一、大鼠耳蜗α_(1D)L-型电压门控钙通道组织特异性异构体的剪切方式及其意义（论文文献综述）
樊永亮[1]（2021）在《中国荷斯坦牛乳腺组织转录组分析及脂肪酸延长和脱饱和相关miRNAs的筛选和功能研究》文中研究表明本课题以中国荷斯坦牛为试验对象,首先,测定分析了一个泌乳周期内牛乳中主要成分的变化规律（预产期7d;产犊后30 d;产犊后90 d;产犊后180 d;产犊后270 d;产犊后305 d）;而后,利用测序技术和生物信息学分析方法鉴定了乳腺发育不同时期的差异表达基因（DEGs）、差异表达microRNAs（DE miRNAs）以及差异信号通路;另外,根据牛乳中主要成分的变化规律预测与脂肪酸代谢相关的DE miRNA和DEGs组合;最后,从细胞水平探究DE miRNA和DEGs组合（miR-193a-5p和FADS1、miR-3 78d和FADS2,miR-128和ELOVL6）在牛乳脂肪酸代谢过程中的分子机制。研究结果如下:（1）相邻时间乳腺组织RNA-seq数据表明:-7vs.30d存在2421个DEGs,其中1073 个 DEGs 上调,1348 个 DEGs 下调;30 vs.90 d 存在 33 个 DEGs,其中 15 个 DEGs上调,18个DEGs下调;90 vs.180 d存在313个DEGs,其中206个DEGs上调,107个 DEGs 下调;180 vs.270 d 存在 718 个 DEGs,其中 293 个 DEGs 上调,425 个 DEGs下调;270 vs.305 d存在1207个DEGs,其中828个DEGs上调,379个DEGs下调。研究发现随着泌乳时期的推进,乳腺细胞内进行着剧烈且复杂的基因表达调控。（2）基于所有时期乳腺组织样品的RNA-seq数据,本试验首次利用加权基因共表达网络（WGCNA）分析,鉴定了与泌乳时期、产奶量和主要乳成分含量相关的10个显着性模块。利用基因本体论（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析对该10个重要模块内的DEGs进行分析,结果表明半乳糖代谢途径是产奶量和乳糖合成的潜在候选通路。在泌乳初期,细胞内离子转运更为频繁,细胞增殖变得活跃。在哺乳后期,细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）可能参与细胞的凋亡。鞘脂信号途径是乳脂合成的潜在候选通路。（3）相邻时间节点乳腺组织miRNA-seq数据表明:-7 vs.30 d组存在45个DE miRNAs,其中 31 个 miRNAs 上调,14 个 miRNAs 下调;30 vs.180 d 组存在 13 个 DE miRNAs,其中 6 个 miRNAs 上调,7 个 miRNAs 下调;180 vs.305 d 组存在 19 个 DE miRNAs,其中7个miRNAs上调,12个miRNAs下调。（4）根据不同时期DEGs和DE miRNAs的数据,构建乳腺组织DE miRNA-DEGs表达互作网络。确定 miR-193a-5p-FADS1、miR-378d-FADS2 和 miR-128-ELOVL6 三个潜在的调控关系对用于后续研究。（5）采用双荧素酶报告基因检测、荧光定量PCR（qRT-RCR）、蛋白免疫印记法（WB）、甘油三酯（TAG）测定和脂肪酸分析等方法对miR-193a-5p及其潜在的靶基因FADS1的功能进行了研究。双荧光素酶报告检测显示,在BMECs中miR-193a-5p靶向FADS1的3’UTR区域,从而调控其表达水平。qRT-PCR和Western blotting结果表明,BMECs中FADS1的表达水平与miR-193a-5p的表达水平呈负相关,且无论是基于 mRNA 水平还是蛋白水平。TAGs、C20:5n3（EPA）、C22:5n3（DPA）和 C22:6n3（DHA）的含量与BMECs中FADS1的表达呈正相关（P≤0.05）,与miR-193a-5p的表达呈负相关（P≤ 0.05）。本研究证实miR-193a-5p通过靶向FADS1调控BMECs中多不饱和脂肪酸（PUFAs）的代谢,显示miR-193a-5p和FADS1是提高乳中PUFAs含量的潜在因素。（6）采用双荧素酶报告基因检测、用qRT-RCR、WB、TAG测定和脂肪酸分析等方法对miR-378d及其潜在靶基因FADS2的功能进行了研究。双荧光素酶报告基因检测证实了 BMECs中miR-378d靶向FADS2的3’UTR区域,从而调控其表达水平。qRT-PCR和WB的结果表明,在BMECs中FADS2的表达水平与miR-378d的表达水平呈负相关。TAG、花生四烯酸（AA）和DHA的含量FADS2的表达呈显着正相关,与miR-378d的表达呈显着负相关。本研究证实miR-378d通过靶向FADS2调控BMECs中PUFAs的代谢,显示了 miR-378d和FADS2是提高牛乳中PUFAs含量的潜在因素。（7）采用双荧素酶报告基因检测、qRT-RCR、WB、TAG测定和脂肪酸分析等方法对miRNA-128及其潜在的靶基因ELOVL6的功能进行研究。双荧光素酶报告基因检测证实了 BMECs中ELOVL6是miR-128的靶基因。qRT-PCR和WB数据表明,无论是ELOVL6的mRNA水平还是蛋白水平,均与BMECs中miR-128的表达呈负相关。TAG、硬脂酸（SA）和油酸（OA）的含量与BMECs中ELOVL6的表达呈显着正相关,与miR-128的表达呈显着负相关。本研究首次证实miR-128通过靶向ELOVL6调控BMECs中脂肪酸的代谢,显示miR-128和ELOVL6是提高牛乳中长链脂肪酸（LCFAs）含量的潜在因素。综上所述,本研究揭示了奶牛乳腺组织基因和miRNA在不同泌乳时期的表达差异,在细胞水平验证了与泌乳相关且具有潜在靶向关系的DE miRNAs-DEGs组合,为厘清奶牛乳腺脂类合成、代谢机制,实现乳成分定向遗传调控,生产优质原料奶奠定基础。
杜智会[2]（2019）在《Cav1.3钙离子通道蛋白和LaminB1核纤层蛋白在大鼠耳蜗发育阶段的表达及作用》文中提出第一部分:新生SD大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及Cav1.3、LaminB1蛋白的表达目的:建立新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞（MCs）体外培养体系,探讨Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白在原代培养的新生大鼠边缘细胞中是否表达。方法:选用新生Sprague Dawley乳鼠（p0-p3）为实验对象,断头处理后在解剖显微镜下分离外侧壁,眼科剪剪切成微小的组织块,利用酶消化法将细胞悬液接种在六孔板上。利用含2%胎牛血清的动物上皮培养基培养,隔天换液。吹打纯化后制成细胞爬片,采用免疫荧光法检测上皮细胞特异性角蛋白CK-18、Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白的表达。结果:倒置光学显微镜下,24小时内可见大部分接种的细胞团块贴壁良好。培养第4-5天时,多角形的边缘细胞和梭形的成纤维细胞混合生长。MCs呈多角形,大小不一,颜色较暗,界限清楚,细胞之间连接紧密,形成典型的铺路石样外观。7-9天时,数百个多角形的边缘细胞以及周围的液体区域形成“dome”结构。14天后,多角形细胞体积变大,胞质内颗粒样物质增多,出现多核或者大核,细胞骨架明显,直至崩解。免疫细胞化学法检测细胞角蛋白CK-18、Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白表达阳性。结论:成功建立了新生大鼠血管纹边缘细胞体外培养体系,为研究边缘细胞的生理功能奠定了技术基础。经过免疫细胞化学实验首次证实了新生大鼠的边缘细胞具有表达Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白的能力,初步揭示了Cav1.3、LaminB1在耳蜗发育中扮演一定的角色,为后续实验奠定了理论基础。第二部分:Cav1.3钙离子通道蛋白在SD大鼠耳蜗组织中的发育性表达目的:研究Cav1.3钙离子通道在新生大鼠耳蜗外侧壁和基底膜发育过程中的表达变化,探讨其在听觉生理过程中的作用。方法:取不同发育时期（0天、7天、14天、21天）SD大鼠为实验对象。利用免疫荧光组织化学染色法、逆转录聚合酶连反应法、实时定量PCR法检测Cav1.3在耳蜗外侧壁（血管纹和螺旋韧带）和基底膜（包括内、外毛细胞）的蛋白以及m RNA水平的表达含量。结果:免疫荧光和逆转录聚合酶连反应显示:Cav1.3钙离子通道在内外毛细胞、血管纹和螺旋韧带均有表达。实时定量PCR法证明Cav1.3钙离子通道在耳蜗外侧壁和基底膜的表达随着发育逐渐增多。结论:Cav1.3钙离子通道在SD大鼠耳蜗中的表达含量随发育逐渐增多。Cav1.3表达量的上调可能与耳蜗的发育、听力的形成、内耳钙离子的稳态、耳蜗内电位（EP）的产生和调节以及听觉功能的正常发挥密切相关。本研究的实验结果为进一步阐明Cav1.3钙离子通道在听觉系统中的作用提供了理论基础。第三部分:Lamin B1蛋白在新生大鼠耳蜗中的发育性表达及意义目的:Lamin B1是一种有效的调节因子,在细胞增殖、细胞分化、神经元细胞迁移和大脑发育等方面有重要的作用。我们旨在研究出生后大鼠耳蜗的形态变化和Lamin B1在耳蜗发育阶段的年龄相关性表达,探讨Lamin B1蛋白与耳蜗发育以及听觉功能的关系。方法:使用新生Sprague-Dawley大鼠（p0、p7、p14、p21）为实验模型。在显微镜下分别解剖分离四个发育阶段的耳蜗膜迷路组织:血管纹（STV,包括螺旋韧带,下同）,基底膜（BM,包括Corti器官,下同）和螺旋神经节（SGC）。采用HE染色和电镜观察耳蜗发育过程中的形态变化,并且应用免疫荧光、实时定量PCR和免疫印迹技术从m RNA和蛋白质水平检测Lamin B1在四个发育阶段耳蜗组织中的表达变化。结果:HE染色结果显示耳蜗基底膜、血管纹、螺旋神经节在出生21天内经历了从不成熟到成熟的演变。免疫荧光法证明各发育阶段耳蜗内的Lamin B1主要分布于内外毛细胞、K?lliker器官、前庭膜、螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带。刚出生时荧光强度达到峰值,而后开始减弱,14天时迅速减弱,21天时荧光强度最低。另外,Western blot和RT-PCR结果证明Lamin B1的蛋白和m RNA在耳蜗组织（外侧壁、螺旋神经节、基底膜）中的相对表达量,随着发育均逐渐减少。结论:耳蜗在发育过程中经历了许多典型的形态学改变。Lamin B1在耳蜗组织中的表达含量也随着发育逐渐变化,与听觉形成的时间匹配。表明Lamin B1可能通过调节耳蜗结构的发育促进了听觉功能的发育和形成。另外,Lamin B1和Cav1.3在耳蜗中的分布相似,而且在发育过程中都发生了调节性变化,提示两种蛋白在耳蜗中有相似的作用,两者均参与了听觉发育及形成机制,也进一步证明了Lamin B1在耳蜗中也扮演重要的角色。第四部分:核纤层蛋白Lamin B1在大鼠耳蜗中的选择性表达及作用目的:Lamin B1是核纤层的重要组成成分,能够有效调控细胞增殖和细胞分化。本实验旨在研究Lamin B1在大鼠耳蜗不同组织中的表达差异并探讨其与听觉功能的关系。方法:以不同发育阶段（p0、p7、p14、p21）的SD大鼠为研究对象。应用免疫荧光法检测Lamin B1在大鼠耳蜗不同组织中的分布差异,采用Western blot和实时定量PCR检测在整个发育阶段,Lamin B1蛋白和m RNA在耳蜗基底膜（BM,包括Corti器官,下同）、螺旋神经节（SGC）和血管纹（STV,包括螺旋韧带,下同）中的表达变化。结果:免疫荧光染色显示Lamin B1主要分布于毛细胞（HCs）、螺旋神经节、血管纹、螺旋韧带（SL,spiral ligament）、前庭膜（RM）和螺旋缘（LLS）。出生0-14天,Lamin B1基因的m RNA在不同耳蜗组织之间的表达没有差异。出生14天时,Lamin B1蛋白水平在螺旋神经节和基底膜中的表达比血管纹和螺旋韧带多,但是螺旋神经节和基底膜的Lamin B1表达含量没有统计学差异。Western blot和PCR结果均表明出生21天时Lamin B1在大鼠耳蜗中的分布具有组织特异性,螺旋神经节最多,基底膜次之,而缺乏神经细胞的血管纹与前两者相比则表达量较少。结论:初步揭示了Lamin B1在发育时期不同耳蜗组织中的表达模式,指出Lamin B1在成年大鼠耳蜗组织中的表达具有组织特异性,可能与听神经细胞和听觉的发育及功能的发挥有密切的关系。另外,Lamin B1耳蜗中的选择性表达模式和Cav1.3相同,进一步证明了Lamin B1在耳蜗中与关键离子通道蛋白有一定关系,并在听觉发育及形成机制中具有重要作用。
祁繁,陈金,褚汉启[3]（2019）在《L型钙离子通道的生物学特性及其在听觉功能中的作用》文中研究指明电压门控性钙离子通道（voltage-gatedcalciumchannel,VGCC）是钙内流的主要途径,依据电生理和药理学特性可以分为L、N、P/Q、R和T五型,能被二氢吡啶类（dihydropyridines,DHPs）拮抗的VGCC通道属于L-型钙离子通道(L-type Ca2+ channels,LTCCs)。作为钙离子通道中的重要一
全超[4]（2018）在《PKB的新型底物SPEG在心脏中的功能研究》文中指出近年来,二型糖尿病（type 2 diabetes）成为全球范围内威胁人类健康的一种内分泌代谢紊乱疾病,引起了广泛的关注。该疾病往往会伴随着多种并发症的发生,其中糖尿病心脏病是造成患者死亡的主要原因。因此,对糖尿病心脏病发病机制的研究非常重要,可以为临床治疗提供相关的理论依据。胰岛素抵抗是二型糖尿病的主要特征,而在胰岛素抵抗的心肌细胞中,由于肌浆网/内质网钙离子ATP酶2a（SERCA2a）功能的失调,细胞中钙离子稳态出现了异常。钙离子对维持心肌细胞的正常功能至关重要,钙离子稳态的异常通常会造成心功能不全、心律失常等多种心脏疾病的发生。然而,为什么胰岛素抵抗会降低SERCA2a的功能仍然不是很清楚。在本文当中,我们对胰岛素处理的小鼠心脏进行蛋白质组学分析鉴定出了一个新的胰岛素/蛋白激酶B（insulin/PKB）的底物——横纹肌特异性表达的蛋白激酶（SPEG）。并通过多种方式证明在胰岛素处理后SPEG可以直接被PKB磷酸化。由PKB介导的SPEG的磷酸化会激活SPEG的第二个激酶结构域（SK2）,从而磷酸化SERCA2a并促进SERCA2a的寡聚化,最终可以促进细胞胞浆中钙离子回流到内质网/肌浆网中。此外,Speg心脏特异性敲除小鼠和无法被PKB磷酸化的Speg3A突变小鼠都表现出心功能不全,SERCA2a的磷酸化和寡聚化水平都显着性降低,且它们的心肌细胞中钙离子回流速度显着性的降低。这些结果表明PKB-SPEG信号通路对维持心脏功能非常重要,主要是通过影响心肌细胞中由SERCA2a介导的钙离子回流来实现的。为了验证该机制的重要性,我们利用了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖小鼠模型进行实验。与预期一样,高脂饮食会导致小鼠心脏功能的减弱,与此同时,我们发现在高脂饮食的小鼠心脏中SPEG的蛋白水平以及SERCA2a的磷酸化水平都出现显着性的降低。以上的这些结果不仅揭示了心肌细胞中一个新的调控钙离子稳态的分子机制,也对临床处理糖尿病心脏病以及心衰具有一定的治疗意义。
周邮[5]（2018）在《听觉发育期内耳钠离子通道的分子特质及其生理功能调控机制》文中认为自发性电活动是哺乳动物感官系统早期发育阶段的共性特征,精细调控感觉信息处理神经回路成熟。听觉形成前,起源于内耳毛细胞的自发动作电位（spontaneous action potential,sAP）,致螺旋神经节（SGNs）爆发式放电活动,并高精度地各级传递至大脑听觉中枢。积累资料提示,毛细胞sAP由Cav1.3介导的内向钙电流、外向延迟整流钾电流和小电导Ca2+激活钾电流协同调控。然而,作为动作电位上升相主要贡献者的电压门控钠通道（VGSCs）却鲜被关注,其分子特质、表达模式、门控特性及生理调控机制等前沿学术疑题未知。本论文研究工作聚焦:1)九种已知VGSC亚型（Nav1.1-1.9）α亚基的mRNA在听觉发育期内耳感觉上皮被检测到,VGSC亚型α亚基的全长序列被克隆解析。序列比对分析,Nav1.1α和Nav1.4α与小鼠其他组织表达序列相同,其余7个VGSC亚型α亚基编码序列经历转录后调控修饰:选择性剪切与RNA编辑,产生一系列在VGSC各功能区域呈散发性的突变位点,形成了结构多样性的亚型变体,被命名为耳蜗型钠通道（CbmNav1.x）。2)九种VGSC亚型α亚基蛋白在IHCs与OHCs中均被检测到,提示两类毛细胞的VGSCs亚型组合表达模式相同。顶-底回感觉上皮差异基因表达谱数据显示,Nav1.5α在顶回感觉上皮表达量较高,Nav1.1α与β4亚基倾向于富集在底回感觉上皮。经单细胞水平定量精细分析,IHCs与OHCs的九种VGSC亚型α亚基表达量呈现时程和方位相关性。IHCs中Nav1.7α与Nav1.9α表达量较高,两者呈相似的动态变化趋势,出生后第8天mRNA表达量达到峰值,其余7个VGSCs表达量则相对较低,但具各自独特的变化趋势。OHCs中Nav1.7α表达量最高且整体呈上升趋势,出生后第2天与第12天分别到达峰值。其余8个VGSC亚型α亚基表达量极低,由此推断,OHCs钠电流主要由Nav1.7贡献。同时,VGSC亚型的选择性组合和时空特征性分布可能是发育期毛细胞sAP动态调节的重要生理基础。3)外源表达两种耳蜗型Nav1.7变体:CbmNav1.7a与CbmNav1.7b,均检测不到钠电流。对此,相关突变体功能鉴定揭示了,一个由U-to-CRNA编辑介导的新型Nav1.7“功能丧失”突变:位于Domain Ⅱ S5与S6片段胞外连接环上的氨基酸残基替换C（934）R。此外,CbmNav1.7b Domain Ⅲ的部分S3片段与S4片段缺失,编码不完整通道蛋白。推测上述氨基酸替换与片段缺失很可能是钠通道的内源保护调控机制。由此推论,毛细胞钠电流可能由CbmNav1.7a（C934）主导。为验证此推论的合理性,首当其冲地必须验证其门控特性。结果表明,与野生型Nav1.7比较,CbmNav1.7a（C934）的功能漂移,四个位点氨基酸残基替换/缺失以单独或组合方式调节通道动力学特性,致使通道适于在阈值下膜电位开放,调控自发性电活动。4)典型的电压依赖性钠电流在发育期内毛细胞（IHCs）与外毛细胞（OHCs）中均能被检测到。电流钳记录显示,OHCs记录不到自发动作电位,电流刺激（70 pA/90pA,400 ms）仅引起单峰发放,而IHCs可记录到连续自发放的动作电位,两者迥异可能归因于OHCs缺少介导sAP持续发放的SK2通道。Ca2+-free外液孵育可消除IHCs自发动作电位,提示毛细胞自发电活动是钙依赖性。500 nM TTX外液孵育可降低sAP发放频率,但并不影响sAP的幅度。动作电位时空参数分析,500 nM TTX外液孵育减少诱发动作电位（evoked action potential,eAP）上升相的最大上升速率与阈下去极化相的上升速率,增加阈值电位时的峰宽。换言之,钠电流减小到达动作电位阈值的时间、增加发放频率。结果清晰地提示,在体情况下,发育期IHCs钠电流通过调整自发电活动频率,调节神经递质量子释放速率,参与听觉发育调控。
刘丰[6]（2014）在《14-3-3蛋白调控Cav2.2通道膜转运机制》文中研究说明研究目的:电压门控钙离子通道（voltage-gated calcium channel,Cav）对于维持可兴奋细胞钙稳态及其正常结构和生理功能具有重要作用。Cav膜表达的调控正日益受到关注,其孔道结构成分a1亚单位的膜转运及在缺乏Cav辅助亚单位的条件下其膜转运的变化和机制,目前仍不清楚。本研究探讨了14-3-3蛋白在Cav2.2通道膜转运过程中的作用及其机制。研究内容:14-3-3蛋白是否调控及如何调控Cav2.2通道膜转运,探索14-3-3蛋白对Cav2.2通道膜转运的影响及其转运途径和相关的可能机制。研究方法:逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测ts A-201细胞和小鼠脑中各类内源性Cav通道辅助亚单位m RNA的表达情况;免疫印迹、免疫共沉淀方法研究14-3-3蛋白与Cav2.2钙通道孔道结构成分a1B亚单位C末端片段之间的相互作用;细胞免疫荧光染色及激光共聚焦技术,观察Cav2.2α1B以及Cav2.2α1B C末端片段的质膜表达情况,探索14-3-3蛋白对Cav2.2α1B膜转运的影响及可能作用机制;单细胞膜片钳电生理技术检测ts A-201细胞上转染的Cav2.2α1B通道电流密度及原代培养的海马神经元上的Cav2.2道电流密度,从功能角度进一步观察14-3-3蛋白对Cav2.2α1B膜表达的影响以及Cavb亚单位与14-3-3蛋白协同调控Cava1膜表达的可能性。结果:在缺乏Cav辅助亚单位条件下,14-3-3τ增强Cav2.2α1B膜表达水平,而表达14-3-3蛋白抑制肽（p SCM138）阻断14-3-3蛋白与Cav2.2α1B之间的相互作用,则会抑制14-3-3蛋白增强Cav2.2α1B膜表达水平效应;Cav2.2α1B C末端存在一段内质网滞留信号,14-3-3蛋白能够影响包含此内质网滞留信号序列的Cav2.2α1B C末端片段（CT1,aa1706-1940）而改变其膜表达水平,却不影响无此信号序列的CT2（aa2102-2220）;14-3-3蛋白屏蔽内质网滞留信号从而增强CT1膜表达水平这一现象在被p SCM138阻断两者之间的相互作用时消失;无论在细胞系还是在培养的海马神经元,14-3-3蛋白与Cavb亚单位均能够协同调控Cav2.2膜表面表达水平。结论:14-3-3蛋白通过屏蔽Cav2.2α1B C末端近端的内质网滞留信号来促进Cav2.2通道膜转运,且其能够与Cavb辅助亚单位协同调控Cav2.2通道膜表达。
肖新敏[7]（2014）在《透骨草杀虫活性成分及其作用机理研究》文中指出透骨草（Phryma leptostachya L.），为透骨草科透骨草属多年生草本植物，广泛分布于喜马拉雅山脉、北美洲和亚洲东部，在东亚一直被用作传统的杀虫植物。我国主要分布在东北、华北及长江流域各地。本论文以透骨草为研究对象，系统研究了其杀虫活性及活性成分，并对其主要杀虫活性成分双氧木脂素A的作用机理进行了初探。主要研究结果如下：1.系统评价了石油醚、乙酸乙酯和甲醇超声提取物的杀虫活性。结果表明，三种提取物对供试的粘虫（Mythimna separate）幼虫、家蝇（Musca domestica）成虫及淡色库蚊（Culex pipiens pallens）幼虫有明显的毒杀活性，对3龄粘虫幼虫8h的胃毒麻醉中浓NC50分别为1690μg/mL、6240μg/mL和11390μg/mL，8h的触杀麻醉中量ND50分别为2.26μg/头、7.20μg/头和24.35μg/头；对家蝇成虫24h的胃毒致死中浓LC50分别为1580μg/mL、2940μg/mL和4990μg/mL；对家蝇成虫24h触杀致死中量LD50分别为1.80μg/头、3.32μg/头和5.56μg/头；对4龄淡色库蚊幼虫24h LC50分别为3.23μg/mL、5.24μg/mL和61.86μg/mL。对小菜蛾（Plutella xyllostella）幼虫和豆蚜（Aphis craccivora）无翅成蚜没有明显的毒杀作用。2.以活性追踪为指导，采用多级硅胶柱层析、凝胶柱层析及RP-HPLC等方法，从透骨草甲醇提取物中分离出5个杀虫活性化合物。采用NMR、UV及HR-ESI/MS等技术对其中4个化合物进行了结构鉴定，4个化合物均是具有二氧双环辛烷骨架的双骈四氢呋喃型木脂素，分别为透骨草灵-I、透骨草灵B、双氧木脂素E及双氧木脂素A，其中透骨草灵B为首次报道的新化合物，双氧木脂素E首次从透骨草中分离得到。3.杀虫活性测定结果表明，（1）透骨草灵-I对3龄粘虫幼虫只具有麻醉活性，其8h麻醉中浓NC50为2580μg/mL，对4龄淡色库蚊幼虫有一定的毒杀活性，24h毒杀致死中浓LC50为1.21μg/mL。（2）透骨草灵B对3龄粘虫幼虫和4龄淡色库蚊幼虫均有一定的毒杀作用，对3龄粘虫幼虫24h胃毒致死中浓LC50为490μg/mL，对4龄淡色库蚊幼虫24h毒杀LC50为0.69μg/mL。（3）双氧木脂素E对多种供试试虫有一定的杀虫活性，对3龄粘虫幼虫24h胃毒LC50为53μg/mL，24h触杀LD50为0.26μg/头；对3龄槐尺蠖（Semiothisa cinerearia）幼虫24h胃毒LC50为1680μg/mL，24h触杀LD50为1.33μg/头；对家蝇成虫24h胃毒LC50为970μg/mL，24h触杀LD50为1.12μg/头；对4龄淡色库蚊幼虫24h毒杀LC50为0.15μg/mL；对美洲大蠊（Periplaneta americana）成虫48h LD50为7.28μg/头。（4）双氧木脂素A对多种供试试虫有很强的杀虫活性，对3龄粘虫幼虫24h胃毒LC50为35μg/mL，24h触杀LD50为0.09μg/头；对3龄槐尺蠖幼虫24h胃毒LC50为66μg/mL，24h触杀LD50为0.049μg/头；对家蝇成虫24h胃毒LC50为39μg/mL，24h触杀LD50为0.047μg/头；对4龄淡色库蚊幼虫24h毒杀LC50为0.025μg/mL；对美洲大蠊成虫48h LD50为4.98μg/头。4个化合物对小菜蛾幼虫和豆蚜无翅成蚜没有明显的毒杀作用。4.症状学观察表明，以LD90剂量双氧木脂素A点滴处理6龄粘虫幼虫和家蝇成虫后，粘虫幼虫麻醉、部分试虫不自主肌肉收缩、震颤，直至死亡；家蝇成虫很快兴奋，接着麻醉直至死亡；美洲大蠊成虫先是重心抬高、腹部屈曲，随后麻醉直至死亡。5.双氧木脂素A对粘虫头部ATP酶的测定结果表明，双氧木脂素A抑制了5龄粘虫头部Na+-K+-ATPase活性，激活了Ca2+-Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性。离体条件下双氧木脂素A对Na+-K+-ATPase最大的抑制率为32.77%，活体条件下最大的抑制率为59.72%；离体条件下对Ca2+-Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase最大激活率分别为33.48%、30.34%，活体条件下对Ca2+-Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase最大的激活率分别为29.72%、28.83%。离体条件下对三种ATP酶在某种程度上均具有一定的剂量效应。6.对果蝇幼虫神经-肌肉接点电位测定结果表明，双氧木脂素A使自发性接点电位（mEJP）释放频率增加，出现了波浪状发放，对兴奋性接点电位（EJPs）没有明显影响。7.测定了双氧木脂素A对美洲大蠊离体神经细胞胞浆中游离[Ca2+]i动力学的影响。结果表明，10nmol/L到100μmol/L浓度范围双氧木脂素A都可引起胞内游离[Ca2+]i升高，且胞内钙水平升高与双氧木脂素A的浓度正相关。双氧木脂素A作用部位是细胞质膜和内质网膜，其作用靶标是质膜上的L-型Ca2+通道和内质网膜上的RyR钙通道，引起外钙内流和内钙释放，使得胞内钙水平升高。双氧木脂素A与nifedipine竞争结合于L-型Ca2+通道，与咖啡因在RyR钙通道上存在不同的亲和位点。8.双氧木脂素A激活L-型Ca2+通道，促进外钙内流；L-型Ca2+通道与RyR在胞浆区的部分相互作用，其构象发生改变并通过蛋白质间的相互作用激活RyR，Ca2+释放通道开放，内质网上的Ca2+释放。外钙内流和内钙释放致使胞浆中游离[Ca2+]i升高，Na+离子流受到抑制，从而抑制Na+-K+-ATPase活性；而突触前膜内Ca2+水平升高，Ca2+结合在囊泡膜上，减少了膜表面的负电荷，使得囊泡之间以及囊泡与突触前膜的粘附易于发生，神经-肌肉自发性接点电位（mEJP）释放频率增加，引起兴奋性神经递质释放，并扩散通过突触间隙，与突触后膜上的受体相结合，引起后膜去极化，形成突触后电位。突触后电位达到Na+的活化阈值，就产生一个新的动作电位，引起中毒试虫的肌肉收缩、震颤直至死亡。
曾星[8]（2013）在《L型钙通道CACNA1D调控前列腺癌细胞雄激素受体活性的机制研究》文中认为钙（Ca2+）是细胞内信号传导最常见的第二信使,介导多种细胞生理过程,如细胞凋亡和增殖,以及肿瘤进展。Ca2+在细胞内外动态平衡的维持主要通过电压调控钙通道（Voltage-Gated Calcium Channel, VGCC）和细胞内钙池摄取,已发现5种主要VGCC （L-, N-, P/Q-, R-,和T型）介导Ca2+的转运。L型钙通道被证实参与雄激素介导的前列腺癌细胞恶性进展过程。近年来流行病学调查研究显示,使用L型钙通道阻滞剂可能降低前列腺癌的发病率。本研究旨在探讨L型钙通道在雄激素信号传导中的调控机制及其在前列腺癌进展过程所起的重要作用。研究过程中通过实时定量PCR技术发现只有L型（Cavl.3）α亚单位基因CACNA1D在前列腺癌患者癌组织中比瘤旁组织表达明显较高。通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）半定量分析显示α1D蛋白在前列腺癌组织中表达明显增高,并进一步在OncomineTM癌症微阵列数据库（http://www.oncomine.org）得到验证：CACNA1D在前列腺癌组织中表达明显高于正常前列腺组织。通过免疫荧光共聚焦显微镜镜下观察和以雄激素反应元件报告基因（ARE-LUC）质粒转染为基础的萤光素酶检测系统进一步研究发发现：L型钙通道阻滞剂硝苯地平和粉防己碱或CACNA1D特异性小分子干扰RNA （small interfering RNA, siRNA）能显着抑制前列腺癌细胞增殖,降低雄激素受体核内转录活性,抑制雄激素受体转录性活化,而通过真核质粒转染超表达CACNA1D,能促进雄激素转录活性。此外,通过实时定量PCR检测,硝苯地平和粉防己碱预处理降低了AR蛋白和AR调节的内源性靶基因PSA和NKX3.1的表达。相比之下,T型钙通道阻滞剂咪拉地尔可增强AR核内转录活性和内源性目的基因的表达。综上所述,L型钙通道CACNA1D在前列腺癌中过表达并与疾病进展有关,可能介导AR调节基因的表达,T型钙通道可能对AR功能有负性调节作用。进一步阐明CACNA1D调控AR通路的机制可为前列腺癌提供新的治疗策略。
许国军[9]（2013）在《增龄性心房颤动心房重构的离子分子机制研究》文中指出目的：房颤的流行病学特征首先和年龄相关，伴随着人口老龄化等社会进步的表现，房颤的患病人数正迅速增加，房颤、老龄化是21世纪全世界必须面对的医疗与社会问题。因此，关注房颤、关注老年房颤就更具有重要的意义。基于房颤和增龄之间的密切关系，近年来国内外学者提出了增龄性房颤这一概念。本研究旨在探讨增龄性心房颤动心房重构的离子分子机制，以期为增龄性房颤的病因、发病机制和治疗等提供新的思路和理论依据。本研究目的是为探索与论证：1)是否心房肌细胞内钙离子平衡异常与左心房复极化障碍伴随增龄而显现，其是否为老年人易触发和易维持房颤的离子机制；2)是否存在心房肌细胞膜L-型钙通道蛋白和细胞内肌质网钙转运调控蛋白异常表达伴随增龄而显现，致使心肌细胞内钙稳态遭到破坏，其是否为增龄性房颤心房电重构的分子基质；3)是否心房肌细胞钙激活中性蛋白酶（calpain1、calpain2）、钙蛋白酶抑素（calpastatin）的表达变化与这种细胞内可能普遍存在的病理生理改变相关，包括在心房老化和房颤中左心房心肌细胞膜特征性的L-型钙通道表达改变、加速的纤维化和细胞凋亡，以期阐明增龄与房颤时心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制及其在增龄性房颤发生维持中的作用；4)伴随着心房老化或者在房颤这种疾病状态下，是否存在MMP-9与TIMP-1，BCL-2与BAX的表达改变与心房结构重构有关；5)是否可能存在的microRNA-1、microRNA-21、microRNA-29和microRNA-133的异常表达与伴随衰老和房颤疾病状态下加重的纤维化和细胞凋亡是否相关。方法：通过持续快速心房起搏建立持续性房颤犬模型，用全细胞膜片钳的方法记录4组犬（成年和老年窦性心律犬、成年和老年持续性房颤犬）的L-型钙电流（ICa-L）电流密度以及动作电位特征；用实时荧光定量聚合酶反应（Realtime PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）的方法针对四组犬：1)检测左心房心肌细胞膜L-型钙通道蛋白和肌浆网钙转运调控蛋白在mRNA和蛋白质表达水平变化；2)检测左心房肌细胞钙激活中性蛋白酶（calpain1、calpain2）、钙蛋白酶抑素（calpastatin）在mRNA和蛋白质表达水平变化；3)检测左心房肌细胞MMP-9与TIMP-1，BCL-2与BAX在mRNA和蛋白质表达水平变化；4)检测左心房肌细胞microRNA-1、microRNA-21、microRNA-29和microRNA-133的表达变化；5)应用光镜、电镜及TUNEL法检测各组犬左心房心肌组织细胞的超微结构变化、心肌纤维化程度以及细胞凋亡指数等结构重构；6)检测目标基因及蛋白的表达变化与心房电重构及结构重构之间是否存在相关性。结果：1.电生理变化：1)窦性心律时体表心电图数据显示，与成年犬比较，老年犬的心电图P波持续时间显着地延长，P波离散度显着地增大（P＜0.05）；2)在窦性心律时成年犬和老年犬左心房组织细胞动作电位的特征性变化趋势：与成年犬比较，老年犬的心肌细胞膜动作电位平台期（2相）电压显着降低，动作电位持续时间（APD90）显着延长，L-型钙电流密度出现了明显地减低（均P＜0.05）；3)与窦性心律时比较，两组犬在发生房颤时均出现了显着的去极化趋势，均出现动作电位持续时间（APD90）缩短，动作电位振幅显着地增大，平台期电位电势显着地减少，L-型钙电流密度出现了显着地减低（均P＜0.05）。2.分子生物学变化：1)在mRNA和蛋白质表达水平，老年犬左心房肌LVDCCa1c显着地降低，而Ca2+-ATPase显着地升高（均P＜0.05），RYR2，IP3R1和PLN普遍地显示出上调的趋势，但无统计学差异（P＞0.05）；与窦性心律犬比较，房颤犬除受磷蛋白（PLN）之外，LVDCCa1c和肌浆网钙转运调控蛋白均显着地下调，尤其是老年房颤犬这种下调趋势更加明显（（均P＜0.05））；2)与成年犬比较，老年犬左心房肌细胞calpain1，calpain2和calpastatin在mRNA和蛋白质表达水平均普遍地显示出上调的趋势，但是未显示出统计学差异（P＞0.05）。此外，在相同年龄的窦性心律犬和慢性房颤犬之间的比较中显示，房颤犬左心房肌细胞calpain1在mRNA和蛋白质表达水平均显着地增高（均P＜0.05），尤其是老年房颤犬增高最为明显；然而，calpain2和calpastatin在mRNA和蛋白质表达水平均未显示出统计学差异（均P＞0.05），老年房颤犬的LVDCCa1c与calpain1在蛋白质表达水平呈现负相关（r=-0.583，P=0.019）；3)与成年犬比较，老年犬左心房肌细胞MMP-9和BAX在mRNA和蛋白质表达水平表达均显着地增高（均P＜0.05），而TIMP-1和BCL-2表达均显着地下降（均P＜0.05）；与窦性心律犬比较，房颤犬左心房肌细胞MMP-9和BAX在mRNA和蛋白质表达水平均显现出有意义的上调趋势（均P＜0.05），尤其是老年房颤犬最为明显，TIMP-1和BCL-2在mRNA和蛋白质表达水平均显现出有意义的下调趋势（均P＜0.05），尤其是老年房颤犬最为明显；4)与成年犬组相比较，在窦性心律时老年犬左心房肌细胞miR-21，29的表达水平显现出显着的上调趋势（均P＜0.05）；然而，miR-1，133的表达水平呈现出显着的下调趋势（均P＜0.05）；与窦性心律老年犬组相比较，在持续性房颤老年组犬左心房心肌组织的miR-1，21，29的表达水平显现出显着的上调趋势（均P＜0.05）；miR-133的表达水平显现出显着的下调趋势（P＜0.05）。3.组织病理学变化：伴随老龄与房颤，犬心肌纤维化程度、细胞超微结构及凋亡指数均显现出有统计学意义的改变（均P＜0.05）。结论：1)这种伴随增龄与房颤而显现的左房电生理和钙转运调控蛋白特异性改变（适应与不良适应反应）可能是增龄性房颤心房电重构的分子基质之一。2)这种伴随增龄与房颤而显现的钙激活中性蛋白酶特异性生物活性改变可能是增龄性房颤心房电重构与结构重构的分子基质之一。3)这种伴随增龄与房颤而显现的MMP-9与TIMP-1，BCL-2与BAX特异性的生物活性改变可能是增龄性房颤心房纤维化重构的分子基质之一。4)这种伴随增龄与房颤而显现的microRNA-1、microRNA-21、microRNA-29和microRNA-133的异常表达与心房结构重构进程中特征性的加重的纤维化和细胞凋亡相关，其对将来可能的临床诊断、预后评估及基因治疗与干预提供了有意义思路和措施。
张忠双[10]（2010）在《GABA介导的神经病理性痛大鼠DRG神经元膜去极化反应的研究》文中指出目的:本研究通过建立坐骨神经慢性压榨模型（chronic constriction injury of the sciatic nerve model, CCI model）,运用电生理学技术,研究γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）介导的神经病理性痛大鼠背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元膜去极化反应,并探讨其可能机制,为进一步揭示神经病理性痛的发生机制提供一定的实验理论依据。方法: 1)制作CCI模型,雄性SD大鼠（n=30只）,随机分为三组,即正常对照组（n=10）假手术组（n=10）和CCI组（n=10）,称重后腹腔注射1 %戊巴比妥纳（40 mg/kg）麻醉。分别在实验前及实验后0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、14 d进行热板实验;2)取正常对照组和CCI组手术侧和非手术侧DRG,应用细胞内微电极记录技术,给予灌流GABA溶液(10-510-3mol/L),观察GABA对DRG神经元的作用。结果:1)神经病理性痛大鼠手术侧的热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency, PWTL）比假手术组明显缩短,于术后第1 d开始降低,第7 d天降至最低（P﹤0.01）;2)获得成功记录的细胞在正常对照组为63例,在CCI模型组手术侧为60例,在CCI模型组手术对侧为58例,所测得的静息电位值在正常对照组、CCI模型大鼠手术侧分别为-51±3 mV（n=63）、-49±4 mV（n=60）和-50±3 mV（n=58）,统计学分析两组DRG标本的神经元静息膜电位之间差异没有统计学意义（P>0.05）;3)同一浓度的GABA(10-510-3 mol/L)引起的去极化反应在CCI模型组大鼠手术侧DRG明显小于正常对照组大鼠。各浓度GABA(10-510-3 mol/L)引起两组大鼠DRG神经元膜去极化反应差异均有统计学意义（n≥6, P<0.05）。结论: 1)大鼠坐骨神经慢性压榨模型可以作为一种稳定的神经病理性痛的研究模型;2)神经病理性痛时,GABA在初级感觉传入终末产生的突触前抑制作用被减弱,从而易化了伤害性信息（痛觉）的传递。
二、大鼠耳蜗α_(1D)L-型电压门控钙通道组织特异性异构体的剪切方式及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠耳蜗α_(1D)L-型电压门控钙通道组织特异性异构体的剪切方式及其意义（论文提纲范文）
（1）中国荷斯坦牛乳腺组织转录组分析及脂肪酸延长和脱饱和相关miRNAs的筛选和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 奶牛泌乳过程及其机制 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 泌乳过程 |
| 1.1.3 泌乳机制 |
| 1.1.3.1 泌乳前乳腺的形态学和功能分化 |
| 1.1.3.2 乳汁的分泌 |
| 1.1.3.3 泌乳维持 |
| 1.1.3.4 泌乳结束 |
| 1.2 牛奶中乳脂的营养价值及其脂肪酸组成 |
| 1.2.1 乳腺中乳脂的组成 |
| 1.2.2 乳腺中乳脂的合成代谢途径 |
| 1.2.2.1 脂肪酸从头合成 |
| 1.2.2.2 乳腺对血液脂肪酸的吸收 |
| 1.2.2.3 甘油三酯合成 |
| 1.2.2.4 乳脂分泌 |
| 1.2.3 多不饱和脂肪酸合成和功能 |
| 1.2.3.1 ω-3多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.2.3.2 ω-6多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.3 基因对动物乳腺组织脂代谢和脂肪酸代谢具有重要的调控作用 |
| 1.4 microRNAs对动物乳腺组织脂代谢和脂肪酸代谢具有重要的调控作用 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第2章 乳腺组织mRNA表达谱分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物和样品采集 |
| 2.1.2 主要仪器及设备 |
| 2.1.3 主要数据库 |
| 2.1.4 主要软件 |
| 2.2 试验步骤 |
| 2.2.1 乳成分的测定 |
| 2.2.2 转录组测序文库的构建 |
| 2.2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2.2 RNA-Seq样品制备 |
| 2.2.2.3 RNA混合池(RNApool)建立 |
| 2.2.3 实验测序建库流程 |
| 2.2.4 数据统计方法 |
| 2.2.4.1 参考序列比对分析 |
| 2.2.4.2 基因表达量分析 |
| 2.2.4.3 差异表达基因鉴定 |
| 2.2.4.4 共表达网络分析 |
| 2.2.4.5 基因功能注释分析 |
| 2.2.4.6 网络功能模块分析 |
| 2.2.4.7 蛋白质互作网络的构建及分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 乳成分分析 |
| 2.3.2 总RNA的质量检测 |
| 2.3.3 测序数据质量评估 |
| 2.3.3.1 测序碱基质量分析 |
| 2.3.3.2 碱基分布检查 |
| 2.3.3.3 测序数据质量预处理 |
| 2.3.4 READS污染检测 |
| 2.3.5 参考序列比对分析 |
| 2.3.5.1 Reads与参考基因组比对结果统计 |
| 2.3.5.2 基因覆盖度分析 |
| 2.3.5.3 READS在参考基因组上的分布 |
| 2.3.6 QC分析 |
| 2.3.6.1 测序饱和度分析 |
| 2.3.6.2 READS在不同元件的富集分析 |
| 2.3.6.3 测序随机性评估 |
| 2.3.7 基因的表达丰度 |
| 2.3.8 新转录本预测及基因结构优化 |
| 2.3.8.1 新转录本预测分析 |
| 2.3.8.2 基因结构优化 |
| 2.3.9 可变剪切分析 |
| 2.3.10 差异表达基因鉴定 |
| 2.3.11 基因功能注释分析 |
| 2.3.11.1 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.3.11.2 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.3.12 加权基因共表达网络分析 |
| 2.3.12.1 加权基因共表达网络构建 |
| 2.3.12.2 基因共表达模块的筛选 |
| 2.3.12.3 基因共表达模块的注释 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第3章 乳腺组织miRNA表达谱分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验步骤 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 small RNA测序数据预处理 |
| 3.3.1.1 数据处理统计 |
| 3.3.1.2 Reads长度分布统计及拷贝数统计 |
| 3.3.2 small RNA测序数据序列比对注释 |
| 3.3.2.1 参考基因组比对率统计 |
| 3.3.2.2 Rfam 比对过滤 |
| 3.3.2.3 转录本序列比对过滤 |
| 3.3.2.4 重复序列比对过滤 |
| 3.3.2.5 miRNA (miRBase数据库)比对注释 |
| 3.3.2.6 reads分类注释汇总 |
| 3.3.3 miRNA表达分析 |
| 3.3.3.1 样本箱线图 |
| 3.3.3.2 miRNA差异分析 |
| 3.3.3.3 DE miRNA的靶向DEGs的功能分析 |
| 3.3.3.4 差异表达miRNA靶基因KEGG分析 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第4章 miR-193a-5p通过靶向FADS1调控乳脂代谢 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验步骤 |
| 4.2.1 miRNA-mRNA互作网络构建 |
| 4.2.2 细胞培养 |
| 4.2.3 细胞总RNA提取 |
| 4.2.4 miRNA-193a-5p与FADS1靶向关系的验证 |
| 4.2.4.1 FADS1 3'UTR区PCR扩增 |
| 4.2.4.2 目的片段与T载体连接 |
| 4.2.4.3 质粒转化 |
| 4.2.4.4 质粒提取 |
| 4.2.4.5 双酶切鉴定和测序验证 |
| 4.2.4.6 割胶回收 |
| 4.2.4.7 目的片段插入pmirGLO-Vector双荧光素酶表达载体 |
| 4.2.4.8 无内毒素质粒提取 |
| 4.2.4.9 双酶切鉴定和测序验证 |
| 4.2.4.10 候选靶基因FADS1突变型双荧光素酶载体构建 |
| 4.2.4.11 荧光素酶报告基因活性检测试验 |
| 4.2.5 细胞转染 |
| 4.2.6 细胞总RNA的提取 |
| 4.2.7 mRNA的定量分析 |
| 4.2.8 miRNA的逆转录和定量 |
| 4.2.9 WB分析 |
| 4.2.9.1 转染后细胞总蛋白的提取 |
| 4.2.9.2 总蛋白含量的测定 |
| 4.2.9.3 蛋白变性 |
| 4.2.9.4 SDS-PAGE电泳 |
| 4.2.9.5 转膜 |
| 4.2.9.6 抗体孵育 |
| 4.2.9.7 发光检测 |
| 4.2.10 甘油三酯含量测定 |
| 4.2.11 脂肪酸含量测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 miRNA-mRNA互作网络构建 |
| 4.3.2 miRNA靶基因功能注释 |
| 4.3.3 靶基因3'UTR PCR扩增 |
| 4.3.4 菌落PCR产物电泳结果 |
| 4.3.5 双荧光素酶表达载体构建 |
| 4.3.6 乳腺上皮细胞中miR-193a-5p特异性靶向FADS1 |
| 4.3.7 miR-193a-5p和FADS1在BMECs中的功能 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第5章 miR-378d通过靶向FADS2调控乳脂代谢 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验步骤 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 miRNA-mRNA互作网络构建 |
| 5.3.2 miRNA靶基因功能注释 |
| 5.3.3 靶基因3'UTR PCR扩增 |
| 5.3.4 菌落PCR产物电泳结果 |
| 5.3.5 双荧光素酶表达载体构建 |
| 5.3.6 乳腺上皮细胞中miR-378d与FADS2 3'UTR靶位点双荧光素酶报告基因的检测结果 |
| 5.3.7 miR-378d和FADS2在BMECs中的功能 |
| 5.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第6章 miR-128通过靶向ELOVL6调控乳脂代谢 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验步骤 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 miRNA-mRNA互作网络构建 |
| 6.3.2 miRNA靶基因功能注释 |
| 6.3.3 靶基因3'UTR PCR扩增 |
| 6.3.4 菌落PCR产物电泳结果 |
| 6.3.5 双荧光素酶表达载体构建 |
| 6.3.6 乳腺上皮细胞中miR-128与ELOVL6 3'UTR靶位点双荧光素酶报告基因的检测结果 |
| 6.3.7 miR-128和ELOVL6在BMECs中的功能 |
| 6.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第7章 全文结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）Cav1.3钙离子通道蛋白和LaminB1核纤层蛋白在大鼠耳蜗发育阶段的表达及作用（论文提纲范文）
| 华中科技大学博士学位论文创新点概述 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 新生SD大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及Cav1.3、LaminB1蛋白的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Cav1.3钙离子通道蛋白在SD大鼠耳蜗组织中的发育性表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LaminB1蛋白在新生大鼠耳蜗中的发育性表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 核纤层蛋白LaminB1在大鼠耳蜗中的选择性表达及作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间的学习工作 |
| 发表文章 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
（3）L型钙离子通道的生物学特性及其在听觉功能中的作用（论文提纲范文）
| 1 LTCCs的分子结构 |
| 2 LTCCs的组织表达及生理功能 |
| 3 L型钙离子通道在听觉功能中的作用 |
| 3.1 L型钙通道在外周听觉系统中的功能 |
| 3.2 L型钙通道在听觉中枢中的功能 |
| 4 问题与展望 |
（4）PKB的新型底物SPEG在心脏中的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景综述 |
| 1 前言 |
| 2 心脏的基本介绍 |
| 2.1 心脏的结构 |
| 2.1.1 心脏壁 |
| 2.1.2 腔室 |
| 2.1.3 瓣膜 |
| 2.1.4 传导系统 |
| 2.2 心脏的发育 |
| 2.3 钙离子在心脏中的作用 |
| 2.3.1 心肌细胞中的钙离子通道 |
| 2.3.1.1 L型和T型的钙离子通道(LTCC和TTCC) |
| 2.3.1.2 RyR2和二型IP3R |
| 2.3.1.3 钠钙交换器(NCX) |
| 2.3.1.4 PMCA |
| 2.3.1.5 SERCA2a |
| 2.3.2 心脏的兴奋收缩耦联(excitation contraction coupling) |
| 2.3.2.1 ECC过程中钙离子的变化 |
| 2.3.2.2 横管(transverse tubules,T-tubules) |
| 2.3.2.3 肌浆网(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum, SR) |
| 3 胰岛素在心脏中的作用 |
| 3.1 胰岛素的合成 |
| 3.2 胰岛素的分泌 |
| 3.3 胰岛素的生物学效应 |
| 3.3.1 胰岛素对代谢的调控 |
| 3.3.1.1 促进骨骼肌及脂肪的葡萄糖吸收 |
| 3.3.1.2 促进肝糖原和肌糖原的合成并抑制肝脏糖异生以及糖原分解 |
| 3.3.1.3 促进脂质合成并抑制脂质分解 |
| 3.3.2 胰岛素影响细胞的生长以及分化 |
| 3.3.3 胰岛素对离子通道的影响 |
| 3.4 胰岛素在心脏中的作用 |
| 3.4.1 调节心脏能量代谢 |
| 3.4.2 调节血管功能 |
| 3.4.3 调节蛋白合成 |
| 3.4.4 维持心脏的钙离子稳态 |
| 3.5 PKB/Akt在心脏的作用 |
| 3.5.1 PKB/Akt的活化 |
| 3.5.2 PKB/Akt的识别序列 |
| 3.5.3 心脏中的PKB/Akt |
| 3.6 糖尿病心脏病(Diabetic cardiomyopathy) |
| 3.6.1 糖尿病的定义以及诊断 |
| 3.6.2 糖尿病心脏病 |
| 3.6.2.1 定义 |
| 3.6.2.2 表型 |
| 3.6.2.3 发病机理 |
| 4 SPEG在心脏中的研究现状 |
| 4.1 定义 |
| 4.2 研究历史 |
| 4.3 SPEG在心脏中的功能 |
| 5 结语 |
| 第二章 PKB的新型底物SPEG通过调节SERCA2a来维持心脏功能 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子生物学 |
| 2.2.2 Speg~(f/f)和Speg敲除以及Speg~(3A)敲入小鼠的构建 |
| 2.2.3 小鼠的饲养、管理以及tamoxifen诱导 |
| 2.2.4 血液生化指标检测 |
| 2.2.5 胰岛素注射和口服葡萄糖耐受试验(OGTT) |
| 2.2.6 组织裂解和蛋白浓度测定 |
| 2.2.7 免疫沉淀和免疫印迹 |
| 2.2.8 质谱分析 |
| 2.2.9 pThr~(484)-SERCA2a位点特异性抗体的产生 |
| 2.2.10 体外磷酸化 |
| 2.2.11 心脏超声(Echo) |
| 2.2.12 成年小鼠原代心肌细胞的分离以及钙瞬变的测定 |
| 2.2.13 成年小鼠原代心肌细胞T管(T-tubules,TT)成像及分析 |
| 2.2.14 细胞培养、转染、分化及裂解 |
| 2.2.15 HEK293细胞钙瞬变的测定 |
| 2.2.16 组织学分析 |
| 2.2.17 免疫荧光及成像 |
| 2.2.18 荧光共振能量转移(FRET)实验 |
| 2.2.19 RNA的提取和定量PCR (QPCR) |
| 2.2.20 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在小鼠心脏中鉴定出SPEG是PKB/Akt的底物 |
| 3.2 心脏特异性缺失Speg的小鼠患有扩张型心肌病 |
| 3.3 Speg~(3A)突变小鼠与心脏特异性缺失Speg的小鼠表型类似 |
| 3.4 SERCA2a是SPEG的相互作用蛋白 |
| 3.5 SPEG的磷酸化及其本身可以调节心肌细胞中钙离子的回收 |
| 3.6 SPEG的磷酸化可以激活它的SK2从而促进SERCA2a磷酸化及寡聚化 |
| 3.7 SERCA2a上的Thr~(484)是由SPEG介导的调控位点 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 已发表论文 |
（5）听觉发育期内耳钠离子通道的分子特质及其生理功能调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 听觉系统自发活性生理功能 |
| 1.2 电压门控钠通道生理功能 |
| 1.3 科学问题 |
| 第二章 发育期内耳钠通道分子特质 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 毛细胞钠通道亚型时空表达特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 耳蜗型钠通道亚型变体电生理特性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 钠电流调控毛细胞自发电活动 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 相关研究内容：视觉剥夺诱导听觉感知功能上调的中枢机制 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者在攻读博士学位期间发表论文列表 |
| 作者在攻读博士学位期间学术交流目录 |
| 作者在攻读博士学位期间参与科研项目 |
| 致谢 |
（6）14-3-3蛋白调控Cav2.2通道膜转运机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 绪论 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 14-3-3τ以不依赖Cav辅助亚单位的方式增强Cav2.2 细胞膜表达水平 |
| 3.2 14-3-3 蛋白调控Cav2.2 钙通道的内质网滞留 |
| 3.3 COPII转运复合体在 14-3-3 蛋白所介导的Cav2.2 钙通道膜转运过程中的作用 |
| 3.4 Arf1-dependent和clathrin-dependent细胞物质运输途径在 14-3-3 蛋白所介导的Cav2.2 钙通道膜转运过程中的作用 |
| 3.5 14-3-3 蛋白和Cavβ亚单位协同调控Cav2.2 钙通道膜转运 |
| 3.6 dynamin1 介导的内吞在 14-3-3τ 所调控的Cav2.2 通道膜转运中的作用 |
| 3.7 14-3-3 蛋白调控Cav2.2 通道膜转运模式图 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录缩略词表 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（7）透骨草杀虫活性成分及其作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杀虫植物资源 |
| 1.1.1 楝科植物 |
| 1.1.2 菊科植物 |
| 1.1.3 豆科植物 |
| 1.1.4 卫矛科植物 |
| 1.1.5 茄科植物 |
| 1.2 杀虫植物的活性成分 |
| 1.2.1 生物碱类 |
| 1.2.2 萜烯类 |
| 1.2.3 黄酮类 |
| 1.2.4 木脂素类 |
| 1.2.5 番荔枝内酯类 |
| 1.3 植物源杀虫剂的作用方式 |
| 1.3.1 胃毒作用 |
| 1.3.2 触杀作用 |
| 1.3.3 麻醉作用 |
| 1.3.4 熏蒸作用 |
| 1.3.5 干扰害虫生长发育 |
| 1.3.6 驱避作用 |
| 1.3.7 拒食作用 |
| 1.3.8 光活化毒杀作用 |
| 1.4 Ca~(2+)通道 |
| 1.4.1 电压门控 Ca~(2+)通道 |
| 1.4.2 Ryanodine 受体 Ca~(2+)通道 |
| 1.4.3 Ca~(2+)-ATPase 和 Na+/Ca~(2+)交换器 |
| 1.5 植物源杀虫剂作用机理的研究思路和方法 |
| 1.5.1 症状学观察 |
| 1.5.2 生理生化研究 |
| 1.5.3 受体研究 |
| 1.6 植物源杀虫剂的开发利用、存在问题及前景展望 |
| 1.6.1 开发利用 |
| 1.6.2 存在问题 |
| 1.6.3 前景展望 |
| 1.7 透骨草的研究现状 |
| 1.7.1 透骨草简介 |
| 1.7.2 透骨草的化学成分研究 |
| 1.8 论文设计思想 |
| 1.8.1 研究内容 |
| 1.8.2 研究方案 |
| 第二章 透骨草杀虫活性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同溶剂及提取方法对提取率的影响 |
| 2.2.2 不同提取物的杀虫活性 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 透骨草杀虫活性成分的分离及结构鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 透骨草甲醇提取物萃取相杀虫活性测定 |
| 3.2.2 活性成分的分离 |
| 3.2.3 化合物结构鉴定 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 活性化合物的杀虫活性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 对粘虫的毒杀活性 |
| 4.2.2 对槐尺蠖的活性 |
| 4.2.3 对淡色库蚊的活性 |
| 4.2.4 对家蝇的活性 |
| 4.2.5 对美洲大蠊的活性 |
| 4.2.6 双氧木脂素 A 作用症状观察 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 双氧木脂素 A 对粘虫体内 ATP 酶的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 对 Na~+-K~+-ATPase 活性的影响 |
| 5.2.2 对 Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase 活性的影响 |
| 5.2.3 对 Ca~(2+)-ATPase 活性的影响 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 双氧木脂素 A 对神经-肌肉接点电位的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 对果蝇神经-肌肉诱发兴奋性接点电位（EJP）的影响 |
| 6.2.2 对果蝇神经-肌肉自发性接点电位（mEJP）的影响 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 双氧木脂素 A 对美洲大蠊离体神经细胞钙通道的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 美洲大蠊神经细胞离体培养 |
| 7.2.2 双氧木脂素 A 对神经细胞内游离[Ca~(2+)]i动力学的影响 |
| 7.2.3 细胞外 Ca~(2+)存在时双氧木脂素 A 对 L-型 Ca~(2+)通道的影响 |
| 7.2.4 细胞外无 Ca~(2+)环境下双氧木脂素 A 对胞内钙库 Ca~(2+)释放通道的影响 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 第八章 结论 |
| 论文主要创新点 |
| 有待进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 化合物谱图 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）L型钙通道CACNA1D调控前列腺癌细胞雄激素受体活性的机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前列腺癌中CACNA1D的筛选鉴定和临床意义分析 |
| 实验一 Oncomine~(TM)的数据分析筛选与前列腺癌相关的L型钙通道α_1亚单位基因 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 实验二 CACNA1D基因在前列腺癌中的表达与疾病进展的关系 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 第二部分 CACNA1D调控前列腺癌细胞雄激素受体活性 |
| 实验一 L型钙离子拮抗抑制前列腺癌细胞生长的实验研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 实验二 增强/抑制CACNA1D的表达调控雄激素受体核内转录活性的实验研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 实验三 钙通道阻滞剂抑制雄激素受体和雄激素受体调节基因PSA和NKX3.1表达的实验研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 英文论文 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（9）增龄性心房颤动心房重构的离子分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 左心房心肌细胞电生理及钙转运调控蛋白的表达改变与增龄及房颤关系的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂及药品 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 钙激活中性蛋白酶表达改变与增龄及房颤关系的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂及药品 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 MMP-9/TIMP-1、BCL-2/BAX 表达改变与增龄及房颤关系的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂及药品 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 miRNAs 的表达改变与增龄所致的左心房结构重构及房颤关系的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂及药品 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）GABA介导的神经病理性痛大鼠DRG神经元膜去极化反应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩语表 |
| 前言 |
| 第一部分 神经病理性痛模型（CCI 模型）的建立 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部份 GABA 介导的神经病理性痛大鼠 DRG 神经元膜去极化 反应的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 导师评语 |
四、大鼠耳蜗α_(1D)L-型电压门控钙通道组织特异性异构体的剪切方式及其意义（论文参考文献）
- [1]中国荷斯坦牛乳腺组织转录组分析及脂肪酸延长和脱饱和相关miRNAs的筛选和功能研究[D]. 樊永亮. 扬州大学, 2021(02)
- [2]Cav1.3钙离子通道蛋白和LaminB1核纤层蛋白在大鼠耳蜗发育阶段的表达及作用[D]. 杜智会. 华中科技大学, 2019(03)
- [3]L型钙离子通道的生物学特性及其在听觉功能中的作用[J]. 祁繁,陈金,褚汉启. 听力学及言语疾病杂志, 2019(01)
- [4]PKB的新型底物SPEG在心脏中的功能研究[D]. 全超. 南京大学, 2018(06)
- [5]听觉发育期内耳钠离子通道的分子特质及其生理功能调控机制[D]. 周邮. 上海大学, 2018(02)
- [6]14-3-3蛋白调控Cav2.2通道膜转运机制[D]. 刘丰. 上海交通大学, 2014(02)
- [7]透骨草杀虫活性成分及其作用机理研究[D]. 肖新敏. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [8]L型钙通道CACNA1D调控前列腺癌细胞雄激素受体活性的机制研究[D]. 曾星. 华中科技大学, 2013(02)
- [9]增龄性心房颤动心房重构的离子分子机制研究[D]. 许国军. 新疆医科大学, 2013(01)
- [10]GABA介导的神经病理性痛大鼠DRG神经元膜去极化反应的研究[D]. 张忠双. 石河子大学, 2010(02)