysporum）T60和绿色木霉（T.viride）T62生长迅速,可通过对营养物质的竞争、生存空间的竞争和重寄生作用,完全抑制黄曲霉菌生长。其次,通过木霉菌代谢产物抑菌活性研究发现:CDA（Czapex Dox Agar）培养基培养木霉菌3–5天后,有15株木霉菌分泌到CDA中的代谢产物显着抑制黄曲霉生长,T60分泌的代谢产物可完全抑制黄曲霉生长,抑制率为100%;用花生培养基培养木霉菌株3–5天后,有14株木霉菌分泌到花生培养基中的代谢产物显着抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素B1（AFB1）,哈茨木霉（T.harzianum）T44分泌的代谢产物抑制黄曲霉产毒的抑制率高达85±6%。研究结果表明:木霉菌可通过其拮抗活性和其代谢产物的抑菌活性抑制黄曲霉;其中部分木霉菌的代谢产物对黄曲霉具有很强的抑制作用,作为候选生防菌剂具有很高的应用价值。4.筛选出可高效降解黄曲霉毒素的里氏木霉（T.reesei）CGMCC3.5218,初步探明木霉菌降解黄曲霉毒素的作用机制并成功应用到粮油产品中黄曲霉毒素的降解。首先,实验比较了65株木霉菌对液体培养基中AFB1（50 ppb）的降解效果,筛选的CGMCC3.5218在含AFB1的液体培养基生长5天后,对浓度为50 ppb、500 ppb、10 ppm、15 ppm的AFB1的降解率分别为100%、95%、88%和66%;其在含浓度为500 ppb的AFB2、AFG1、AFG2的液体培养基生长7天后,对三种毒素的降解率分别为86%、88%和87%。进一步研究发现:CGMCC3.5218对AFB1的降解主要是细胞外代谢产物的酶促降解作用且活性酶为耐高温的非金属结合蛋白。最后,对CGMCC3.5218降解AFB1的培养条件进行优化,结果显示最适培养温度为28–37℃,培养基最适pH为4.5–8.3,多种含碳氮的培养基均适合做培养基质;在优化的培养条件下,CGMCC3.5218可高效降解花生粕、玉米和饲料中的黄曲霉毒素,可将自然污染的玉米中浓度为1657μg/kg的黄曲霉毒素降至安全水平（20μg/kg）。因此,里氏木霉CGMCC3.5218作为有效降解粮油产品中黄曲霉毒素的生物菌剂具有很高的应用价值。综上,本研究为粮油产品黄曲霉及其毒素污染的及时发现和有效防控提供了新方法,对抑制粮油产品黄曲霉及其毒素污染和保障消费安全具有重要理论意义与实用价值。
郭倩妤[9]（2020）在《猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用》文中指出猪消化道类病毒性疫病是近年来生猪养殖生产实践中最为普遍和突出的疾病,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。许多国内外的研究表明:猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastro enteritis virus,TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）、猪轮状病毒A型（Porcine rotavirus groupA,PoRVA）和猪轮状病毒C型（Porcine rotavirus group C,PoRV C）是临床上引起猪消化道腹泻的主要病毒性病原,且常呈现出混合感染或继发感染,导致猪群的高发病率和高死亡率,加大了诊断和防治的难度。为了实现临床对猪消化道主要病毒性疫病多种病原体混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述病原体的五重RT-PCR检测方法并进行了初步应用,为猪消化道病毒性疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段和理论参考依据。主要研究内容如下:1.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一RT-PCR检测方法的建立及检测参照Gen Bank上PEDVN（KT323979）、TGEVN（EU074218）、PDCoVN（MH715491）、PoRVAVP6（MH320796）、PoRV CVP6（KJ814472）等基因的部分序列片段,采用Primer Select等相关软件和平台,分别设计了5对用于扩增PEDVN、TGEVN、PDCoVN、PoRVAVP6和PoRV CVP6基因的部分片段的引物,大小分别为799 bp、375 bp、271 bp、525 bp和184 bp。将实验室检测呈PEDV、TGEV、PoRVA阳性的粪便样品及肠道组织等病料提取核酸和生物公司合成的含PDCoVN基因和PoRV C基因的部分片段的阳性质粒,分别以阳性病料的核酸和合成的质粒作为模板,通过对5种病毒单一RT-PCR扩增产物的鉴定,结果扩增出与预期相符的条带。将PEDV、TGEV、PoRVA的RT-PCR产物进行胶回收,并将胶回收后的产物与p MD-19T载体进行连接并转化入感受态细胞,通过对阳性克隆菌的筛选后提取相应的重组质粒,并以其中的5种重组质粒作为反应模板优化对单一病毒的PCR反应退火温度,并对敏感性进行检测,建立了能够用于PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒快速诊断的单一RT-PCR检测方法。结果显示:（1）最佳反应体系:5对引物浓度均为10μmo L/L,TGEV、PDCoV和PoRV C上下游引物各1μL,PEDV和PoRVA上下游引物1.5μL,模板各2μL,金牌Mi X（Green）补足25μL。（2）最佳反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;在51.0～60.5℃之间的退火温度条件下,PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一病毒RT-PCR均可扩增出特异的条带,但55.1℃45 s退火温度最佳;72℃45 s延伸,35个循环;72℃延伸10 min。（3）敏感性结果表明,上述5种病毒模板的最低核酸检测量分别为:PEDV 0.39 pg、TGEV 0.34 pg、PDCoV 0.35pg、PoRVA 0.37 pg和PoRV C 0.34 pg。2.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的建立在上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的五种病毒单一RT-PCR基础上,对PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR反应的体系进行调整,通过不断摸索模板和引物的用量、浓度以及退火温度的优化,并对五重RT-PCR的特异性、敏感性及重复性进行探索,建立了一种能够同时快速的鉴别PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒性疫病的五重RT-PCR检测方法。结果表明:（1）50μL体积是RT-PCR的最佳反应总体系。两步法的PCR体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,金牌Mi X（Green）补足50μL;一步法反应体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,2×1 Step Buffer 25μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 2μL,RNase free water 8.5μL。（2）反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;55.1℃45 s（退火）;72℃45s（延伸）,35个循环;72℃10min（延伸）是最佳反应条件。（3）特异性、敏感性和重复性试验结果表明:五重RT-PCR能扩增出PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的特异性片段,分别为799 bp、525 bp、271 bp、375 bp和184 bp,未扩增出CSFV、JEV、PCV2、PRV及正常细胞组织的DNA/RNA;五重RT-PCR中各种病毒的最低核酸检测量分别为:PEDV 39 pg、TGEV34 pg、PDCoV35 pg、PoRVA37pg、PoRVC 34 pg。3.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的初步应用应用所建立的猪主要消化道病毒五重RT-PCR检测方法对2017～2020年间采集自贵州省内不同地区、不同规模化养猪场、农户散养等的临床病料共计523份进行了相关的检测。通过对病料进行检测,比较多重RT-PCR与单一RT-PCR的检测情况,结果表明:来自贵州省不同猪场的523份样品中,阳性率分别为PEDV 26.96%（141/523）、PoRVA13.96%（73/523）、TGEV 1.72%（9/523）、PDCoV 1.53%（8/523）,未检测到PoRV C感染。PEDV+TGEV的二重感染阳性率为1.72%（9/523）,PEDV+PDCoV的二重感染阳性率为1.53%（8/523）,PEDV+PoRVA的二重感染阳性率为1.91%（10/523）,未检测到三重及以上的感染现象,五重RT-PCR检测结果与单一RT-PCR方法的检测结果一致。
陈基明[10]（2020）在《aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus,a MPV）主要引起鸡和火鸡的上呼吸道感染,造成蛋鸡产蛋率和蛋品质下降。近年发现a MPV对番鸭等其它禽类也存在致病性。a MPV单一感染致死率不高,但会导致免疫力下降,继发其它疾病,增加死亡率。目前除大洋洲外均出现a MPV感染的报道,该病严重威胁了世界范围内的养禽业。血清学调查表明目前包括广西在内的多个地区养鸡场的鸡群普遍存在a MPV感染,且不同品种、性别和用途的鸡群均感染严重,部分种鸡群阳性感染率甚至达到100%。a MPV分离较为困难,其感染鸡的临床症状、解剖病变又与传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）相似,传统的病理解剖观察很难区分。此外,近年来a MPV、IBV和NDV混合感染呈多发态势。因此,建立同时检测a MPV、IBV和NDV的诊断方法和了解该病在鸡群的流行情况非常重要。本课题组前期已建立了a MPV的RT-PCR检测方法,因此,本研究在此基础上建立a MPV、IBV及NDV三重RT-PCR检测方法并应用于临床样品检测,同时原核表达了a MPV N蛋白中亲水性和抗原性较好的保守区,纯化后作为包被抗原建立能够检测a MPV特异性抗体的通用型间接ELISA方法,具体如下。一、a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法的建立和应用根据Genbank收录的NDV的F基因序列设计一对特异性引物,结合本课题组已设计的a MPV及IBV通用引物,建立了能够同时检测a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法。对扩增条件进行优化,特异性试验、敏感性试验和重复性试验等结果表明了方法的可行性。结果显示三重RT-PCR方法能够特异地扩增a MPV、IBV及NDV,而IBDV、ILTV、REV、ALV、MDV、MDPV、DHAV、FADV、DTMUV、E.coli、Salmonella等扩增结果均为阴性;所建立的三重RT-PCR方法最低检出限为1 ng/μL的c DNA;重复性试验结果表明该方法重复性良好。应用建立的方法对220份临床样品检测,结果a MPV检测阳性率为10.45%（23/220）;IBV阳性率为56.4%（124/220）;NDV阳性率2.7%（6/220）。本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法,为养禽生产中三种常见多发的呼吸道疾病的同步快速诊断和疫情的监控提供了有力的技术支撑。二、禽偏肺病毒N蛋白的原核表达根据生物信息学软件对a MPV N蛋白氨基酸序列保守性、二级结构及B细胞抗原位点进行预测,选取较为保守、亲水性、抗原性好的N基因部分片段连入表达载体p ET32a-1中,转化大肠杆菌DE3细胞进行IPTG诱导表达,优化条件后大量表达,利用Ni-NTA树脂进行纯化,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示成功表达了N蛋白。a MPV N蛋白在原核表达系统中的成功表达为a MPV快速诊断技术的开发及基因工程疫苗的研制奠定了基础。三、禽偏肺病毒N蛋白间接ELISA方法的建立及应用应用以上纯化好的重组N蛋白作为包被抗原,经过一系列的条件优化,初步建立了基于N蛋白的间接ELISA方法,所建立ELISA方法与NDV、IBDV、AIV、ALV、MDV、IBV等阳性血清均无交叉反应,批内重复性试验最大变异系数为6.20%,批间重复性试验最大变异系数为8.25%,均小于10%。应用建立的N蛋白间接ELISA方法与商品化试剂盒对326份血清样品进行平行检测,结果表明所建立的N蛋白间接ELISA方法与商品试剂盒符合率为95.4%。对广西地区规模化养殖公司鸡群共960份血清样品进行a MPV抗体检测,结果表明a MPV抗体阳性率为94.06%。本研究为a MPV ELISA检测试剂盒研制打下了基础,同时为a MPV的早期诊断与流行病学调查建立了技术平台。综上所述,本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法;设计并原核表达保守性、抗原性、亲水性良好的通用型N蛋白;并且基于此蛋白建立了间接ELISA方法。本研究为常见多发的a MPV、IBV及NDV混合感染的快速诊断、疫情监测提供了良好的技术平台,为a MPV的早期诊断和流行病学调查奠定了扎实的技术基础。
二、RT-PCR技术常见问题的分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR技术常见问题的分析（论文提纲范文）
（1）儿童手足口病常用实验室诊断方法的评价研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 HFMD的流行现状 |
| 1.1.2 HFMD的疾病负担 |
| 1.1.3 肠道病毒的病原学特征 |
| 1.1.4 临床常用的肠道病毒实验室诊断方法 |
| 1.1.5 其他肠道病毒实验室诊断方法及其临床应用局限性 |
| 1.1.6 HFMD早期实验室诊断的临床意义 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 基于RT-PCR的分子实验对肠道病毒诊断效能的影响因素研究 |
| 1.2.2 ELISA法检测血清EV-A71 IgM抗体诊断效能的研究 |
| 1.3 尚未解决的科学问题及研究目的 |
| 1.3.1 尚未解决的科学问题 |
| 1.3.2 研究目的 |
| 1.3.3 研究的必要性 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 研究设计概述 |
| 2.1.1 主要研究内容 |
| 2.1.2 研究的技术路线 |
| 2.2 研究地点 |
| 2.3 研究对象 |
| 2.3.1 病例定义及纳入、排除标准 |
| 2.3.2 病例纳入及管理 |
| 2.3.3 病例资料收集 |
| 2.3.4 标本采集及转运 |
| 2.4 实验室检测 |
| 2.4.1 联合RT-PCR检测咽拭子标本 |
| 2.4.2 商品化real-time RT-PCR检测粪便标本 |
| 2.4.3 商品化ELISA试剂盒检测血清标本 |
| 2.5 统计分析 |
| 2.5.1 描述性统计分析 |
| 2.5.2 阳性检出率的统计分析 |
| 2.5.3 诊断一致性评价的统计分析 |
| 2.5.4 诊断效能评价的统计分析 |
| 2.6 质量控制 |
| 2.7 伦理审批 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 纳入病例的基本特征 |
| 3.1.1 病例的纳入 |
| 3.1.2 纳入病例的基本特征 |
| 3.2 标本采集、检测及诊断结果概况 |
| 3.2.1 标本采集及检测情况 |
| 3.2.2 病例的诊断结果 |
| 3.2.3 病例诊断结果的比较 |
| 3.3 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性评价 |
| 3.3.1 纳入分析病例的基本特征及诊断结果 |
| 3.3.2 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR对EV-A71和CVA16的阳性检出率及其影响因素 |
| 3.3.3 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性及其影响因素 |
| 3.4 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能评价 |
| 3.4.1 纳入分析病例的基本特征 |
| 3.4.2 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的阳性检出率及其影响因素 |
| 3.4.3 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能评价及其影响因素 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 研究小结 |
| 4.2 结果的比较和解释 |
| 4.2.1 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性 |
| 4.2.2 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能评价 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论与建议 |
| 5.2 创新性 |
| 5.3 研究结果的科学和公共卫生意义 |
| 5.4 局限性 |
| 5.5 未来研究展望 |
| 附录 |
| 附录1 手足口病病例住院调查表 |
| 附录2 感染科院内临床记录表 |
| 附录3 PICU院内临床记录表 |
| 附录4 出院结局记录表 |
| 附录5 主要仪器设备 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童手足口病的肠道病毒实验室诊断研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果简介 |
| 致谢 |
（2）2018年广州地区手足口病流行病学调查及柯萨奇病毒A组6型快速检测方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 2018 年广州地区HFMD流行病学调查研究 |
| 引言 |
| 材料及方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.HFMD病原学流行特征 |
| 2.肠道病毒流行月份分布情况 |
| 3.一般临床资料和实验室检查结果 |
| 4.CVA6、CVA10、CVA16 的遗传进化分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 基于重组酶聚合酶扩增技术的柯萨奇病毒A组6 型快速检测方法的建立与评价 |
| 引言 |
| 材料及方法 |
| 1.临床标本采集与病毒分离 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.RT-RPA-LFS检测方法的建立和优化 |
| 2.RT-RPA-LFS检测方法的灵敏度和特异性评价 |
| 3.RT-RPA-LFS检测方法的临床样本检测与评价 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 手足口病实验室分型检测方法的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）食源性多重耐药普通变形杆菌P3M环丙沙星和多粘菌素抗性调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 细菌耐药性问题 |
| 1.1.1 细菌耐药性的产生 |
| 1.1.2 细菌耐药性的挑战及危害 |
| 1.1.3 应对细菌耐药性问题的举措 |
| 第二节 环丙沙星及耐药性概述 |
| 第三节 多粘菌素及耐药性概述 |
| 第四节 变形杆菌概述 |
| 1.4.1 变形杆菌分类及特征 |
| 1.4.2 耐药变形杆菌 |
| 第五节 基因水平转移 |
| 1.5.1 基因水平转移机制 |
| 1.5.2 抗生素抗性基因水平转移 |
| 第六节 非编码RNA概述 |
| 1.6.1 非编码RNA的特性及作用机制 |
| 1.6.2 非编码RNA调控细菌耐药性 |
| 第七节 本课题选题依据、研究意义、研究内容及技术路线 |
| 1.7.1 选题依据与研究意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.7.3 技术路线 |
| 第二章 普通变形杆菌P3M多重耐药特性鉴定和进化分析 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 培养基配方 |
| 2.1.5 生物信息学分析软件 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 细菌基因组提取 |
| 2.2.2 普通变形杆菌P3M全基因组测序 |
| 2.2.3 细菌系统进化分析 |
| 2.2.4 最低抑菌浓度测定 |
| 2.2.5 部分抑菌浓度指数(FICI)测定 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 2.3.1 P3M基因组描述和鉴定 |
| 2.3.2 P3M药物敏感性分析 |
| 2.3.3 联合用药效果评价 |
| 2.3.4 变形杆菌属系统进化分析 |
| 2.3.5 P3M中介导多重耐药性的双组份系统的鉴定 |
| 2.3.6 P3M中可移动遗传元件的鉴定 |
| 第四节 本章小结 |
| 第三章 普通变形杆菌P3M中两个新型质粒的功能鉴定和进化分析 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基配方 |
| 3.1.5 生物信息学分析软件 |
| 3.1.6 PCR扩增引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 质粒的分离和测序 |
| 3.2.2 质粒转化 |
| 3.2.3 p3M-2A~*和p3M-2B~*质粒的构建 |
| 3.2.4 最低抑菌浓度测定 |
| 3.2.5 生存率实验 |
| 3.2.6 系统进化分析 |
| 3.2.7 质粒序列线性比对 |
| 3.2.8 细菌质粒提取 |
| 3.2.9 细菌总RNA的提取 |
| 3.2.10 细菌总RNA反转录为cDNA |
| 3.2.11 实时荧光定量PCR |
| 3.2.12 质粒消除实验 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 3.3.1 p3M-2A与p3M-2B质粒特征概述 |
| 3.3.2 p3M-2A与p3M-2B质粒对菌株环丙沙星抗性的影响 |
| 3.3.3 p3M-2A质粒功能鉴定 |
| 3.3.4 qnr D携带质粒的系统发育分析 |
| 3.3.5 p3M-2B质粒的可能形成过程 |
| 第四节 本章小结 |
| 第四章 普通变形杆菌P3M非编码RNA CsiR调控环丙沙星抗性研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基配方 |
| 4.1.5 生物信息学分析软件 |
| 4.1.6 PCR及qRT-PCR扩增引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 普通变形杆菌P3M非编码RNA测序 |
| 4.2.2 细菌基因组提取 |
| 4.2.3 目的DNA片段扩增 |
| 4.2.4 目的DNA片段纯化 |
| 4.2.5 细菌质粒提取 |
| 4.2.6 目的DNA片段与质粒双酶切反应 |
| 4.2.7 连接反应 |
| 4.2.8 大肠杆菌感受态细胞转化 |
| 4.2.9 菌落PCR验证 |
| 4.2.10 缺失突变菌株的构建 |
| 4.2.11 功能回补菌株的构建 |
| 4.2.12 细菌总RNA的提取 |
| 4.2.13 细菌总RNA反转录为cDNA |
| 4.2.14 实时荧光定量PCR |
| 4.2.15 最低抑菌浓度测定 |
| 4.2.16 生存率实验 |
| 4.2.17 微量热泳动实验 |
| 4.2.18 半衰期测定实验 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 4.3.1 参与环丙沙星抗性调控的非编码RNA的确定 |
| 4.3.2 CsiR参与环丙沙星抗性调控的靶标基因预测 |
| 4.3.3 CsiR与可能靶标基因emrB的互作位点分析 |
| 4.3.4 CsiR与靶标基因emrB的作用机制研究 |
| 4.3.5 CsiR与靶标基因emrB互作的进化分析 |
| 第四节 本章小结 |
| 第五章 普通变形杆菌P3M非编码RNA PsiR调控多粘菌素抗性研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与质粒 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基配方 |
| 5.1.5 生物信息学分析软件 |
| 5.1.6 PCR及qRT-PCR扩增引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 5.2.1 普通变形杆菌P3M非编码RNA测序 |
| 5.2.2 细菌基因组提取 |
| 5.2.3 目的DNA片段扩增 |
| 5.2.4 目的DNA片段纯化 |
| 5.2.5 细菌质粒提取 |
| 5.2.6 目的DNA片段与质粒双酶切反应 |
| 5.2.7 连接反应 |
| 5.2.8 大肠杆菌感受态细胞转化 |
| 5.2.9 菌落PCR验证 |
| 5.2.10 缺失突变菌株的构建 |
| 5.2.11 功能回补菌株的构建 |
| 5.2.12 细菌总RNA的提取 |
| 5.2.13 细菌总RNA反转录为cDNA |
| 5.2.14 实时荧光定量PCR |
| 5.2.15 最低抑菌浓度测定 |
| 5.2.16 生存率实验 |
| 5.2.17 微量热泳动实验 |
| 5.2.18 半衰期测定实验 |
| 第三节 结果与讨论 |
| 5.3.1 参与多粘菌素抗性调控的非编码RNA的确定 |
| 5.3.2 PsiR参与多粘菌素抗性调控的靶标基因预测 |
| 5.3.3 PsiR与可能靶标基因pgsA的互作位点分析 |
| 5.3.4 PsiR与靶标基因pgsA的作用机制研究 |
| 5.3.5 PsiR与靶标基因pgsA互作的进化分析 |
| 第四节 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 第一节 总结 |
| 第二节 论文创新点 |
| 第三节 展望 |
| 附录 突变株、回补株构建电泳图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
（4）长链非编码RNA RASSF8-AS1竞争性结合miR-664b-3p调控TLE1表达影响喉鳞状细胞癌的发生发展过程（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 RASSF8-AS1 的筛选及其在喉鳞状细胞癌中的表达情况 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RASSF8-AS1 对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 RASSF8-AS1 靶向miRNA的选择、鉴定及miR-664b-3p对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 miR-664b-3p在喉鳞癌中靶向调控的mRNA筛选、鉴定以及TLE1 对喉鳞状细胞癌细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）弥漫大B细胞淋巴瘤信号通路相关microRNA和蛋白质的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分: 弥漫大B细胞淋巴瘤差异microRNA的筛选及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分: 弥漫大B细胞淋巴瘤差异蛋白质的筛选及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分: hsa-miR-193a-3p靶向TCL1 调控PI3K/AKT信号通路影响弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡和周期的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 TCL1 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（6）实时荧光双重SRCA方法检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 沙门氏菌简介 |
| 1.2.1 沙门氏菌生物学特性 |
| 1.2.2 沙门氏菌流行病学分析 |
| 1.2.3 沙门氏菌特异性基因选择 |
| 1.3 志贺氏菌简介 |
| 1.3.1 志贺氏菌生物学特性 |
| 1.3.2 志贺氏菌流行病学分析 |
| 1.3.3 志贺氏菌特异性基因选择 |
| 1.4 食源性致病菌检测方法 |
| 1.4.1 传统检测方法 |
| 1.4.2 免疫学检测方法 |
| 1.4.3 分子生物学检测方法 |
| 1.4.4 生物传感器检测方法 |
| 1.5 跨越式滚环等温扩增技术 |
| 1.6 双重RF-SRCA方法 |
| 1.6.1 技术概要 |
| 1.6.2 染料选择 |
| 1.7 本研究的主要内容 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株 |
| 2.1.2 培养基与试剂 |
| 2.1.3 试验仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株的培养 |
| 2.2.2 基因组DNA的提取和检测 |
| 2.2.3 SRCA引物设计与筛选 |
| 2.2.4 引物的处理与保存 |
| 2.2.5 单重RF-SRCA预反应体系及条件 |
| 2.3 单重RF-SRCA反应条件和反应体系的优化 |
| 2.3.1 反应温度的优化 |
| 2.3.2 Mg~(2+)添加量的优化 |
| 2.3.3 dNTPs添加量的优化 |
| 2.3.4 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量的优化 |
| 2.3.5 引物添加量的优化 |
| 2.3.6 Bst DNA聚合酶添加量的优化 |
| 2.3.7 荧光染料添加量的优化 |
| 2.4 双重RF-SRCA可行性试验及引物优化 |
| 2.4.1 双重RF-SRCA可行性试验 |
| 2.4.2 双重RF-SRCA引物的优化 |
| 2.5 双重RT-PCR反应体系及反应程序 |
| 2.6 单重RF-SRCA扩增产物测序分析 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.8 灵敏度分析 |
| 2.8.1 单重RF-SRCA灵敏度分析 |
| 2.8.2 双重RF-SRCA灵敏度分析 |
| 2.8.3 双重RT-PCR灵敏度分析 |
| 2.9 人工污染乳制品中沙门氏菌和志贺氏菌的检出限分析 |
| 2.9.1 人工污染样品 |
| 2.9.2 单重RF-SRCA检出限分析 |
| 2.9.3 双重RF-SRCA检出限分析 |
| 2.9.4 双重RT-PCR检出限分析 |
| 2.10 实际样品中沙门氏菌和志贺氏菌检测 |
| 2.10.1 双重RF-SRCA方法和双重RT-PCR对实际样品进行检测 |
| 2.10.2 国标方法对实际样品进行检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA提取与检测 |
| 3.1.1 DNA模板的完整性验证 |
| 3.1.2 DNA浓度和纯度分析 |
| 3.2 RF-SRCA反应体系和反应条件的优化 |
| 3.2.1 反应温度的优化 |
| 3.2.2 Mg~(2+)添加量的优化 |
| 3.2.3 dNTPs添加量的优化 |
| 3.2.4 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量的优化 |
| 3.2.5 引物添加量的优化 |
| 3.2.6 Bst DNA聚合酶添加量的优化 |
| 3.2.7 荧光染料添加量的优化 |
| 3.3 确定双重RF-SRCA最终反应体系 |
| 3.3.1 双重RF-SRCA的可行性分析 |
| 3.3.2 双重RF-SRCA引物浓度优化 |
| 3.3.3 双重RF-SRCA最终反应体系 |
| 3.4 单重RF-SRCA扩增产物测序分析 |
| 3.5 RF-SRCA引物特异性分析 |
| 3.6 RF-SRCA的灵敏度分析 |
| 3.6.1 单重RF-SRCA灵敏度分析 |
| 3.6.2 双重RF-SRCA灵敏度分析 |
| 3.6.3 双重RT-PCR灵敏度分析 |
| 3.7 人工污染乳制品中沙门氏菌和志贺氏菌检出限分析 |
| 3.7.1 单重RF-SRCA检出限分析 |
| 3.7.2 双重RF-SRCA检出限分析 |
| 3.7.3 双重RT-PCR检出限分析 |
| 3.8 实际样品中沙门氏菌和志贺氏菌检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 硕士期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（7）甘蓝型油菜和拟南芥GLABRA3在花青素和种子油脂积累中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 十字花科芸薹属植物 |
| 1.1.1 油菜产业发展现状 |
| 1.1.2 拟南芥种子发育过程 |
| 1.2 植物种子油脂的代谢与调控 |
| 1.2.1 植物种子油脂代谢过程 |
| 1.2.2 影响植物种子油脂积累的因素 |
| 1.3 植物花青素的概述 |
| 1.3.1 植物花青素的生物学功能及应用 |
| 1.3.2 植物花青素的结构和分类 |
| 1.3.3 植物花青素的生物合成与调控 |
| 1.4 bHLH转录因子GL3 的功能研究 |
| 1.5 本研究的内容与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料和生长环境 |
| 2.1.1 植物材料及培养条件 |
| 2.1.2 拟南芥的种植 |
| 2.1.3 试验材料的获取 |
| 2.2 植物总RNA的提取和单链c DNA的合成 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 单链cDNA的合成 |
| 2.3 感受态细胞的制备 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.4 植物表达载体构建和拟南芥转基因植株获取 |
| 2.4.1 目的基因的克隆 |
| 2.4.2 植物表达载体的构建 |
| 2.4.3 拟南芥基因组DNA的提取 |
| 2.4.4 拟南芥突变体鉴定 |
| 2.4.5 拟南芥转基因植株的筛选和鉴定 |
| 2.5 蛋白质多序列比对和系统进化分析 |
| 2.5.1 GL3蛋白质的多序列比对 |
| 2.5.2 GL3蛋白质的系统进化分析 |
| 2.6 烟草叶片亚细胞定位 |
| 2.7 植物组织GUS染色 |
| 2.8 拟南芥叶片和种子表型分析 |
| 2.8.1 拟南芥叶片和种子花青素含量测定 |
| 2.8.2 拟南芥种子脂肪酸含量测定 |
| 2.9 转录组测序(RNA-seq) |
| 2.10 基因表达分析 |
| 第三章 在花青素生物合成和表皮毛形成过程中AtGL3下游靶标基因的全基因组鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 AtGL3基因的表达模式分析 |
| 3.2.2 拟南芥gl3突变体的基因型鉴定和表型分析 |
| 3.2.3 在花青素合成和表皮毛形成过程中AtGL3下游靶标基因的功能分析 |
| 3.2.4 参与幼嫩茎尖和正在伸展的真叶中花青素合成和表皮毛形成的基因表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BnGL3-1在花青素生物合成和表皮毛形成过程中的功能分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 GL3的蛋白多序列比对和系统进化分析 |
| 4.2.2 BnGL3-1的蛋白质亚细胞定位 |
| 4.2.3 BnGL3-1在拟南芥中的异位表达 |
| 4.2.4 BnGL3-1参与调控幼嫩茎尖和正在伸展的真叶中的花青素生物合成和表皮毛形成过程 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BnGL3-1和AtGL3 在种子油脂和花青素积累过程中的功能分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 AtGL3在种子中的表达模式分析 |
| 5.2.2 BnGL3-1和AtGL3 对种子形态和重量等表型的影响 |
| 5.2.3 BnGL3-1和AtGL3 参与调控种子油脂积累过程 |
| 5.2.4 BnGL3-1和AtGL3 参与调控种子花青素生物合成过程 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论和创新点 |
| 6.1.1 主要结论 |
| 6.1.2 创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）粮油黄曲霉与毒素同步检测及木霉阻控技术研究（论文提纲范文）
| 博士学位论文评阅 人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄曲霉毒素概述 |
| 1.1.1 黄曲霉毒素种类及其理化性质 |
| 1.1.2 黄曲霉毒素毒性及其危害 |
| 1.1.3 黄曲霉毒素限量标准 |
| 1.1.4 黄曲霉毒素生物合成 |
| 1.2 黄曲霉毒素检测技术研究进展 |
| 1.2.1 黄曲霉毒素薄层层析及仪器分析技术 |
| 1.2.2 黄曲霉毒素免疫分析技术 |
| 1.2.3 黄曲霉毒素生物传感器分析技术 |
| 1.2.4 黄曲霉毒素噬菌体展示介导免疫PCR检测技术 |
| 1.3 黄曲霉菌检测技术研究进展 |
| 1.3.1 黄曲霉菌概述 |
| 1.3.2 黄曲霉菌检测技术方法 |
| 1.4 黄曲霉及其毒素污染生物防控研究现状 |
| 1.4.1 生防微生物种类 |
| 1.4.2 生物防控作用机理 |
| 1.4.3 生防效果影响因子 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 粮油黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮RT-PCR同步检测技术研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 仪器与耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要缓冲液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 纳米抗体噬菌体扩增 |
| 2.3.2 同步免疫反应条件优化 |
| 2.3.3 双重RT-PCR反应条件优化 |
| 2.3.4 RT-PCR同步检测AFT和 ZEN的技术评价 |
| 2.3.5 实际样品中AFT和 ZEN的 RT-PCR同步检测 |
| 2.3.6 样品中毒素的HPLC法测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 RT-PCR同步检测AFT和 ZEN的原理 |
| 2.4.2 同步免疫反应的条件优化 |
| 2.4.3 扩增效率评估 |
| 2.4.4 RT-PCR同步检测AFT和 ZEN的技术评价 |
| 2.4.5 实际样品中AFT和 ZEN的 RT-PCR同步检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 包被羊抗鼠抗体IgG的优势 |
| 2.5.2 噬菌体介导的RT-PCR同步检测技术优势及应用前景 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 玉米黄曲霉毒素及其产毒菌RT-PCR同步检测技术研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 仪器与耗材 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要缓冲液及培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 纳米抗体噬菌体扩增 |
| 3.3.2 Nor-1参考基因制备 |
| 3.3.3 双重RT-PCR的反应条件优化 |
| 3.3.4 玉米中黄曲霉毒素RT-PCR检测标准曲线建立 |
| 3.3.5 玉米中黄曲霉菌RT-PCR检测标准曲线建立 |
| 3.3.6 黄曲霉毒素检测可靠性验证 |
| 3.3.7 黄曲霉菌检测可靠性验证 |
| 3.3.8 实际样品分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 双重RT-PCR反应条件优化 |
| 3.4.2 双重RT-PCR扩增效率 |
| 3.4.3 RT-PCR检测黄曲霉毒素的技术评价 |
| 3.4.4 RT-PCR检测黄曲霉菌的技术评价 |
| 3.4.5 RT-PCR技术在实际样品中同步检测的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 基于nor-1基因检测黄曲霉菌的特异性和可靠性 |
| 3.5.2 噬菌体介导的RT-PCR同步检测小分子污染物和微生物的优势及应用前景 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 花生黄曲霉及其毒素污染木霉菌阻控技术研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 仪器与耗材 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株来源及活化 |
| 4.3.2 木霉菌与黄曲霉菌相互作用关系研究 |
| 4.3.3 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌生长的影响研究 |
| 4.3.4 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌产毒的影响研究 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 木霉菌与黄曲霉菌生长速率 |
| 4.4.2 木霉菌与黄曲霉菌相互作用关系 |
| 4.4.3 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌生长的影响 |
| 4.4.4 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌产毒的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 粮油黄曲霉毒素污染木霉菌降解技术研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 仪器与耗材 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要溶液和培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 木霉菌株来源及鉴定 |
| 5.3.2 不同木霉菌降解AFB1的能力差异分析 |
| 5.3.3 超高效降解黄曲霉毒素的木霉菌株筛选 |
| 5.3.4 里氏木霉CGMCC3.5218降解黄曲霉毒素的作用机理研究 |
| 5.3.5 里氏木霉CGMCC3.5218 降解实际样品中AFT的应用研究 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 不同木霉菌降解AFB1的能力差异 |
| 5.4.2 超高效降解AFB1的木霉菌株筛选 |
| 5.4.3 里氏木霉CGMCC3.5218降解黄曲霉毒素的作用机理 |
| 5.4.4 里氏木霉CGMCC3.5218降解粮油产品中黄曲霉毒素的应用 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 不同木霉菌降解AFB1的能力差异 |
| 5.5.2 里氏木霉CGMCC3.5218对AFB1的作用机理 |
| 5.5.3 里氏木霉CGMCC3.5218的应用前景 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪主要消化道类病毒概述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.1 PEDV病原学特征及基因组结构 |
| 1.1.2 PEDV编码蛋白 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.2.1 TGEV病原学特征及基因组结构 |
| 1.2.2 TGEV编码蛋白 |
| 1.3 猪德尔塔冠状病毒 |
| 1.3.1 PDCoV病原学特征及基因组结构 |
| 1.3.2 PDCoV编码蛋白 |
| 1.4 猪轮状病毒 |
| 1.4.1 PoRV病原学特征及基因组结构 |
| 1.4.2 PoRV编码蛋白 |
| 1.4.3 PoRV分群 |
| 2 猪消化道类病毒分子生物学检测方法研究进展 |
| 2.1 猪消化道病毒性疫病常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.1 猪流行性腹泻病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.2 猪传染性胃肠炎病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.3 猪德尔塔冠状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.4 猪轮状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2 猪消化道病毒性疫病实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.1 猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.2 猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.3 猪德尔塔冠状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.4 猪轮状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.3 猪消化道病毒性疫病环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.1 猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.2 猪传染性胃肠炎病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.3 猪德尔塔冠状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.4 猪轮状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.4 猪消化道病毒性疫病重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.1 猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.2 猪传染性胃肠炎病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.3 猪德尔塔冠状病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.5 猪消化道病毒性疫病基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.1 猪流行性腹泻病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.2 猪传染性胃肠炎病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.3 猪轮状病毒因芯片检测方法研究进展 |
| 2.6 猪消化道病毒性疫病多重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.1 二重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.2 三重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.3 四重及以上PCR检测方法研究进展 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA及 PoRVC单重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒来源 |
| 1.2 病料来源 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病料的处理 |
| 2.3 病毒核酸的提取及cDNA模板的制备 |
| 2.4 病毒核酸的PCR扩增 |
| 2.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 2.5.1 目的基因的回收纯化 |
| 2.5.2 目的基因与pMD19-T载体的连接 |
| 2.5.3 重组质粒的转化 |
| 2.5.4 重组质粒的抽提及鉴定 |
| 2.6 单一病毒PCR检测方法的建立 |
| 2.6.1 单一病毒PCR反应体系的建立 |
| 2.6.2 单一病毒PCR反应条件的优化 |
| 2.6.3 单一病毒PCR的敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 3.2 单一病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 单一病毒RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.2.2 单一病毒RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.3 单一病毒的RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.2.4 单一病毒RT-PCR敏感性检测 |
| 3.3 单一RT-PCR检测方法对临床样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 规模化猪场猪消化道主要病毒五重RT-PCR方法的建立与初步应用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 模板来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 试验使用的主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.2 五重RT-PCR反应退火温度的优化 |
| 2.2.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 2.2.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.5 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.6 五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 2.3 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.1.1 五重RT-PCR最佳反应体系 |
| 3.1.2 五重RT-PCR退火温度的优化 |
| 3.1.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 3.1.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 3.1.5 五重RT-PCR反应重复性试验 |
| 3.2 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 4 猪消化道主要病毒五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 4.1 阳性对照的制备 |
| 4.2 阴性对照的制备 |
| 4.3 反应液的制备 |
| 4.4 试剂盒说明 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文 |
| 附录二 攻读硕士学位期间参与的课题 |
| 附录三 本文用到的部分英文缩写及含义说明 |
| 致谢 |
（10）aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽偏肺病毒的病原学 |
| 1.1.1 禽偏肺病毒的病原分类 |
| 1.1.2 禽偏肺病毒病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 禽偏肺病毒基因组成和结构蛋白 |
| 1.1.4 禽偏肺病毒的复制与侵染机制 |
| 1.2 禽偏肺病毒的流行病学 |
| 1.2.1 禽偏肺病毒的宿主与易感动物 |
| 1.2.2 禽偏肺病毒的传播与分布 |
| 1.3 禽偏肺病毒的临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 禽偏肺病毒的临床症状 |
| 1.3.2 禽偏肺病毒的病理变化 |
| 1.4 禽偏肺病毒的诊断方法 |
| 1.4.1 禽偏肺病毒的分离与培养 |
| 1.4.2 禽偏肺病毒的鉴定与鉴别诊断 |
| 1.4.2.1 禽偏肺病毒的电镜鉴定 |
| 1.4.2.2 禽偏肺病毒的分子生物学鉴定 |
| 1.4.2.3 禽偏肺病毒的血清学鉴定 |
| 1.4.2.4 禽偏肺病毒的鉴别诊断 |
| 1.5 禽偏肺病毒的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 禽偏肺病毒、传染性支气管炎病毒及新城疫病毒的三重RT-PCR方法的建立和应用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 毒株的增殖及RNA抽提 |
| 2.2.1.1 病毒的增殖 |
| 2.2.1.2 病毒核酸的提取及反转录 |
| 2.2.2 RT-PCR引物设计与合成 |
| 2.2.3 NDV通用引物的RT-PCR方法的扩增条件的优化 |
| 2.2.3.1 引物浓度范围的优化 |
| 2.2.3.2 退火温度范围的优化 |
| 2.2.3.3 特异性试验 |
| 2.2.3.4 敏感性试验 |
| 2.2.3.5 重复性试验 |
| 2.2.3.6 临床初步应用 |
| 2.2.4 三重RT-PCR鉴别方法的扩增条件优化 |
| 2.2.4.1 引物浓度范围的优化 |
| 2.2.4.2 退火温度范围的优化 |
| 2.2.5 三重RT-PCR特异性试验 |
| 2.2.6 三重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.2.7 三重RT-PCR重复性试验 |
| 2.2.8 三重RT-PCR的初步应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDV通用引物的RT-PCR方法的扩增条件的优化结果 |
| 2.3.1.1 NDV通用引物的RT-PCR方法的引物添加量优化结果 |
| 2.3.1.2 NDV通用引物的RT-PCR方法的退火温度优化结果 |
| 2.3.1.3 NDV通用引物的RT-PCR方法特异性试验结果 |
| 2.3.1.4 NDV通用引物的RT-PCR方法敏感性试验结果 |
| 2.3.1.5 NDV通用引物的RT-PCR方法重复性试验结果 |
| 2.3.1.6 NDV通用引物的RT-PCR方法的临床初步应用 |
| 2.3.2 三重RT-PCR引物添加量优化结果 |
| 2.3.3 三重RT-PCR退火温度优化结果 |
| 2.3.4 三重RT-PCR特异性试验结果 |
| 2.3.5 三重RT-PCR敏感性试验结果 |
| 2.3.6 三重RT-PCR重复性试验结果 |
| 2.3.7 三重RT-PCR的初步应用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽偏肺病毒N蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株的增殖及RNA抽提 |
| 3.2.1.1 病毒的增殖 |
| 3.2.1.2 病毒的提取及反转录 |
| 3.2.2 N蛋白重组表达质粒的构建 |
| 3.2.2.1 N基因的扩增 |
| 3.2.2.2 目的片段与表达载体的连接 |
| 3.2.2.3 连接产物的转化 |
| 3.2.2.4 重组表达质粒的抽提 |
| 3.2.2.5 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 N基因的原核表达 |
| 3.2.3.1 重组表达质粒转化表达菌株 |
| 3.2.3.2 重组N蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.2.3.3 重组N蛋白的Western Blot鉴定 |
| 3.2.3.4 重组N蛋白的诱导表达条件的优化 |
| 3.2.3.5 重组N蛋白的大量诱导表达 |
| 3.2.3.6 重组N蛋白的纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PCR扩增重组N基因的结果 |
| 3.3.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3.2.1 重组表达质粒的PCR及酶切鉴定结果 |
| 3.3.2.2 重组表达质粒的测序结果 |
| 3.3.3 SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.3.3.1 不同诱导时间蛋白表达结果 |
| 3.3.3.2 不同浓度诱导剂蛋白表达结果 |
| 3.3.3.3 重组N蛋白Western Blot结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 禽偏肺病毒N蛋白的间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 主要试剂的配制 |
| 4.1.3 样品来源 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 N蛋白的间接ELISA最佳条件的摸索 |
| 4.2.1.1 抗原包被浓度和血清检测浓度的摸索 |
| 4.2.1.2 抗原包被条件的摸索 |
| 4.2.1.3 封闭时间的摸索 |
| 4.2.1.4 一抗作用时间的摸索 |
| 4.2.1.5 酶标二抗浓度的摸索 |
| 4.2.1.6 酶标二抗作用时间的摸索 |
| 4.2.1.7 显色TMB底物反应时间的摸索 |
| 4.2.1.8 阴阳性临界值的确定 |
| 4.2.1.9 ELISA特异性试验 |
| 4.2.1.10 ELISA敏感性试验 |
| 4.2.1.11 ELISA重复性试验 |
| 4.2.2 间接ELISA与商品化试剂盒的比较 |
| 4.2.3 间接ELISA的临床应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 间接ELISA摸索结果 |
| 4.3.1.1 抗原包被浓度和血清检测浓度的摸索结果 |
| 4.3.1.2 抗原包被条件的摸索结果 |
| 4.3.1.3 封闭时间的摸索 |
| 4.3.1.4 一抗作用时间的摸索 |
| 4.3.1.5 酶标二抗浓度的摸索 |
| 4.3.1.6 酶标二抗作用时间的摸索 |
| 4.3.1.7 显色TMB底物反应时间的摸索 |
| 4.3.1.8 阴阳性临界值的确定 |
| 4.3.1.9 根据摸索出的最佳条件确定间接ELISA的步骤 |
| 4.3.1.10 ELISA特异性试验 |
| 4.3.1.11 ELISA敏感性试验 |
| 4.3.1.12 ELISA重复性试验 |
| 4.3.2 间接ELISA与商品化试剂盒的比较 |
| 4.3.3 间接ELISA的临床应用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
四、RT-PCR技术常见问题的分析（论文参考文献）
- [1]儿童手足口病常用实验室诊断方法的评价研究[D]. 张天琛. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]2018年广州地区手足口病流行病学调查及柯萨奇病毒A组6型快速检测方法的建立[D]. 谢佳. 广州医科大学, 2021(02)
- [3]食源性多重耐药普通变形杆菌P3M环丙沙星和多粘菌素抗性调控机制研究[D]. 张宏扬. 南开大学, 2021(02)
- [4]长链非编码RNA RASSF8-AS1竞争性结合miR-664b-3p调控TLE1表达影响喉鳞状细胞癌的发生发展过程[D]. 刘涛. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]弥漫大B细胞淋巴瘤信号通路相关microRNA和蛋白质的筛选及功能研究[D]. 高海霞. 新疆医科大学, 2021(08)
- [6]实时荧光双重SRCA方法检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌研究[D]. 陈秀玲. 河北农业大学, 2020(05)
- [7]甘蓝型油菜和拟南芥GLABRA3在花青素和种子油脂积累中的功能分析[D]. 高晨浩. 西北农林科技大学, 2020
- [8]粮油黄曲霉与毒素同步检测及木霉阻控技术研究[D]. 任显凤. 中国农业科学院, 2020
- [9]猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用[D]. 郭倩妤. 贵州大学, 2020
- [10]aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用[D]. 陈基明. 广西大学, 2020(02)