一、白血病细胞JAK/STAT途径异常激活（论文文献综述）
亢培颖,李伊瑶,史敏,李永军[1]（2021）在《JAK/STAT信号通路在急性T淋巴细胞白血病中的研究进展》文中研究指明Janus蛋白酪氨酸激酶（Janus activated kinase, JAK）-信号传导及转录激活因子（signal transduction and activators of transcription, STAT）信号通路的异常激活与急性T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL）的发病有密切关系。近年文献报道,JAK/STAT信号通路的上游信号分子异常,如白细胞介素7受体的异常表达,以及下游转导信号分子,如Suz12、PIM1等的异常激活均对T-ALL的发生发挥重要作用。本文对参与T-ALL发生发展的JAK/STAT信号通路机制以及基于该信号通路靶向治疗的最新研究进展作一综述。
韩卓[2]（2021）在《维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究》文中提出维生素C（Vitamin C,VitC）是人和动物必需的营养物质。科学界对于VitC功能几乎所有的认识都基于它作为电子供体,即作为天然还原剂的化学性质,主要表现在VitC能够清除细胞代谢过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,保护重要的生物大分子免于氧化损伤,维持细胞的正常功能。对VitC研究的一次重大突破,在于发现VitC是亚铁离子(ferrous ion,Fe2+)和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）依赖型双加氧酶(Fe2+-and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,Fe2+/2OGDDs)家族关键的“辅因子”,维持Fe2+/2OGDDs在细胞内的活性。进一步研究揭示,VitC能作为辅因子调节Fe2+/2OGDDs家族中与表观修饰有关的酶的催化活性,其中包括DNA羟化酶TET（ten-eleven translocation（TET）family of DNA hydroxylases）和具有Jumonji-C结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji-C domain-containing histone demethylases）。这一发现直接加速了VitC在干细胞和再生医学领域中的研究,越来越多的证据表明VitC能够通过调控表观修饰酶的活性来提升细胞重编程的效率和质量,也能参与调节干细胞的自我更新和定向分化。有研究曾提出,VitC作为辅因子的生物学功能,本质上依然以VitC固有的还原性为基础,但VitC对表观修饰酶功能调控的特殊性却暗示VitC很可能还存在其他的作用机制,说明我们目前对VitC功能的认识很可能还存在很大空白,大大限制了VitC的应用价值。2014年,本课题组研究发现,VitC通过激活Janus kinase（JAK）2/signal transducer and activator of transcription（STAT）2信号途径,在小鼠胚胎干细胞中诱导Nanog基因的表达。我们曾初步证实,钠离子依赖型VitC转运蛋白2（sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）能够介导VitC对JAK2和STAT2的信号激活,并参与对下游基因的调控,提示VitC与细胞信号转导有关联。在此基础上,本研究以小鼠F9畸胎瘤干细胞系为主要研究对象,首次证明VitC具有“生物信号分子”的作用,完善了对VitC生物学功能的认知。研究可分为两大阶段,第一阶段揭示VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能;第二阶段研究VitC激活的JAK2信号传递途径具有的调控作用及其对VitC生物学功能的补充。主要的研究内容和结果列举如下:1.发现和探究VitC转运蛋白SVCT2的受体功能。首先,通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）和免疫印迹,我们证明SVCT2特异性结合JAK2而不结合JAK1、JAK3和TYK2。然后,通过基序预测和突变体策略,研究SVCT2蛋白序列中介导JAK2结合和激活的关键结构基序。结果显示,位于SVCT2羧基末端的618-621位氨基酸序列以及连接第8～9号跨膜螺旋的胞质侧肽段中的418-422位氨基酸序列是负责结合JAK2的关键基序,介导VitC对JAK2的激活。通过磷酸化位点预测和突变体策略,研究JAK2对SVCT2潜在的磷酸化作用及其对招募STAT2的影响。结果显示,VitC激活的JAK2催化SVCT2羧基端Tyr626发生磷酸化,介导SVCT2对STAT2的招募,进一步诱导JAK2和STAT2的磷酸化。之后,通过双荧光素酶报告（Dual Luciferase Reporter）实验,我们还证明SVCT2响应VitC处理增强STAT2的转录因子活性,且依赖JAK2的激活。综上,本研究证实SVCT2是VitC的“受体样转运蛋白”,具有JAK2偶联受体的典型特征。此外,本研究还证明VitC对JAK2的激活与VitC在细胞内的积累无关。2.研究SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间的关联。通过co-IP和免疫印迹,研究SVCT2介导的VitC运输对JAK2激活的影响。结果显示,抑制SVCT2对VitC的运输作用会抑制SVCT2对JAK2的磷酸化激活。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography）实验,研究SVCT2对JAK2的激活是否反过来影响SVCT2对VitC的运输。结果显示,抑制JAK2的激活也会削弱SVCT2对VitC的运输能力。这部分研究证明,SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间紧密偶联、不可分割,是一个完整的生物学事件。3.研究VitC激活JAK2与清除ROS之间的关系。首先,通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫印迹,研究VitC抑制ROS的作用对激活JAK2的影响。结果显示,VitC对JAK2的激活并不依赖对ROS的抑制。接下来,我们研究VitC激活的JAK2是否反过来影响VitC对ROS水平的调控。结果显示,VitC抑制细胞内ROS的水平且部分依赖JAK2的活性。随后的研究进一步证明,VitC激活的JAK2催化其固有底物脯氨酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK1）发生磷酸化,活化的PDHK1又催化脯氨酸脱氢酶E1α亚基（E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase,PDHA1）Ser232发生磷酸化,抑制PDHA1的活性,降低细胞氧化代谢效率,进而抑制ROS的产生。4.研究JAK2的激活对VitC表观调控功能的影响。通过免疫荧光、点杂交和免疫印迹,研究VitC激活的JAK2对5hm C水平的调控。结果显示,抑制JAK2的激活会抑制VitC对5hm C水平的促进。通过磷酸化位点预测和突变体策略,我们首次证明TET3是JAK2的激酶底物。VitC和SVCT2激活的JAK2直接催化TET3 Tyr1375发生磷酸化。后续研究证实Tyr1375的磷酸化增强了TET3的酶活性并影响其对靶基因的选择,表明VitC不仅仅以辅因子身份调控TET酶的功能。另外,VitC激活的JAK2催化其固有底物组蛋白H3第41位酪氨酸残基发生磷酸化,而后者有利于开放染色质状态的建立。通过微球菌核酸酶消化实验,我们证明VitC确实能够提高基因组DNA的可接近性,且依赖于JAK2的激活。5.研究JAK2的激活对VitC在细胞多能性和分化调控中的影响。通过碱性磷酸酶染色、表达谱m RNA测序和实时定量PCR,研究VitC激活的JAK2对F9细胞的多能性,以及对多能性和分化相关基因表达的影响。结果显示,在F9细胞中,VitC对细胞多能性没有明显影响,但倾向于促进分化发育相关基因（特别是与神经成熟相关基因）的表达,且依赖于JAK2的激活;只有在JAK2活性被抑制的条件下,VitC更倾向于促进细胞的多能性,并诱导一系列多能性相关基因（但不包括Nanog）的表达。进一步的研究发现,VitC激活的JAK2实际上通过两条作用相反的途径分别调控两类下游基因的表达,即通过依赖STAT2的途径调控少数特定多能性相关基因（比如Nanog）的表达;通过不依赖STAT2的途径调控与分化相关基因的表达。综上,本研究发现VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能,并证明激活JAK2是VitC发挥调控作用的重要途径。这是对VitC生物学作用突破性的发现,为其生理和药理功能的研究带来新的思考,对VitC在疾病治疗和再生医学等众多领域的应用具有一定的指导意义。
周翀[3]（2021）在《CXCLs/ERK/LIF信号通路在癌相关脂肪细胞介导乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用与分子机制》文中认为肿瘤侵袭和转移是导致乳腺癌病人死亡的主要原因。肿瘤的发生与其所处的微环境密切相关,乳腺肿瘤微环境中脂肪细胞含量丰富,乳腺癌早期局部肿瘤细胞侵入脂肪组织,诱导脂肪细胞转变为癌相关脂肪细胞（cancer-associated adipocytes,CAA）。CAA表型发生改变,并分泌大量的细胞因子和趋化因子,促进邻近乳腺癌的侵袭和转移,然而其在乳腺肿瘤微环境中的作用及相关分子机制尚不明确。目的:研究乳腺肿瘤微环境的CAA如何影响乳腺癌细胞进展以及脂肪细胞与乳腺癌细胞的相互作用关系,重点研究白血病抑制因子（LIF）在其中的作用与分子机制。方法:1、分离前脂肪细胞进行原代细胞培养,并诱导前脂肪细胞生成成熟脂肪细胞;利用transwell共培养小室建立成熟脂肪细胞和乳腺癌细胞互作的体外研究模型;细胞划痕、transwell迁移和基质胶侵袭实验被用来评估与脂肪细胞共培养后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力;Q-PCR和ELISA分析共培养后脂肪细胞LIF的表达及培养上清中LIF的含量;Western blot分析乳腺癌细胞中LIF下游信号的激活情况;si RNA干扰乳腺癌细胞中Stat3表达并检测CAA和LIF对其迁移和侵袭等影响;利用H&E染色和免疫组化分析乳腺癌患者组织切片中LIF和p-Stat3的表达情况。2、采用选择性通路抑制剂探究CAA中LIF的上游通路,Q-PCR检测CAA中调控LIF表达的上游信号通路;Western blot分析CAA中LIF上游信号通路的调控关系;免疫荧光分析CAA中LIF上游信号的表达与定位。3、采用RNA-seq分析共培养后乳腺癌细胞中的差异表达基因并筛选调控LIF的关键分泌蛋白并经Q-PCR验证;利用Q-PCR、ELISA和Western blot分析ELR+CXC趋化因子的受体抑制剂对CAA中LIF的表达、分泌及其上游信号通路的调控情况;利用Q-PCR、ELISA和Western blot分析重组蛋白CXCL3和CXCL8对LIF的表达、分泌及其上游信号通路的调控情况;通过免疫荧光分析重组蛋白CXCL3和CXCL8对LIF的上游转录因子定位的影响;以及利用Q-PCR和Western blot分析CXCL3中和性抗体对乳腺癌源性CXCLs诱导的LIF的表达、分泌及其上游信号通路激活的影响;通过Q-PCR分别检测正常乳腺组织和乳腺癌、正常脂肪组织和癌旁脂肪组织中CXCL1-3和CXCL8的表达情况。结果:1、原代培养人前脂肪细胞,并诱导为成熟脂肪细胞。通过transwell小室将脂肪细胞与乳腺癌细胞共培养36 h,Q-PCR检测发现,脂肪细胞中脂肪细胞的分化标志物PPAR-γ、C/EBP-α表达明显降低,HSL及促炎因子IL-1β、IL-6、CCL2的表达明显升高;油红O染色显示,与单独培养的脂肪细胞相比,与乳腺癌细胞共培养后的脂肪细胞内脂滴变小,表明与乳腺癌细胞共培养后脂肪细胞转变为CAA。2、与乳腺癌细胞共培养后脂肪细胞中LIF m RNA水平显着上调,脂肪细胞上清中LIF的含量明显增多。H&E染色和免疫组化结果显示,与正常乳腺组织中的脂肪细胞相比,毗邻乳腺癌组织的脂肪细胞高表达LIF。3、重组蛋白rh LIF和CAA培养上清（CAA-CM）均能显着促进乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞的迁移和侵袭以及其胞内Stat3的磷酸化;LIF中和性抗体可以逆转CAA-CM对MDA-MB-231和BT549迁移侵袭及Stat3磷酸化的促进作用。4、Stat3特异性抑制剂Stattic可以分别逆转CAA-CM或rh LIF对MDA-MB-231和BT549细胞的迁移和侵袭及其胞内Stat3磷酸化的促进作用。利用si RNA敲低MDA-MB-231中Stat3的表达显着抑制CAA-CM诱导的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭;对临床乳腺癌组织标本的免疫组化结果显示,乳腺癌癌旁脂肪细胞LIF的表达与乳腺癌细胞Stat3的磷酸化呈正相关。5、在共培养体系中分别加入LY3214996和PD98059（两者均为ERK1/2抑制剂）、JSH-23和BAY 11-7082（两者均为NF-κB抑制剂,且后者可以抑制p65的磷酸化）以及Stattic（Stat3抑制剂）后,脂肪细胞LIF m RNA表达受到显着抑制。此外,与MDA-MB-231细胞共培养后,脂肪细胞内ERK1/2、NF-κB p65和Stat3磷酸化水平均显着增强。向共培养体系加入LY3214996,脂肪细胞内ERK1/2的磷酸化被显着抑制,同时Stat3和p65磷酸化水平也被明显抑制;免疫荧光实验发现,与单独培养的脂肪细胞相比,与乳腺癌细胞共培养后脂肪细胞Stat3和p65蛋白的入核明显增多。6、通过RNA-seq筛选与脂肪细胞共培养后乳腺癌MDA-MB-231细胞中的差异表达的分泌蛋白基因,其中ELR+CXC趋化因子亚家族成员CXCLs（CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8）的差异表达较显着;Q-PCR验证差异表达的分泌蛋白基因与RNA-seq筛选的结果一致。7、通过Q-PCR、ELISA和Western Blot发现与MDA-MB-231共培养后,CAA中LIF m RNA表达,CAA上清中LIF的含量,以及脂肪细胞胞内ERK1/2、NF-κB和Stat3磷酸化水平,均受到CXCR2的抑制剂SB225002的抑制;重组蛋白CXCL3和CXCL8均能诱导脂肪细胞ERK1/2、NF-κB p65和Stat3磷酸化,并上调LIF的表达,这种作用受CXCR2的抑制剂SB225002的显着抑制;并且在共培养体系中,CXCL3中和性抗体与SB225002的作用一致。8、通过Q-PCR检测发现,与正常乳腺组织相比,ELR+CXC趋化因子亚家族成员CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8 m RNA水平在乳腺癌组织和癌旁脂肪组织中均显着上调。9、Q-PCR结果显示,LIF能上调乳腺癌细胞中CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8的表达。因此LIF和CXCLs在乳腺癌细胞和脂肪细胞相互作用过程中形成恶性正反馈环。结论:乳腺癌细胞源性和CAA源性的CXCLs通过与CAA细胞表面受体CXCR2结合,激活ERK1/2信号通路,随后激活转录因子Stat3和NF-κB p65,使其磷酸化入核并启动LIF表达;CAA分泌LIF增多,通过旁分泌作用于乳腺癌细胞,激活乳腺癌细胞Stat3信号从而促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
肖启荣[4]（2021）在《托珠单抗逆转骨髓微环境所诱导AML细胞药物抵抗的作用机制研究》文中提出背景:急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一类起源于造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）的高度异质性的恶性血液系统疾病,以髓系细胞分化障碍、凋亡受阻和增殖失控为特点,是成人急性白血病中最常见的类型,其复发与耐药始终是影响其预后的主要障碍,而AML的复发与耐药与骨髓微环境息息相关。前期研究发现发现残留于骨髓微环境中的AML细胞存在PI3K/AKT、JAK/STAT3、MEK/ERK等信号通路的异常激活,且这一异常参与了微环境诱导的药物抵抗;另一方面发现,与正常供者相比,未经治疗及复发/难治的AML患者分泌的IL-6水平较多,且AML细胞与人骨髓基质细胞HS-5共培养之后更加明显地提高了IL-6的表达水平。目的:研究托珠单抗（tocilizumab,TCZ）通过阻断IL-6介导的JAK-STAT3信号通路在逆转微环境所诱导AML细胞药物抵抗中发挥的作用。方法:1.利用生物信息学技术探究IL-6在微环境所诱导AML细胞药物抵抗中所发挥的作用;2.将AML细胞株（U937、HL-60）与人骨髓基质细胞株（HS-5）共培养体外模拟白血病细胞在骨髓微环境中生存;3.构建IL-6基因敲低的HS-5细胞株;4.CCK-8法与Annexin V-APC/7-AAD双染法检测HS-5细胞IL-6基因敲除前后、托珠单抗作用前后粘附共培养AML细胞对常见化疗药物阿糖胞苷（cytarabine,Ara-C）、柔红霉素（daunorubicin,DNR）和高三尖杉酯碱（homoharringtonine,HHT）的药物抵抗性的改变;5.Western Blot法检测共培养前后及托珠单抗作用后IL-6-JAK-STAT3信号通路的改变;6.构建人AML小鼠皮下荷瘤模型,体内探讨TCZ协助Ara-C杀伤白血病细胞的作用机制。结果:1.生物信息学所分析的结果提示,预后不良的FLT3-ITD基因突变的AML患者中的差异表达基因的KEGG富集于IL-6信号通路、癌症通路,并且IL-6与FLT3-ITD基因突变的AML患者中的差异表达基因存在着潜在的互相作用。2.单独给药的TCZ对粘附共培养前后的AML细胞无明显抑制作用;粘附共培养后原癌基因信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）升高,且随着时间延长逐渐增加。3.粘附共培养可显着降低AML细胞株（U937、HL-60）对Ara-C、DNR和HHT的化疗敏感性,而TCZ协助作用后可逆转骨髓微环境所诱导药物抵抗,并且抑制粘附共培养后AML细胞内升高的STAT3,与其磷酸化蛋白p-STAT3,以及PI3K、ERK信号通路中的重要磷酸化蛋白p-AKT、p-ERK 1/2;4.与敲低IL-6的人骨髓基质细胞HS-5进行黏附共培养,可减少骨髓基质细胞诱导的AML细胞药物抵抗;5.小鼠体内研究表明,TCZ可协同Ara-C清除体内HL-60白血病细胞,并显着抑制荷瘤小鼠瘤体体积的增长;通过免疫组化法检测到,IL-6-JAK-STAT3轴关键蛋白分子STAT3、p-STAT3、p-AKT以及p-ERK 1/2在TCZ作用下表达减弱。结论:IL-6-JAK-STAT3轴参与TCZ协助Ara-C杀伤AML细胞,抑制该轴的激活有利于增强AML细胞的化疗敏感性。
顾敏[5]（2021）在《不同类型CRLF2基因表达异常对急性B淋巴细胞白血病细胞生物学特点和药物敏感性的影响》文中提出目的:研究比较不同类型CRLF2基因表达异常引起的CRLF2表达上调对急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL）细胞系Nalm6增殖、细胞周期及对化疗药物敏感性的影响,探讨其可能的作用机制。方法:分别构建空载体和4种不同CRLF2基因表达异常的荧光质粒,即CRLF2过表达、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、CRLF2突变型（F232C）和Vector,用慢病毒载体系统包装带有GFP荧光标记的CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C的慢病毒和对照病毒,同时建立CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C慢病毒稳定感染Nalm6细胞系和对照病毒稳定感染Nalm6细胞系;实时定量PCR方法（q PCR）及Western Blot方法验证转染后CRLF2基因及蛋白表达水平在Nalm6细胞系中上调;CCK-8和流式细胞术检测CRLF2不同类型基因异常引起的基因表达上调对细胞增殖、周期影响;Western Blot检测CRLF2不同类型基因表达异常对增殖、周期蛋白表达的影响。高通量药敏检测CRLF2不同基因异常对19种化疗药物的药物敏感性的影响。转录组测序技术（RNA-seq）比较CRLF2不同基因异常引起的基因表达变化。结果:成功建立CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C慢病毒感染B-ALL细胞系及对照病毒感染的B-ALL细胞系,4种CRLF2基因表达异常均可引起CRLF2表达上调,同时促进Nalm6细胞增殖。RNA-seq检测到在CRLF2突变型（F232C）中JAK/STAT通路表达上调,Western blot检测到F232C中p-STAT5蛋白表达明显增强。RNA-seq检测到系统性红斑狼疮（SLE）和转录失调通路在CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C过表达Nalm6细胞系中都表达上调,造血细胞系、破骨细胞分化等通路在大多数过表达Nalm6细胞系中表达下调。在5种细胞系中,表达F232C的细胞系对地塞米松的半抑制浓度（IC50或GI50）与对照组及表达CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2的细胞系相比明显增高,对地塞米松耐药。结论:CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达均可促进B-ALL细胞增殖,并激活JAK/STAT等信号通路。同时导致对多种化疗药物敏感性减低,特别是CRLF2突变型（F232C）对地塞米松明显耐药,对研究地塞米松在B-ALL中耐药提供一个新的研究思路。
张玺[6]（2020）在《苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究》文中研究指明背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于早期无明显症状,缺乏有效的早期检测筛查手段,约70%患者在诊断时已是晚期。目前,手术联合化疗是卵巢恶性肿瘤的主要治疗手段,但化疗对患者身体毒副作用大,且容易复发并产生耐药性。磷酸化是目前研究最广泛的翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）,能够调节细胞生长、分化、凋亡等多种细胞功能。磷酸化信号通路的改变与癌症密切相关,同时它们也可作为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质组学研究表明,由磷酸化等蛋白翻译后修饰介导的信号通路在卵巢癌的发生和耐药过程中起着关键作用。苦参碱是从中药苦参中提取的有效生物活性成分,具有广泛的生物学活性,比如抗炎、抗病毒、抗癌、镇痛、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化等。大量研究表明,苦参碱在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种类型的癌症中具有明确的抗癌效果。然而,苦参碱对卵巢癌的影响及其潜在的分子机制尚未见报道。目的:本研究旨在探究苦参碱对卵巢癌的作用及其分子机理,为苦参碱作为新型抗癌药物的深入研究提供线索和依据。方法:1.MTT法和平板克隆形成实验检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP增殖能力的影响。2.流式细胞术检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞周期和凋亡的影响。3.透射电子显微镜和荧光显微镜观察苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP自噬的影响。4.划痕实验、Transwell侵袭实验和免疫荧光技术评估苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞迁移和侵袭的影响。5.体外血管生成试验探讨苦参碱对肿瘤血管生成的影响。6.酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3分泌血管内皮生成因子VEGFA的影响。7.逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测苦参碱对血管内皮生成因子VEGFA和血管生成素ANG-1m RNA水平的影响。8.Western blot检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关蛋白的表达及肿瘤相关磷酸化信号通路的影响。9.分别建立卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP裸鼠皮下移植瘤和尾静脉小鼠模型,定期腹腔注射苦参碱,观察苦参碱对体内卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响。10.苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织坏死、肿瘤转移及肝脏损伤的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织凋亡的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780和小鼠肿瘤组织总的蛋白质磷酸化水平的影响以及肿瘤组织中增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。12.免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）进一步验证苦参碱对小鼠肿瘤组织中信号通路蛋白磷酸化水平的影响。13.全自动生化分析仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartic aminotransferase,AST）含量,评估苦参碱对小鼠肝功能的影响。结果:1.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱阻滞卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞周期在G0/G1期,上调p21蛋白表达,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达;同时降低ERK1/2和MEK1/2蛋白磷酸化水平。3.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3发生凋亡,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达;同时降低PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。4.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3自噬,上调LC3-II蛋白表达,下调SQSTM1蛋白表达;同时降低Akt和m TOR蛋白磷酸化水平。5.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3迁移和侵袭,降低FAK和Rho A蛋白活性及磷酸化水平。6.苦参碱抑制卵巢癌细胞对血管生成的促进作用,降低卵巢癌细胞A2780和SKOV3分泌VEGFA水平,同时降低卵巢癌A2780和SKOV3细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平。7.苦参碱降低HUVEC/A2780和HUVEC/SKOV3共培养体系中内皮细胞HUVECs中ANG-1 m RNA和蛋白表达水平,同时下调VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。8.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780体内肿瘤增殖和转移能力,降低卵巢癌细胞和肿瘤组织中总的蛋白质磷酸化水平。9.Western blot和IHC结果表明,苦参碱下调肿瘤组织中信号通路相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2、Tie2蛋白磷酸化水平。10.苦参碱对肝脏组织无损伤作用,对小鼠血清中ALT和AST含量变化无显着影响。11.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,抑制细胞迁移和肿瘤血管生成。12.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP体内肿瘤增殖和转移能力。结论:苦参碱能够抑制卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成,同时降低ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。苦参碱通过抑制肿瘤相关磷酸化信号通路调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成,从而抑制卵巢癌的发生发展。背景:近几十年来,分子靶向治疗已在许多癌症类型的临床治疗中取得了良好的疗效,如乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等。确定理想的靶点是肿瘤分子靶向治疗成功的关键。分子靶向治疗的靶点可作用于细胞表面抗原、受体和生长因子,能够调控细胞增殖和转移、细胞周期和血管生成相关信号转导通路。靶向治疗可与过表达的分子结合,调节该分子调控的信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖,最终导致细胞死亡。原癌基因c-Src（Src）是一种非受体酪氨酸激酶,与多种人类癌症的发生、维持、进展和转移扩散密切相关。Src通过与多种蛋白和蛋白复合物相互作用并使其磷酸化,在细胞信号传导过程中起关键作用。苦参碱是从传统中药苦参中提取的生物碱之一,具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等广泛的药理学活性。研究表明,苦参碱对多种癌症类型包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病等均具有抗肿瘤活性。苦参碱发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭、抑制血管生成等途径实现的。目前,有关苦参碱抗肿瘤作用的研究颇为广泛,然而其发挥抗癌活性的直接作用靶点尚未见报道。目的:本研究旨在寻找苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点并探讨其作用机制,为开发肿瘤靶向药物提供实验依据。方法:1.选取人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF7、人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3、人宫颈癌细胞He La六种癌细胞为研究对象,MTT法检测苦参碱对癌细胞增殖能力的影响。2.分别建立人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3皮下移植瘤模型,定期腹腔注射苦参碱或生理盐水,观察苦参碱对体内肿瘤增殖能力的影响。3.以槐果碱和乙醇胺为原料进行化学反应,合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱。红外光谱和质谱对13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱进行结构表征。4.13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱与氨基偶联树脂进行偶联反应,制备苦参碱偶联树脂。紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度变化,间接反映偶联反应效率。5.提取卵巢癌细胞SKOV3总蛋白,利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色寻找苦参碱特异性结合蛋白。液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）鉴定苦参碱特异性结合蛋白。6.细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）实验验证苦参碱作用靶点;构建GST-Src重组蛋白,Pull down实验进一步验证苦参碱作用靶点。7.构建Src分段质粒,转染HEK293T细胞,Pull down实验验证苦参碱结合区域。8.构建GST-Kinase重组蛋白,Western blot进一步验证苦参碱结合区域。9.采用Discovery Studio 4.5软件,分子对接苦参碱与Src激酶结构域,探究苦参碱结合Src激酶结构域的氨基酸。10.选取苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞,测定苦参碱对癌细胞中Src激酶活性的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:1.苦参碱抑制癌细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱抑制体内癌细胞增殖能力。3.化学合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱,产率为65%,红外光谱与质谱结构表征结果与13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱结构一致。4.制备苦参碱偶联树脂,紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度,偶联反应效率为54%。5.利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色结果显示,分子量55-70 k Da之间有明显蛋白条带;且加入苦参碱后,此蛋白条带明显减弱,猜测此蛋白可能为苦参碱特异性结合蛋白。LC-MS/MS质谱定性分析发现,Src为苦参碱特异性结合蛋白。6.CETSA实验结果表明,与对照组相比,苦参碱处理组Src蛋白的热稳定性明显增强。同时,GST-Src重组蛋白进行Pull down实验,结果显示,苦参碱偶联树脂组检测到Src蛋白,且加入苦参碱后,Src蛋白明显减少,进一步证实Src为苦参碱作用靶点。7.分别构建Src分段质粒USH3、SH4-UD、SH3、SH2、Kinase,转染HEK293T细胞过表达后,提取总蛋白进行Pull down实验,Western blot结果分析显示,苦参碱结合Src激酶结构域。8.GST-Kinase重组蛋白进行Pull down实验,Western blot结果表明,苦参碱偶联树脂组检测到目的蛋白,且加入苦参碱后,目的蛋白明显减少,进一步证实Src激酶结构域为苦参碱结合区域。9.Discovery Studio 4.5软件预测苦参碱与Src激酶结构域3D分子对接情况,结果显示,苦参碱结合Src激酶结构域,主要作用可能是因为苦参碱与Ala392形成较强的氢键作用力;同时,苦参碱与周围氨基酸形成范德华力等其他作用力。10.苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞后,细胞中Src激酶活性均显着降低。11.Western blot结果表明,苦参碱显着下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。结论:苦参碱抑制癌细胞增殖。苦参碱作用靶点为Src,Src激酶结构域为苦参碱结合区域。同时,苦参碱能够下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。因此,苦参碱通过靶向Src激酶结构域下调磷酸化信号通路进而抑制癌细胞增殖。
徐婷婷[7]（2020）在《成人ALL中基因的分析及JAK3突变在ALL中的意义》文中研究说明第一部分 成人ALL中基因的分析目的分析成人急性淋巴细胞白血病（ALL）中基因分布的特点,并通过微小残留病检测（MRD）试图探讨相关基因的预后特征。材料和方法回顾性分析2017年1月至2019年12月在我院就诊的246例初治成人ALL,结合流式细胞术、实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）、二代测序技术（NGS）检测患者的白血病免疫分型和MRD、43种融合基因及16种突变基因。采用SPSS21.0统计分析数据,计数资料采用χ2检验,生存分析采用Kaplan-Meier检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果246例ALL患者中,B-ALL患者202例,T-ALL患者40例,双表性患者4例,其中CD19、cCD79a在B-ALL中最具诊断价值,cCD3和CD7在T-ALL中最具诊断价值。RT-PCR共检测出99（40.2%）例患者表达8种融合基因,在B-ALL中90（44.6%）例患者表达融合基因,表达较高的3种为:BCR-ABL（75 例）、E2A-PBX1（10 例）、MLL-AF4（5 例）。NGS 共检测出 69（28.0%）例患者,表达12种突变基因,在T-ALL中28（70%）例患者出现基因突变,其中48.3%的患者发生基因共突变。在T-ALL中突变率较高的依次为:NOTCH1、JAK3、FBXW7、IL-7R;B-ALL 中突变率较高的则是:TP53、IL-7R、PAX5。本研究中涉及突变较多的信号通路包括:JAK/STAT信号通路（JAK1、JAK3、IL-7R）,NOTCH 信号通路（NOTCH1、FBXW7）和 MARK/PI3K 信号通路（TP53）。E2A-PBX1基因、JAK/STAT信号通路突变组的患者诱导治疗的MRD 阳性率均高于阴性组（P<0.05）。结论在B-ALL种普遍存在基因重排,在T-ALL中普遍存在基因突变及共突变。E2A-PBX1基因、JAK/STAT信号通路突变组的患者预后可能差,需扩大样本量以及进一步随访。第二部分JAK3突变在ALL中的意义目的分析成人急性淋巴细胞白血病（ALL）中JAK3基因的突变及共突变的特征,并通过微小残留病检测（MRD）和其共突变基因试图探讨JAK3基因突变的预后特征。材料和方法回顾性分析2017年1月至2019年12月在我院就诊的246例初治成人ALL,结合流式细胞术、实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）、二代测序技术（NGS）检测患者的MRD及16种突变基因。采用SPSS21.0软件统计分析数据,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,P<0.05提示差异有统计学意义。结果246例ALL患者中,共10例患者发生JAK3基因突变,8例为T-ALL,1例B-ALL,1例双表性患者,其中90%的患者发生了基因共突变,多与NOTCH1（4例）、PHF6（3例）及FBXW7（2例）发生共突变。共检测出4种JAK3的突变位点:A573V、R657Q、V674A和M511I,其中R657Q是突变最多的位点（50%）,其次是M511I（30%）。此外,有1例患者同时有A573V、R657Q 2种位点突变。在T-ALL中,JAK3突变的患者较阴性组年龄更低,血小板计数更高,但诱导治疗的MRD阳性率更高（P<0.05）。结论JAK3基因突变的患者可能预后差,但是需要扩大样本量,继续随访。
胡晓丽[8]（2020）在《Gilteritinib联合ATO对FLT3-ITD突变细胞株协同机制研究》文中研究表明目的:急性髓系白血病（AML）是一种异质性的恶性克隆性疾病,由于反复的发生遗传改变以及转化,骨髓中未成熟的髓系祖细胞诱导白血病细胞增殖和存活,这些细胞能够自我更新和维持恶性群体以及产生亚克隆,尽管近年来的诊断和治疗改善了AML患者的预后,但总体5年生存率仍不到30%,并且大约只有40-45%的年轻人和10-20%的老年急性髓细胞性白血病（AML）可以用目前的标准化疗达到缓解。FMS酪氨酸激酶3（FLT3）蛋白是Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族的一员,对早期造血祖细胞的增殖和分化具有重要的作用。FLT3基因通常仅在骨髓CD34阳性的前体细胞中表达,位于13q12染色体上,缺乏FLT3基因的干细胞存在重建T细胞和骨髓细胞的能力下降。因此,FLT3可能在多能干细胞和B细胞的发育中起着重要的作用。FMS酪氨酸激酶3（FLT3）突变是急性髓细胞白血病（AML）中最常见的突变之一,存在于约40%的细胞遗传学正常的AML患者中;另外一些急性淋系白血病ALL-T（pre-T）患者也存在FLT3-ITD突变,预后不容乐观。FLT3有两大类突变:约20%至25%的患者在FLT3的近膜结构域发生内部串联重复（FLT3-ITD）;约7%到10%的患者在FLT3酪氨酸激酶结构域发生点突变D835（FLT3-TKD）。目前我们的研究主要涉及FLT3-ITD,这是FLT3最常见的突变。含FLT3-ITD突变的AML患者复发率高,预后差。FLT3酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）作为单一药物仅获得有限的临床疗效。Gilteritinib是一种新研发的FLT3酪氨酸激酶抑制剂（TKI）,目前已被证明在临床试验中是有效的;三氧化二砷（ATO）是一种有效的抗癌药物,也是急性早幼粒细胞白血病（APL）的标准化疗用药。本研究拟在探究FLT3酪氨酸酶抑制剂Gilteritinib联合ATO对FLT-ITD突变细胞株的潜在机制,为FLT3-ITD突变白血病治疗提供实验依据。方法:采用western blot技术检测伴FLT3-ITD突变的MV4-11和MOLM13细胞株及含有FLT3-WT的细胞株HL-60和THP-1细胞株中的FLT3蛋白含量。以不同浓度的Gilteritinib处理MV4-11、MOLM13、HL-60以及THP-1四种细胞株;以不同浓度Ara-c,DAC和ATO分别处理MV4-11细胞;以不同浓度的Gilteritinib,ATO单药或两药联合处理MV4-11和MOLM13细胞株,同时用CCK-8法检测细胞活性。以2.5n M的Gilteritinib,0.5μM的ATO单药或两药联合处理MV4-11和MOLM13细胞株,甩片后应用瑞氏染色观察细胞的形态变化,流式细胞术检测细胞的凋亡及细胞周期,western blot检测FLT3蛋白及下游分子STAT5、ERK和AKT蛋白水平以及其蛋白磷酸化水平。Western blot技术检测Gilteritinib处理MV4-11和MOLM13细胞株后160KD FLT3蛋白含量的变化以及Gilteritinib处理MV4-11细胞对内质网通路蛋白GRP94、ATF6、PERK和IRE1a的影响并进一步应用western blot技术检测Gilteritinib与ATO联合用药处理MV4-11和MOLM13细胞后对IRE1a-JNK通路的影响。采用小干扰技术,将IRE1a基因小干扰RNA（si RNA-IRE1a）和阴性对照干扰片段（si RNA-control）成功转染MV4-11和MOLM13细胞以敲减IRE1a基因的表达,用RT-PCR和western blot检测IRE1a基因敲减效率,之后应用流式细胞术检测IRE1a基因敲减之后Gilteritinib与ATO两药联合对MV4-11和MOLM13细胞的凋亡的影响,western blot检测两药联合处理对MV4-11和MOLM13细胞凋亡通路BAX蛋白和BCL-2蛋白的影响。应用内质网激活剂衣霉素与Gilteritinib联合处理MV4-11和MOLM13细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况以及western blot技术检测凋亡相关蛋白。建立MV4-11细胞荷瘤鼠,Gilteritinib与ATO单药或两药联合治疗后,观察瘤体生长情况。Western blot技术检测FLT3蛋白以及下游分子STAT5、ERK和AKT蛋白水平及其蛋白磷酸化水平以及IRE1a-JNK信号水平,免疫组化检测瘤体增殖以及Tunel试剂盒检测瘤体凋亡。结果:（1）FLT3-ITD突变的MV4-11和MOLM13细胞株FLT3蛋白表达高于FLT3野生型THP-1和HL-60细胞株,Gilteritinib能够特异性的抑制MV4-11和MOLM13的增殖,ATO与Ara-c和DAC相比,其对MV4-11细胞株的抑制更明显。Gilteritinib和ATO两药联合能够协同抑制MV4-11和MOLM13细胞株的增殖活性,增加凋亡,抑制侵袭;形态学上,两药联合能够引起细胞更明显的凋亡和坏死改变。（2）Gilteritinib单药能够显着降低MV4-11和MOLM13细胞株FLT3蛋白及下游分子STAT5、ERK和AKT蛋白的磷酸化水平,增加MV4-11和MOLM13细胞膜表面160KD FLT3蛋白的表达。Gilteritinib处理MV4-11细胞后,内质网总标记蛋白GRP94被下调,ATF6和PERK变化不明显,IRE1a及其下游信号磷酸化JNK蛋白被抑制。Gilteritinib与ATO两药联合相对于Gilteritinib单药可以明显上调IRE1a蛋白及其下游磷酸化的JNK蛋白。（3）RT-PCR和western blot结果均显示IRE1a基因被成功敲减。IRE1a基因敲减后降低了Gilteritinib与ATO的联合效应,细胞凋亡下降,凋亡通路被抑制。衣霉素（内质网途径激活剂）与Gilteritinib联合处理MV4-11和MOLM13细胞株同样可以引起凋亡增加和凋亡通路的激活。（4）Gilteritinib与ATO两药联合可以明显抑制裸鼠MV4-11瘤体的生长。Gilteritinib单药能够显着降低裸鼠MV4-11瘤体FLT3蛋白及下游分子STAT5、ERK和AKT蛋白的磷酸化水平,Gilteritinib与ATO两药联合可以上调裸鼠MV4-11瘤体IRE1a-JNK通路。Gilteritinib与ATO两药联合可以抑制瘤体细胞增殖以及上调裸鼠MV4-11瘤体凋亡。结论:Gilteritinib与ATO联合应用对FLT3-ITD突变MV4-11和MOLM13细胞株在增殖抑制、凋亡增加、侵袭能力减弱以及对裸鼠肿瘤生长抑制方面具有协同作用。Gilteritinib单药能够显着降低FLT3蛋白及下游分子STAT5、ERK和AKT蛋白的磷酸化水平,Gilteritinib增加了MV4-11和MOLM13细胞株细胞膜表面160KD的FLT3蛋白,抑制IRE1a及其下游信号磷酸化JNK,加入ATO后可逆转Gilteritinib对IRE1a的下调。IRE1a基因敲除降低了Gilteritinib与ATO的联合效应,细胞凋亡下降,凋亡通路被抑制,衣霉素（内质网途径激活剂）与Gilteritinib联合处理MV4-11和MOLM13细胞株可以进一步引起凋亡增加。
王雅清[9]（2020）在《STAT基因家族中STAT1、STAT3、STAT5与GRIM-19蛋白在皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤中的表达及相关性的实验研究》文中认为背景:据统计皮肤鳞状细胞癌是我国发病率最高的皮肤恶性肿瘤,相比其他类型的皮肤癌转移率更高、预后较差。角化棘皮瘤是一种少见的皮肤交界性肿瘤,其组织学特征与皮肤鳞癌相似,仅依靠形态学鉴别十分困难,误诊率极高。在2006年版的WHO皮肤肿瘤组织学分类中,角化棘皮瘤为一种良性上皮性肿瘤,但近年来有研究者提出角化棘皮瘤是皮肤鳞癌的一种变异型,部分病例最终可以发展为鳞癌,应看作是皮肤鳞癌的癌前病变或“角化棘皮瘤型皮肤鳞状细胞癌”。在最新版（2018年）的分类标准中,角化棘皮瘤被归为高分化鳞状细胞癌,但目前临床上对于角化棘皮瘤的定义仍极具争议。这两类肿瘤的治疗和预后截然不同,大多数角化棘皮瘤发展迅速但可自愈,而皮肤鳞癌早期生长缓慢不易察觉,到了晚期多发生周围组织的浸润和转移,所以两者的鉴别诊断至关重要。目前临床病理中仍缺乏特异性高的鉴别标记物,也为治疗的精准性增加了难度。因此,我们希望找到参与调控皮肤鳞癌发生的重要基因,通过检测它在皮肤鳞癌与角化棘皮瘤之间的表达差异,判断是否可以作为两者鉴别的分子标记物或未来靶向治疗的新方向。大量研究发现信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）家族基因在细胞的增殖、凋亡、分化和免疫调节等生理过程中都起着复杂而重要的调节作用,激活后的STATs基因可通过转录调控多种原癌基因的表达来诱导肿瘤的发生。其中STAT3被发现在多种恶性肿瘤中表达上调,但是对于皮肤鳞癌和角化棘皮瘤中,STATs基因的表达情况以及癌基因STAT3在交界性的角化棘皮瘤中是否与皮肤鳞癌存在明显差异,之前的相关研究较少。有报道称干扰素联合维甲酸诱导的细胞凋亡相关基因19（gene associated with retinoid-interferon mortality-19,GRIM-19）是一种有效的STAT3激活抑制剂,可以直接与STAT3结合抑制其激活从而抑制细胞增殖并促进凋亡。但是在皮肤鳞癌的发生机制中,是否存在GRIM-19/STAT3轴的调控,之前的研究较少,本课题将围绕这些问题进行研究。目的:1.检测STAT家族中的肿瘤相关基因STAT1、STAT3及STAT5在皮肤鳞癌及角化棘皮瘤中的表达情况以及是否与患者的各临床特征有关;2.癌基因STAT3在皮肤鳞癌和角化棘皮瘤中的表达差异有无统计学意义;3.在皮肤鳞癌和角化棘皮瘤中,GRIM-19的表达情况以及它是否与STAT3的表达存在相关性。方法:1.采用免疫组化检测皮肤鳞癌、角化棘皮瘤和正常组织中STAT1、STAT3、STAT5以及GRIM-19基因蛋白的表达情况,并用统计学分析各基因的表达与患者各临床特征之间有无相关性;以及GRIM-19与STAT3的表达是否存在相关性。2.通过对公共基因芯片数据库（GEO）中皮肤鳞癌的数据集进行生物信息学分析,数据采用配对t检验的方法计算皮肤鳞癌样本与正常对照样本中STAT1、STAT3、STAT5以及GRIM-19基因表达量的差异;并对GRIM-19与STAT3基因的表达量进行相关性分析。结果:1.免疫组化结果显示STAT家族中p-STAT1、p-STAT5（磷酸化状态下）在皮肤鳞癌和角化棘皮瘤中均为阴性;p-STAT3蛋白在皮肤鳞癌中阳性率为63.4%,且与分化程度呈负相关（P=0.027,P<0.05）,与其他临床特征无关;在角化棘皮瘤中阳性率为62.1%,与各临床特征均无关;2.p-STAT3蛋白在皮肤鳞癌和角化棘皮瘤中的阳性率均高于正常组织的阳性率11.1%,且差异均具有统计学意义（P<0.05）;但p-STAT3蛋白在皮肤鳞癌与角化棘皮瘤中的差异无统计学意义（P=0.909,P>0.05）;3.GRIM-19在皮肤鳞癌中阳性率为43.9%,且与肿瘤大小呈负相关（P=0.009,P<0.05）,与分化程度正相关（P=0.028,P<0.05）,与其他临床特征无关;在角化棘皮瘤中阳性率为48.3%,且与恶变程度负相关（P=0.005,P<0.05）,与其他临床特征无关;在正常组织中阳性率为61.1%,三者之间的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。4.在皮肤鳞癌中,GRIM-19与p-STAT3蛋白的表达呈负相关（r=-0.656,P=0.000,P<0.05）;在角化棘皮瘤中,GRIM-19与p-STAT3蛋白的表达呈正相关（r=0.471,P=0.010,P<0.05）。5.GEO数据库中皮肤鳞癌的数据分析显示STAT1、STAT3、STAT5a基因在皮肤鳞癌组和正常对照组中均存在显着表达差异（P<0.05）;GRIM-19基因在皮肤鳞癌组和正常对照组中无表达差异（P>0.05）,且GRIM-19与STAT3不存在相关性（r=0.2448,P=0.42,P>0.05）。结论:在皮肤鳞癌中,STAT3基因m RNA和蛋白的表达均上调,说明STAT3基因参与了皮肤鳞癌的发生,起到了促癌作用。但是,STAT3的蛋白在皮肤鳞癌和角化棘皮瘤之间的表达差异不明显,不能作为两者的鉴别诊断标记物。GRIM-19基因m RNA和蛋白的表达在皮肤鳞癌、角化棘皮瘤和正常皮肤中均无明显差异,且GRIM-19与STAT3相关性较差,说明在皮肤鳞状细胞肿瘤中,不存在GRIM-19基因通过抑制STAT3的活化来发挥抑癌作用,GRIM-19/STAT3轴可能未参与皮肤鳞癌发生的分子机制。
彭珊琴[10]（2020）在《益肾通痹汤抑制JAK3/STAT3通路及其抗炎机制的研究》文中研究指明目的:研究益肾通痹汤抑制CIA大鼠关节炎症及其骨质破坏的作用,围绕JAK3/STAT3通路,研究益肾通痹汤抗炎的作用机制。方法:1.胶原诱导性关节炎模型的建立:选用清洁级雌性Wistar大鼠,体重100g±20g。将Ⅱ型牛胶原溶于0.05 mmol/L醋酸中,最终浓度2mg/ml,4℃混匀过夜制成胶原溶液,再将牛Ⅱ型胶原溶液与等体积的弗氏完全佐剂1:1比例充分反复混匀,乳化成油包水乳剂,乳化剂最终达到1mg/ml,按大鼠体重给药,每100g体重0.2ml,距尾根2cm处进针皮下注射。2.大鼠造模成功后随机分为5组,每组10只,分别为益肾通痹汤低剂量组、益肾通痹汤剂量组、益肾通痹汤高剂量组、甲氨蝶呤组及CIA模型组。按大鼠体重给药,甲氨蝶呤组2.5mg/kg,益肾通痹汤高剂量组18g/kg,益肾通痹汤中剂量组9g/kg,益肾通痹汤低剂量组4.5g/kg,于足肿第1天开始给药,MTX组每周一次给予灌胃,益肾通痹汤每天一次进行灌胃,CIA模型组和空白组每天给予生理盐水2ml灌胃,所有Wistar大鼠均采用正常饮食。连续给药5周后,麻醉处死大鼠并取材。3.足肿容积法测量:用5%苦味酸在大鼠下肢踝关节处作上记号,按照记号将下肢放入足肿测量仪内,以测量每只大鼠的容积值（ml）,每次测定足容积两次,取其平均值。并观察大鼠毛发、自由活动及精神状态等一般情况。4.关节HE病理片的评价:取左前肢和右后肢近端第3足趾关节,固定、切片,HE染色,对中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润,滑膜细胞增生还有关节软骨破坏进行盲法评价。计分方法:（1）炎性细胞浸润,0分:无浸润;1分:1-5个HP;2分:6-10个HP;3分:11-15个HP;4分:形成小脓肿（2）滑膜纤维组织增生程度,0分无增生;1分增生占1/3HP;2分增生占1/2HP;3分增生占1HP;4分增生>1HP。（3）关节软骨破坏情况,0分无破坏;1分小灶状破坏<1/3;2分1/2破坏;3分2/3破坏;4分全部破坏5.大鼠X片评分:每只大鼠的足趾和踝关节破坏分骨侵蚀（erosion）和关节间隙改变（Joint space narrowing,JSN）两个方面进行评价。骨侵蚀评分标准:0分:正常;1分:可疑或有1个微小局部病灶;2分:2个局部病灶或病灶总表面积≤50%;3分:3个以上的病灶或病灶总表面积>50%:4分:关节面完全破坏,或出现骨缩小。关节间隙:0分:正常;1分:可疑或有一个微小局部病灶;2分:关节出现狭窄;3分:关节强直或关节间隙增宽。骨侵蚀共96块骨,关节间隙共100个。由影像学医生盲法阅片后评分。6.滑膜组织m RNA的提取和q PCR实验,分析益肾通痹汤对CIA大鼠滑膜的IL-1β、TNF-α、IL-6的含量的影响。7.流式细胞术测定益肾通痹汤对大鼠淋巴结Th1/Th2细胞的比率的影响。8.细胞毒性试验:采用CCK-8试验检测益肾通痹汤氯仿部位（YSLF）4000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml不同浓度组对Jurkat细胞增殖的影响。9.ELISA法检测益肾通痹汤氯仿部位（YSLF）对Jurkat细胞分泌的TNF-α、IFN-γ等细胞因子的含量的影响。10.采用Western blot技术来观察益肾通痹汤氯仿部位（YSLF）对Jurkat细胞中STAT3、JAK3及其磷酸化蛋白表达水平的影响。结果:1.大鼠足肿值（ml）:第1天造模成功,CIA造模组（1.67±0.28）、MTX组（1.67±0.27）、中药低剂量组（1.42±0.20）、中药中剂量组（1.52±0.17）、中药高剂量组（1.67±0.27）与正常组大鼠足肿值（0.69±0.05）相比差异有统计学意义（P<0.05）;CIA关节炎症起病后第7天左右达到高峰,然后逐渐消退;给药后34天,与CIA造模组（1.42±0.25）相比,MTX组（0.95±0.11）、中药中剂量组（0.91±0.01）、中药高剂量组（0.96±0.23）与造模组（1.42±0.25）相比可明显抑制CIA大鼠足肿（P<0.05）,而中药低剂量组（1.27±0.27）与CIA造模组（1.42±0.25）足肿值相比无差异无统计学意义（P>0.05）。2.给药后35天,HE病理片显示CIA大鼠出现明显的炎性细胞浸润,滑膜组织增生和软骨破坏。和CIA组（3.3±0.67）对比,中药中剂量组（1.6±0.70）、中药高剂量组（1.5±0.53）和MTX（1.4±0.52）组可抑制CIA大鼠炎性细胞浸润（P<0.05）;和CIA组（2.8±0.79）对比,中药中剂量组（1.6±0.70）、中药高剂量组（1.0±0.67）和MTX（0.9±0.74）组可以明显减少CIA大鼠滑膜细胞增生（P<0.05）;和CIA组（3.1±0.74）对比,中药中剂量组（1.8±0.63）、中药高剂量组（1.4±0.52）和MTX（1.2±0.63）组可以明显减少CIA大鼠软骨破坏（P<0.05）。3.CIA大鼠X片:CIA大鼠X线表现是以远端趾间关节、近端趾间关节、踝关节受累为特点,双侧呈对称性。CIA起病后第7天以关节软组织肿胀为主,第15天关节软组织肿胀逐渐减轻,第35天可见明显的骨质侵蚀,伴有骨质增生性反应,骨端增生、粗大,远端趾间关节,近端趾间关节间隙狭窄或增宽,部分踝关节间隙消失,关节相互融合导致骨性强直。给药后35天,甲氨蝶呤（114.4±10.54）和中药中（1123.6±7.73）、高剂量（120.7±9.91）都可明显抑制CIA大鼠骨质侵蚀（175.8±13.42）,二者比较差异有统计学意义（P<0.05）;甲氨蝶呤（107.5±5.56）和中药中（111.9±5.61）、高剂量（110.8±6.32）都可明显抑制CIA大鼠（156.1±24.68）关节间隙改变,二者比较差异有统计学意义（P<0.05）。4.滑膜组织m RNA表达:和CIA模型组IL-1β（10.75±0.19）对比,正常组中IL-1β（1.05±0.07）表达显着下降（P<0.05）;和CIA模型组TNF-α（17.19±2.02）对比,正常组中TNF-α（1.33±0.03）的m RNA表达下降,差异有统计学意义（P<0.05）;和CIA模型组IL-6（19.1±0.6）对比,正常组中IL-6（1.62±0.06）表达下降,差异有统计学意义（P<0.05）;甲氨蝶呤组（3.42±0.16）、益肾通痹汤中（6.26±0.32）、益肾通痹汤高剂量组（4.2±0.37）的IL-1β的m RNA表达明显低于CIA组（10.75±0.19）（P<0.05）。甲氨蝶呤组（6.73±0.13）、益肾通痹汤中（8.5±0.0）、益肾通痹汤高剂量组（7.14±0.25）的TNF-α的m RNA表达明显低于CIA组（17.19±2.02）（P<0.05）;甲氨蝶呤组（9.83±0.13）、益肾通痹汤中（11.51±0.37）、益肾通痹汤高剂量组（10.75±0.19）的IL-6的m RNA表达明显低于CIA组（19.1±0.6）（P<0.05）。5.和正常组大鼠Th1细胞（11.50±3.27）相比,CIA大鼠中Th1细胞比例升高（38.65±3.52）;和正常组大鼠Th2细胞（31.28±5.16）相比,CIA大鼠中Th2细胞比例下降（1.43±0.60）,差异有统计学意义（P<0.05）。和CIA模型组（38.65±3.52）对比,益肾通痹汤中（23.78±5.19）、高剂量组（23.22±4.80）和MTX组（21.87±5.47）的Th1细胞比例下降,差异有统计学意义（P<0.05）,益肾通痹汤低剂量组（32.68±0.83）和CIA模型组（38.65±3.21）对比差异无统计学意义（P>0.05）;益肾通痹汤低剂量组（7.88±4.12）、中剂量组（18.65±3.76）、高剂量组（19.12±3.79）和MTX组（19.63±3.36）的Th2细胞比例和CIA模型组Th2细胞比例（1.43±0.60）相比差异有统计学意义（P<0.05）。6.YSLF 4000ng/ml、2000ng/ml这两个浓度会导致细胞增值率的下降,而YSLF1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml组细胞增殖率正常,故选择这3个浓度梯度进行实验。7.PHA刺激Jurkat细胞24h后,与单纯PHA刺激细胞（202.33±11.06）相比,YSLF低剂量组（156.33±11.37）、YSLF中剂量组（139.33±5.50）、YSLF高剂量剂量组（112.00±8.19）组分泌TNF-α水平均降低（P<0.05）;与单纯PHA刺激细胞（57.00±2.65）相比,YSLF低剂量组（31.66±4.51）、YSLF中剂量组（24.67±2.08）、YSLF高剂量剂量组（23.00±2.94）组细胞分泌IFN-γ水平均降低,差异有统计学意义（P<0.05）。8.与空白组细胞p-JAK3/JAK3（0.07±0.02）相比,IL-2刺激后p-JAK3/JAK3（0.81±0.02）升高,与空白组细胞p-Stat3/Stat3（0.10±0.02）相比,IL-2刺激后p-Stat3/Stat3（0.83±0.10）蛋白水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）;YSLF中剂量组（0.07±0.01）、YSLF高剂量组（0.08±0.02）与JAK3抑制剂ZM39923（0.06±0.02）组p-JAK3/JAK3蛋白水平均降低,与IL-2组（0.81±0.02）差异有统计学意义（P<0.05）;YSLF中剂量组（0.14±0.02）、YSLF高剂量组（0.14±0.04）与JAK3抑制剂ZM39923（0.18±0.03）组p-Stat3/Stat3蛋白水平均降低,与IL-2组（0.83±0.10）差异有统计学意义（P<0.05）;结论:益肾通痹汤抑制CIA模型大鼠的关节炎症,减少滑膜增生和软骨破坏,其机制可能是益肾通痹汤通过调节了Th1/Th2细胞的平衡,减少了炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放,从而抑制炎症反应的作用。益肾通痹汤氯仿部位通过可以抑制JAK3/STAT3信号通路蛋白磷酸化,减少炎症因子TNF-α、IFN-γ的释放,发挥抗炎和免疫调节作用。
二、白血病细胞JAK/STAT途径异常激活（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白血病细胞JAK/STAT途径异常激活（论文提纲范文）
（1）JAK/STAT信号通路在急性T淋巴细胞白血病中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 JAK/STAT信号通路 |
| 2 JAK/STAT信号通路在T-ALL中的作用机制 |
| 3 JAK/STAT信号通路的异常激活 |
| 3.1 JAK/STAT信号通路异常激活的上游突变 |
| 3.2 JAK/STAT信号通路异常激活的下游突变 |
| 4 靶向JAK/STAT信号通路治疗T-ALL |
| 4.1 单独治疗 |
| 4.2 联合治疗 |
| 4.3 IL-7R靶向治疗 |
| 4.4 中药治疗 |
| 5 展望 |
（2）维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 维生素C性质及其生物学功能的研究进展 |
| 1.1.1 维生素C的发现、生物合成及利用 |
| 1.1.2 维生素C的运输及机体稳态调节 |
| 1.1.3 维生素C的抗氧化性 |
| 1.1.4 维生素C是二价铁离子和α-氧戊二酸盐依赖性双加氧酶家族蛋白的关键辅因子 |
| 1.1.5 维生素C促进细胞重编程 |
| 1.1.6 维生素C是一个低甲基化诱导因子 |
| 1.1.7 维生素C的潜在抗癌机制 |
| 1.1.8 维生素C与其他疾病的关系及潜在治疗作用 |
| 1.1.9 维生素C在调控细胞信号通路方面的初探索 |
| 1.1.10 维生素C已知的生物学功能具有两面性 |
| 1.2 钠离子依赖型维生素C转运蛋白SVCTs的研究进展 |
| 1.2.1 SVCTs的结构、定位和运输作用 |
| 1.2.2 SVCT1和SVCT2 表达和功能的调控 |
| 1.2.3 SVCT2 在调控细胞分化和细胞功能成熟中的作用 |
| 1.3 非受体型酪氨酸激酶JAK2 的研究进展 |
| 1.3.1 JAK激酶家族蛋白的结构和功能简介 |
| 1.3.2 JAK2 激酶活性的调控 |
| 1.3.3 非经典细胞核内JAK2 信号转导途径研究进展 |
| 第二章 维生素C转运蛋白SVCT2 受体功能的探究 |
| 2.1 材料、试剂与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 2.1.6 细胞培养 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 蛋白质免疫(共)沉淀(Immunoprecipitation (IP)/co-Immunoprecipitation (co-IP)) |
| 2.1.11 总RNA提取、反转录和实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR) |
| 2.1.12 双荧光素酶报告实验(Dual Luciferase Reporter Assay,DLR) |
| 2.1.13 细胞内VitC含量测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SVCT2 响应VitC处理特异性激活JAK2和STAT2 |
| 2.2.2 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导与JAK2 的互作 |
| 2.2.3 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导对JAK2 的磷酸化激活 |
| 2.2.4 VitC对 JAK2 的激活与VitC的胞内积累无关且呈现振荡性 |
| 2.2.5 VitC诱导SVCT2 Tyr~(626)发生磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.6 SVCT2 Tyr626的磷酸化介导对 STAT2 的招募 |
| 2.2.7 SVCT2 响应VitC处理增强STAT2 的转录因子活性 |
| 2.2.8 SVCT2对JAK2 的激活依赖对VitC的运输 |
| 2.2.9 SVCT2对VitC的充分运输依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.10 DHA和 GLUT1/3 不能激活JAK2/STAT2 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 VitC激活的JAK2 信号途径调节细胞内ROS的水平 |
| 3.1 材料、试剂与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 免疫印迹 |
| 3.1.9 细胞内ROS含量测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VitC对 JAK2 的激活与对 ROS的抑制无关 |
| 3.2.2 VitC抑制ROS的水平且部分依赖JAK2 的激活 |
| 3.2.3 激活JAK2 有助于SVCT2对ROS的抑制 |
| 3.2.4 VitC诱导PDHK1和PDHA1 的磷酸化且依赖JAK2 的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞表观调控 |
| 4.1 材料、试剂与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 4.1.6 细胞培养 |
| 4.1.7 真核表达载体构建 |
| 4.1.8 细胞转染 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 IP/co-IP |
| 4.1.11 5mC和5hmC免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验 |
| 4.1.12 点杂交(dot blot,DB)实验 |
| 4.1.13 微球菌核酸酶消化实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VitC诱导F9 细胞基因组5hm C的积累且部分依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.2 VitC激活的JAK2 催化 TET3 Tyr~(1375)发生磷酸化 |
| 4.2.3 Tyr~(1375)的磷酸化提高TET3 的酶活性 |
| 4.2.4 VitC诱导组蛋白H3 Tyr~(41)的磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.5 VitC提高F9 细胞DNA的可接近性且依赖JAK2 的激活 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞多能性和分化调控 |
| 5.1 材料、试剂与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 主要试剂配方 |
| 5.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 免疫印迹 |
| 5.1.9 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色实验 |
| 5.1.10 总RNA提取、反转录和RT-q PCR |
| 5.1.11 表达谱m RNA测序及数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VitC和 JAK2 抑制剂处理下F9 细胞表达谱m RNA测序分析 |
| 5.2.2 VitC在 JAK2 活性抑制的条件下促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.3 激活JAK2 不利于VitC促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.4 VitC诱导多能性相关基因Nanog、Esrrb、Prdm14和Prdm16 的表达且依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.5 VitC诱导神经成熟相关基因的表达且严格依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.6 VitC激活的JAK2 分别通过依赖 STAT2 和不依赖 STAT2 的途径诱导多能性相关基因和分化相关基因的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 研究有待改进之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）CXCLs/ERK/LIF信号通路在癌相关脂肪细胞介导乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用与分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 乳腺癌简介 |
| 1.2 肥胖与乳腺癌 |
| 1.3 脂肪细胞的分化 |
| 1.4 肿瘤微环境与癌相关脂肪细胞 |
| 1.5 LIF与肿瘤 |
| 1.6 ELR+CXC趋化因子与肿瘤 |
| 第2章 脂肪源性LIF对乳腺癌细胞的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂材料 |
| 2.1.3 主要细胞、组织 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要试剂配置 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞复苏及冻存 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 人前脂肪细胞原代培养 |
| 2.2.6 体外诱导前脂肪细胞分化 |
| 2.2.7 共培养系统以及细胞培养上清的获取 |
| 2.2.8 RNA的提取、纯度及完整性检测 |
| 2.2.9 RNA逆转录及实时定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.10 Western blot |
| 2.2.11 细胞划痕实验 |
| 2.2.12 Transwell细胞迁移和基质胶侵袭实验 |
| 2.2.13 细胞增殖实验 |
| 2.2.14 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.15 RNAi转染 |
| 2.2.16 苏木精-伊红染色(H&E)和免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.17 流式细胞分析鉴定脂肪细胞表面标志物 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 前脂肪细胞的鉴定、分化和CAA的形成 |
| 2.3.2 CAA对乳腺癌细胞的作用 |
| 2.3.3 LIF在乳腺癌相关脂肪细胞中高表达 |
| 2.3.4 重组蛋白LIF促进乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.5 LIF中和性抗体逆转CAA对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 2.3.6 Stattic抑制CAA-CM和 LIF诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.7 靶向Stat3的RNAi抑制CAA-CM和 LIF诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.8 LIF与 IL-6和GM-CSF协同促进乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 2.3.9 癌旁脂肪组织中 LIF的表达与乳腺癌组织中 Stat3 的磷酸化呈正相关 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 CAA中 LIF高表达的上游信号通路 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 主要试剂配制 |
| 3.2.2 Western blot |
| 3.2.3 RNA提取、逆转录、实时定量PCR |
| 3.2.4 免疫荧光 |
| 3.2.5 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ERK的抑制剂显着下调CAA中 LIF的表达 |
| 3.3.2 ERK1/2 激活转录因子Stat3和NF-κB上调CAA中 LIF的表达 |
| 3.3.3 免疫荧光检测 CAA 中 Stat3 和 p65 的表达和定位 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 CXCLs激活CAA中 ERK1/2 信号通路上调LIF的表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备 |
| 4.1.2 主要试剂材料 |
| 4.1.3 主要细胞、组织 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组蛋白的配制 |
| 4.2.2 抑制剂母液配制 |
| 4.2.3 RNA提取、逆转录、实时定量PCR |
| 4.2.4 Western blot |
| 4.2.5 免疫荧光 |
| 4.2.6 高通量测序(RNA-seq)分析 |
| 4.2.7 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.2.8 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CXCLs在与脂肪细胞共培养的乳腺癌细胞中高表达 |
| 4.3.2 乳腺癌细胞通过CXCR2 激活CAA胞内ERK1/2 信号通路并上调LIF的表达 |
| 4.3.3 重组蛋白 CXCL3 和 CXCL8 通过激活 ERK/Stat3/NF-κB 信号通路以上调 LIF 的表达 |
| 4.3.4 CXCL3 的中和性抗体抑制CAA中 LIF的表达及其上游信号通路的激活 |
| 4.3.5 乳腺癌和癌相关脂肪细胞(CAA)高表达CXCLs |
| 4.3.6 LIF上调乳腺癌中CXCLs的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 LIF在肿瘤微环境中的作用 |
| 参考文献 |
（4）托珠单抗逆转骨髓微环境所诱导AML细胞药物抵抗的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 细胞株 |
| 2 方法 |
| 2.1 生物信息学数据分析 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 建立共培养体系 |
| 2.4 AML细胞对化疗药物敏感性的检测 |
| 2.5 构建IL-6 基因敲低的HS-5 细胞株(HS-5~(IL-6-KD))和空载体细胞株(HS-5~(NC)) |
| 2.6 基因表达的检测 |
| 2.7 建立人AML小鼠模型,探讨TCZ协助Ara-C对小鼠AML细胞的化疗敏感性 |
| 2.8 统计学分析 |
| 结果与讨论 |
| 第一部分 通过生物信息学技术分析IL-6 与AML的相关性 |
| 1 结果 |
| 2 讨论 |
| 第二部分 IL-6-JAK-STAT3 轴的活化与Ara-C、DNR、HHT化疗敏感性的相关性 |
| 1 结果 |
| 2 讨论 |
| 第三部分 NOD/SCID小鼠体内研究TCZ协助Ara-C降低肿瘤负荷作用与IL-6-JAK-STAT3 轴的相关性 |
| 1 结果 |
| 2 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 IL-6 及其抗体在恶性血液肿瘤的研究进展与应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）不同类型CRLF2基因表达异常对急性B淋巴细胞白血病细胞生物学特点和药物敏感性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:CRLF2低表达人白血病细胞株的筛选及CRLF2过表达质粒的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞培养相关试剂 |
| 2.1.2 病毒包装及感染相关试剂 |
| 2.1.3 流式抗体及荧光染料 |
| 2.1.4 分子生物学实验相关试剂 |
| 2.1.5 常用有机和无机试剂 |
| 2.1.6 主要仪器及耗材 |
| 2.2 研究方法和分组 |
| 2.2.1 常用细胞系 |
| 2.2.2 细胞的复苏及培养 |
| 2.2.3 骨髓单个核细胞分离 |
| 2.2.4 过表达载体构建与质粒提取 |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 慢病毒包装与感染 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 Western blot |
| 3 结果 |
| 3.1 人急性淋巴细胞白血病细胞株Nalm6中CRLF2相对表达低 |
| 3.2 CRLF2过表达载体构建 |
| 3.3 CRLF2过表达载体鉴定 |
| 第二部分:CRLF2过表达对Nalm6及SupB-15细胞增殖、周期、凋亡及药物敏感性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 研究方法和分组 |
| 2.2.1 细胞增殖分析 |
| 2.2.2 细胞周期分析 |
| 2.2.3 Annexin V/7AAD细胞凋亡检测 |
| 2.2.4 CRLF2基因表达的qPCR检测 |
| 2.2.5 相关蛋白表达的Western blot检测 |
| 2.2.6 CCK-8法检测药物敏感性 |
| 2.2.7 细胞系高通量体外药效评估(HDS)检测 |
| 2.2.8 综合药物敏感性评估 |
| 3 结果 |
| 3.1 CRLF2过表达对Nalm6细胞及SupB-15白血病细胞系细胞生物学特性的影响 |
| 3.1.1 CRLF2过表达促进Nalm6细胞增殖 |
| 3.1.2 CRLF2过表达对B-ALL细胞凋亡的影响 |
| 3.1.3 CRLF2过表达对B-ALL细胞周期的影响 |
| 3.2 CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达对Nalm6细胞生物学特性的影响 |
| 3.2.1 CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达对Nalm6细胞增殖和周期的影响 |
| 3.2.2 CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达B-ALL细胞系药物敏感性差异 |
| 3.2.3 CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达B-ALL细胞系中多药耐药性比较 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:CRLF2、CRLF2-IK6、P2RY8-CRLF2、F232C基因过表达对B-ALL细胞系信号通路的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.2 研究方法和分组 |
| 2.2.1 RNA测序文库的构建 |
| 2.2.2 测序数据分析 |
| 2.2.3 Western blot |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CRLF2基因在急性淋巴细胞白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 苦参碱通过调控肿瘤相关磷酸化信号通路抑制卵巢癌的发生发展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点与作用机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 苦参碱抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（7）成人ALL中基因的分析及JAK3突变在ALL中的意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 成人ALL中基因的分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 JAK3突变在ALL中的意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 成人ALL中基因的研究及JAK3突变在ALL中的意义 |
| 参考文献 |
| 个人简历及硕士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）Gilteritinib联合ATO对FLT3-ITD突变细胞株协同机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 Gilteritinib联合ATO对 FLT3-ITD突变细胞株的体外研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Gilteritinib联合ATO抑制FLT3-ITD突变细胞株的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附 DAC单药抑制 FLT3-ITD突变细胞株机制 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（9）STAT基因家族中STAT1、STAT3、STAT5与GRIM-19蛋白在皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤中的表达及相关性的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 STAT基因家族中STAT1、STAT3、STAT5 蛋白在皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤中表达情况的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 STAT3与GRIM-19 蛋白在皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤中表达相关性的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 生物信息学分析验证STAT1、STAT3、STAT5和GRIM-19 基因在皮肤鳞癌中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 STAT家族基因在肿瘤中的表达及预后价值的初步探讨 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）益肾通痹汤抑制JAK3/STAT3通路及其抗炎机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 类风湿关节炎治疗的研究综述 |
| 1.1 现代医学对类风湿关节炎的认识 |
| 1.1.1 RA病因学和发病机制的研究 |
| 1.1.2 JAK/STAT信号转导与类风湿关节炎 |
| 1.2 中医学对类风湿关节炎的认识 |
| 1.2.1 中医病名 |
| 1.2.2 中医病因病机 |
| 1.2.3 中医治疗类风湿关节炎 |
| 第二章 益肾通痹汤对胶原诱导型关节炎作用的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物饲养条件和实验药物 |
| 2.2.2 造模方法和动物分组 |
| 2.2.3 大鼠取材 |
| 2.2.4 大鼠关节组织HE染色 |
| 2.2.5 关节X光片 |
| 2.2.6 滑膜组织m RNA的提取和qPCR实验 |
| 2.2.7 流式细胞术检测大鼠淋巴结Th1、Th2细胞的比例 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大鼠的一般情况和关节炎症 |
| 2.3.2 关节病理片 |
| 2.3.3 关节X光片 |
| 2.3.4 滑膜组织目的基因相对表达量 |
| 2.3.5 大鼠淋巴结Th1、Th2细胞比例 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 益肾通痹汤调控JAK3/STAT3通路抑制炎症因子 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞来源 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 |
| 3.1.3 主要抗体 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 中药提取物的制作流程 |
| 3.2.2 细胞复苏、传代、冻存和计数 |
| 3.2.3 细胞毒性实验 |
| 3.2.4 ELISA实验检测细胞分泌的IFN-γ、TNF-α的水平 |
| 3.2.5 WB实验测JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3的表达 |
| 3.2.6 统计分析方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 细胞毒性实验 |
| 3.3.2 细胞分泌的TNF-α、IFN-γ水平 |
| 3.3.3 细胞的JAK3、p-JAK3、Stat3、p-Stat3蛋白水平 |
| 3.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 附件 |
| 致谢 |
四、白血病细胞JAK/STAT途径异常激活（论文参考文献）
- [1]JAK/STAT信号通路在急性T淋巴细胞白血病中的研究进展[J]. 亢培颖,李伊瑶,史敏,李永军. 河北医科大学学报, 2021(12)
- [2]维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究[D]. 韩卓. 西北农林科技大学, 2021
- [3]CXCLs/ERK/LIF信号通路在癌相关脂肪细胞介导乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用与分子机制[D]. 周翀. 南昌大学, 2021(01)
- [4]托珠单抗逆转骨髓微环境所诱导AML细胞药物抵抗的作用机制研究[D]. 肖启荣. 福建医科大学, 2021(02)
- [5]不同类型CRLF2基因表达异常对急性B淋巴细胞白血病细胞生物学特点和药物敏感性的影响[D]. 顾敏. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究[D]. 张玺. 华中科技大学, 2020(01)
- [7]成人ALL中基因的分析及JAK3突变在ALL中的意义[D]. 徐婷婷. 郑州大学, 2020(02)
- [8]Gilteritinib联合ATO对FLT3-ITD突变细胞株协同机制研究[D]. 胡晓丽. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]STAT基因家族中STAT1、STAT3、STAT5与GRIM-19蛋白在皮肤鳞状细胞癌和角化棘皮瘤中的表达及相关性的实验研究[D]. 王雅清. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [10]益肾通痹汤抑制JAK3/STAT3通路及其抗炎机制的研究[D]. 彭珊琴. 广州中医药大学, 2020(05)
标签：乳腺癌论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 蛋白质磷酸化论文; 肿瘤异质性论文; 基因合成论文;