一、阿霉素诱导细胞凋亡时的基因调控（论文文献综述）
许远[1]（2021）在《miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究》文中研究说明甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid caner,ATC）是所有甲状腺肿瘤中恶性程度最高且预后极差的一种病理类型,临床确诊时往往已是晚期。由于其缺乏分化不能聚碘,所以无法以放射碘进行治疗。阿霉素（doxorubicin,DOX）目前是治疗ATC的一线化疗药物,但是在治疗后期ATC对阿霉素的耐药性是导致最终化疗失败的主要原因。然而目前ATC阿霉素耐药的机制研究进展缓慢,耐药逆转剂的开发更是滞后。阿霉素化疗的耐药机制尚不十分清楚,近年的研究表明,异常表达的多种微小RNA（microRNAs,miRNAs）参与了肿瘤多药耐药的形成。miRNAs是一类高度保守的内源性、非编码、单链RNA分子,参与了多种肿瘤的发生发展。我们通过GEO、TCGA等数据库检索、生物信息学分析以及大量文献复习,确定microRNA-27b-3p（miR-27b-3p）及过氧化物酶体增殖物受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ）作为进一步的研究目标。之前的研究发现,miR-27b-3p以及PPAR-γ的异常表达与胃癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤耐药性相关,但两者在ATC中的表达情况以及对阿霉素治疗敏感性的影响等尚未见报道。为了阐明miR-27b-3p与PPAR-γ是否参与ATC细胞耐药形成、以及如何逆转ATC细胞对阿霉素的耐药性,我们探讨了在ATC阿霉素耐药细胞系SW1736/DOX 和 8305C/DOX 中 miR-27b-3p 与 PPAR-γ 靶向调控关系、miR-27b-3p与PPAR-γ的动态表达对ATC细胞阿霉素耐药性的影响、以及可能同时参与调控的miR-27b-3p/PPAR-γ轴上游及下游基因,为逆转ATC阿霉素耐药提供理论依据。第一部分 人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株的构建目的建立人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株,描述其生物学特性;并在mRNA水平及蛋白水平检测耐药相关基因P-gp在耐药株与敏感株中的表达差异以验证耐药株的成功建立,为下一步开展肿瘤耐药性的机制研究提供科研模型。方法1.以人甲状腺癌未分化癌细胞SW1736、8305C为亲代细胞,以阿霉素为筛选药物,采用逐步递增阿霉素浓度,间歇作用体外诱导构建SW1736/DOX、8305C/DOX耐药细胞株模型。2.采用CCK-8法检测经不同浓度阿霉素作用后耐药株细胞及其亲代细胞的抑制情况,以便筛选出最合适的干预浓度和作用时间。3.通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹印迹法检测耐药相关蛋白P-gp在耐药株和敏感株细胞中的表达差异。4.利用腺病毒转染技术,构建稳定表达荧光LUC细胞株SW1736-LUC/DOX、8305C-LUC/DOX,用于后期动物实验。结果1.采用低浓度加药持续诱导法,逐步递增培养液中阿霉素的浓度,间歇作用体外诱导筛选,历时3个月获得了在阿霉素作用下生长良好的耐药细胞株,分别命名为SW1736/DOX和8305C/DOX。通过实验我们发现,在逐渐升高的阿霉素浓度作用下,耐药株SW1736/DOX、8305C/DOX细胞抑制比率上升幅度明显低于亲本细胞株。2.用CCK-8法测得SW1736细胞对阿霉素的IC50为0.82 μM,SW1736/DOX细胞对阿霉素的IC50为8.83 μM,其耐药系数RI为10.73;8305C细胞对阿霉素的IC50为1.77 μM,8305C/DOX细胞对阿霉素的IC50为9.22 μM,其耐药系数RI为5.41。根据RI常规分级,SW1736/DOX、8305C/DOX细胞较亲本SW1736、8305C细胞对阿霉素为中度耐药,具有明显的耐药性。并筛选出1 μM的最适阿霉素作用浓度和48小时的作用时间。3.qRT-PCR 结果显示,在耐药细胞株 SW1736/DOX、8305C/DOX 中 P-gp mRNA表达较其亲代细胞株SW1736、8305C明显上调,存在显着性差异（p<0.01）;Western Blot结果显示,耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中P-gp蛋白表达量明显升高,存在显着性差异,提示ATC耐药株模型构建成功。4.利用腺病毒（pHBLV-CMV-MCS-EF1-fLUC-T2A-PURO）转染技术,我们获得了稳定表达LUC基因的细胞株SW1736-LUC/DOX和8305C-LUC/DOX,用于后期动物实验。结论两种ATC细胞获得耐药性的过程是逐渐改变的,有明显的剂量依赖关系,耐药株细胞较其亲代细胞对阿霉素药物更为耐受,而且耐药株中耐药相关蛋白P-gp的mRNA和蛋白高表达也验证了耐药细胞株的成功构建。利用SW1736/DOX、8305C/DOX模型,我们可以在后续的microRNAs及其靶基因调控水平上研究其耐药性的改变,并以此为基础进一步开展逆转耐药的研究。第二部分 miR-27b-3p的表达水平与人甲状腺未分化癌细胞对阿霉素敏感性的关系目的通过生物信息学分析结合文献复习,找出可能与ATC阿霉素耐药性相关的差异表达miRNAs,进一步筛选出在ATC阿霉素耐药株细胞中异常表达的miRNA,通过体外和体内实验检测其表达水平与ATC细胞阿霉素药物敏感性的关系。方法1.通过NCBI网站上的GEO数据库、TCGA数据库等检索并下载与甲状腺癌化疗耐药相关的数据集,分析差异表达的miRNAs。筛选出可能与甲状腺未分化癌阿霉素化疗耐药相关的差异miRNAs作为主要研究对象。2.在多种相关miRNAs中,采用qRT-PCR技术,进一步筛选出ATC耐药株细胞和亲代细胞中存在显着差异表达的miRNA。3.体外实验:通过控制miRNA表达（miRNA inhibitor）,观察转染组与非转染组耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。4.体内实验:构建裸鼠异种体内ATC耐药细胞株移植瘤模型,通过敲低目标miRNA（miRNA antagomir）,观察实验组与对照组荷瘤小鼠移植瘤的生长曲线,qRT-PCR分析移植瘤中目标miRNA的表达改变。结果1.我们使用 TCGAbiolinks R 包下载 TCGA-THCA miRNA-seq readcount 数据与临床样本数据,使用ggplot2R包绘制火山图。共找到差异miRNA394个,其中上调miRNA264个,下调miRNA 130个。通过查阅大量文献综述,我们在差异miRNA中筛选出与甲状腺未分化癌密切相关,且参与多种不同恶性肿瘤化疗耐药性调控的 miRNA:miR-200 家族（包括 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141）、miR-205 和 miR-27b 作为下一步研究的目标 miRNAs。2.通过RT-PCR实验对上述miRNAs在ATC细胞株SW1736、8305C及其耐药株SW1736/DOX、8305C/DOX中的表达水平进行了筛选检测,结果显示,miR-27b-3p在耐药株细胞中的表达水平明显升高,与其亲代细胞相比,具有显着性差异（p<0.01）。因此,我们选择miR-27b-3p作为研究ATC阿霉素耐药机制的目标miRNA。3.为了明确miR-27b-3p表达水平的高低是否对ATC细胞的耐药性产生影响,我们在耐药细胞株中转染miR-27-3p inhibitor及scramble miRNA,采用CCK-8法检测耐药细胞株中转染组和对照组细胞对化疗药物阿霉素敏感性的变化。结果显示,与对照组相比,转染miR-27-3p inhibitor组随着药物浓度增加,细胞抑制比率逐渐上升,IC50值明显降低,差异具有统计学意义（p<0.01）,提示抑制miR-27b-3p表达可显着提高ATC细胞对阿霉素的敏感性。4.为了进一步验证miR-27b-3p在体内对ATC阿霉素耐药性的调控作用,我们构建了裸鼠异种体内皮下移植瘤模型。实验组在瘤体内注射了 miR-27b antagomir之后,移植瘤生长明显减缓;取出瘤体后检测瘤重变化与体积变化一致。两组荷瘤小鼠移植瘤大体照片对比进一步表明,注射miR-27b antagomir增强了阿霉素的抗肿瘤效应。与体外细胞实验结果一致,miR-27b antagomir干扰后,移植瘤组织中miR-27b-3p的表达显着降低。以上体内实验结果证实,敲低miR-27b-3p可以增强ATC耐药细胞对阿霉素药物的化疗敏感性。结论miR-27b-3p在甲状腺未分化癌阿霉素耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中显着高表达,抑制miR-27b-3p表达可以增强甲状腺未分化癌细胞对阿霉素化疗敏感性。第三部分 miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性目的探讨miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ对ATC细胞阿霉素耐药性的调控及其分子机制,并对miR-27b-3p/PPAR-γ调控轴的上游及下游信号分子进行初步的拓展研究。方法1.通过多个数据库预测miR-27b-3p下游的靶基因并进行Venn分析,采用clusterProfiler R包对靶基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,同时结合TCGA-THCA mRNA-seq readcount数据与临床样本数据,选取与甲状腺癌相关的靶基因作为下一步的研究对象。2.通过生物信息学分析明确miR-27b-3p与靶基因的结合位点。3.通过双荧光素酶报告实验验证该基因是否miR-27b-3p的直接靶标。4.在SW1736和8305C细胞转染miR-27b-3p模拟物,通过qRT-PCR和WB实验观察靶基因mRNA以及蛋白水平的改变,以明确两者表达相关性。5.通过qRT-PCR和WB实验明确该靶基因在耐药细胞株与亲代细胞株中mRNA和蛋白的表达差异。6.构建并转染该基因的过表达质粒,观察耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。7.在SW1736和8305C细胞转染miR-27b-3p模拟物,qRT-PCR检测转染组和非转染组下游转录因子的mRNA表达水平,筛选出显着性差异表达的下游基因,ELISA实验检测其在耐药株与敏感株中的表达情况,并通过挽救实验验证其是否参与miR-27b-3p对ATC细胞阿霉素耐药性的调节。8.WB法分别检测耐药株细胞胞浆以及细胞核内磷酸化NF-κB p65的含量变化;在耐药细胞株SW1736/DOX和8305C/DOX中分别转染NF-κBp65的抑制剂BAY 11-7082,通过qRT-PCR检测miR-27b-3p及其靶基因的mRNA表达改变,以验证NF-κB p65是否通过影响miR-27b-3p对其靶基因的调控进而影响ATC细胞阿霉素耐药性。结果1.通过TargetScan数据库、miRDB数据库和miRTarBase数据库预测miR-27b-3p的靶基因,进行Venn分析,同时能在3个数据库可预测到的靶mRNA共17个。针对miR-27b-3p筛选到的mRNA基因进行功能富集分析,GO分析发现显着差异表达的基因在生物过程方面主要参与生殖系统发育、对制动应激反应、动物器官的再生、胚胎上皮形态的发生以及胎盘发育等;在细胞成分上主要集中在细胞质膜和膜的外源性组分、泛素配体复合物、非对称性突触、内质网腔等;在分子功能方面主要影响蛋白C末端结合、VEGF受体结合等。KEGG富集分析发现差异表达的基因主要集中在miRNA对恶性肿瘤的调控作用、MAPK信号通路、p53相关通路、甲状腺癌调控等方面。从KEGG信号通路分析我们可以看出,PPAR-γ与甲状腺癌密切相关,我们将筛选出的差异基因通过Gepia在线工具检索,发现PPAR-γ基因在甲状腺癌症组中相对于癌旁组显着低表达。前期的研究提示PPAR-γ基因高表达能提高甲状腺癌放射性碘治疗疗效,我们使用 TCGAbiolinks R 包下载 TCGA-THCA mRNA-seq readcount数据与临床样本数据,经分析发现PPAR-γ在甲状腺癌放疗组的表达较非放疗组明显下调。此外我们通过查阅文献,发现PPAR-γ还参与乳腺癌、卵巢癌、肺癌等化疗耐药性的形成。因此我们假设PPAR-γ是miR-27b-3p调控ATC化疗耐药性的一个重要靶标,故而选择miR-27b-3p/PPAR-γ来作为我们下一步研究的对象。2.采用TarScan4.0软件分析miR-27b-3p对PPAR-y的靶向作用,结果显示miR-27b-3p靶向作用于PPAR-γ的可能PCT值达到73,且context score的百分概率达到67。我们也采用miRanda数据库分析miR-27b-3p的作用靶点,结果显示miR-27b-3p的5’种子区有7个核苷酸与PPAR-y的3’-UTR完全互补,位于82-88碱基之间。3.在ATC细胞株转染miR-27b-3p mimics,qRT-PCR及WB实验结果显示:与对照组相比,转染组PPAR-γ的mRNA和蛋白水平均显着降低,差异有统计学意义（p<0.01）,表明过表达miR-27b-3p可以有效调控PPAR-y在甲状腺未分化癌细胞株中mRNA和蛋白的表达,两者呈显着负相关。4.在转染野生型pmirGLO-PPARG-3’UTR-wt报告基因质粒的两组细胞中,共转染miR-27b-3p mimics组的荧光素酶活性为空白对照组的45.2%,存在显着的统计学差异（p<0.01）;而在转染突变型pmirGLO-PPARG-3’UTR-mut质粒的两组细胞中,共转染miR-27b-3p mimics组和对照组的荧光酶素活性无显着差异,提示miR-27b-3p可以明显抑制含有PPAR-y 3’UTR的荧光素酶报告基因的表达,而这种抑制作用可以被结合位点5个核苷酸的突变所逆转。由此可见,miR-27b-3p对PPAR-γ存在靶向调控,表明PPAR-γ的确是miR-27b-3p的直接靶基因。5.RT-PCR及WB实验结果提示PPAR-γ在耐药株中的mRNA及蛋白水平显着低于亲代细胞株,差异具有统计学意义（p<0.01）。6.构建过表达PPAR-γ质粒并转染耐药细胞株SW1736/DOX及8305C/DOX,结果显示耐药株对阿霉素的IC50明显下降,提示过表达PPAR-γ可显着提高ATC细胞对阿霉素的敏感性。7.在ATC细胞株中转染miR-27b-3p mimics后,下游基因bFGF的mRNA表达明显降低,而c-Myc、Bcl2、VEGF的表达无显着差异,通过ELISA法测定转染组培养基中bFGF的浓度,得到了相同的结果。ELISA法检测耐药细胞株的bFGF表达显着低于亲本细胞株。提示miR-27b-3p水平上调对bFGF的表达有抑制作用,挽救实验证实过表达PPAR-γ可以逆转这种抑制作用。以上结果均提示bFGF受PPAR-γ正向调节,并可能参与miR-27b-3p/PPAR-γ轴对ATC细胞阿霉素敏感性的调控。8.耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中NF-κB p65的总蛋白和核蛋白水平均显着上升,提示耐药株细胞中NF-κB p65呈现活化状态。NF-κB p65受到抑制后,miR-27b-3p的表达也随着显着下调,而PPAR-γ的表达较对照组显着上调。以上结果提示,ATC耐药细胞中miR-27b-3p水平上调与NF-κB p65活化有关,NF-κB p65可能作为miR-27b-3p/PPAR-γ调控轴的上游调控基因对ATC耐药性产生影响。结论过表达PPAR-γ可以增加甲状腺未分化癌耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX对阿霉素的敏感性;PPAR-γ是miR-27b-3p的直接靶基因,miR-27b-3p可能通过靶向PPAR-γ参与调控ATC细胞阿霉素耐药性;NF-κB p65与bFGF分别作为miR-27b-3p/PPAR-γ轴的上游及下游信号分子,参与调控ATC细胞对阿霉素的耐药性。
刘燕[2]（2020）在《基于新型纳米PDT技术的肿瘤高效治疗策略及应用研究》文中提出癌症是导致人类死亡的首要原因之一,药物疗效的改善及肿瘤转移与复发的抑制等都是癌症治疗面临的重要难题,开发安全、高效、精准的纳米药物治疗技术和方法一直是癌症治疗研究的热点。纳米药物对肿瘤的治疗效果由药物颗粒在体内层级输运及相互作用的过程决定,其中纳米药物的载药量、肿瘤内富集效率、瘤内渗透程度、细胞内化剂量以及药效作用靶点结合效率、肿瘤细胞耐药性等都是制约纳米药物治疗效率的因素。虽然已经有大量的探索性研究,但是由于上述影响因素相互交织,因而难以给出清晰的影响规律。本论文基于课题组多年来对光动力PDT肿瘤治疗新技术的研究,利用其光敏即时响应的精准控释特性、发挥药效的单线氧浓度与释放速率的可控性,以及亚细胞器的靶向技术、具有良好生物相容性的表面修饰技术等,将稀土纳米PDT药物颗粒作为研究的纳米药物模型,分别针对论文中所提出的肿瘤高效治疗策略开展系统研究,具体如下:（1）纳米药物的协同靶向策略。构建UCNs-GOQD纳米PDT药物颗粒,其中UCNs可吸收近红外光,激发新型高效的纳米光敏剂GOQD释放单线氧。基于ROS作用距离极短（～150 nm）、线粒体是PDT高效作用靶点,分别从瘤体富集、细胞内化及线粒体精准定位等方面,研究细胞膜的透膜靶向剂FA（叶酸）、线粒体的靶向剂TPP（三苯基膦）的协同靶向效应。体外的Hela细胞实验表明,相对于FA或者TPP的单一修饰,FA/TPP层级靶向的纳米药物在细胞内的吞噬剂量分别增加了20%、40%,在线粒体位置的靶向效率分别提升了46%、50%,因而对Hela细胞具有更强的杀死效果。在体内小鼠肿瘤模型实验中,FA/TPP层级靶向的纳米药物在小鼠肿瘤内的富集含量相对于FA修饰提升了40%,相对于TPP修饰提升了75%,其在瘤体内线粒体靶向效率分别相对提升了16%和10%,从而对小鼠的Hela实体瘤具有更高效的抑制。表明协同靶向策略可以有效促进纳米药物颗粒的瘤内富集、细胞内化和精准定位以及肿瘤治疗效果。（2）纳米药物的细胞传递策略。在UCNs@Pp IX纳米PDT药物颗粒表面,同时引入生物相容性良好的赖氨酸齐聚物PLL和细胞膜的高效透膜靶向剂FA,以研究其在肿瘤细胞之间相互作用的特性以及瘤内渗透的特性。In-vitro实验发现,具有PLL/FA表面修饰的UCNs@Pp IX纳米颗粒可以在transwell体系的不同细胞层之间有效传递,并且其在Hela细胞内的吞噬剂量是氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）修饰的1.51倍,排出速度是APTS修饰的1.8倍;通过对胞内转运蛋白Rab的标记转染,PLL/FA修饰的纳米粒子与胞内循环转运蛋白Rab11的重合度可达到55%,而APTS修饰的纳米粒子仅为32%。表明PLL/FA修饰的纳米粒子在Hela细胞之间具有高效的转胞吞介导的细胞传递作用。在in vivo实验中,PLL/FA修饰的纳米粒子在肿瘤内的渗透程度更高;细胞内化效率可达到62.8%,是APTS修饰的2.6倍,且最终能够消除肿瘤。而当加入不同抑制剂时,细胞对PLL/FA修饰纳米颗粒的吞噬及排出剂量受到显着抑制,纳米粒子与胞内循环转运蛋白Rab11的定位效率也显着降低;与此同时,瘤内渗透效果减弱,细胞内化效率降低,治疗后瘤体出现残存。通过数据拟合发现in-vivo瘤内渗透程度与in-vitro细胞吞吐剂量存在正向依赖关系,表明细胞传递作用可以有效促进纳米药物颗粒在瘤内的深层渗透以及肿瘤治疗效果。（3）纳米药物的耐药规避策略。我们利用UCNs@Pp IX纳米PDT药物颗粒研究PDT纳米治疗技术对异质性和耐药性脑胶质瘤细胞以及相关小鼠皮下肿瘤模型的杀伤作用。研究发现,异质性脑胶质瘤细胞LN229、U87、T98G对临床标准一线化疗药物替莫唑胺TMZ的耐受性差异很大,细胞半抑制浓度IC50分别为194μM、485μM、1442μM,且LN229与U87细胞在低浓度TMZ诱导下会形成耐药细胞株LN229/TMZ（IC50升高至606μM）、U87/TMZ（IC50升高至980μM）。PDT纳米技术作用时,异质性细胞以及诱导耐药细胞对纳米PDT药物颗粒都比较敏感,IC50浓度均在70～92 ug/ml之间。在小鼠肿瘤治疗实验中,TMZ对不同瘤体模型的治疗效果差异很大,而纳米PDT药物颗粒对各类TMZ耐药/非耐药瘤体均表现出显着的肿瘤抑制及根除效果。利用Q-PCR技术研究细胞内耐药基因的调控情况发现,TMZ处理后,细胞内耐药基因显着上调,多重耐药通路被激活;纳米PDT药物颗粒处理后,抗凋亡蛋白显着下调,凋亡蛋白显着上调,引起细胞凋亡,而其它的耐药通路并没有受到明显调控。表明,纳米PDT治疗技术以其独特的毒性机制,直接诱导细胞凋亡,可以有效规避耐药通路的激活,从而实现对耐药瘤体的高效治疗。基于上述策略的研究结果,我们设计且制备了新型UCNs@Pp IX-PLL-FA纳米PDT药物颗粒,将药物光敏剂Pp IX连接在齐聚物PLL上,该纳米PDT颗粒的药物负载效率提高至25wt%～43wt%,远高于文献报道的14wt%;同时in-vivo实验表明:该纳米PDT药物颗粒能够在肿瘤内有效富集,深层渗透,且在肿瘤细胞中高效内化;另外通过anti-CD133标记发现,纳米PDT药物颗粒对干性Hela细胞与非干性Hela细胞均具有高效杀伤效果。该纳米PDT药物颗粒兼具上述三种策略,同时具有高效的药物负载,成功地以5.6 mg/kg（i.p.）的安全注射剂量,实现了对小鼠Hela瘤体模型的根除,且在40天没有复发,为安全高效的纳米PDT药物在临床中的应用转化提供了可能。
彭科[3]（2020）在《右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）后处理对原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）过程中心肌细胞损伤的影响。方法:（1）新生乳鼠原代心肌细胞的提取和培养。选取新生48小时内的Sprague Dawley（SD）大鼠提取和原代培养心肌细胞,并运用免疫荧光染色法鉴定心肌细胞的纯度。（2）不同浓度的右美托咪定对正常培养的原代心肌细胞的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组,0.1、1、10、50μM不同浓度的右美托咪定处理24小时组。与对照组相比,观察不同浓度的右美托咪定对正常状态下培养的心肌细胞是否存在细胞毒性。（3）不同缺氧复氧时间对原代心肌细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为7组（每组n=6）:对照组和6个H/R组。H/R组通过氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）建立细胞 H/R 模型,分别于缺氧 3、6、12 小时+复氧3小时（H3R3、H6R3、H12R3组）以及缺氧6小时+复氧6、12、24小时（H6R6、H6R12、H6R24组）的不同缺氧复氧时间点使用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒检测心肌细胞活力,确定本实验条件下细胞缺氧复氧模型的作用时间点。（4）不同浓度右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤后细胞活力和细胞毒性的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组,3个右美托咪定处理组。处理组中分别给予0.1、1、10μM不同浓度的右美托咪定后处理（即在复氧开始时加入到细胞培养基）,使用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测心肌细胞活力和细胞毒性,以确定本实验中最佳的右美托咪定后处理浓度。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时细胞凋亡的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。在复氧开始时给予1 μM的右美托咪定后处理,复氧结束后采用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡率。（6）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）、凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）和BCL2样蛋白X（BCL2-Associated X,BAX）蛋白表达水平影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用Western Blot检测各组HIF-1α、BCL-2、BAX蛋白水平的表达。（7）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和BAX在细胞内的定位的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用双标免疫荧光法检测各组心肌细胞内HIF-1α和BAX蛋白在细胞中的定位情况和表达水平。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）乳鼠原代心肌细胞正常培养至72小时,经免疫荧光染色鉴定其心肌细胞纯度达98%,可稳定供以下实验使用。（2）0.1、1、1 0 μM的右美托咪定对于正常培养的心肌细胞活力均无显着影响,而高浓度的右美托咪定（50μM）则使得细胞活力降低至对照组的82.42±2.39%（P<0.01）,说明右美托咪定大于50μM的浓度时会对原代心肌细胞产生一定的细胞毒性。（3）心肌细胞的活力在H3R3、H6R3、H12R3、H6R6、H6R12、H6R24的各个不同时间点和对照组细胞相比均明显下降（P<0.01）,选取缺氧6小时复氧3小时用于后续的细胞实验（此时细胞活力下降至对照组的63.21±1.74%）。（4）与H/R组相比,使用0.1、1、10μM的右美托咪定后处理显着改善H/R损伤后的心肌细胞活力,减少LDH释放量（P<0.01）。其中浓度为1 μM的右美托咪定后处理效果最好,细胞活力与H/R组相比为75.21±2.23%vs.60.00±1.11%（P<0.01）,培养基中 LDH 释放量与 H/R 组相比为 200.8±7.37%vs.267.5 ± 5.57%（P<0.01）。因此,选取1μM的右美托咪定用于后续的细胞实验。（5）流式细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,缺氧复氧过程显着增高原代心肌细胞的凋亡率至38.60±0.90%（P<0.01）,而使用1 μM右美托咪定后处理可以使H/R损伤后的心肌细胞凋亡率降低至20.94±0.96%（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示,H/R组细胞HIF-1α和BAX的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,而BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX的比值显着降低（P<0.01）。右美托咪定后处理显着降低了 HIF-1α和BAX蛋白的表达水平（P<0.01）,并且翻转了 BCL-2蛋白表达（P<0.05）以及BCL-2/BAX的比值（P<0.01）。（7）双标免疫荧光实验结果显示,HIF-1α与BAX蛋白的表达在原代心肌细胞内存在共定位关系。在H/R组中,HIF-1α和BAX的荧光表达强度较对照组显着升高（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低了H/R损伤时HIF-1α和BAX的荧光表达水平（P<0.01）。结论:1 μM右美托咪定后处理可以显着减轻乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤,具体表现为改善H/R损伤导致的细胞活力下降、减轻细胞毒性、抑制LDH释放量、以及降低细胞凋亡率。右美托咪定后处理在细胞水平上减轻缺氧复氧损伤的保护作用很可能与其抑制HIF-1α蛋白的表达,调节凋亡相关蛋白的水平,从而抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡有关。第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制目的:进一步探讨右美托咪定后处理是否通过调控HIF-1α的转录活性、抑制细胞凋亡、从而减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤及其分子机制。方法:（1）HIF-1α 脯氨酰羟化酶 2（prolyl hydroxylase-2,PHD2）抑制剂 IOX2 对原代心肌细胞常氧和H/R状态下HIF-Iα和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+IOX2组。IOX2是一种特异性的HIF-1α PHD2抑制剂,可通过抑制HIF-1α的降解从而增强其转录活性。IOX2的使用浓度为50μM,在复氧开始时使用右美托咪定前加入到细胞培养基之中。使用Western Blot方法检测HIF-1α、Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19kD interacting protein 3,BNIP3）、半胱氨酸蛋白酶-3 剪切体（cleaved caspase-3）蛋白水平的表达。（2）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为0.1%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）,用于溶解IOX2。使用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力。（3）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时线粒体膜电位的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。使用JC-1荧光染色法检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）水平。正常线粒体膜中,JC-1以聚合体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出红色荧光;而凋亡细胞的线粒体膜电位ΔΨm下降或消失,JC-1以单体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。通过分析不同状态下JC-1红色/绿色荧光的比值可以得到细胞线粒体膜电位的相对数值,线粒体膜电位下降提示线粒体的结构性损伤。（4）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot 检测各组细胞 HIF-1α和 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、聚 ADP-核糖聚合酶 1 剪切体（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1,cleaved PARP-1）蛋白水平的表达。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX 组。使用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组细胞内HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平。（6）通过质粒转染正常培养的原代心肌细胞以证实HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。合成目的基因 HIF-1α DNA,将其构建到质粒载体 pLenti-GⅢ-CMV-GFP-2A-Puro上:并合成启动子BNIP3 promoter和BNIP3启动子突变体,将其构建到双荧光酶素报告质粒载体 pLenti-miniCMV-RenLuc-PGK-Luc-SV40-GFP-2A-Puro 上。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:BNIP3启动子组、BNIP3启动子+空载质粒组、BNIP3启动子+HIF-1α质粒组、BNIP3启动子突变+HIF-1α质粒组。将质粒转染正常培养的心肌细胞24小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达强度,并使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转录因子HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。（7）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时BNIP3启动子活性的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+DEX组、H/R组、H/R+DEX 组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。将报告基因 BNIP3 promoter质粒分别转染以上细胞24小时之后,按照分组情况对细胞进行H/R、DEX、IOX2的处理。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测BNIP3启动子的活性。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,IOX2使正常培养的原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达水平明显着升高为对照组的254.4±22.37%（P<0.01）。在H/R状态下,IOX2仍有进一步升高HIF-1α的趋势,但差异不具有统计学意义（431.1±37.86%vs.353.2±35.61%,P>0.05）。同时,IOX2并不影响BNIP3和cleaved caspase-3在正常培养的细胞和H/R状态下细胞中的表达。该结果说明IOX2可以有效的稳定HIF-1α的表达水平而并不增加细胞凋亡。（2）IOX2对于正常培养的心肌细胞活力没有明显影响。H/R造成细胞活力显着下降至对照组的60.26 ± 2.17%（P<0.01）,使用1 μM的右美托咪定后处理使细胞活力升高为77.72±1.63%（P<0.01）,而IOX2使用后细胞活力又下降为63.10±2.36%（P<0.01）。因此,IOX2逆转了右美托咪定后处理的作用,说明右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致的心肌细胞活力下降。（3）线粒体膜电位JC-1染色结果显示,H/R使原代心肌细胞的线粒体膜电位ΔΨm显着下降,即较高的绿色JC-1单体/红色JC-1聚合体比值。1μM的右美托咪定后处理减轻了线粒体膜电位ΔΨm的下降,使得红色JC-1聚合体增加,绿色JC-1单体减少。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对线粒体膜电位ΔΨm的效果（P<0.01）。这提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡过程中线粒体结构损伤。（4）Western Blot结果显示,1 μM的右美托咪定后处理使H/R时原代心肌细胞的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,而BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡相关蛋白的改变。（5）qPCR结果显示,H/R时HIF-1α和BNIP3的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。1μM的右美托咪定后处理显着降低了 H/R时的BNIP3的激活（P<0.01）,但并没有明显改变HIF-1α的mRNA表达水平。该结果提示右美托咪定后处理在HIF-1α的转录后水平而非mRNA水平抑制了 HIF-1α蛋白对靶基因BNIP3的激活。（6）正常培养的心肌细胞转染BNIP3启动子/启动子突变体、HIF-1α质粒24小时后,双荧光酶素报告基因结果显示BNIP3启动子+HIF-1α质粒组的荧光素酶活性显着升高（P<0.01）,BNIP3启动子突变+HIF-1α DNA质粒组的荧光素酶活性与之相比则显着降低（P<0.01）。该结果说明合成的BNIP3启动子可以被HIF-1α DNA激活,该质粒系统的构建有效。（7）双荧光酶素报告基因结果显示,H/R时荧光素酶活性显着升高、BNIP3启动子被激活（P<0.01）,1 μM的右美托咪定后处理则降低了 H/R引起的高荧光素酶活性（P<0.01）。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对BNIP3启动子活性的抑制作用（P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α的转录活性抑制了 H/R导致的BNIP3启动子的激活。结论:特异性HIF-1α脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2可以稳定HIF-1α蛋白的表达水平,同时对乳鼠原代心肌细胞的活性和细胞凋亡没有不良影响。1 μM的右美托咪定后处理可以改善H/R后原代心肌细胞的活力、恢复线粒体膜电位、减轻线粒体结构损伤、调控凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平、并在转录后水平抑制了 HIF-1α对靶基因BNIP3的激活。然而,IOX2逆转了上述效果,阻断了右美托咪定后处理对原代心肌细胞缺氧复氧的保护作用。综合本部分机制研究的结果,右美托咪定后处理通过在转录后水平作用于HIF-1α此关键靶点,抑制其对下游靶基因的激活,抑制凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而在细胞水平减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤。第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:阐明右美托咪定后处理对大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）过程中心肌损伤和凋亡相关蛋白表达的影响,并进一步证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号通路发挥对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:（1）大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-lα蛋白表达随再灌注时间的变化。取24只健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（每组n=6）:假手术组、心肌缺血30分钟再灌注2小时、6小时、和24小时组。使用Western Blot检测再灌注2、6、24小时大鼠左心室组织中HIF-1α的蛋白表达水平,取其表达变化最显着的时刻作为后续实验的观察时间点。（2）右美托咪定后处理和IOX2对心肌缺血再灌注过程中大鼠心率的影响。使用MedLab生物医学信号处理系统监测大鼠心电图的变化。取42只健康成年雄性SD大鼠随机分为7组（每组n=6）:假手术组、假手术+DEX组、I/R组、I/R+IOX2组、I/R+DEX组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO）+30%聚乙二醇300（PEG300）,用于溶解IOX2。再灌注开始时,经过右颈内静脉泵注右美托咪定负荷剂量6 μg/kg/h持续10分钟,追加维持剂量0.7μg/kg/h持续15分钟。IOX2组中,使用右美托咪定前经大鼠腹腔给予25μg/mg的IOX2。记录基础值、缺血15和30分钟、再灌注15、30、60分钟的心率值,并比较心率随时间变化的曲线下面积以观察心率在此期间整体的变化。（3）右美托咪定后处理和IOX2对大鼠心肌缺血再灌注过程中动脉血气、电解质、酸碱平衡的影响。上述7组大鼠于再灌注6小时经腹主动脉取血,行动脉血pH、动脉血氧分压（partial pressures of oxygen,PaO2）、动脉血二氧化碳分压（partial pressures of carbon dioxide,PaCO2）、动脉氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,Hct）、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、碱剩余（base excess,BE）的分析,以了解各组动物在实验过程中内环境的是否稳定。（4）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组 n=6）:假手术组、假手术+DEX 组、I/R 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。给药方式同第（2）部分。于再灌注6小时取下腔静脉血,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清cTnI的水平,以明确各组大鼠心肌损伤的程度。（5）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌组织凋亡的影响。上述6组大鼠于再灌注6小时取左心室组织,行冰冻切片。并使用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）标记凋亡细胞断裂基因组 DNA的3’-OH末端,在荧光显微镜下检测各组大鼠心肌绀织的凋亡情况。（6）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌梗死面积的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。于再灌注 6小时,左心室组织行2%伊文氏蓝/1%氯化二苯四氮唑（Evans blue/2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色,分析心肌组织缺血危险区（area at risk,AAR）和心肌梗死区（infarct area,IA）的面积,心肌切片后以称重法分别记录其重量,心肌梗死面积最终以IA 区的承量占AAR区的市量的百分比（IA总重量/AAR总重量×100%）来表示。（7）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。取36只雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot检测缺血再灌注、右美托咪定、IOX2干预后各组大鼠心肌组织中HIF-1α和凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平的变化。（8）心肌缺血再灌注实验过程中各组大鼠死亡率的比较。记录和比较以上所有7部分实验中,在未达到实验终点前由于任何原因引起的的大鼠死亡情况。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,缺血30分钟再灌注2、6、24小时的三组大鼠心肌组织内HIF-1α蛋白表达均较假手术组显着升高（P<0.01）,且再灌注6小时组的表达量显着高于2小时组（P<0.01）和24小时组（P<0.05）。因此,选取缺血30分钟再灌注6小时作为最佳时间点应用于后续大鼠实验。（2）心电图及心率监测结果显示,心肌缺血再灌注过程引起了大鼠心电图的显着变化,即缺血时ST段显着抬高、再灌注时出现快速型心律失常如室性心动过速、甚至室颤。右美托咪定后处理对于ST段变化和心律失常没有显着影响。实验过程中右美托咪定组的大鼠心率有减慢的趋势,但组内和组间比较的差异都不具有统计学意义（P>0.05）,各组的曲线下面积（心率×时间）也相似。（3）血气、电解质、血红蛋白的结果显示,再灌注6小时各组大鼠的动脉血pH、Pa02、PaCO2、SaO2、Hb、Hct、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、BE 数值都在正常范围。与假手术组相比,经受心肌I/R的大鼠PaCO2、HCO3-、BE的数值偏低,但组间比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此,实验过程中大鼠的内环境保持稳定。（4）血清cTnI检测结果显示,I/R组大鼠血清cTnI浓度显着升高为9.78±0.42 ng/ml（P<0.01）,右美托咪定后处理则使cTnI降低至5.07±0.33 ng/ml（P<0.01）,但I/R+DEX+IOX2组又升高为8.19±0.43 ng/ml（P<0.01）。右美托咪定后处理显着减少了大鼠心肌I/R导致的cTnI释放,该保护作用被IOX2逆转,提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌组织损伤。（5）TUNEL凋亡检测结果显示,I/R组大鼠心肌组织凋亡率为36.67±1.97%（P<0.01）,右美托咪定后处理组则降低至15.59±0.80%（P<0.01）,而I/R+DEX+IOX2组又升高为28.74±1.38%（P<0.01）。此结果证明右美托咪定后处理通过调控HIF-1 α减轻I/R导致大鼠心肌组织的凋亡。（6）Evans Blue/TTC双染检测结果显示,除假手术组外的各组大鼠心肌缺血危险区AAR的面积在45%左右,组间具有可比性（P>0.05）。I/R组和I/R+IOX2组大鼠的心肌梗死面积显着升高为39.27±0.72%和41.53±1.50%（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低梗死面积至20.20±2.07%（P<0.01）,而IOX2又使梗死面积增加至33.90±2.06%（P<0.01）。因此,右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌梗死面积。（7）Western Blot的结果显示,右美托咪定后处理使I/R时心肌组织的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,而IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α蛋白减轻I/R导致大鼠心肌凋亡相关蛋白的改变。（8）整个实验过程中总共有9只大鼠在实验终点前死亡。死亡原因包括失血、严重心律失常（室性心动过速和室颤）、呼吸衰竭。死亡率分别为:假手术组（1/25,即4.0%）、假手术+DEX组（0/6,即0%）、I/R组（2/38,即5.26%）、I/1R+IOX2组（2/20,即 10%）、I/R+DEX 组（1/1 9,即 5.26%）、I/R+DEX+IOX2 组（2/20,即10%）、I/R+DEX+溶剂组（1/19,即5.26%）。各组死亡率的组间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:右美托咪定后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为降低血清cTnl水平、减轻心肌组织凋亡、减少心肌梗死面积、调控凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平。特异性 HIF-1α 脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2则逆转了右美托咪定后处理的心肌保护作用和以上指标的变化。综合本部分研究结果,右美托咪定后处理通过作用于HIF-1α此关键靶点减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。
王新斌[4]（2020）在《基于miRNA探讨右归丸对激素抵抗型肾病综合征大鼠的增敏作用及机制研究》文中研究说明研究背景与目的:激素抵抗型肾病综合征（SRNS）致病因素复杂,临床治疗较为棘手,疗效不尽如人意,随着病情的变化,常易发展为终末期肾病而危及患者的生命。足细胞损伤与慢性肾病发生、发展密切关联,足细胞相关蛋白、基因突变及表达异常是SRNS发生的关键环节。有研究表明,miRNA表达失调与肾病有关,成熟的Dicer酶可以通过一些非编码的微小RNA来介导调节SD分子的应答。故调控Dicer-miRNA通路,使SD分子的表达得以改善,减少蛋白尿。右归丸可通过减毒增敏来减缓SRNS肾病足细胞的损伤,发挥减少尿蛋白和保护肾脏的作用,其分子机制尚未完全阐明。方法:1.64只雄性SPF级Wistar大鼠适应性饲养1周,按体重随机分为空白组（Control,12只）和造模组（52只）。造模成功后随机分为模型组（Model）;泼尼松组（PAT）;泼尼松+右归丸高、中、低组（PAT+YGh、PAT+YGm、PAT+YGl）。一次性尾静脉注射阿霉素6mg/kg（10mg/支,用0.9%氯化钠溶液2ml稀释成浓度为5mg/ml）,同时给予臀部肌肉注射氢化可的松25mg/kg/d（50mg/支,用0.9%氯化钠2ml溶液稀释成浓度为25mg/ml）,2周,复制阿霉素肾病肾阳虚证模型。空白组大鼠左右后肢交替肌注等剂量生理盐水。2.各组大鼠成功造模2周后,固定时间灌胃,持续6周。分别于造模前、造模后14天、药物干预后14、28、42天代谢笼收集各实验大鼠24小时尿液标本,记录尿量。实验第55天晚上8点测定大鼠自主活动,开启自主活动仪测定5min的活动次数与抬头次数。第56天各组实验大鼠心脏采血,全自动生化分析仪检测血生化指标。3.实验第56天,局麻摘取双肾,将大鼠左侧肾脏切除取上下级分别加入4%戊二醛、4%多聚甲醛固定液固定组织,用于电镜、光镜、免疫荧光镜;右肾储存于-70oC冰箱,肾小球cRNA提取,用于基因芯片检测及RT-PCR相互验证。4.HE、PAS、PASM-Masson观察肾组织病理变化;免疫组化、western-blotting、real-time PCR等方法检测肾组织中dicer、nephrin、podocin、CD2AP、synaptopodin、Bax?Bcl-2?caspase-3蛋白及mRNA的表达。结果:1.大鼠一般状态造模后第7d大鼠腹腔中出现少量腹水,同时每日排出尿量减少,精神状态欠佳,食量减少,体重停止增长且下降。2周大鼠腹水明显增多,出现大量尿蛋白,且24h尿蛋白定量>100mg/kg,同时大鼠出现嗜睡、反应迟钝,有弓背耸肩现象,蜷卧少动,体毛发灰发暗,大便稀溏等中医阳虚体征。提示SRNS模型大鼠复制成功。2.血肌酐、血尿素氮、总蛋白、白蛋白、24h尿蛋白、血脂检测结果各干预组均有不同程度的改善,右归丸中剂量组减少尿蛋白量、降低血脂疗效优于各干预组,各治疗组血肌酐、血尿素氮降低有统计学意义（p<0.05）。3.肾小球病理形态改变光镜下空白组肾小球结构形态稳定;模型组肾小球略显肿胀,基底膜不规则增厚,系膜细胞轻度增生,肾小管内出现透明的管型;各治疗组肾小球病理形态的改变介于空白组与模型组之间。电镜下发现足细胞有足突融合、消失的改变,空白组足细胞未发现异常改变;且在电镜下,右归丸中剂量组对减轻足细胞融合,足细胞恢复效果明显。4.miRNA芯片分析结果模型组与空白组相比较,差异表达的miRNA 23个,且高表达miRNA 15个、低表达miRNA 8个;与模型组比较,右归丸干预组中高表达的miRNA9个,低表达miRNA 6个,其中SRNS肾病大鼠模型组织中rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P表达上调,rno-mir-205表达下调,经右归丸治疗后,上调的rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P得到抑制,而下调的rno-mir-205得到增强。通过real-time PCR对特异基因相互验证结果显示:模型组rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P与空白组rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P表达量比分别为1.94、2.53倍;rno-mir-205表达量其模型组与空白对照组的比值为0.28,所得结果与基因芯片接近,证实以上所筛选miRNA是SRNS最有代表性的miRNA。5.Dicer酶、SD蛋白分子的检测结果SRNS大鼠肾组织中Dicer酶免疫荧光强度、蛋白与mRNA表达均上调,而nephrin、podocin、CD2AP与synaptopodin结果相反,二者呈负相关。提示dicer酶通过Dicer-miRNA负向调控足细胞裂隙孔膜相关蛋白分子,同时骨架蛋白表达减少及足细胞的凋亡与miRNA有一定的相关性。6.右归丸干预后dicer、nephrin、podocin、CD2AP免疫荧光、蛋白与核酸的表达结果与模型组比较,右归丸组肾组织Dicer酶免疫荧光强度减弱,呈线状分布,核酸与蛋白表达下降,而SD相关分子免疫荧光表达增强,呈颗粒状分布,mRNA与蛋白表达量均升高。7.细胞凋亡相关因子免疫荧光、蛋白与mRNA的表达检测结果与空白组比较,模型组Bax、caspase-3免疫荧光强度均增强,蛋白及mRNA表达均升高（p<0.05）,而Bcl-2表达降低（p<0.05）,各干预组对Bax/Bcl-2、caspase-3表达水平均有改善,但右归丸干预各组Bax、caspase-3蛋白及mRNA表达下调,Bcl-2蛋白和mRNA表达明显上升（p<0.01）。说明右归丸通过骨架蛋白及细胞凋亡因子发挥保护足细胞作用,这一作用与右归丸对类固醇激素的增敏作用有关。结论:1.本实验在复制激素抵抗型肾病综合征动物模型时采用“病证结合”的方式,即单次尾静脉注射阿霉素6mg/kg建立FSGS肾病模型,同时肌注氢化可的松25mg/kg,造成肾阳虚证,成功地模拟典型的SRNS临床病证,效果确切。2.基因芯片对SRNS大鼠肾组织中miRAN筛选显示,SRNS肾病大鼠皮质中23个miRNAs特异性表达,其中15个高表达,8个低表达,Fold Change从0.3到3.4。筛选出SRNS特征性miRNA:rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P的表达显着上调,提示这些miRNA可能参与足细胞损伤。rno-mir-205在激素抵抗型肾病综合征模型大鼠中低表达,提示miRNA可能通过抑制足细胞凋亡和增强激素对药物的敏感性而发挥作用。3.SRNS肾病大鼠足细胞裂孔隔膜分子及骨架蛋白的表达是通过Dicer酶介导miRNA负向来调控。足细胞的损伤及足细胞的凋亡还可能通过Dicer-miRNA来参与。提示Dicer-miRNA是防治SD蛋白分子与尿蛋白异常的靶向点。4.右归丸可下调激素抵抗型肾病综合征模型大鼠Dicer表达,同时右归丸对SRNS肾病大鼠足细胞裂孔隔膜分子nephrin、CD2AP、podocin及骨架蛋白synaptopodin表达的影响可能是通过Dicer-miRNA途径来调控。提示Dicer、rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P可能是右归丸治疗SRNS肾病,维护保护肾小球滤过屏障,保护足细胞,减少蛋白尿的靶点。5.右归丸可抑制SRNS大鼠肾组织中Bax升高,Bcl-2的下降,修复足细胞Bax/Bcl-2平衡态,降低凋亡标志性蛋白caspase-3活性,改善足突融合,从而维持足细胞数目的稳定,保护足细胞免于凋亡。6.右归丸各剂量组均可改善激素抵抗型肾病综合征蛋白尿、改变低蛋白血症、降低胆固醇和甘油三酯的水平,减轻足细胞足突融合、降低或减少细胞膜外基质积聚、肾小球系膜增生及肾小管上皮细胞变性等发挥减毒增敏作用。然右归丸中剂量组疗效显着。
陈镝[5]（2020）在《荜茇酰胺提取分离及抗乳腺癌的作用机制》文中指出乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,造成了沉重的医疗负担和社会负担。乳腺癌的治疗方案包括手术、放射治疗、内分泌治疗、靶向治疗以及化学治疗。目前,化疗仍是乳腺癌临床治疗的主要方案,但其毒副作用较大、易导致耐药的问题一直缺乏改善,导致预后很差。因此,寻找新的药物与其联用从而改善这些问题就显得尤为紧迫。荜茇酰胺（piperlongumine,PL）被报道具有选择性的抗癌活性,但其在国产荜茇根中的分布,以及单用和联用时杀伤乳腺癌的机制仍有待深入调查。本论文依次研究了荜茇酰胺的提取分离、荜茇酰胺单用以及与胡椒碱、阿霉素联用的抗癌作用和机制。第一,研究了国产荜茇根中的生物碱成分。4.5 kg荜茇根购自云南并经形态学鉴定,粉碎后经乙醇提取和减压浓缩,得到470 g浸膏。溶解浸膏,用硅胶柱色谱分离,以石油醚、乙酸乙酯、甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱,得到3相提取物,其中石油醚相24g,乙酸乙酯相203 g,甲醇相232g。各相使用不同比例的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱并逐相分离,共得到15种成分。通过碘化铋钾显色反应确定其中4种成分为生物碱类化合物。通过核磁解析确定4种生物碱分别为荜苃酰胺（12.8 mg）、胡椒碱（piperine,PP）（8.59 g）、胡椒内酰胺A（70.4mg）、胡椒内酰胺D（20.4mg）。上述结果表明,国产荜茇根含有丰富的生物碱,其中荜茇酰胺和胡椒碱为抗癌活性成分。第二,研究了荜茇酰胺在体外和体内抗乳腺癌的作用和机制。细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验显示,荜茇酰胺能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7增殖并诱导其凋亡,而对正常乳腺细胞MCF-10A的作用较弱,表现出一定抗癌选择性。蛋白免疫印迹实验显示,荜茇酰胺能有效抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞中信号转导与转录激活子 3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）的活化,从而调控STAT3下游不同信号通路分子的表达,最终诱导细胞凋亡,并且这种调控作用依赖于活性氧（reactive oxygen species,ROS）。裸鼠造模实验显示,4mg/kg和12mg/kg荜茇酰胺均能够有效降低裸鼠肿瘤体积和重量,并下调肿瘤组织中p-STAT3表达,但高剂量组的抑癌作用并未显着强于低剂量组。苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色实验显示,荜苃酰胺在相应剂量下对裸鼠均无显着的器官毒性。上述结果表明,荜茇酰胺可有效抑制乳腺癌细胞增殖,并具有良好的选择性和体内安全性。第三,研究了荜茇酰胺和胡椒碱联合应用抗乳腺癌的作用和机制。细胞增殖实验显示,荜茇酰胺和胡椒碱均能抑制乳腺癌细胞增殖,荜茇酰胺的活性显着强于胡椒碱,且表现出一定抗癌选择性,细胞凋亡实验证实了这一结论。联合指数（combination index,CI）分析实验显示,荜茇酰胺和胡椒碱在中低剂量联用时（PP 50 μM+PL 5 μM、PP 100μM+PL 5μM）在 MDA-MB-231、MCF-7细胞中的CI值均小于1,而在MCF-10A细胞中则大于1,表明两药在该剂量下对乳腺癌细胞具有选择性的协同抑制作用,两药联合的细胞凋亡实验证实了这一结论。蛋白免疫印迹实验显示,当两药单用时,荜茇酰胺可抑制MDA-MB-231细胞中p-STAT3表达,而胡椒碱则上调了 p-STAT3表达。当两药联用时,p-STAT3表达显着下降,表明荜茇酰胺和胡椒碱产生了协同抑制STAT3活化的作用,这种协同调控作用并未发生在正常乳腺细胞中。裸鼠造模实验显示,4mg/kg荜茇酰胺和10mg/kg胡椒碱联用时能够有效降低裸鼠肿瘤体积和重量,并协同抑制肿瘤组织中p-STAT3表达。HE染色实验显示,荜茇酰胺和胡椒碱在相应剂量下对裸鼠均无显着的器官毒性。上述结果表明,荜茇酰胺和胡椒碱可协同抑制乳腺癌细胞增殖,并具有良好的选择性和体内安全性。第四,研究了荜茇酰胺和阿霉素（doxorubicin,DOX）联合应用抗三阴性乳腺癌的作用和机制。细胞增殖实验显示,荜茇酰胺和阿霉素均能抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,阿霉素的活性显着强于荜茇酰胺,细胞凋亡实验证实了这一结论。CI分析实验显示,荜茇酰胺和阿霉素在低剂量联用时（PL 5μM+DOX 0.5μM）在 MDA-MB-231、MDA-MB-453 细胞中的 CI 值分别为0.57和0.61,表明两药在该剂量下对三阴性乳腺癌细胞具有良好的协同抑制作用,两药联合的细胞凋亡实验证实了这一结论。蛋白免疫印迹实验显示,当两药单用时,荜茇酰胺可抑制两种细胞中p-STAT3表达,而阿霉素则显着上调了 p-STAT3表达。相较于阿霉素单用,两药联用时抑制了 p-STAT3表达,即荜茇酰胺可逆转阿霉素活化STAT3的不利调控作用。裸鼠造模实验显示,4 mg/kg荜茇酰胺和0.8 mg/kg阿霉素联用时能够有效降低裸鼠肿瘤体积和重量。此外,荜茇酰胺可逆转肿瘤组织中阿霉素上调p-STAT3的不利调控作用。HE染色实验显示,荜茇酰胺和阿霉素在相应剂量下对裸鼠均无显着的器官毒性。上述结果表明,荜茇酰胺和阿霉素可协同抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,并具有良好的体内安全性。综上所述,本论文从国产荜茇根中分离出荜茇酰胺;揭示了荜茇酰胺通过氧化应激效应抑制STAT3活化进而介导三条信号途径诱导乳腺癌细胞凋亡的机制;论证了荜茇酰胺和胡椒碱、阿霉素协同抗乳腺癌的作用和机制。本论文的研究表明,荜茇酰胺抑制STAT3活化的作用将有助于降低阿霉素的毒副作用并改善其耐药问题,为乳腺癌的临床治疗提供了新的思路。
雷子贤[6]（2020）在《miRNA在白癜风血浆中的差异表达及其功能研究》文中研究指明目的:筛选白癜风血浆中差异表达的mi RNA,基于白癜风免疫致病机理进一步筛选相关mi RNA,验证差异表达的mi RNA;预测差异表达mi RNA的靶基因并进行筛选,分析差异表达mi RNA与靶基因的表达关系;分离并培养原代黑素细胞,通过细胞水平的功能学实验探究过表达或抑制差异表达mi RNA后对细胞的生物学功能影响及对其靶基因在m RNA和蛋白水平表达的影响,采用双荧光素酶报告基因实验分析差异表达mi RNA和其靶基因的调控机制。方法:通过mi RNA芯片检测血浆中mi RNA的表达情况,采用免疫致病机理相关的mi RNA PCR Array检测血浆中mi RNA的表达水平,利用q RT-PCR进行血浆中差异表达mi RNA的表达验证;基于Target Scan在线预测差异表达mi RNA的靶基因,采用生物信息学技术加权基因共表达网络分析筛选白癜风相关基因,选取差异表达mi RNA的靶基因;分离培养原代黑素细胞,合成差异表达mi RNA的类似物和抑制物,转染到原代黑素细胞中,通过CCK-8法、流式细胞术检测转染前后原代黑素细胞的增殖、凋亡等生物学行为的变化,进一步在m RNA水平和蛋白水平通过q RT-PCR及western blot技术分别检测转染前后差异表达mi RNA靶基因的表达水平变化情况,采用双荧光素酶报告基因实验探究差异表达mi RNA与其靶基因的调控机制。结果:在白癜风血浆中,相对于正常对照,mi RNA芯片筛选出mi R-223-3p、mi R-6089、mi R-6800-5p、mi R-2861、mi R-328-5p、mi R-5703、mi R-574-5p、mi R-6125、mi R-630、mi R-8069,免疫致病机理相关的mi RNA PCR Array筛选出mi R-223-3p、mi R-15b-5p、let-7e-5p、let-7g-5p、mi R-20a-5p,这两者共同筛选到mi R-223-3p,经过q RT-PCR检测验证,相对于正常对照,mi R-223-3p在白癜风血浆中表达明显升高。对mi R-223-3p的靶基因进行预测与筛选,基于生物信息学技术,初步筛选到FOXO3,经在白癜风公共数据集GSE75819、GSE53146、GSE90880中检测FOXO3的表达水平均为下调趋势。细胞水平的功能学实验显示:在原代培养的黑素细胞中过表达mi R-223-3p后,明显抑制了黑素细胞的增殖能力,促进了细胞的凋亡;而抑制mi R-223-3p的表达后则表现为与过表达相反的效应。同时,过表达mi R-223-3p后FOXO3在m RNA和蛋白水平表达均明显降低。双荧光素酶报告基因实验结果表明,mi R-223-3p通过与FOXO3基因的3’UTR区直接结合而参与调控原代黑素细胞的增殖与凋亡。结论:在白癜风血浆中mi R-223-3p特异性高表达,mi R-223-3p靶向作用于FOXO3,与FOXO3基因的3’UTR直接结合,mi R-223-3p负向调控FOXO3表达,参与调控原代黑素细胞的增殖与凋亡,有望为白癜风的治疗靶点及研究方向提供新的选择。
宋乐[7]（2020）在《菲并咪唑衍生物的抗肿瘤活性及其诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡的作用机制》文中进行了进一步梳理在当前世界疾病谱中,恶性肿瘤位居死因顺位前列,成为严重危害人类生命健康的重要疾病之一。多样化的治疗策略中,化学药物治疗仍占据肿瘤治疗的核心地位。常用抗肿瘤药物虽然对肿瘤细胞有着较强的抑制作用,但对于正常组织的毒副作用以及长时间应用后产生的耐药性限制其临床应用。因此,寻找具有良好抗肿瘤活性且对正常组织毒性低的药物,成为当前研究者的工作重点与难点。据报道,咪唑环是含富电子的含氮杂环,有利于其衍生物与多种治疗靶标结合,在抗肿瘤、抗菌和抗病毒等方面表现良好的生物活性。另外,1,10-邻菲啰啉是研究较为广泛的N-杂环平面鳌合剂之一,良好的刚性平面结构和大共轭结构能影响DNA结构,在抗肿瘤、抗菌等方面也有着广泛应用。本课题在此理论基础上,合成了一系列菲并咪唑衍生物,筛选出体外抗肿瘤活性较好的化合物,并通过细胞生物学、分子生物学和实验动物模型探究其体内抗肿瘤活性及其抗肿瘤作用机制。本文的具体研究工作如下:（1）通过改变菲并咪唑衍生物上的取代基团及取代基团位置,设计合成了一系列含不同卤素元素的菲并咪唑衍生物,并运用电喷核磁共振技术（NMR）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）对目标化合物的结构进行表征。（2）采用噻唑蓝比色法（MTT法）评价菲并咪唑类衍生物（1-6）对多个肿瘤细胞株的抗肿瘤活性,结果发现菲并咪唑类衍生物对不同肿瘤细胞株具有良好的抗肿瘤作用,尤其是化合物4对人鼻咽癌CNE-1细胞具较强的生长抑制作用,并且对比人正常角化细胞HaCaT毒性较低。（3）运用斑马鱼肿瘤异种移植模型研究化合物4的体内抗肿瘤活性,结果表明化合物4（3和6μM）能够抑制人鼻咽癌CNE-1细胞在斑马鱼的体内增殖与转移,并且化合物4浓度≤8μM时对斑马鱼胚胎没有明显毒性效应。（4）运用细胞生物学、分子生物学技术研化合物4的抗肿瘤作用机制。流式细胞术和TUNEL-DAPI双染检测表明化合物4能够诱导CNE-1细胞凋亡。单细胞凝胶电泳和γH2AX免疫荧光实验均证实化合物4可诱导CNE-1细胞DNA损伤。线粒体膜电位和细胞内活性氧（ROS）水平的检测结果表明化合物4能够导致CNE-1细胞线粒体膜电位下降,还能够使细胞内ROS水平升高。综上所述,本论文成功合成菲并咪唑衍生物（1-6）,其中化合物4能够诱导CNE-1细胞DNA损伤,并且通过提高细胞内ROS水平引起线粒体功能障碍,最后导致CNE-1细胞凋亡。因此,我们认为化合物4有潜力发展为通过线粒体介导鼻咽癌细胞凋亡诱导剂。
陆林[8]（2020）在《miR-505靶向下调HMGB1抑制Akt通路调控肝癌细胞增殖、凋亡及阿霉素诱导的细胞毒性》文中认为目的:肝细胞癌（HCC）以恶性度高及预后差为特点,对于晚期肝细胞癌患者全身化疗是延长生存期的最常用治疗策略。对肝细胞癌的分子生物学研究能够发掘早期诊断的标志物,并用来评价预后,作为治疗的靶点,并能使化疗增敏,减少化疗药的应用剂量。阿霉素（ADM）是晚期肝癌治疗中最主要的化疗药物,但阿霉素耐药是影响化疗效果的主要因素。miRNA参与大部分肿瘤的增殖、凋亡及侵袭等恶性行为,并对肿瘤化疗耐药具有调控作用。在HCC患者的血清中,miR-505表达改变,而高迁移族蛋白1（HMGB1）对肝癌的化疗具有致耐药作用,经过生物信息学预测,二者具有靶向调节关系。目前还没有miR-505在肝癌细胞中的作用及机制研究。本研究对miR-505与HMGB1在肝癌细胞增殖、侵袭、EMT及凋亡等恶性行为进行了检测,并观察了miR-505对阿霉素诱导肝癌细胞毒性的作用及机制,目的在于观察miR-505在肝癌组织及细胞中的表达水平及功能的调控,探讨miR-505对HMGB1的调控作用及对ADM诱导的肝细胞癌毒性的作用及机制,为肝癌的早期诊断、预后评价、治疗靶点及化疗耐药的调控提供新的靶基因。研究方法:1.观察肝细胞癌组织及细胞中miR-505及HMGB1表达水平差异,应用qRT-PCR检测miR-505及HMGB1mRNA在人肝癌组织、配对人正常肝脏组织、四种人肝癌细胞株（QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97、HepG2）及人正常肝细胞株（LO2）中的表达。应用Western blot检测HMGB1在以上标本中蛋白水平表达。2.为了证明miR-505及HMGB1是否参与MHCC97的增殖、凋亡及侵袭行为,以miR-505 mimics或pcDNA3.1-HMGB1上调miR-505或HMGB1表达,以anti-miR-505或HMGB1-siR下调miR-505或HMGB1表达,分别转染到MHCC97中。在转染后以qRT-PCR进行mRNA水平转染效率验证,以Western blot验证HMGB1蛋白转染效率。以MTT法检测不同转染条件下MHCC97细胞增殖,Western blot法检测不同转染条件下MHCC97细胞Ki67蛋白表达,以流式细胞术进行细胞凋亡检测、以Transwell法检测细胞侵袭能力。3.观察不同的人肝癌细胞（QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97、HepG2）对ADM敏感性及miR-505、HMGB1对ADM诱导的肝癌细胞毒性影响,采用MTT法对ADM干预下四种不同肝癌细胞表现的毒性作用进行了检测。选择对ADM敏感的MHCC97细胞及HepG2细胞,给予上调或下调miR-505及HMGB1表达,MTT法观察不同浓度梯度ADM诱导的肝癌细胞毒性变化。4.为了观察miR-505对MHCC97细胞中TGF-β诱导的EMT是否具有调控作用,以miR-505 mimics和anti-miR-505转染MHCC97细胞,qRT-PCR和Western blot观察EMT相关基因（N-cadherin、fibronectin、vimentin、E-cadherin）在mRNA和蛋白水平变化。5.采用荧光素酶报告进行确定HMGB1是否作为miR-505直接靶标。6.为了观察miR-505调控HMGB1下调对MHCC97细胞的增殖及侵袭是否具有抑制作用,对ADM诱导的肝癌细胞凋亡是否具有促进作用,我们通过siRNA转染MHCC97细胞,下调HMGB1的表达以模拟miR-505过表达对MHCC97细胞增殖及侵袭的作用,MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测侵袭,流式细胞术检测凋亡。7.验证miR-505过表达通过下调HMGB1对ADM处理的肝癌细胞caspase-3活性的影响,采用Caspase-3活性检测转染HMGB1-siR、Con-siR,或分别联合0.5μM或0.75μM浓度ADM处理的MHCC97细胞及HepG2细胞中Caspase-3活性。8.以Western blot法检测MHCC97细胞及HepG2细胞在不同干预条件下γH2AX蛋白表达,观察下调HMGB1表达对ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤作用。9.以Western blot检测转染Con-miR、miR-505、miR-505+Vector、miR-505+HMGB1及分别联合给予0.5μM或0.75μM ADM处理48h后的MHCC97和HepG2细胞中γH2AX表达,观察miR-505过表达是否通过下调HMGB1促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤。10.采用Western blot法检测Akt信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β相对表达,进一步观察miR-505/HMGB1轴是否通过Akt信号通路调控ADM诱导的肝癌细胞毒性。结果:1.miR-505在人肝细胞癌组织及细胞（QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97、HepG2）中表达低于正常肝组织及正常肝细胞（LO2）,HMGB1蛋白及mRNA在人肝细胞癌组织及肝癌细胞中表达高于正常肝组织及正常肝细胞。2.miR-505对MHCC97细胞增殖、侵袭及ki67蛋白表达具有抑制作用,对凋亡具有促进作用,而HMGB1对MHCC97细胞增殖、侵袭及ki67蛋白表达具有促进作用,对凋亡具有抑制作用。3.给予不同浓度梯度ADM处理肝癌细胞,MHCC97对ADM最为敏感,其次为HepG2,miR-505能够增强ADM诱导的肝癌细胞毒性,而HMGB1减弱ADM诱导的肝癌细胞毒性。4.miR-505参与调控MHCC97细胞TGF-β诱导的EMT。5.miR-505以转录后方式直接抑制HMGB1的表达。6.miR-505通过抑制HMGB1表达抑制MHCC97的增殖及侵袭,促进ADM诱导的肝癌细胞凋亡。过表达HMGB1部分逆转了miR-505对MHCC97增殖和侵袭的抑制作用,也逆转了对凋亡的促进作用。下调HMGB1表达增强ADM诱导的肝癌细胞凋亡率。上调miR-505通过下调HMGB1表达增强ADM对肝癌细胞的杀伤作用。miR-505过表达增强ADM诱导的肝癌细胞凋亡是通过下调HMGB1表达实现的。7.miR-505通过下调HMGB1表达增强了ADM诱导的肝癌细胞中Caspase-3活性。8.下调HMGB1表达促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤。9.miR-505过表达通过下调HMGB1促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤。10.下调HMGB1表达减少了p-Akt及p-GSK-3β的表达,抑制了ADM诱导的肝癌细胞中Akt通路的活性,上调miR-505表达通过靶向下调HMGB1抑制ADM诱导的肝癌细胞Akt及GSK-3β磷酸化。结论:1.miR-505在肝细胞癌组织及细胞中表达下调,对肝癌细胞增殖、侵袭及EMT行为具有抑制作用,促进凋亡,对ADM诱导的肝癌细胞毒性具有增敏作用。HMGB1在肝细胞癌组织及细胞中表达上调,对肝癌细胞增殖、侵袭行为具有促进作用,抑制凋亡,对ADM诱导的肝癌细胞毒性具有增加抗药性作用。2.miR-505直接靶向作用于HMGB1的3’-UTR端介导肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭行为,并通过下调HMGB1来增强ADM诱导的HCC细胞毒性。3.miR-505靶向下调HMGB1抑制Akt通路从而增强ADM诱导的肝癌细胞毒性、促进凋亡、增强caspase-3活性。
姜博文[9]（2019）在《杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷在银屑病治疗中的作用及机制研究》文中研究指明银屑病是一种增生性、炎症性、慢性皮肤疾病,此病发生率高且极易复发,目前该疾病的发病机制仍不完全明确。银屑病存在发病周期长、治愈难度高等特征,使患者精神及身体皆承受压力和痛苦,明显干扰到患者的日常生活与工作,故此病被视为当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。目前,银屑病治疗药物主要包括甲氨蝶呤、地塞米松、维A酸类、维生素（Vit）D3类似物与糖皮质激素等,还有部分生物制剂,如依那西普等也用于此病的治疗,但这些药物及治疗手段均存在一些治疗局限性及不同程度的毒副作用,因此迫切需要开发更有效、更安全的银屑病治疗药物。1.抑制HaCaT细胞活力的化合物的筛选在本研究中,我们首先利用银屑病相关的细胞模型-人角质形成细胞HaCaT,对250余种传统中药化合物进行筛选,发现杠柳苷元能够显着抑制HaCaT细胞的活力,但在所用的剂量范围内对人成纤维细胞Hs-68的活力几乎无影响,提示杠柳苷元可能具有作为银屑病治疗候选药物的潜力。为了获得抑制HaCaT细胞活力的高效低毒的化合物,我们检测了6种杠柳苷元结构类似物对HaCaT细胞活力的影响,最后选取了对HaCaT细胞抑制作用较强,但对正常Hs-68细胞低毒的杠柳苷元结构类似物铃兰毒苷作为后续研究的化合物,并将其与杠柳苷元的活性进行了对比研究。2.杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制研究根据已有文献报道,银屑病皮损部位可观察到角质形成细胞（keratinocytes,KC）具有很强的生长、增殖和分化能力,并且凋亡受到抑制。因此,在探究杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制时,我们首先检测了杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞增殖的影响。研究结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷可通过抑制DNA合成,降低Ki67、cyclin D1和cyclin E蛋白表达水平以及增加p21蛋白表达,诱导HaCaT细胞G1/S期细胞周期阻滞,从而抑制其增殖。随后,我们通过检测杠柳苷元或铃兰毒苷处理后HaCaT细胞的形态学变化、凋亡相关蛋白casapase-3的激活情况、细胞凋亡率及凋亡抑制剂z-VAD-fmk的抑制效果,分析杠柳苷元及铃兰毒苷对HaCaT细胞凋亡的影响。结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷处理后的HaCaT细胞并未表现出明显的凋亡特征。但在通过DAPI染色观察HaCaT细胞形态时发现,经杠柳苷元或铃兰毒苷处理后的HaCaT细胞其细胞核稀疏成网状,染色质向边缘聚集、细胞肿胀最终破裂。这一形态学变化与细胞坏死的特征相似,暗示杠柳苷元或铃兰毒苷可能诱导HaCaT细胞发生坏死。随后,PI染色及细胞培养液中LDH释放检测结果表明,杠柳苷元或铃兰毒苷的作用使得HaCaT细胞的细胞膜失去完整性。此外,杠柳苷元或铃兰毒苷还可使HaCaT细胞的ATP水平下降,促进细胞坏死。透射电镜也可清楚地观察到两种化合物处理后的细胞出现细胞坏死的典型特征。同时,程序性坏死抑制剂Nec-1能够有效阻断杠柳苷元或铃兰毒苷对细胞活力的抑制作用,证实了杠柳苷元或铃兰毒苷确实是通过诱导HaCaT细胞发生程序性坏死从而抑制细胞活力的。进一步探索发生细胞程序性坏死的机制,发现在杠柳苷元或铃兰毒苷作用后的HaCaT细胞中ROS表达水平升高,而活性氧清除剂NAC、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和程序性坏死抑制剂Nec-1均能抑制ROS的产生,并且NAC和apocynin还能够阻断杠柳苷元或铃兰毒苷诱导的程序性坏死。以上结果表明,杠柳苷元或铃兰毒苷对HaCaT细胞活力的抑制作用是通过抑制HaCaT细胞增殖及诱导细胞发生ROS介导的细胞程序性坏死来实现的。3.杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷对银屑病模型鼠的治疗作用研究前面的结果显示,杠柳苷元和铃兰毒苷在细胞水平表现出明显的抗银屑病作用,为进一步研究两种化合物对银屑病的治疗效果,我们构建了两种诱发性银屑病小鼠模型,诱导剂分别为咪喹莫特（IMQ）和佛波酯（TPA）,并探讨了两种化合物对模型鼠银屑病样病变的治疗作用。结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷涂抹治疗可明显缓解由咪喹莫特和佛波酯所诱导的小鼠银屑病样皮肤损伤,并显着减少新生血管的生成、血管周围炎症细胞,如CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD11b+/CD11c+树突状细胞、皮肤淋巴细胞相关抗原CLA+T细胞和Vγ4+T细胞的浸润,同时杠柳苷元和铃兰毒苷也下调了相关炎症因子IL-17A、IL-17F、IL-22、TNF-α、IFN-γ的表达水平。综上所述,我们的研究发现,杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷可通过抑制皮肤角质形成细胞的增殖和诱导其发生细胞程序性坏死、抑制免疫细胞浸润和炎症因子的异常表达来改善银屑病小鼠的皮肤损伤,从而缓解银屑病的症状。本研究从细胞和动物模型的水平揭示了两种高效低毒天然化合物的抗银屑病效果,为研发新一代银屑病治疗药物提供了新的先导化合物。
范建平[10]（2018）在《两种绿绒蒿属植物醇提物抑制白血病细胞增殖效应的生物学机制研究》文中研究指明恶性肿瘤（癌症）现已成为严重危害人类健康的多发病、常见病。据世界卫生组织（WHO）的统计表明:当前全球每年罹患恶性肿瘤（癌症）的患病人数高达1200万以上,预计到2020年世界上肿瘤发病率将上升50%。现今,恶性肿瘤的治疗方法依然是外科手术、放射治疗及化学疗法。传统的化疗药物在治疗肿瘤上对细胞的选择性较差,在杀伤肿瘤细胞的同时,也会对正常细胞造成损伤,特别是对造血系统和免疫系统具有极大的杀伤力和破坏性,常引发骨髓抑制、免疫功能低下甚至产生新的肿瘤等副作用,同时还容易引起细胞耐药性的产生。因此,在临床治疗恶性肿瘤上,寻求疗效好且毒副作用小的药物和治疗方法成为现今癌症治疗的迫切需要。当代医学研究发现中草药具有药源性广泛、应用历史悠久,价格低廉、不良反应少、遗传毒性低等优点,可以在治疗肿瘤的同时对机体的整体功能进行调理、恢复,增强病人的免疫力,延长生存期,是当前研发抗肿瘤新药的热点。本研究采用产于青藏高原道地藏药全缘绿绒蒿和多刺绿绒蒿为研究材料,以K562人白血病细胞、L1210小鼠白血病细胞为离体细胞模型,小鼠肉瘤S180细胞荷瘤小鼠为在体研究模型,系统地研究了全缘绿绒蒿醇提物、多刺绿绒蒿醇提物抑制白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡的细胞、分子生物学机制,主要研究结果如下:1、采用GC-MS技术分析了全缘绿绒蒿醇提取物和多刺绿绒蒿醇提取物的化学成分,分别确认了20种、16种不同化学组分;选择K562和L1210两种白血病细胞,利用MTT法研究全缘绿绒蒿醇提物、多刺绿绒蒿醇提物对白细胞的杀伤作用,筛选出抑制肿瘤细胞增殖的IC50值。2、通过MTT法分析在不同药物浓度下,全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞、多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞和正常小鼠外周血PBMCs细胞及人脐带静脉血HUVEC细胞的增殖抑制效应;结果表明全缘绿绒蒿提取物对K562细胞的增殖具有抑制作用,呈现出明显的时间和浓度依赖相关性,而对PBMCs没有损伤作用;多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞有一定的增殖抑制效应,而对正常细胞无毒作用,其对L1210细胞的杀伤效应有时间和浓度依赖性。3、使用扫描电子显微镜技术研究了全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞、多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞表面膜结构的影响4、通过DNA凝胶电泳技术、细胞核的HO染色观察细胞内DNA损伤情况。实验结果显示,全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞的增殖有抑制作用,与MTT结果一致,呈时间和浓度依赖相关性,抑制细胞增殖的机制可能与细胞DNA损伤相关。采用流式细胞仪（AnnexinV-FIT/PI双染）分析药物对K562细胞周期的影响,结果显示细胞周期发生了改变,细胞周期阻滞于G2/M期,具有浓度依赖性。5、细胞形态学观察和生化分析不同实验组全缘绿绒蒿醇提物诱导K562细胞凋亡的发生,通过分析ROS产率的变化、线粒体膜电位的改变和细胞色素C定位分布变化等探讨了药物诱导细胞凋亡的细胞生物学机制。6、在分子水平上初步探讨了全缘绿绒蒿醇提物诱导K562细胞p53、Caspase-3、剪切Caspase-9和PARP与药物孵育时间的相关性,分析了药物诱导K562细胞凋亡的分子生物学机制。7、采用细胞核HO染色法和生化分析研究了多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞的DNA损伤的影响,实验表明多刺绿绒蒿醇提物处理L1210细胞后DNA产生片段化,流式细胞仪分析表明药物影响了L1210的细胞周期,细胞周期阻滞于G2/M期。8、分析了 ROS产率的变化和线粒体膜电位改变在多刺绿绒蒿醇提物诱导L1210细胞凋亡中的作用。9、以S180荷瘤小鼠为研究模型,对多刺绿绒蒿醇提物进行了在体抗肿瘤机制研究,研究结果如下:发现其对S180荷瘤小鼠的体重和生活状态没有影响,脏器指数分析表明,对荷瘤小鼠的免疫器官无明显损伤;通过抑瘤率分析可以看出,对肿瘤细胞具有明显的杀伤和抑制作用,其杀伤和抑制肿瘤生长作用可能是通过激活肿瘤细胞内的促凋亡蛋白Bax、肿瘤抑制基因p53以及Caspase家族蛋白的表达实现的。多刺绿绒蒿醇提物对肿瘤细胞的明显杀伤和抑制作用,以及其对荷瘤小鼠免疫系统的低毒、无害,使多刺绿绒蒿有可能作为抗肿瘤药物新药开发,为这一传统藏药合理开发使用提供新的理论依据。
二、阿霉素诱导细胞凋亡时的基因调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、阿霉素诱导细胞凋亡时的基因调控（论文提纲范文）
（1）miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株的构建 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 miR-27b-3p的表达水平对ATC细胞阿霉素耐药性的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分 miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ调节ATC细胞阿霉素耐药性 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 论文创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miRNA调控肿瘤耐药性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English paper Ⅰ |
| English paper Ⅱ |
（2）基于新型纳米PDT技术的肿瘤高效治疗策略及应用研究（论文提纲范文）
| 符号与标记 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米治疗技术的研究现状 |
| 1.2.1 纳米药物的构筑 |
| 1.2.2 纳米药物的肿瘤富集 |
| 1.2.3 纳米药物的瘤内渗透 |
| 1.2.4 纳米药物的细胞内化 |
| 1.2.5 纳米药物的缓释 |
| 1.3 纳米治疗技术的发展趋势 |
| 1.3.1 药物负载新模式 |
| 1.3.2 药物控释新技术 |
| 1.3.3 药物瘤内渗透新路径 |
| 1.3.4 精准靶向新技术 |
| 1.3.5 耐药抑制新方法 |
| 1.4 论文选题及设计思路 |
| 第二章 多功能PDT纳米粒子的构筑 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 UCNS-GOQD-FA/TPP纳米体系的构筑 |
| 2.2.1 实验试剂及合成步骤 |
| 2.2.2 材料表征 |
| 2.2.3 结构与性能分析 |
| 2.3 UCNS@PPIX-PLL-FA纳米体系的构筑 |
| 2.3.1 实验试剂及合成步骤 |
| 2.3.2 材料表征 |
| 2.3.3 结构与性能分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 协同靶向策略在肿瘤治疗中的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验步骤 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 活性氧释放 |
| 3.3.2 细胞吞噬 |
| 3.3.3 线粒体靶向定位 |
| 3.3.4 细胞毒性与细胞凋亡 |
| 3.3.5 体内靶向及细胞器定位 |
| 3.3.6 瘤体治疗效果 |
| 3.3.7 体内代谢分布 |
| 3.3.8 生物安全性评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 细胞传递策略在肿瘤治疗中的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验步骤 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Transwell体系中的迁移 |
| 4.3.2 细胞吞吐特性 |
| 4.3.3 细胞内转运通路 |
| 4.3.4 瘤内渗透扩散 |
| 4.3.5 细胞吞吐作用抑制 |
| 4.3.6 细胞内转运作用抑制 |
| 4.3.7 抑制剂作用下的瘤内渗透 |
| 4.3.8 转胞吞与瘤内渗透的关系 |
| 4.3.9 肿瘤治疗效果 |
| 4.3.10 生物安全评估 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 耐药规避策略在肿瘤治疗中的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验步骤 |
| 5.3 结果讨论 |
| 5.3.1 TMZ与 PDT作用对GBM细胞的杀伤 |
| 5.3.2 PDT对 TMZ诱导耐药细胞的杀伤 |
| 5.3.3 细胞吞噬 |
| 5.3.4 细胞内活性氧释放 |
| 5.3.5 细胞内基因调控 |
| 5.3.6 纳米药物在肿瘤内的渗透 |
| 5.3.7 肿瘤模型的治疗效果 |
| 5.3.8 生物安全评估 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 安全、小剂量的纳米PDT粒子对肿瘤的高效治疗 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验步骤 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 光敏剂负载 |
| 6.3.2 活性氧释放 |
| 6.3.3 He La细胞与Hela-CSCs对纳米粒子的吞噬 |
| 6.3.4 He La细胞与Hela-CSCs的 PDT毒性 |
| 6.3.5 瘤内扩散 |
| 6.3.6 瘤内细胞内化 |
| 6.3.7 瘤体治疗效果 |
| 6.3.8 体内分布代谢 |
| 6.3.9 生物安全评估 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 全文总结 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
| 致谢 |
（3）右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 结论和展望 |
| 综述 (第一部分)心肌缺血再灌注损伤和右美托咪定心肌保护作用的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 (第二部分)A systematic Review: Effects of Perioperative Dexmedetomidine Use on Postoperative Mortality and Major Morbidity in Adult Patients Who undergo Cardiac and Non-cardiac Surgery |
| References |
| 附录 |
| 个人简历及博士研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）基于miRNA探讨右归丸对激素抵抗型肾病综合征大鼠的增敏作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 SRNS现代医学研究 |
| 2 足细胞损伤是导致SRNS的关键环节 |
| 3 miRNA诱导SRNS的作用机制 |
| 3.1 miRNA与足细胞 |
| 3.2 miRNA与足细胞相关基因的表达 |
| 4 传统医学对激素抵抗型肾病综合征的研究 |
| 4.1 SRNS病因病机 |
| 4.2 右归丸治疗肾病综合征的新机制 |
| 5 戴恩来教授“病证结合”以“益火之源,以消阴翳”立论 |
| 6 建立假说 |
| 第二章 右归丸治疗SRNS肾病减毒增敏机制实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物、试剂与器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 复制SRNS肾病大鼠模型 |
| 2.3 给药的剂量及方法 |
| 2.4 标本的采集及检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 右归丸对SRNS大鼠一般状态的影响 |
| 3.2 右归丸对模型大鼠体重质数的影响 |
| 3.3 各组大鼠24 小时尿蛋白定量结果 |
| 3.4 右归丸对SRNS大鼠自主活动的影响 |
| 3.5 各组大鼠总蛋白、白蛋白、血脂指标变化 |
| 3.6 各组大鼠肾功能指标的变化 |
| 3.7 光镜观察各组大鼠肾组织病理变化 |
| 3.8 电镜观察各组大鼠肾组织超微结构变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 激素抵抗型肾病综合征大鼠肾皮质miRNA的差异性表达 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验的主要药物、试剂与器材 |
| 1.3 实验分组和动物模型的复制 |
| 1.4 指标检测及方法 |
| 1.5 基因芯片检测肾皮质miRNA的表达 |
| 1.6 Real-time PCR验证候选miRNAs |
| 2 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 SRNS模型大鼠一般情况 |
| 3.2 用药前后各组大鼠尿蛋白定量变化 |
| 3.3 各组大鼠肾组织HE染色(光镜) |
| 3.4 透射电镜观察足细胞微结构变化 |
| 3.5 各组大鼠肾皮质miRNA芯片检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 基于Dicer-microRNA对 SRNS大鼠足细胞SD分子调控及右归丸的干预作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.2 实验的主要药物、试剂与器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 SRNS大鼠模型制备 |
| 2.2 给药的方法和剂量 |
| 2.3 指标检测及方法 |
| 2.4 肾皮质dicer、nephrin、podocin、CD2AP、synaptopodin免疫荧光染色 |
| 2.5 肾组织Dicer与 SD分子蛋白检测(Western Blotting) |
| 2.6 肾皮质Dicer与 SD分子mRNA检测(RT-PCR) |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 SRNS大鼠一般情况 |
| 3.2 用药前后各组大鼠尿蛋白定量变化 |
| 3.3 光镜观察各组大鼠肾脏病理改变(PASM染色) |
| 3.4 肾皮质Dicer与 SD分子免疫荧光染色变化 |
| 3.5 肾皮质Dicer与 SD蛋白表达 |
| 3.6 各组大鼠肾皮质Dicer与 SD分子mRNA表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 右归丸对SRNS大鼠足细胞凋亡因子Bax、Bcl-2、caspase-3 的干预作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要试剂与药物 |
| 1.2 动物与分组 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 SRNS大鼠模型的建立 |
| 2.2 24h-upr及血清生化指标的检测 |
| 2.3 肾小球微结构检查(透射电镜) |
| 2.4 免疫荧光法检测肾组织Bax?Bcl-2?caspase-3 的表达 |
| 2.5 肾皮质Bax?Bcl-2?caspase-3 蛋白检测(Western Blotting法) |
| 2.6 大鼠肾皮质Bax?Bcl-2?caspase-3 mRNA表达检测(RT-PCR法) |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠24h尿蛋白量变化 |
| 3.2 足细胞电镜观察结果 |
| 3.3 各组大鼠肾组织Bax?Bcl-2?baspase-3 免疫荧光染色 |
| 3.4 肾皮质Bax?Bcl-2?caspase-3 蛋白表达 |
| 3.5 肾皮质Bax?Bcl-2?caspase-3 mRNA表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 创新点 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 附录 |
（5）荜茇酰胺提取分离及抗乳腺癌的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1 综述 |
| 1.1 乳腺癌概述 |
| 1.1.1 乳腺癌的发展现状 |
| 1.1.2 乳腺癌的发病机制 |
| 1.1.3 乳腺癌的治疗方案 |
| 1.2 荜茇酰胺的抗癌研究 |
| 1.2.1 荜茇酰胺的提取分离与化学合成 |
| 1.2.2 荜茇酰胺的体外抗癌活性 |
| 1.2.3 荜茇酰胺的体内抗癌活性 |
| 1.2.4 荜茇酰胺的抗癌机制 |
| 1.2.5 荜茇酰胺的毒理分析 |
| 1.2.6 荜茇酰胺的药代动力学研究 |
| 1.3 JAK/STAT信号通路与癌症 |
| 1.3.1 JAK和STAT家族 |
| 1.3.2 STAT与致癌信号通路 |
| 1.3.3 STAT的过度表达 |
| 1.3.4 STAT与肿瘤细胞增殖和凋亡 |
| 1.3.5 STAT与肿瘤血管生成 |
| 1.3.6 STAT与肿瘤免疫逃逸 |
| 1.3.7 STAT成为癌症治疗的靶点 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 荜茇根中生物碱的提取分离 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荜茇根提取物的制备 |
| 2.2.2 荜茇根中化学成分的分离 |
| 2.2.3 分离产物的结构鉴定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 胡椒碱的核磁解析 |
| 2.3.2 胡椒内酰胺D的核磁解析 |
| 2.3.3 荜茇酰胺的核磁解析 |
| 2.3.4 胡椒内酰胺A的核磁解析 |
| 2.3.5 其他化合物的确定 |
| 2.4 小结 |
| 3 荜茇酰胺抗乳腺癌的作用和机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 MTT实验 |
| 3.2.3 克隆形成实验 |
| 3.2.4 细胞凋亡实验 |
| 3.2.5 细胞周期实验 |
| 3.2.6 ROS实验 |
| 3.2.7 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.2.8 动物实验 |
| 3.2.9 免疫组化实验 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 荜茇酰胺抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 3.3.2 荜茇酰胺抑制乳腺癌细胞克隆形成 |
| 3.3.3 荜茇酰胺诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 3.3.4 荜茇酰胺诱导乳腺癌细胞周期阻滞 |
| 3.3.5 荜茇酰胺对凋亡通路和STAT3通路的调控 |
| 3.3.6 ROS参与荜茇酰胺对STAT3/凋亡通路的调控 |
| 3.3.7 ROS介导STAT3通路调控的细胞凋亡 |
| 3.3.8 荜茇酰胺体内抗乳腺癌的作用 |
| 3.3.9 荜茇酰胺体内抗乳腺癌的机制 |
| 3.3.10 荜茇酰胺抗乳腺癌的机制 |
| 3.4 小结 |
| 4 荜茇酰胺协同胡椒碱抗乳腺癌的作用和机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 MTT实验 |
| 4.2.3 药物协同作用分析实验 |
| 4.2.4 细胞凋亡实验 |
| 4.2.5 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.2.6 动物实验 |
| 4.2.7 免疫组化实验 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 荜茇酰胺和胡椒碱抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 4.3.2 荜茇酰胺和胡椒碱诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 4.3.3 荜茇酰胺和胡椒碱协同抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 4.3.4 荜茇酰胺和胡椒碱协同诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 4.3.5 荜茇酰胺和胡椒碱协同诱导乳腺癌细胞凋亡的机制 |
| 4.3.6 荜茇酰胺和胡椒碱体内协同抗乳腺癌的作用 |
| 4.3.7 荜茇酰胺和胡椒碱体内协同抗乳腺癌的机制 |
| 4.4 小结 |
| 5 荜茇酰胺协同阿霉素抗三阴性乳腺癌的作用和机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 MTT实验 |
| 5.2.3 细胞凋亡实验 |
| 5.2.4 药物协同作用分析实验 |
| 5.2.5 蛋白免疫印迹实验 |
| 5.2.6 动物实验 |
| 5.2.7 免疫组化实验 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 荜茇酰胺和阿霉素抑制三阴性乳腺癌细胞增殖 |
| 5.3.2 荜茇酰胺和阿霉素诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡 |
| 5.3.3 荜茇酰胺和阿霉素协同抑制三阴性乳腺癌细胞增殖 |
| 5.3.4 荜茇酰胺和阿霉素协同诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡 |
| 5.3.5 荜茇酰胺和阿霉素协同诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制 |
| 5.3.6 荜茇酰胺和阿霉素体内协同抗乳腺癌的作用 |
| 5.3.7 荜茇酰胺和阿霉素体内协同抗乳腺癌的机制 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论、创新与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图: 荜茇根中生物碱类化合物的核磁谱图 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）miRNA在白癜风血浆中的差异表达及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 白癜风血浆中差异表达mi RNAs的筛选与验证 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验相关试剂耗材 |
| 1.3 主要实验相关仪器设备 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 统计学分析 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 miR-223-3p靶基因的预测分析及筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 miR-223-3p调控相关靶基因的预测与筛选 |
| 1.2 白癜风相关基因的分析与miR-223-3p靶基因的筛选 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 mi R-223-3p在人表皮黑素细胞中靶向调控FOXO3 的机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验相关试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与设备 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 统计学分析 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Micro RNA 在免疫相关性皮肤病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）菲并咪唑衍生物的抗肿瘤活性及其诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 抗肿瘤化学药物的研究 |
| 1.2.1 抗肿瘤化学药物发展的历史沿革 |
| 1.2.2 临床常见的抗肿瘤化学药物 |
| 1.3 咪唑类化合物抗肿瘤活性的研究 |
| 1.4 1,10-菲啰啉衍生物抗肿瘤活性的研究 |
| 1.5 菲并咪唑衍生物抗肿瘤活性的研究进展 |
| 1.6 肿瘤治疗与细胞凋亡 |
| 1.6.1 细胞凋亡的基本概念 |
| 1.6.2 细胞凋亡的形态学特征 |
| 1.6.3 细胞凋亡的主要途径 |
| 1.7 鼻咽癌的流行病学及易感因素 |
| 1.8 鼻咽癌的临床治疗 |
| 1.9 本论文的研究思路 |
| 1.10 本课题的创新点 |
| 1.11 本论文中菲并咪唑衍生物的分子结构式及编号 |
| 第二章 菲并咪唑衍生物的抗肿瘤活性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂及材料 |
| 2.2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菲并咪唑衍生物的合成 |
| 2.3.2 细胞培养技术 |
| 2.3.3 MTT比色法检测菲并咪唑衍生物的抗肿瘤活性 |
| 2.3.4 化合物4对CNE-1细胞斑马鱼异种移植模型的影响 |
| 2.3.5 化合物4对斑马鱼胚胎的安全性评价 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 菲并咪唑衍生物的体外抗肿瘤活性 |
| 2.4.2 化合物4对CNE-1细胞斑马鱼异种移植模型的生长抑制 |
| 2.4.3 化合物4对斑马鱼胚胎的安全性评价 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 化合物4对鼻咽癌CNE-1细胞抗肿瘤作用机制的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂及材料 |
| 3.2.2 实验仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 流式细胞术检测周期阻滞和凋亡 |
| 3.3.2 TUNEL-DAPI双染色检测细胞凋亡 |
| 3.3.3 检测化合物4 诱导CNE-1 细胞DNA损伤 |
| 3.3.4 JC-1探针检测线粒体膜电位 |
| 3.3.5 细胞内活性氧含量检测 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 流式细胞术分析化合物4对CNE-1细胞周期时相分布及凋亡的影响 |
| 3.4.2 TUNEL-DAPI双染分析CNE-1 细胞凋亡 |
| 3.4.3 化合物4 诱导CNE-1 细胞DNA损伤 |
| 3.4.4 JC-1探针检测CNE-1细胞线粒体膜电位变化 |
| 3.4.5 CNE-1细胞内活性氧含量的变化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要英文缩略词 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文情况 |
（8）miR-505靶向下调HMGB1抑制Akt通路调控肝癌细胞增殖、凋亡及阿霉素诱导的细胞毒性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 miR-505 调控人肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭、EMT及阿霉素诱导的肝癌细胞毒性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 细胞标本 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用试剂的配置 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 qRT-qPCR |
| 2.2.3 蛋白质印迹 |
| 2.2.4 转染 |
| 2.2.5 MTT法 |
| 2.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 Transwell检测细胞侵袭 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-505及HMGB1 在肝癌组织及细胞系中的表达 |
| 3.2 miR-505及HMGB1对MHCC97 增殖及Ki67 影响 |
| 3.3 miR-505及HMGB1对MHCC97 细胞凋亡的影响 |
| 3.4 不同浓度ADM对人肝癌细胞的毒性比较 |
| 3.5 miR-505及HMGB1对ADM诱导的肝癌细胞毒性影响 |
| 3.6 miR-505对MHCC97细胞侵袭能力影响 |
| 3.7 miR-505对MHCC97 细胞TGF-β诱导的EMT影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 miR-505 靶向下调HMGB1 调控人肝癌细胞增殖、侵袭及阿霉素诱导的肝癌细胞毒性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 细胞标本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂的配置 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 双荧光素酶检测 |
| 2.2.3 qRT-PCR |
| 2.2.4 蛋白质印迹 |
| 2.2.5 转染 |
| 2.2.6 Transwell检测细胞侵袭 |
| 2.2.7 MTT法 |
| 2.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-505 靶向作用于MHCC97 细胞HMGB1的3’-UTR端,并以转录后方式抑制HMGB1的表达 |
| 3.2 miR-505 通过下调HMGB1 抑制MHCC97 细胞的增殖及侵袭 |
| 3.3 miR-505 通过下调HMGB1 降低阿霉素诱导的肝癌细胞存活率 |
| 3.4 miR-505 下调HMGB1 表达增强ADM诱导的肝癌细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 miR-505 下调HMGB1 表达抑制AKT通路增强阿霉素诱导的肝癌细胞毒性及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 细胞标本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂的配置 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 蛋白质印迹 |
| 2.2.3 转染 |
| 2.2.4 Caspase-3 活性测定 |
| 2.2.5 MTT法 |
| 2.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-505 过表达对ADM干预的肝癌细胞中Caspase-3 活性的影响 |
| 3.2 下调HMGB1 表达增强ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤 |
| 3.3 miR-505 过表达通过下调HMGB1 促进ADM诱导的肝癌细胞DNA损伤 |
| 3.4 miR-505 过表达通过下调HMGB1 抑制Akt信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷在银屑病治疗中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、银屑病 |
| (一)银屑病的概述 |
| (二)银屑病的发病机制 |
| (三)银屑病的治疗 |
| (四)银屑病样模型 |
| 二、细胞程序性坏死 |
| (一)细胞程序性坏死的信号通路 |
| (二)细胞程序性坏死与活性氧ROS |
| (三)细胞程序性坏死的特征 |
| (四)细胞程序性坏死的检测方法 |
| 三、杠柳苷元及其衍生物的研究进展 |
| (一)杠柳苷元的简介 |
| (二)杠柳苷元的生物学活性 |
| (三)铃兰毒苷的简介 |
| (四)铃兰毒苷的生物学活性 |
| 四、本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一)化合物 |
| (二)细胞株 |
| (三)实验动物 |
| (四)实验试剂 |
| 二、实验仪器 |
| 三、实验方法 |
| (一)细胞的培养 |
| (二)抑制HaCaT细胞活力的中药单体化合物的筛选 |
| (三)杠柳苷元及其结构类似物对HaCaT细胞及Hs-68 细胞IC_(50)和IC_(10)的检测 |
| (四)免疫荧光染色 |
| (五)BrdU掺入检测 |
| (六)流式细胞术检测细胞周期 |
| (七)免疫印迹分析 |
| (八)DAPI染色 |
| (九)TUNEL染色 |
| (十)抑制剂作用的检测 |
| (十一)细胞形态观察和PI染色 |
| (十二)乳酸脱氢酶(LDH)释放检测 |
| (十三)ATP检测 |
| (十四)流式细胞术检测细胞凋亡率和坏死率 |
| (十五)透射电镜实验观察细胞结构 |
| (十六)流式细胞术检测细胞中的ROS水平 |
| (十七)IMQ诱导的银屑病样小鼠模型的制备 |
| (十八)TPA诱导的银屑病样小鼠模型的制备 |
| (十九)HE染色 |
| (二十)ELISA检测组织中炎症因子表达量 |
| (二十一)流式细胞术检测组织中炎症细胞数量 |
| (二十二)免疫组织化学染色 |
| (二十三)统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 一、抑制HaCaT细胞活力的中药化合物的筛选 |
| (一)抑制HaCaT细胞活力的中药化合物筛选 |
| (二)杠柳苷元及其结构类似物对HaCaT细胞活力的影响 |
| 二、杠柳苷元和铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制研究 |
| (一)杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞增殖的影响 |
| (二)杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞凋亡的影响 |
| (三)杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞坏死的影响 |
| (四)杠柳苷元和铃兰毒苷诱导HaCaT细胞发生程序性坏死的机制研究 |
| 三、杠柳苷元和铃兰毒苷对银屑病样模型小鼠的治疗作用 |
| (一)杠柳苷元和铃兰毒苷对IMQ诱导的银屑病样模型小鼠的治疗作用 |
| (二)杠柳苷元和铃兰毒苷对TPA诱导的银屑病样模型小鼠的治疗作用 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（10）两种绿绒蒿属植物醇提物抑制白血病细胞增殖效应的生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肿瘤 |
| 1.2 肿瘤的发生与形成 |
| 1.2.1 肿瘤的概念 |
| 1.2.2 肿瘤的形成与发展 |
| 1.2.3 肿瘤的预防和治疗 |
| 1.3 肿瘤研究的新进展 |
| 1.3.1 肿瘤(tumor)与基因组印记 |
| 1.3.2 肿瘤与微卫星DNA |
| 1.3.3 肿瘤免疫编辑 |
| 1.3.4 肿瘤干细胞 |
| 1.3.5 细胞周期与肿瘤 |
| 1.3.6 细胞信号转导与肿瘤 |
| 1.3.7 细胞死亡与肿瘤 |
| 1.3.8 血管形成与肿瘤 |
| 1.4 抗肿瘤药物的研究与开发 |
| 1.4.1 抗肿瘤药物的分类 |
| 1.4.2 天然抗肿瘤药物 |
| 1.4.3 化学合成药物 |
| 1.4.4 生物工程药 |
| 1.5 当今世界抗肿瘤药物发展趋势 |
| 1.6 我国抗肿瘤药现状及其发展方向: |
| 1.7 中药(包括藏药)与抗肿瘤研究 |
| 1.7.1 中药抗肿瘤有效成分研究 |
| 1.7.2 中药抗肿瘤机制研究 |
| 1.7.3 中医药在治疗肿瘤方面的临床应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究依据、研究内容、研究特色及创新性 |
| 2.1 研究依据 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 本项目的研究特色与创新 |
| 参考文献 |
| 第三章 全缘绿绒蒿提取物对人白血病细胞K562作用机制研究 |
| 3.1 实验材料和试剂仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验细胞来源 |
| 3.1.3 外周血单核细胞的分离 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.1.5 仪器设备 |
| 3.2 实验方法和内容 |
| 3.2.1 全缘绿绒蒿(Meconopsis integrifolia (Maxim.) Franch.)醇提物制备 |
| 3.2.2 全缘绿绒蒿醇提物化学成分分析-GC/MS检测 |
| 3.2.3 实验分组及处理条件 |
| 3.2.4 全缘绿绒蒿醇提物对人白血病细胞K562增殖抑制作用 |
| 3.2.5 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞DNA损伤的检测 |
| 3.2.6 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞对细胞核形态的影响 |
| 3.2.7 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞周期影响的分析 |
| 3.2.8 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞凋亡检测(AnnexinV-FITC/PI试验) |
| 3.2.9 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞线粒体膜电位影响检测 |
| 3.2.10 全缘绿绒蒿醇提物作用于K562细胞中活性氧(ROS)变化检测 |
| 3.2.11 免疫组化法观察细胞内细胞色素C(cytochrome c)的变化 |
| 3.2.12 全缘绿绒蒿醇提物诱导K562细胞凋亡相关蛋白Western blotting检测 |
| 3.2.13 全缘绿绒蒿醇提物作用于K562细胞对细胞表面结构的影响 |
| 3.2.14 统计学分析 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.3.1 全缘绿绒蒿醇提物化学成分分析(GC-MS检测分析) |
| 3.3.2 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞毒效应 |
| 3.3.3 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞使DNA发生片段化 |
| 3.3.4 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞肿瘤细胞核形态发生改变 |
| 3.3.5 全缘绿绒蒿醇提物能够引起K562细胞发生细胞周期阻滞 |
| 3.3.6 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞引起细胞凋亡分析 |
| 3.3.7 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞线粒体膜电位变化研究 |
| 3.3.8 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞活性氧ROS生成检测 |
| 3.3.9 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞细胞色素C释放检测 |
| 3.3.10 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞凋亡相关蛋白表达检测分析 |
| 3.3.11 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞24,48h后,K562细胞表面形态发生明显变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多刺绿绒蒿醇提物对小鼠白血病细胞L1210增殖效应的研究 |
| 4.1 实验材料及试剂仪器 |
| 4.1.1 细胞来源与细胞培养 |
| 4.1.2 外周血单核细胞的分离 |
| 4.1.3 试剂与配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2. 实验方法 |
| 4.2.1 多刺绿绒蒿乙醇提取物的获取 |
| 4.2.2 实验分组 |
| 4.2.3 多刺绿绒蒿乙醇提取物的化学成分分析 |
| 4.2.4 细胞活性检测 |
| 4.2.5 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞的DNA损伤效应研究 |
| 4.2.6 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞核形态的影响 |
| 4.2.7 多刺绿绒蒿醇提物处理对L1210细胞周期的影响 |
| 4.2.8 Annexin V-FITC/PI检测多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞凋亡率的影响 |
| 4.2.9 细胞膜完整性检测 |
| 4.2.10 活性氧生成检测 |
| 4.2.11 细胞膜表面超微结构观察 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 多刺绿绒蒿醇提物GC-MS分析 |
| 4.3.2 多刺绿绒蒿醇提物对小鼠L1210细胞的毒效应 |
| 4.3.3 多刺绿绒蒿醇提物作用L1210细胞,对DNA损伤的影响 |
| 4.3.4 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞核形态的影响 |
| 4.3.5 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞周期的影响 |
| 4.3.6 多刺绿绒蒿醇提物诱导L1210细胞凋亡检测 |
| 4.3.7 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞膜损伤效应 |
| 4.3.8 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞ROS的影响 |
| 4.3.9 多刺绿绒蒿醇提物影响L1210细胞膜表面超微结构 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 多刺绿绒蒿醇提物对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 药品与试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 |
| 5.2.3 动物分组及给药方法 |
| 5.2.4 小鼠体重及移植瘤大小的测量 |
| 5.2.5 EMH对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 |
| 5.2.6 EMH对S180荷瘤小鼠免疫器官作用 |
| 5.2.7 免疫组化法检测小鼠有关凋亡蛋白 |
| 5.3 数据分析实验数据均以Mean±SD进行表示。 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 EMH对S180荷瘤小鼠生理状态的影响 |
| 5.4.2 EMH对S180荷瘤小鼠实体瘤的肿瘤抑制情况 |
| 5.4.3 EMH对小鼠免疫器官的影响 |
| 5.4.4 多刺绿绒蒿醇提物对小鼠实体瘤凋亡相关蛋白caspase表达的影响 |
| 5.4.5 EMH对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中Bcl-2家族蛋白表达的研究 |
| 5.4.6 多刺绿绒蒿醇提物对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶表达的作用 |
| 5.4.7 EMH对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子表达的影响 |
| 5.4.8 EMH对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中促凋亡蛋白p53表达的探究 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
四、阿霉素诱导细胞凋亡时的基因调控（论文参考文献）
- [1]miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究[D]. 许远. 山东大学, 2021(11)
- [2]基于新型纳米PDT技术的肿瘤高效治疗策略及应用研究[D]. 刘燕. 上海交通大学, 2020(01)
- [3]右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究[D]. 彭科. 苏州大学, 2020(06)
- [4]基于miRNA探讨右归丸对激素抵抗型肾病综合征大鼠的增敏作用及机制研究[D]. 王新斌. 甘肃中医药大学, 2020(08)
- [5]荜茇酰胺提取分离及抗乳腺癌的作用机制[D]. 陈镝. 陕西科技大学, 2020(01)
- [6]miRNA在白癜风血浆中的差异表达及其功能研究[D]. 雷子贤. 新疆医科大学, 2020
- [7]菲并咪唑衍生物的抗肿瘤活性及其诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡的作用机制[D]. 宋乐. 广东药科大学, 2020(01)
- [8]miR-505靶向下调HMGB1抑制Akt通路调控肝癌细胞增殖、凋亡及阿霉素诱导的细胞毒性[D]. 陆林. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷在银屑病治疗中的作用及机制研究[D]. 姜博文. 东北师范大学, 2019(04)
- [10]两种绿绒蒿属植物醇提物抑制白血病细胞增殖效应的生物学机制研究[D]. 范建平. 陕西师范大学, 2018(01)