一、对胶原纤维三色特殊染色过程的一点改进（论文文献综述）
谢吕琴[1]（2021）在《海藻糖掺杂和巯基化合物接枝对胶原自组装及热稳定性的影响研究》文中指出作为动物体内分布最广、含量最高的蛋白质,胶原独特的三螺旋结构和氨基酸组成使其具备丰富的细胞生物学功能,被广泛地应用于生物医学和组织工程材料等相关领域。在上述领域的应用中,胶原三螺旋结构的完整性直接关系到材料各项性能的发挥,而成为实践应用中的关键性指标。天然胶原热变性温度较低,在制取、加工和应用中极容易受环境温度的影响而发生变性并导致三螺旋结构的解离,从而大幅度降低其实际应用价值。自组装,是天然胶原的特征性分子行为之一。研究发现自组装纤维化后可以提升胶原热稳定性,该处理方式也被应用于胶原类材料的制造。但是,通过单纯的自组装纤维化对材料热稳定性能的提升依然有限,往往难以达到实际应用的性能需求。因此,如何通过各种技术改良提升胶原热稳定性能,依然是胶原研究的重要方向之一。基于此,本论文尝试采用海藻糖掺杂和巯基化合物接枝两种手段提升胶原自组装产物的热稳定性能。一方面研究两种技术手段介入对胶原自组装行为、产物构造的影响;另一方面综合评价胶原自组装产物热稳定性能的变化,优化技术条件,为胶原热稳定性能的提升提供技术支撑。主要研究内容如下:（1）海藻糖掺杂对胶原自组装行为和产物热稳定性能的影响以牛跟腱胶原为原料,添加不同量海藻糖,制备胶原/海藻糖体系,跟踪分析胶原的自组装行为和产物构造变化情况,同步开展不同条件下自组装产物热稳定性能的变化。浊度实验表明,与天然胶原相比,添加海藻糖后胶原的自组装速率显着提高,说明加入海藻糖有效提高了胶原自组装进程;采用氯胺T比色法表征海藻糖对胶原凝胶化性能的影响,结果显示,加入海藻糖提高了胶原自组装程度;圆二色谱（CD波长扫描）和红外光谱研究表明,添加海藻糖后胶原的三螺旋结构完整性无显着变化;圆二色谱温度扫描和差示扫描量热法（DSC）结果均显示,添加合适比例的海藻糖,Col/AT（2/1）,使胶原自组装产物热稳定性得到提高;扫描电镜和透射电镜的结果表明,加入海藻糖后胶原自组装形成的纤维产物仍能形成三维网状的纤维结构且具有明显的D周期;细胞相容性实验中,胶原/海藻糖自组装形成的纤维产物对细胞显示出良好的生物相容性,结果表明海藻糖能提高细胞相容性。（2）巯基化合物接枝对胶原自组装行为和产物热稳定性能的影响以牛跟腱胶原为原料,按照N-乙酰同型半胱氨酸硫内酯（NAHT）和胶原ε-氨基摩尔比分别为5和20,将NAHT加入到天然胶原溶液中制备巯基化胶原。TNBS分析证实巯基化试剂已经成功接枝到胶原上,计算得到接枝率分别为72%、73%;圆二色谱（CD）和红外光谱结果显示,Col-SH的三螺旋结构与天然胶原接近,表明巯基化不会破坏胶原三螺旋结构的完整性;浊度实验表明,巯基化可以提高胶原自组装速率;采用氯胺T比色法表征巯基化胶原自组装程度,研究结果提示巯基化能有效促进胶原自组装;流变学结果表明,巯基化有利于胶原自组装产物机械强度的提高;SEM和TEM分析证实Col-SH能够形成典型的纤维结构且具有明显的D周期;DSC结果显示,天然胶原和Col-SH的热解离温度（Tm）分别为103.9℃和107.7℃,表明巯基化胶原自组装形成纤维产物的热稳定性比天然胶原高,能显着提高胶原热稳定性;细胞实验表明Col-SH形成的水凝胶与天然胶原细胞相容性接近,能促进细胞正常增殖分化。本研究尝试了两种改进胶原自组装产物热稳定性能的方法,研究结果证实,两种方法均不影响胶原的自组装行为、产物构造和生物相容性,同时能在一定程度上改进组装胶原的热稳定性能。该研究结果对胶原类材料的性能改进和应用拓展具有实践意义。
李华[2]（2021）在《天然交联剂对脱细胞猪角膜基质的交联及其性能的研究》文中研究指明研究背景全球角膜盲患者以每年150-200万例的速度增长,使角膜盲成为视力丧失的第二大原因。在我国角膜盲包括单眼盲和双眼盲患者约为301.5万,而复明的主要治疗手段仍为穿透性角膜移植或板层角膜移植术。由于角膜捐献材料匮乏,远远不能满足临床需求。因此,为了解决人类角膜供体不足的问题,角膜替代物的开发具有极高的临床应用前景。自中国食品药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）审批通过脱细胞猪角膜基质（Acellularporcine corneal stroma,APCS）用于临床以来,我国已有多家大型医院开展使用APCS行板层角膜移植手术（Lamellar keratoplasty,LKP）,对其进行了临床观察研究并做了相关的报道。研究证明了其在真菌、细菌、单纯疱疹病毒等感染性角膜炎的治疗中具有较好的安全性和有效性。同时以上研究也提出了 APCS在临床应用中存在的问题,在适应证方面因其存在生物力学薄弱的风险尚未用于圆锥角膜的治疗;术后并发症方面包括术后缝线过早松弛、术后角膜溶解（发生率8.5%-23.1%）、术后不同程度的新生血管形成以及角膜钙化等问题。但是目前以上并发症的原因和风险因素仍不明确,以及如何改良APCS避免以上问题尚未见报道和研究。综上所述,为了增加APCS临床适应证、减少术后并发症的发生以提高其临床应用的成功率,我们进行了一系列相关研究。首先体外证实了 APCS存在生物力学相对薄弱以及容易被胶原酶降解的问题;基于这些结果,我们进一步分析了其出现生物力学薄弱、角膜溶解及角膜钙化的可能原因和风险因素。进而我们设计了一种新型的“天然交联剂/牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）”的交联体系,不仅可以有效提高APCS的生物力学强度及抵抗胶原酶降解的能力,还可以维持角膜透明性。我们利用该交联体系制备了一种交联APCS,对其透明度、吸水性、交联度、生物力学、超微结构及生物相容性等特征进行了检测,并应用动物LKP模型对其体内功能进行了观察。研究目的体外综合分析APCS的生物力学、抵抗胶原酶降解及钙化的特点,然后分析其生物力学薄弱、角膜溶解及角膜钙化的可能原因和风险因素。最后进一步探讨了天然交联剂对APCS的改良,并对其透明度、吸水性、交联度、生物力学、超微结构及生物相容性等进行了检测。研究方法1.利用单轴拉伸实验及原子力显微镜检测APCS、新鲜猪角膜（Natural porcine cornea,NPC）及人角膜的整体和表面生物力学性能;2.利用体外胶原酶降解实验检测APCS、NPC及人角膜抵抗胶原酶降解的能力;3.应用傅里叶红外光谱检测APCS、NPC及人角膜的胶原蛋白二级结构,从胶原蛋白结构分析角膜生物力学薄弱及容易被胶原酶降解的可能原因;4.利用蛋白质谱分析APCS与NPC的差异蛋白,分析差异蛋白与角膜溶解的关系;5.用眼前节相干光断层扫描仪、Von Kossa和扫描电镜/能谱仪对APCS临床发生的钙沉积进行了形态表征、病理染色及成分鉴定,为角膜钙化的临床和病理诊断提供证据,并从APCS的清洁程度和脱细胞处理后钙代谢相关蛋白的变化来分析产生钙沉积的可能原因。6.将天然交联剂原花青素（Proanthocyanidin,PA）和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate,EGCG）及京尼平（Genipin,GNP）应用到APCS的改良中,研发了一种“天然交联剂/BSA”保护性交联体系,交联后可提高APCS稳定性,同时可减轻交联过程中的颜色变化从而保持角膜透明性。7.通过体内外实验检测交联APCS的透明性、吸水性、交联度、生物力学、组织结构及生物相容性。并建立兔LKP模型,观察交联APCS的体内功能。研究结果第一部分APCS临床应用的并发症分析1.APCS整体的弹性模量比NPC低,但未达到统计学差异（1.72±0.36 MPa vs 2.33±0.48MPa,P=0.054）,并明显低于人角膜（2.64±0.17MPa,P=0.007）。APCS与NPC、人角膜的表面弹性模量无统计学差异。2.体外胶原酶降解实验显示APCS在胶原酶作用2 h时可发生完全降解,NPC及新鲜人角膜在胶原酶作用4 h时发生完全降解。3.傅里叶红外光谱结果显示,与NPC相比,APCS的α-螺旋减少,β-折叠、β-转角以及无规则卷曲的增加,表明胶原蛋白的蛋白结构趋向无序化。4.通过分析APCS下调表达的429个差异蛋白,其在细胞构成方面主要富集于细胞外间隙和细胞外组分;在生物学过程方面主要富集于肽酶、内肽酶、蛋白水解酶和水解酶活性的负调控等;在分子功能方面主要富集于异构酶活性、内肽酶调节活性及肽酶抑制剂活性的调控。5.Von Kossa染色结果显示APCS-LKP术后出现的白色混浊为钙盐的沉积,且位于角膜前弹力层下的浅基质层;扫描电镜能谱仪结果显示,APCS-LKP术后的钙盐沉积的主要成分为Ca、P、O,且Ca/P为1.33,符合羟基磷灰石的Ca/P比,证实了其为钙化性角膜带状病变的诊断。6.在分析APCS产生钙沉积的影响因素时,发现APCS制备过程中随着灭菌水清洗次数的增加,角膜表面的结晶物钠、磷含量减少,同时伴随角膜肿胀程度增加、透明度下降。当灭菌水清洗次数达10次时（3分/次）,钠和磷含量可降至最低,同时也可避免角膜过度肿胀。另外脱细胞后下调的429个差异蛋白中7.14%为钙调蛋白,3.17%为钙结合蛋白均与钙代谢有关。第二部分天然交联剂对APCS的交联及其性能的研究1.三种天然交联剂0.5%PA交联APCS（PA-APCS）,0.5%GNP交联APCS（GNP-APCS）,0.8%EGCG交联APCS（EGCG-APCS）均伴有颜色变化,当交联溶液中加入 10%BSA 后,即 0.5%PA/10%BSA 交联 APCS（PA/BSA-APCS）,0.5%GNP/10%BSA 交联 APCS（GNP/BSA-APCS）及 0.8%EGCG/10%BSA 交联APCS（EGCG/BSA-APCS）颜色明显减轻,透光率也得到相应的提高。2.交联反应完成后,交联APCS的交联度明显提高,其中PA-APCS交联度最高（40.98±6.24%）,其次为 GNP-APCS（24.59±4.18%）,PA/BSA-APCS（22.78±0.65%）,GNP/BSA-APCS（16.26±4.04%）,EGCG-APCS（14.63± 1.28%）及EGCG/BSA-APCS（6.64±0.69%）。3.与APCS相比,交联APCS的吸水率均明显下降,加入10%BSA后吸水率会得到明显改善。研究显示角膜吸水性在最初120 min内已趋于稳定,在所有交联 APCS 中,仅 PA/BSA-APCS 的吸水率（574.67±64.67%）与 APCS（882.97±18.63%）最接近。4.体外胶原酶降解实验显示,除GNP/BSA-APCS在胶原酶作用6 h后发生完全降解外,其它交联APCS完全降解时间均显着延长超过12 h。在胶原酶处理12 h 后,PA-APCS 重量减轻最小（2%）,低于 EGCG-APCS（13%）、GNP-APCS（17%）、EGCG/BSA-APCS（34%）及 PA/BSA-APCS（43%）。5.角膜生物力学测试显示,交联APCS整体弹性模量均明显提高,EGCG-APCS 为 8.54±1.68 MPa,GNP-APCS 为 8.46±1.76 MPa,PA-APCS 为6.64± 1.63 MPa,EGCG/BSA-APCS 为 6.63±1.38 MPa,GNP/BSA-APCS 为 5.66±1.11 MPa,PA/BSA-APCS 为 4.89±0.53 MPa。交联后各组 APCS 的表面弹性模量均明显提高,其中仅PA/BSA-APCS组的表面弹性模量（0.071±0.087 MPa）与人角膜（0.016±0.012MPa）最接近。6.苏木素和伊红染色（Hematoxylin and eosin,H&E）和马松染色结果显示,在交联APCS中胶原纤维呈不同程度的增粗,并在PA-APCS和EGCG-APCS中出现胶原纤维间隙。透射电镜结果显示,GNP/BSA-APCS组胶原纤维的间距增加并且胶原纤维的排列趋于不规则。各组交联APCS的胶原纤维直径出现不同程度的增粗,其中PA-APCS的胶原纤维直径最大（35.13±3.13 nm）,比APCS胶原纤维直径（25.93±2.11 nm）增加了 35%。其次为 EGCG-APCS（32.56±2.29nm）,PA/BSA-APCS（29.63±2.53nm）,EGCG/BSA-APCS（29.47±2.09 nm）,均大于GNP-APCS 组（27.98±1.89 nm）和 GNP/BSA-APCS 组（27.92±2.23 nm）。7.FTIR结果显示交联APCS酰胺Ⅰ-Ⅲ的峰没有发生明显的变化且A1235/A1450均大于0.6,表明交联剂并未破坏胶原的三螺旋结构完整性。另外在PA-APCS和PA/BSA-APCS中均可见到特征性的芳香烃和醚,表明PA已成功反应至APCS中。PA/BSA-APCS的特征峰强度低于PA-APCS,说明BSA可以减缓交联反应。8.细胞毒性和细胞粘附试验表明,仅浓度为1:5的EGCG/BSA-APCS角膜浸提液可抑制人角膜上皮细胞系（HCECs）的生长,其余各组对HCECs生长均无抑制作用。SEM显示,接种于玻璃片、APCS和PA/BSA-APCS表面的HCECs生长良好,形成了带有微绒毛和微皱褶的扁平上皮细胞层。在GNP/BSA-APCS表面可见角膜上皮细胞小而鼓突;而EGCG/BSA-APCS上未见角膜上皮形态的细胞,仅可见死亡的细胞碎片。活/死细胞染色显示种植于EGCG/BSA-APCS上的HCECs存活率为5.7±0.4%,而其余各组HCECs存活率均>90%。9.APCS及PA/BSA-APCS两组角膜囊袋植入术后角膜均透明,未出现角膜新生血管、植片降解和排斥,说明APCS及PA/BSA-APCS的组织相容性良好。H&E染色显示术后3个月时两组角膜均未见炎症细胞浸润、移植物降解,并且PA/BSA-APCS组在植片-植床连接处可见宿主角膜基质细胞开始长入植片。10.兔LKP术后3-6个月时,角膜植片PA/BSA-APCS开始出现褪色,并在6个月时两组验光结果无统计学差异,可反映活体角膜透明度和角膜屈光度良好。术后修复过程中,PA/BSA-APCS上皮修复较慢,但缝线不易发生松动。H&E染色结果显示,两组在术后6个月时均有较多宿主角膜基质细胞迁移至移植物实现了组织再生。研究结论1.体外证实了 APCS的整体生物力学性能薄弱,其可能与APCS的胶原蛋白二级结构无序、结构稳定性下降有关。2.体外证实了 APCS容易被胶原酶降解,主要与APCS的结构无序和下调的差异蛋白富集于细胞外基质分解的负调控有关。提示我们需要探索一种能够更好地保护细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）小分子蛋白的脱细胞方法或者通过体外交联提高APCS稳定性的方法。3.APCS-LKP术后角膜植片钙化的发生可能与APCS制作过程中清洗不够彻底导致残存的磷含量过高、脱细胞处理引起的钙代谢相关蛋白下调以及术后含磷眼药水的使用有关,具体相关机制还需进一步研究。4.“天然交联剂/BSA”这一保护性交联体系,可以减轻APCS交联过程中的颜色变化从而保持角膜透明度,同时可提高APCS的稳定性。5.PA/BSA-APCS具有良好的角膜透明度、适当的吸水性、改善的角膜整体和表面生物力学、增强的抵抗胶原酶降解能力和良好的生物相容性。6.PA/BSA-APCS在兔LKP模型中,术后角膜可完全上皮化,角膜缝线几乎未松动,并且术后6个月时有较多的宿主角膜基质细胞长入移植物。PA/BSA-APCS可作为角膜组织的替代物,同时该保护性交联体系也可应用于其它生物工程领域。
黎重阳[3]（2021）在《金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽抗皮肤光老化活性及作用机制差异》文中研究指明中波紫外线（UVB）的长期辐射可引起皮肤光老化的产生,其主要表现为皮肤干燥、褶皱、色素沉积等。胶原多肽具有良好生理活性,被认为在改善光老化皮肤方面具有潜在应用。胶原多肽的抗皮肤光老化活性与其生物来源、肽段序列、平均分子量等有关。有研究报道,鱼皮胶原和鱼骨胶原在氨基酸组成、存在形式、羟化程度等方面有所不同,可能对酶解产物及其活性产生不同影响。金枪鱼产量巨大,但在加工过程可产生占总量50～70%左右的副产物,如皮、骨等,造成了极大的资源浪费。本研究以金枪鱼鱼皮和鱼骨为原料,探究鱼皮和鱼骨胶原多肽对光老化皮肤的保护效果及作用机制,并阐明二者之间存在的差异及原因。首先通过不同蛋白酶及组合酶解制备金枪鱼皮胶原多肽（Tuna skin collagen peptides,TSCP）和金枪鱼骨胶原多肽（Tuna bone collagen peptides,TBCP）,评价其水解度、游离氨基含量、平均分子量分布、抗氧化活性、保湿吸湿性等指标间的差异;在此基础上,通过UVB辐照NIH/3T3细胞和ICR小鼠以建立光老化模型,探究了TSCP和TBCP的抗光老化作用及其分子机制,并深入分析二者的差异。主要研究结果及结论如下:（1）采用中性蛋白酶（Neu）、碱性蛋白酶（Alc）、风味蛋白酶（Fla）、碱性蛋白酶+中性蛋白酶（Alc+Neu）、碱性蛋白酶+中性蛋白酶+风味蛋白酶（Alc+Neu+Fla）酶解制备TSCP和TBCP,并测定其理化性质、体外抗氧化活性及保湿吸湿性。结果表明,与单一酶解相比,复合酶水解更能促进低分子量胶原多肽的产生;与单一酶水解的胶原多肽相比,复合酶水解得到的胶原多肽在保湿性和吸湿性能方面具有明显提升;在相同水解条件下,TSCP较TBCP具有更高比例的低分子量肽,且保湿性和吸湿性也更加优异,对DPPH·清除效果更好;二者在O2-·清除率方面无显着性差异（P<0.05）;而TBCP的·OH清除效果和ORAC抗氧化能力略优越TSCP。这表明TSCP和TBCP均具有潜在护肤功能,但可能在护肤机制方面存在差异。（2）通过UVB照射NIH/3T3细胞构建光老化细胞模型,根据TSCP和TBCP的自由基清除活性、保湿性、吸湿性以及清除活性氧（ROS）能力,Alc+Neu+Fla水解的TSCP和TBCP具有较优保湿性和吸湿性以及良好的抗氧化活性,因此选定Alc+Neu+Fla水解的TSCP和TBCP进行后续抗光老化活性的探究。细胞实验结果表明,在0.1 mg/m L浓度作用下,TSCP和TBCP可提高光老化NIH/3T3细胞的存活率,对UVB诱导细胞内产生的过量ROS具有显着清除作用（P<0.05）,可显着抑制细胞内MMP-1的mRNA及其蛋白表达（P<0.05）,并显着提高TGF-β1和I型胶原蛋白表达量（P<0.05）,对TGF-β1和I型胶原蛋白的mRNA表达提升也有一定的促进作用。TSCP和TBCP均对UVB诱导的光老化NIH/3T3细胞具有保护作用。与TBCP相比,TSCP处理组中光老化NIH/3T3细胞的存活率显着增加（P<0.05）,TSCP可清除光老化细胞中过量的ROS至正常水平,且TSCP组中TGF-β1的mRNA及其蛋白表达量显着高于TBCP组（P<0.05）。这表明TSCP在提高光老化细胞存活率和抗氧化能力,促进TGF-β1表达方面具有更加显着的效果。（3）通过UVB照射ICR雌性小白鼠构建光老化小鼠皮肤模型,研究并对比TSCP和TBCP对光老化小鼠皮肤的修复效果,并探究其作用机制及存在的差异。结果表明,在200 mg/kg的灌胃剂量下,TSCP和TBCP能有效抑制UVB诱导的小鼠皮肤红斑、褶皱变多等现象,减缓小鼠角质层过度角化和表皮增厚,提升小鼠皮肤水合能力,显着提高小鼠皮肤中羟脯氨酸含量以及总抗氧化能力（T-AOC）（P<0.05）,并显着抑制小鼠皮肤中MMP-1的过度表达（P<0.05）,提高TGF-β1和I型胶原蛋白表达量。此外,TSCP和TBCP可抑制ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化表达。由此证明,TSCP和TBCP对UVB诱导的小鼠皮肤损伤具有修复作用,推测其主要通过减缓小鼠皮肤的氧化应激作用,并通过抑制MAPK信号通路的活化,降低MMP-1的合成,同时促进TGF-β1的合成,诱导I型胶原蛋白表达量增加,从而起到保护小鼠皮肤光老化作用。TBCP组中小鼠皮肤表皮和角质层较TSCP组更薄,胶原纤维结构较TSCP组更完整,ERK1磷酸化水平显着低于TSCP组（P<0.05）,JNK2磷酸化表达与NC组无显着性差异（P>0.05）,且TBCP组中MMP-1表达量显着低于NC组（P<0.05）;而TSCP组中小鼠皮肤含水量较UVB组显着提高（P<0.05）,且TGF-β1蛋白表达量显着高于TBCP组（P<0.05）,而p38蛋白磷酸化表达显着低于TBCP组（P<0.05）。这表明TBCP在抑制光老化小鼠表皮增厚和角质层过度角化,保持胶原纤维结构的完整性,降低小鼠皮肤中ERK和JNK蛋白磷酸化表达以及MMP-1蛋白表达方面的能力更强;而TSCP在提高光老化小鼠皮肤的水合能力,促进小鼠皮肤中TGF-β1蛋白表达,抑制p38蛋白磷酸化表达方面效果更优。综上所述,金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽均能有效改善UVB诱导的NIH/3T3细胞和ICR小鼠皮肤光损伤,但二者在作用分子机制方面存在差异。金枪鱼皮胶原多肽可能具有更加优异的抗氧化活性,可清除光老化机体内过量的活性氧,抑制p38蛋白的活化,并且更能促进TGF-β1蛋白表达量,增加I型胶原蛋白的合成,从而发挥抗光老化活性;而金枪鱼骨胶原多肽可能在抑制光老化机体中MAPK通路相关蛋白（ERK、JNK）,降低MMP-1蛋白表达,从而抑制其对I型胶原蛋白的降解方面具有更优异的作用。本研究既为胶原肽在皮肤光老化领域的研究提供新的理论依据,又为金枪鱼副产物的高值化利用提供新思路。
陆康[4]（2021）在《微结构丝素蛋白薄膜的仿生制备及其在肌腱修复中的应用》文中提出随着运动健身的普及,越来越多的人开始进行体育锻炼,但由于人口老龄化及不正确的运动姿势,肌腱损伤发病率也逐年增加。常见的肌腱损伤包括肌腱病、肌腱撕裂/断裂伤等。肌腱损伤的治疗方式主要包括非手术治疗和手术治疗,非手术治疗一般适用于轻度损伤且效果有限,手术治疗包括残端清理缝合、自体或异体腱移植替代等,取得了广泛的疗效。由于肌腱的特殊生物学性能及愈合机制,损伤肌腱的愈合结果通常为瘢痕组织形成。不同于肌腱的原生基质结构,瘢痕组织基质内的胶原纤维呈无序排列,生物学功能较差且易发生二次损伤。组织工程是新兴的组织修复方法,其目的是通过生物材料促进组织原生结构的有效修复,研究内容包括种子细胞、支架材料及支架-细胞复合体构建三个方面。肌腱修复中,来自内源性修复细胞的肌腱干/祖细胞（TSPCs）,在肌腱修复中起到关键作用,是肌腱组织工程中常用的种子细胞。支架材料的制备是组织工程需着重考虑的因素。多种生物材料被用于肌腱修复研究,主要可分为天然材料及人工材料,天然材料生物毒性较小但其力学强度低,可加工性较差;人工材料虽易于制备且具有较好的力学性能,但其生物相容性较差,在体内存在潜在毒性。近年研究发现,丝素蛋白薄膜生物支架具有较好的生物相容性、可塑性及可控的力学强度,被应用于角膜、神经等组织修复并取得较好的效果,是软组织修复中优良的组织工程材料,在肌腱修复中具有较高的潜在价值,但还未得到深入研究。将丝素蛋白薄膜用于肌腱修复,需要使丝素蛋白薄膜具有与原生肌腱相似的微环境,才可有效提升其生物学功能最终促进肌腱修复。早期研究多以生物支架交联大分子活性基团（如生长因子）作为主要方法,但存在易失活、不稳定的缺点。近年组织工程研究指出,当生物支架具有与组织相似的物理性质（力学、硬度等）和微结构时,可有效促进组织修复。在丝素蛋白薄膜支架表面制备仿生物理微结构,是提升其生物学性能的有效方法且具有高稳定性和精准性的优点。以原生肌腱物理性质及微结构为参考,仿生制备具有生物功能的微结构丝素蛋白薄膜,对肌腱修复具有重要的应用价值。本研究首先分析了肌腱的微观结构及力学特点作为丝素蛋白薄膜生物支架的参考依据;然后仿生制备微结构丝素蛋白薄膜并观察其在体内对损伤肌腱的修复作用;最后在体外实验中探究微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs的生物学调控作用及相关分子通路,综合评估微结构丝素蛋白薄膜在肌腱修复中的应用价值,为肌腱修复提供新的思路。1.肌腱显微结构与力学性能分析1.1方法1.1.1通过扫描电镜和苏木精-伊红染色观察肌腱组织微结构,并对胶原纤维宽度进行分析对比。1.1.2测试肌腱的生物力学特点。1.2结果1.2.1肌腱外观呈亮白色,触之质地紧实,韧性强,静息状态下呈蜷屈状,受到力后会随之伸展拉长,外观相对静息时更为细长且去除拉伸力后可恢复原有形态。1.2.2通过SEM观察肌腱,低倍放大时（50X）可见肌腱表面的结构致密,胶原纤维束在肌腱表面呈现褶皱样形态;放大100-500倍可见胶原纤维平行排列的胶原纤维束;放大倍数2000X-10000X可见胶原纤维由纳米级纤维丝构成。1.2.3 HE染色可见胶原纤维呈均为长条索状,粗细不一的胶原纤维在肌腱中呈平行排列;肌腱固有细胞具有相似的形态及排列特点。1.2.4胶原纤维的宽度主要分布在5-10μm,部分胶原纤维宽度小于5μm或大于15μm。1.2.5随着拉伸应力不断增加,肌腱中纤维丝、胶原纤维及纤维束被拉伸到极限载荷;随着进一步被动拉伸肌腱组织会分离断裂,应力数值归于初始值。1.3结论1.3.1肌腱由纳米级纤维丝排列形成的胶原纤维束,狭长的固有细胞夹杂在其中,纤维束直径主要分布于5-20μm之间且5-10μm区间占比最多。1.3.2肌腱样本的力学性能与其形变呈正相关。1.3.3肌腱纤维的形态及力学数据,作为微结构丝素蛋白薄膜材料制备的参考依据。2.仿生丝素蛋白薄膜支架的制备、改性与表征2.1方法2.1.1提取再生丝素蛋白溶液,参考1.3.3小节结果仿生制备具有不同微结构的丝素蛋白薄膜,水退火处理对材料进行改性处理。2.1.2傅立叶红外光谱仪（FTIR）检测丝素蛋白薄膜材料内的蛋白构象变化。2.1.3原子力显微镜（AFM）检测丝素溶液及丝素蛋白薄膜的物理特性。2.1.4扫描电镜（SEM）观察丝素蛋白薄膜表面微结构形态。2.1.5拉伸测试检测改性后不同微结构丝素蛋白薄膜的力学特性。2.2结果2.2.1丝素蛋白溶液的质量分数为4.53±3.4%,AFM显示丝素蛋白溶液内丝素纤维丝平行致密排列。2.2.2制备了不同表面结构的丝素蛋白薄膜,结构完整无皱缩及气泡,改性后薄膜材料的物理性质发生显着改变。2.2.3水退火处理后丝素蛋白薄膜内部β片层蛋白构象显着升高。2.2.4 AFM发现丝素蛋白薄膜支架经水退火改性后表面会出现纳米级粗糙结构。2.2.5 SEM观察到丝素蛋白薄膜表面微结构形态清晰且符合仿生设计尺寸。2.2.6无微结构与5μm微结构丝素蛋白薄膜的力学性能较低,10、15和20μm微结构丝素蛋白薄膜的最大抗拉强度与原生肌腱相似,但在拉伸过程中会提前达到最大载荷。2.3小结2.3.1再生丝素蛋白溶液性质稳定,以之为原料制备的丝素蛋白薄膜形态完整,水退火改性后支架的物理性质显着提升。2.3.2改性后丝素蛋白薄膜内部β-片层蛋白构象显着增加,材料表面会出现纳米级粗糙结构。2.3.3微结构为10、15、20μm的丝素蛋白薄膜具有较好的力学性能。3.微结构丝素蛋白薄膜在体内对损伤肌腱的修复作用3.1实验方法3.1.1建立大鼠跟腱损伤模型:正常组（N）、缺损组（D）、异体腱替代组（R）、无微结构丝素蛋白薄膜组（S）、微结构丝素蛋白薄膜组（G）。3.1.2应用MRI、苏木精-伊红及免疫组化染色分析微结构丝素蛋白薄膜在体内对损伤肌腱的修复作用。3.2实验结果3.2.1 D组跟腱组织的宽度及厚度明显高于其它组,S组与R组样本宽度及厚度低于D组,G组样本的宽度及厚度最低。3.2.2 MRI脂肪抑制像示:术后第4周R组、D组和S组均以炎性高信号为主,R组中可见异体腱低信号,G组可见少量不连续低信号;8周后D组仍以炎性高信号为主,R组异体腱两端呈炎性高信号,S组和G组均可见连续低信号,但S组信号连续性低于G组。3.2.3组织学染色示:D组纤维形态紊乱且再生相关标志物的表达量较低;R组移植腱的纤维结构与原生纤维不连续,肌腱分化标志物表达量较低;S组胶原纤维形态相比D组中相对有序,修复区两端两端纤维与原生纤维少量连续,肌腱蛋白C（TNC）和腱调蛋白（TNMD）表达轻度升高,但与R组无明显差别;G组胶原纤维排列最为有序且肌腱修复标志物TNC、TNMD和一型胶原蛋白（COLIA1）显着高于其它组。3.2.4组织学综合评分:G组显着高于其它组,S组与R组无明显差别,D组评分最低。3.3小结3.3.1微结构丝素蛋白薄膜可以减轻肌腱修复中的瘢痕增生,促进胶原纤维的有序形成及肌腱标志物的表达。4.微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs生物学行为的调控及分子机制4.1微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs生物学行为的调控4.1.1实验方法4.1.1.1提取原代TSPCs,通过免疫荧光及诱导分化染色鉴定其干/祖细胞特性。4.1.1.2将TSPCs与支架材料共培养后,活死细胞荧光共染观察丝素蛋白薄膜的细胞相容性,CCK-8监测细胞的增殖活性。4.1.1.3细胞骨架及细胞核双荧光染色观察TSPCs的细胞形态及空间排列。4.1.1.4聚合酶链式反应（PCR）分析TSPCs在不同材料组中肌腱分化标志物表达量差异。4.1.2结果4.1.2.1 TSPCs表面标志物CD3及CD34阴性,CD44和CD90呈阳性;经过分化诱导培养后,TSPCs分别向脂肪系、骨系和软骨系分化。4.1.2.2微结构丝素蛋白薄膜表面的TSPCs生存能力良好,不同组间内TSPCs的增殖能力无显着差异。4.1.2.3 5μm及10μm微结构丝素蛋白薄膜表面TSPCs呈现与原生肌腱中相似的细窄形态及空间排列,肌腱标志物基因表达也显着升高,当微结构为10μm时更为显着。4.1.3小结4.1.3.1丝素蛋白薄膜具有良好的生物相容性,微结构的加入不会影响TSPCs的细胞活性。4.1.3.2 10μm微结构丝素蛋白薄膜可显着改变TSPCs细胞形态和空间排列,并通过磷酸化黏着斑激酶（FAK）促进TSPCs朝向肌腱系分化。4.2微结构丝素蛋白薄膜调控TSPCs的内在分子机制4.2.1实验方法4.2.1.1 m RNA转录组学及蛋白组学高通量测序,分析TSPCs内差异基因和蛋白的表达情况。4.2.1.2 WB对比分析关键通路分子的蛋白表达量。4.2.2实验结果4.2.2.1聚类分析提示差异表达的基因和蛋白在功能及定位上具有协同性。4.2.2.2 GO分析提示差异基因及蛋白本体功能差异性主要包括:（1）细胞生理功能（Biological Process,BP）:迁移、粘附及表面蛋白定位;（2）基因分子功能（Molecular Function,MF）:结合肌动蛋白丝和肌动蛋白;（3）细胞成分（Cellular Component,CC）:肌动蛋白细胞骨架、肌动蛋白丝、应力纤维丝。4.2.2.3 KEEG富集分析提示差异变化集中在FAK-Actin信号通路和PI3K-AKT信号通路。4.2.2.4微结构10μm的丝素蛋白薄膜支架可促进TSPCs肌腱标志物SCX、TNC、TNMD及COLIA1的表达,黏着斑激酶（FAK）的磷酸化激活具有关键作用;TSPCs中整合素分子α2β1蛋白表达量显着升高;磷酸化PI3K和AKT（308/473）与肌腱标志物TNC和TNMD显着升高;在加入PI3K-AKT通路抑制剂后,TNC和TNMD的表达会同时被抑制。4.2.3小结4.2.3.1整合素α2β1作为TSPCs的膜下微环境感受器,负责感知微结构丝素蛋白薄膜支架中的物理信号并传递到细胞内。4.2.3.2微结构丝素蛋白薄膜通过FAK-Actin及FAK-PI3K-AKT分子途径协同调控TSPCs细胞骨架蛋白的重塑。4.2.3.3微结构丝素蛋白薄膜通过FAK-PI3K-AKT分子信号通路诱导TSPCs成肌腱分化。
蔡向东[5]（2021）在《病变胶原蛋白的靶向成像》文中提出胶原蛋白是人体含量最多的蛋白质,也是众多疾病的关键生物标志物。作为细胞外基质的主要成分,胶原蛋白在细胞的黏附、增殖、分化和转移等基本生理过程中扮演重要角色,而它的异常重塑则被认为是纤维化、关节炎、癌症等疾病的关键病理过程。纤维化相关疾病中常发现I型胶原蛋白的过度沉积,类风湿关节炎和骨关节炎病人中则普遍存在II型胶原蛋白的过度降解,而不同类型胶原蛋白的异常分布则被认为与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。因此,病变胶原蛋白的高效检测对这些严重疾病的机理研究、诊断、治疗和预后评价至关重要。本论文旨在开发病变胶原蛋白的靶向多肽探针及相关疾病的组织成像方法,主要内容如下:1)病变胶原蛋白由于其特殊的结构,它的靶向检测一直是巨大挑战。最新研究发现,具有（Gly-Pro-Hyp）n重复序列的多肽探针,在保持单链的状态下,可以特异性结合病变胶原蛋白中的解折叠位点。然而,该类多肽探针会自发形成三聚体,从而丧失对病变胶原蛋白的结合能力。我们首次通过向胶原多肽探针序列中间位置引入氨基脯氨酸,并修饰大位阻的羧基荧光素染料构建了新型多肽荧光探针。该多肽荧光探针保持稳定的单链结构,可以特异性识别不同组织中的病变胶原蛋白。该多肽探针不需要热处理和紫外线处理,消除了组织损伤的潜在风险,在胶原蛋白相关疾病的诊断和治疗中有广泛的应用潜力。2)我们通过将（Gly-Pro-Hyp）7序列与数个带电荷的氨基酸Asp连接,构建了一系列胶原蛋白靶向多肽探针PCTP-Dn（n为Asp的数量）。该系列探针三重螺旋结构的稳定性随Asp的数量增加而逐渐减弱,并且多肽探针PCTP-D6在生理条件下显着保持单链构象。我们构建的新型多肽探针通过静电排斥作用抑制（Gly-Pro-Hyp）n序列三聚体的形成,可以高效检测不同类型的动物结缔组织和人病理组织中的病变胶原蛋白,在胶原蛋白相关疾病的机理研究中有良好的应用前景。3)我们首次构建了一种由重复的（Gly-Hyp-Pro）n序列组成的新型多肽探针F-GOP-10,该探针即使在0°C时仍可保持单链构象。F-GOP-10可以靶向识别人骨关节炎组织中的病变胶原蛋白,但完全不染色正常的软骨组织。同时,F-GOP-10对人肝纤维化和各种癌组织的成功染色,证明它是一种强大的靶向识别病变胶原蛋白的工具。不同数量Gly-Hyp-Pro的F-GOP-n系列多肽探针均未形成三聚体,表明（Gly-Hyp-Pro）n序列本质上具有单链特性。这种100%纯单链的多肽探针,可以被精确定量,能用于石蜡切片和冰冻切片的染色,在临床应用中具有巨大潜力。4)量子点（QDs）具有波长易调节、高亮度等优良的光学性质,在生物传感器领域广泛应用。然而,如何在量子点上修饰靶向多肽并构建稳定的QDs靶向探针,目前仍然困难重重。我们首次设计了主-客体肽系统,用于构建稳定性和选择性俱佳的QDs-多肽探针。我们筛选发现,包含Cys和带负电荷氨基酸的短肽,可以作为主体肽,能够显着增强量子点的稳定性和水溶性;同时,包含Cys和靶向序列的客体肽,很容易非共价键合到量子点上。不同主-客体肽修饰的量子点均表现优良的稳定性和靶向性,并且成功地用于细胞器、膜蛋白和细胞外基质蛋白的成像以及3D肿瘤细胞模型的多组分成像。我们开发的主-客体肽体系,为构建稳定的QDs-多肽探针提供了一种广泛适用、简单可行的方法,为量子点在细胞和组织的靶向成像的应用提供了强有力的工具。5)胶原蛋白在纤维化、癌症等疾病中的病变是一个复杂的过程,中间常常有多种不同类型的胶原蛋白参与。我们利用新建立的主-客体肽体系,构建了多种稳定性和选择性俱佳的QDs-多肽探针,可以同时靶向检测I、II、IV型及变性胶原蛋白。因为量子点的大位阻效应,修饰在量子点上的变性胶原蛋白靶向多肽始终保持单链状态,完全避免了热处理和紫外线处理导致的组织损伤风险。同时,量子点波长易调节的优良性质,赋予了不同靶向多肽探针多色特性,方便实现不同组分的共成像。该新型QDs-多肽探针,成功用于纤维化和胚胎发育过程中不同类型胶原蛋白的靶向成像。我们开发的QDs-胶原蛋白靶向多肽探针体系,为同时、高灵敏、高特异性检测不同类型的胶原蛋白提供了一个高效的工具箱,为纤维化、癌症等严重疾病的机理研究和早期检测提供了新的机遇。
陈云娜[6]（2021）在《基于肿瘤微环境的PEG化丹酚酸B脂质体与PEG化多西他赛脂质体联合用药相互作用机制研究》文中进行了进一步梳理增生性乳腺癌中高度纤维化和富含胶原蛋白的特性可导致纳米药物临床治疗失败和免疫抑制肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）的形成。肿瘤相关成纤维细胞（Tumor-associated fibroblasts,TAFs）是TME中含量丰富的基质细胞。TAFs不仅通过分泌细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）升高间质液压（Interstitial fluid pressure,IFP）降低纳米粒在肿瘤中的渗透,还有助于免疫抑制微环境。因此,抑制TAFs激活重塑TME是提高纳米药物抗肿瘤效率的有效策略。目的:本课题研究PEG化丹酚酸B脂质体（PEGylated salvianolic acid B liposomes,PEG-SAB-Lip）是否可以通过干扰TGF-β1/Smad信号抑制TAFs激活,重塑TME,促进纳米粒在肿瘤中的渗透,增强肿瘤免疫反应,提高PEG化多西他赛脂质体（PEGylated docetaxel liposomes,PEG-DTX-Lip）的化疗作用。方法:（1）采用乙醇注入法制备PEG-SAB-Lip,并通过单因素考察和正交实验筛选最优处方。从粒径、Zeta电位、包封率（Encapsulation efficiency,EE%）、载药量、形态、放置稳定性和体外释放方面对PEG-SAB-Lip进行表征和质量评价。（2）体外研究丹酚酸B（Salvianolic acid B,SAB）和PEG-SAB-Lip对TGF-β1激活的小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中TGF-β1/Smad信号的影响,并建立NIH3T3细胞和4T1细胞混合的3D球形模型,研究SAB和PEG-SAB-Lip是否可以增强纳米粒在3D球形模型中的渗透和抗肿瘤作用。（3）将100μL含有小鼠乳腺癌4T1细胞（5×105）和小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞（2.5×105）的PBS和基质胶以1:1（v/v）的比例皮下注射到小鼠的右侧腹建立小鼠乳腺癌模型。采用免疫荧光和Masson’s三色染色验证富含丰富TAFs的乳腺癌模型。模型成功后,探究重复三次尾静脉注射SAB和PEG-SAB-Lip后对肿瘤纤维化微环境和免疫微环境的调节,以及对纳米粒在乳腺癌中渗透的影响。Western blot实验研究SAB和PEG-SAB-Lip作用后对肿瘤组织中TGF-β1/Smad信号相关蛋白（TGF-β1、Smad2、Smad3、p Smad2、p Smad3、Smad4和α-SMA）表达的影响。免疫荧光实验和Masson’s三色染色分别用于研究SAB和PEG-SAB-Lip作用后对肿瘤区域α-SMA和胶原沉积的影响。为了研究SAB和PEG-SAB-Lip对肿瘤免疫微环境的影响,采用免疫荧光和RT-qPCR实验考察了肿瘤区域免疫细胞群、细胞因子和趋化因子表达的变化。载有荧光染料DiD的PEG化脂质体（PEGylated DiD liposomes,PEG-DiD-Lip）作为模型纳米粒被用于研究SAB和PEG-SAB-Lip预处理后是否可以增加纳米粒在肿瘤深处的渗透和分布。（4）在小鼠肿瘤模型中研究PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用是否能够增加PEG-DTX-Lip的抗肿瘤效率。其中,肿瘤体积变化趋势、肿瘤重量和肿瘤组织细胞凋亡情况被用于评价PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用的抗肿瘤效率。HE染色、小鼠体重变化和肝肾功能指标被用于安全性评估。结果:1 PEG-SAB-Lip的表征和质量评价最优处方和最佳工艺制备的PEG-SAB-Lip的粒径、Zeta电位、EE%和载药量分别为166.2±13.35 nm、-37.8±2.51 mV、82.04±2.91%和17.21±0.61%。透射电镜的结果显示PEG-SAB-Lip为表面光滑的球形结构。此外,PEG-SAB-Lip在4℃下储存15天后相对稳定,没有明显的药物泄漏。体外释放的研究显示PEG-SAB-Lip能够延长SAB的释放时间。2 SAB和PEG-SAB-Lip增强纳米粒在三维多细胞肿瘤球体的渗透和抗肿瘤作用2.1 SAB和PEG-SAB-Lip抑制TAFs激活TGF-β1激活后的NIH3T3细胞中α-SMA的表达被上调。SAB和PEG-SAB-Lip以浓度依赖方式逆转了这种上调。在确定SAB和PEG-SAB-Lip具有抑制TAFs激活的功能后,进一步探索了其潜在机制。Western blot的研究结果显示,低、中、高浓度的SAB和PEG-SAB-Lip分别作用于TGF-β1激活的NIH3T3细胞后,TGF-β1/Smad信号相关蛋白的表达显着降低且呈剂量依赖性。2.2 SAB和PEG-SAB-Lip增强纳米粒在三维多细胞肿瘤球体的渗透和细胞毒性首先,筛选了三维多细胞肿瘤球体的培养方案。NIH3T3和4T1细胞的总数为15000,培养时间为3天时成球性较好。不同浓度的SAB和PEG-SAB-Lip作用三维多细胞肿瘤球体后,PEG-DiD-Lip可以从球体周围渗透到球体深处。此外,随着SAB和PEG-SAB-Lip浓度增加,渗透到球体深处的PEG-DiD-Lip增多。然后,进一步研究了SAB或PEG-SAB-Lip预处理后是否能够增加PEG-DTX-Lip对多细胞肿瘤球体的细胞毒性。研究结果显示,单一使用PEG-DTX-Lip的IC50值为111.97μM,而SAB和PEG-DTX-Lip联合使用后IC50值显着降低为16.54μM,PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用后IC50值为11.95μM。这一结果表明SAB和PEG-SAB-Lip可以显着增加PEG-DTX-Lip在多细胞肿瘤球体中的抗肿瘤活性。3 PEG-SAB-Lip重塑肿瘤微环境3.1 PEG-SAB-Lip改善肿瘤纤维化微环境为了研究PEG-SAB-Lip是否可以抑制TAFs激活,采用免疫荧光观察肿瘤组织中TAFs活化标志物α-SMA的表达。结果显示,SAB和PEG-SAB-Lip预处理后肿瘤区域α-SMA阳性TAFs显着降低,并且PEG-SAB-Lip的作用强于SAB。Masson’s三色染色的结果表明生理盐水（Normal saline,NS）和空白脂质体（PEGylated blank liposomes,PEG-B-Lip）组中胶原蛋白沉积严重,而SAB和PEG-SAB-Lip组中胶原蛋白显着降低（P<0.05,P<0.01）。此外,PEG-SAB-Lip对胶原沉积的调节作用强于SAB（P<0.05）。由于大多数TAFs响应TGF-β1从驻留的成纤维细胞中分化而来,因此考察了TGF-β1和下游信号蛋白的表达。PEG-SAB-Lip可显着降低α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、pSmad2、pSmad3和Smad4的表达（与NS组相比,P<0.05或P<0.01）。SAB可显着下调TGF-β1、Smad3、pSmad2和pSmad3蛋白水平（与NS组相比,P<0.05或P<0.01）。值得注意的是,PEG-SAB-Lip对TGF-β1信号的调节作用强于SAB。3.2 PEG-SAB-Lip改善肿瘤免疫微环境RT-qPCR探讨PEG-SAB-Lip处理后对肿瘤区域Th1细胞因子（包括IFN-γ、TNF-α、IL-12α、IL-2）、Th2细胞因子（包括IL-4、IL-6、IL-10、IL-13）、炎性因子（IL-1β）和趋化因子（CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13）的影响。结果显示,SAB组Th1细胞因子IL-2的表达升高（P<0.05）,而Th2细胞因子IL-4的表达降低（P<0.001）,对于其它细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12α、IL-6、IL-10、IL-13的表达没有影响。PEG-SAB-Lip治疗后肿瘤区域Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12α、IL-2的表达显着增加,而Th2细胞因子IL-4、IL-6和IL-10的表达显着降低。此外,PEG-SAB-Lip处理组炎性因子IL-1β、趋化因子CCL5和CXCL13的表达降低,CXCL9和CXCL10的表达升高。和NS组相比,PEG-SAB-Lip对CCL2和CXCL12的表达作用不明显。免疫荧光染色观察各组处理后肿瘤区域免疫细胞群的变化。结果显示,SAB作用的小鼠肿瘤区域CD4+T细胞募集,对CD8+T细胞没有影响。PEG-SAB-Lip作用后CD8+和CD4+T细胞向肿瘤组织的浸润增加。与NS组相比,游离SAB或PEG-SAB-Lip组中MDSCs和Tregs明显降低（P<0.01或P<0.001）。SAB或PEG-SAB-Lip处理可增加肿瘤中M1巨噬细胞的数量,减少M2巨噬细胞的数量。3.3 PEG-SAB-Lip增强PEG-DiD-Lip在肿瘤中的分布和渗透PEG-DiD-Lip被作为模型纳米粒研究PEG-SAB-Lip是否可以增强纳米粒在肿瘤中的分布和渗透。结果显示,SAB和PEG-SAB-Lip预处理后,PEG-DiD-Lip在肿瘤区域的分布显着增加,表明SAB和PEG-SAB-Lip预处理增加随后注入纳米粒在肿瘤中的分布。此外,荧光显微镜观察PEG-DiD-Lip在肿瘤中的渗透。结果显示,SAB或PEG-SAB-Lip预处理的肿瘤中的PEG-DiD-Lip渗透到远离血管的区域,表明PEG-DiD-Lip在肿瘤中的渗透增强。更重要的是,与SAB组相比,PEG-DiD-Lip在PEG-SAB-Lip组中的渗透距离更远。因此,选择PEG-SAB-Lip进行后续研究。4 PEG-SAB-Lip增强PEG-DTX-Lip在乳腺肿瘤模型中的抗肿瘤效率4.1 PEG-SAB-Lip对PEG-DTX-Lip抗肿瘤效率的影响采用顺序治疗方案研究PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗对肿瘤生长的抑制作用。结果表明,和NS治疗相比,单独用PEG-DTX-Lip治疗产生较弱的肿瘤生长抑制作用,而单独用PEG-SAB-Lip治疗没有明显的肿瘤生长抑制。正如预期的那样,先用PEG-SAB-Lip预处理再用PEG-DTX-Lip治疗可显着抑制肿瘤生长,表明PEG-SAB-Lip增强了PEG-DTX-Lip的抗肿瘤作用。TUNEL染色的结果显示当单一使用PEG-DTX-Lip治疗或PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗后,肿瘤细胞出现明显凋亡（P<0.05,P<0.001）。此外,和单一使用PEG-SAB-Lip或PEG-DTX-Lip相比,PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用的肿瘤细胞凋亡更明显（P<0.05,P<0.001）,表明PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用可增强PEG-DTX-Lip的抗肿瘤效率。4.2 PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗对TME的影响免疫荧光的结果显示单一PEG-SAB-Lip治疗或PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗的肿瘤组织中α-SMA表达降低,表明肿瘤区域TAFs减少,纤维化微环境被改善。Masson’s三色染色的结果可以观察到单一使用PEG-SAB-Lip处理或PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用后肿瘤组织中胶原蛋白减少。而单一使用PEG-DTX-Lip治疗后肿瘤组织中胶原蛋白没有明显变化。这意味着PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合使用可以降低肿瘤组织胶原沉积,并且这一作用是由PEG-SAB-Lip产生的。PEG-SAB-Lip单一疗法和PEG-SAB-Lip与PEG-DTX-Lip联合疗法均导致TGF-β1及其下游相关蛋白的表达显着降低（P<0.05或P<0.01）。PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗后Th1细胞因子的水平增加,CCL5、CXCL12和CXCL13的表达降低。此外,PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗的肿瘤中CD4+、CD8+T细胞和M1巨噬细胞增加,M2巨噬细胞、MDSCs和Tregs降低。4.3 PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗的安全性评估在治疗过程中,小鼠体重没有明显降低。血浆中谷草氨酶（Aspartase,AST）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）和肌酐（Creatinine,Cre）的水平均在正常值内,表明各治疗组对肝肾功能没有损伤。HE染色结果显示各治疗组处理后,在心、肝、脾、肺和肾组织中没有观察到明显的损伤,表明各治疗组对其它组织没有明显的毒性。结论:1.体外研究的结果表明PEG-SAB-Lip可通过抑制TGF-β1/Smad信号抑制TAFs激活,增强PEG-DiD-Lip在三维多细胞肿瘤球体中的渗透,并增加PEG-DTX-Lip对三维多细胞肿瘤球体的细胞毒性。2.在体内重复三次注射PEG-SAB-Lip可抑制TAFs激活,重塑TME,增加纳米粒在肿瘤组织的分布和渗透,改善免疫抑制微环境,增强PEG-DTX-Lip的抗肿瘤效率。
周维政[7]（2021）在《氟化物对发育性髋关节发育不良发病易感性的影响及其作用机制的研究》文中研究指明目的:发育性髋关节发育不良（DDH）是一种较为常见的儿童髋关节出生缺陷疾病,早期会影响学步期儿童的步态,晚期可进展为骨关节炎,严重降低儿童生活质量。早发现,早预防能够显着改善DDH的治疗结局。但DDH病因尚不清楚,目前已普遍接受其是由遗传与环境等多因素共同作用所导致。除易感基因外,已知的危险因素还包括关节松弛、宫内臀位以及生后直腿襁褓等。尤其是关节松弛作为主要危险因素,其增加会明显提高DDH的发病易感性。尽管目前DDH与微量元素的摄入水平之间的相关性尚缺乏有力的证据,但是越来越多的研究提示氟化物亦会对软组织,尤其是富含胶原蛋白的软组织造成损害。而关节囊是维持髋关节结构强度与稳定性的重要解剖结构,其成分便是胶原蛋白。然而以往研究中并无氟化物致DDH发病的相关报道,因此本研究构建氟中毒与DDH联合的动物模型,以明确氟化物的过量摄入能否造成髋关节关节囊结构强度下降,进而导致关节松弛,增加DDH的发病易感性,并进一步探究其内在的分子生物学机制。研究方法:本研究共分为三部分。第一部分、生命早期高氟暴露对DDH发病率的影响将12只3月龄的Wistar孕鼠（孕0天）随机分成对照组、饮氟50 mg/L组、饮氟100 mg/L组和饮氟150 mg/L组共4组。孕鼠分娩后仍采用相同浓度喂养直至幼鼠离乳（生后21天）。生后立即对幼鼠后肢直腿襁褓体位固定4天。观察各组DDH的发生率。第二部分、氟化物对正常大鼠髋关节关节囊形态结构及功能的影响及其作用机制将9只3月龄的Wistar孕鼠（孕0天）随机分成3组,即对照组,饮氟50 mg/L组和饮氟100 mg/L组。孕鼠分娩后仍采用相同浓度喂养直至幼鼠离乳（生后21天）。收集各组子代髋关节关节囊,利用扫描电子显微镜观察关节囊随着氟化物浓度的升高其表面胶原纤维束排列变化趋势;利用透射电子显微镜观察关节囊随着氟化物浓度的升高其胶原纤维直径变化趋势;通过Masson染色观察各组关节囊形态以及胶原纤维含量变化;PCR以及Western Blot检测分析各组关节囊组织中Col1a1与Col3a1的mRNA水平以及蛋白质表达水平差异;利用凋亡检测试剂盒与Western Blot检测各组关节囊组织凋亡水平以及凋亡相关蛋白质表达水平的变化。第三部分、氟化物对大鼠关节囊原代成纤维细胞的胶原代谢的影响及其作用机制利用组织块法从正常组大鼠髋关节关节囊中提取原代成纤维细胞并对其进行鉴定;利用CCK-8法观察含不同浓度氟化物的培养基对原代成纤维细胞的毒性作用,确定实验组细胞接受氟化物干预的浓度;利用细胞免疫荧光观察实验组与对照组Col1a1与Col3a1在细胞水平的表达;利用透射电子显微镜观察元代成纤维细胞内亚细胞结构改变;PCR以及Western Blot检测原代成纤维细胞凋亡相关蛋白表达变化趋势;利用流式细胞分析技术分析实验组与对照组发生细胞凋亡的比例;通过检测原代成纤维细胞线粒体膜电位（MMP）、活性氧自由基（ROS）、过氧化氢酶活力（CAT）、超氧化物歧化酶活力（SOD）、总抗氧化能力（AOC）以及氧化应激损伤指标丙二醛（MDA）的含量综合分析对照组和实验组之间氧化应激产生及损伤严重情况差异。结果:第一部分、生命早期高氟暴露对DDH发病率的影响1、生命早期高氟暴露联合生后直腿襁褓建立慢性氟中毒DDH模型成功;2、高氟暴露显着增加生后直腿襁褓所致的DDH的发病率。第二部分、氟化物对正常大鼠髋关节关节囊形态结构及功能的影响及其作用机制1、未施加直腿襁褓方式而单纯生命早期高氟暴露不会导致DDH发病;2、染氟组髋关节关节囊较对照组菲薄,胶原纤维直径纤细,纤维束排列疏松紊乱;3、染氟组关节囊Col1a1与Col3a1的mRNA水平较对照组显着下调,而蛋白表达水平Col1a1呈下降趋势,与Col3a1变化趋势相反;4、染氟组关节囊细胞凋亡发生较对照组明显增多,凋亡相关蛋白表达水平同样较对照组明显升高。第三部分、氟化物对大鼠关节囊原代成纤维细胞的胶原代谢的影响及其作用机制1、Col1a1与Col3a1在原代成纤维细胞经氟化物染毒处理后表达趋势与体内实验结果一致;2、在原代成纤维细胞中染氟组凋亡相关基因的mRNA水平以及蛋白表达水平均显着上调;3、染氟组原代成纤维细胞内超微结构（线粒体、内质网等）较对照组发生明显变化;4、经染氟处理后的原代成纤维细胞其线粒体膜电位水平显着下降,活性氧自由基产生明显增加,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力以及总抗氧化能力无明显改变,而氧化应激损伤水平MDA含量较对照组升高;5、原代成纤维细胞中染氟组发生早期凋亡与晚期凋亡的细胞比例显着高于对照组。结论:1、生命早期高氟暴露并不会直接导致DDH的发病;但会增加DDH的发病易感性;2、高氟造成关节囊胶原纤维纤细且排列稀疏紊乱,导致机械强度下降引发关节松弛;3、高氟下调关节囊Col1a1的表达,但上调Col3a1的表达;4、高氟激活关节囊成纤维细胞的氧化应激,调控线粒体内源性途径,促使关节囊成纤维发生细胞凋亡。
张媛[8]（2020）在《硫酸钠和5-氟尿嘧啶基于TGF-β信号通路对驴皮肤伤口愈合的影响》文中研究说明目的:瘢痕疙瘩是伤口愈合中组织修复的必然结果,因此,抑制瘢痕疙瘩的形成一直是临床上的难点。然而驴皮含有大量的胶原纤维,在伤口愈合时会产生大量的胶原蛋白,但其伤口不会因为胶原蛋白的过度沉积而形成增生性瘢痕疙瘩。本研究在体外培养的驴皮肤成纤维细胞中添加硫酸钠、5-FU,分别筛选其合适的作用浓度与时间。然后,在新疆驴皮肤上建立伤口,并分别外敷硫酸钠、注射5-FU,以探讨此两种药物对肉芽期伤口愈合的作用,同时从分子学角度初步分析影响胶原蛋白合成的调控机制。方法:（1）采用组织块法体外培养驴皮肤成纤维细胞,并分别用HE、Masson、免疫化学染色进行细胞鉴定;再用添加了高浓度组（2000μg/m L、1500μg/m L）、中浓度组（1000μg/m L、500μg/m L、250μg/m L）和低浓度组（100μg/m L、50μg/m L、10μg/m L）硫酸钠、5-FU培养液分别体外培养驴皮肤成纤维细胞,用MTT和Caspase-3法分别检测细胞增殖率和凋亡率。最后分别用RT-q PCR、ELISA法检测不同浓度硫酸钠、5-FU培养液中,影响驴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白的相关基因表达量及蛋白浓度。（2）选取6只新疆母驴,建立驴皮肤伤口,每头驴沿背部脊柱两侧共取六个直径为1.5 cm大小的圆形伤口,伤口间的距离大于30 cm,其中同侧三个伤口为处理组,另一侧三个伤口为对照组,创伤后第三天开始给药。分别于创伤后0 d、7 d、17 d、100 d测量计算创面愈合率,HE染色观察创面组织学变化,Masson染色观察创面胶原纤维的增生情况,RT-q PCR、ELISA法检测TGF-β信号通路中部分关键基因smad7、smad3、COL3A1、COL1A1、COL1A2和TGF-β1基因在驴伤口皮肤内的表达差异。结果:（1）驴皮肤成纤维细胞培养5 d后,开始从组织块边缘爬出、25 d后长满整个培养皿;经HE、Masson及免疫化学染色鉴定,驴皮肤成纤维细胞培养成功。添加中浓度组的硫酸钠培养液对成纤维细胞的增殖率显着高于高、低浓度组（P<0.05）,相应地,中浓度组的凋亡率显着低于其他两组（P<0.05）。相比于24 h,硫酸钠作用于成纤维细胞48 h能显着提高胶原蛋白合成相关基因的表达量（P<0.05）,250μg/m L浓度的效果最佳。（2）高、中浓度组的5-FU培养液对抑制成纤维细胞增殖率显着高于其它组（P<0.05）,相应地,低浓度组的凋亡率显着低于其他两组（P<0.05）。相比于12 h,5-FU作用于成纤维细胞24 h能显着抑制胶原蛋白合成相关基因的表达量（P<0.05）,100μg/m L浓度的效果最佳。（3）与对照组相比,硫酸钠组加快了驴皮肤伤口愈合的速度,缩短肉芽期伤口愈合时间,7 d、17 d时硫酸钠组的创面愈合率均显着高于对照组（P<0.05）,100 d时硫酸钠组表面有瘢痕疙瘩;伤口组织HE、Masson染色后,硫酸钠组胶原结构较致密,纤维束较粗大且排列紊乱;硫酸钠组smad3、COL3A1、COL1A1、COL1A2和TGF-β1基因相对表达量显着升高（P<0.05）,smad7基因显着降低（P<0.05）;硫酸钠组COL1A1、COL1A2、TGF-β1蛋白浓度也显着高于对照组（P<0.05）。（4）与对照组比,5-FU组创面肉芽期时收缩较慢且伤口愈合率小,100 d时5-FU组表面无瘢痕疙瘩;HE、Masson染色后,5-FU组胶原密度下降且间隙变宽,纤维束排列有序;5-FU组smad3、COL3A1、COL1A1、COL1A2和TGF-β1基因相对表达量显着下降（P<0.05）,smad7相对表达量显着上升（P<0.05）;5-FU组COL1A1、COL1A2、TGF-β1蛋白浓度也显着低于对照组（P<0.05）。结论:（1）250μg/m L硫酸钠培养液培养驴皮肤成纤维细胞48 h,能显着提高细胞增殖率,促进细胞信号通路相关基因合成胶原蛋白。（2）100μg/m L 5-FU培养24 h,可有效抑制成纤维细胞的增殖,抑制细胞信号通路相关基因合成胶原蛋白。（3）驴皮伤口外敷硫酸钠可加快伤口愈合的速度,缩短肉芽期伤口愈合的时间,但愈合后形成瘢痕疙瘩,上调TGF-β/smad信号通路相关基因m RNA相对表达量及蛋白浓度（4）驴皮伤口注射5-FU,可延长肉芽期伤口愈合的时间,但愈合后不形成瘢痕疙瘩,下调TGF-β/smad信号通路相关基因m RNA相对表达量及蛋白浓度。本试验为人类伤口愈合机制和无瘢痕疙瘩愈合的研究提供参考依据。
杨慧华[9]（2020）在《上睑提肌与衰老》文中认为上睑下垂是一种可以发生在各年龄层,影响美观与日常生活的疾病。主要分为先天性上睑下垂和获得性上睑下垂两大类。成年人群中以获得性上睑下垂中的老年性上睑下垂最为多见。目前学术界主流观点认为老年性上睑下垂的发病机制为上睑提肌腱膜断裂或者退行性变,而上睑提肌肌肉本身功能不受影响。与之相呼应的,关于骨骼肌与衰老关系的研究也发现眼外肌作为一个特殊的肌群具普遍具有高于普通骨骼肌的再生能力,并且有假说认为眼外肌可能不受衰老的影响。但是这些研究大都是在动物模型上开展的,并且研究对象多是协调眼球运动的三对眼外肌,具体到上睑提肌与衰老的研究目前还是十分稀少的。随着近期的一些研究在老年性上睑下垂患者的上睑提肌中发现了脂肪浸润的现象,对主流观点的质疑也越来越多。上睑提肌是否能够免受衰老的影响,在老年性上睑下垂患者中上睑提肌本身是否真的正常也成为相关领域研究人员的一个关注点。为了验证上睑提肌与衰老的关系,本研究选取了来自协和医学院遗体捐献中心的11具生前无相关眼部疾病的遗体的20份上睑提肌样本（不包含肌腱部分）进行了组织病理染色研究。11具遗体中6具为男性,5具为女性,20份样本中8份标本来自女性,12份来自男性。9份来自左眼,11份来自右眼。按照年龄将样本分为较年轻组（年龄65-79岁,5具遗体,平均年龄73.6±5.6岁,10份标本）和较年老组（年龄82-100岁,6具遗体,平均年龄88.5±6.5岁,10份标本）,对每份标本分别进行HE染色、Masson染色和VG染色,光镜下观察肌纤维分布情况和完整程度、脂肪浸润、结缔组织增生等等情况。对每份标本的HE染色,随机选取三个高倍镜视野,用IPP软件计算肌纤维面积所占比例,取平均值作为标本的肌纤维面积比例;以同样的方法计算每份标本Masson染色结果的胶原纤维面积比例。根据数据本身的特点选用Mann-Whitney U检验或者t检验分析年龄、性别、左右眼对肌纤维面积比例和胶原纤维面积比例的影响。在20%较年轻组和20%较年老组标本中观察到不同程度的脂肪浸润情况。两组染色结果均有部分切片可见局部胶原纤维增生的情况（较年轻组3份标本,其中两份来源于同一具遗体;较年老组1份标本）。按年龄分组,较年轻组和较年老组之间肌纤维面积比例和胶原纤维面积比例均不存在统计学意义上的差距（P肌=0.112 P胶=0.226）;按性别分组,肌纤维面积比例和胶原纤维面积比例差距也不显着（P 肌=0.452 P胶=0.537）;按照来源于左右眼分组,肌纤维面积比例和胶原纤维面积比例仍无明显差异（P 肌=0.732 P 胶=0.382）就本研究的结果来看:在年龄较大的成年人群中,部分人群的上睑提肌存在脂肪浸润;不同年龄层之间的上睑提肌肌纤维面积比例和胶原纤维面积比例不存在明显差异。同时无论是性别和还是标本来源（左眼或右眼）都不会对肌纤维面积比例和胶原纤维面积比例产生显着影响。
李雅林[10]（2020）在《酶制剂在生皮脱脂过程的应用及性能研究》文中指出近年来,国内外对酶制剂在制革加工过程中的应用研究较多。蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶可分别通过对脂肪、球状蛋白和蛋白多糖等的降解作用,达到去除纤维间质,松散胶原纤维的作用。如果采取蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶多酶复合协同可能产生更好的作用效果。所以,本文选用了碱性蛋白酶JRH、糖化酶TH、碱性脂肪酶JZ,以脱脂产生的废液中的总蛋白浓度、胶原蛋白占总蛋白的比率、脱脂率为指标,确定了由碱性蛋白酶JRH、糖化酶TH和碱性脂肪酶JZ构成的复合酶脱脂剂的配方。将复合酶用于生猪皮的脱脂过程,对比了脱脂前后猪皮的组织学结构差异以及物理机械性能的变化,探讨了复合酶在猪皮脱脂过程中的协同作用机理。将复合酶用于猪皮、黄牛皮、绵羊皮等几种生皮的脱脂过程中,并对脱脂效果进行了比较。最后,对脱脂产生的废水进行了环境影响评估并探究了三种酶相对适宜的使用条件。研究结果显示,以脱脂产生的废液中的总蛋白浓度、胶原蛋白占总蛋白的比率、脱脂率为筛选条件,适宜的复合酶配方为每千克生皮使用碱性蛋白酶JRH 20000 U、糖化酶TH 40000 U、碱性脂肪酶JZ 6000 U。在该复合酶用量条件下,复合酶对生猪皮的脱脂率达到82.3%,产生的脱脂废水中的总蛋白浓度为1570.58μg/mL,胶原蛋白占总蛋白的比率为0.47%,能有效地脱除生皮内的脂肪以及胶原纤维间质,分散胶原纤维。通过荧光显微镜的观察以及对三种酶复合前后的脱脂率、总蛋白浓度等数据的分析,发现碱性蛋白酶JRH、糖化酶TH和碱性脂肪酶JZ之间具有一定的协同脱脂作用。分别通过光学显微镜和扫描电镜的观察,发现复合酶对猪皮内脂肪的脱除效果和对胶原纤维的分散作用比非离子脱脂剂的作用效果更好。相较于经非离子脱脂剂处理的猪皮,经复合酶处理的猪皮的机械性能更优。复合酶对绵羊皮和黄牛皮也有良好的脱脂效果。与非离子脱脂剂脱脂工艺废水相比,复合酶脱脂产生的工艺废水对环境污染更小,更易生物降解。
二、对胶原纤维三色特殊染色过程的一点改进（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、对胶原纤维三色特殊染色过程的一点改进（论文提纲范文）
（1）海藻糖掺杂和巯基化合物接枝对胶原自组装及热稳定性的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胶原蛋白简介 |
| 1.1.1 胶原的组成与结构 |
| 1.1.2 胶原的分类与应用 |
| 1.2 胶原的自组装 |
| 1.3 胶原热稳定的研究进展 |
| 1.3.1 不同来源对胶原热稳定性影响 |
| 1.3.2 不同提取方法对胶原热稳定性影响 |
| 1.3.3 不同溶剂体系对胶原热稳定性的影响 |
| 1.3.4 不同聚合物对胶原热稳定性的影响 |
| 1.3.5 交联对胶原热稳定性的影响 |
| 1.4 立题依据 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 创新点 |
| 第二章 海藻糖对胶原自组装及热稳定性的影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.3 胶原/海藻糖(Col/AT)共混体系的制备 |
| 2.2.4 Col/AT体系自组装行为的表征 |
| 2.2.5 Col/AT体系中三螺旋结构的表征 |
| 2.2.6 Col/AT体系中胶原分子结构的表征 |
| 2.2.7 Col/AT体系自组装程度的表征 |
| 2.2.8 Col/AT体系热稳定性的表征 |
| 2.2.9 Col/AT体系自组装所得纤维产物的形貌表征 |
| 2.2.10 Col/AT体系自组装产物的细胞相容性表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 海藻糖对胶原自组装动力学行为的影响研究 |
| 2.3.2 海藻糖对胶原自组装程度的影响研究 |
| 2.3.3 海藻糖对胶原分子结构的影响研究 |
| 2.3.4 海藻糖对胶原热稳定性的影响研究 |
| 2.3.5 海藻糖对胶原自组装纤维产物微观形貌的影响研究 |
| 2.3.6 海藻糖对胶原自组装产物细胞相容性的影响研究 |
| 2.4 本章小节 |
| 第三章 巯基化胶原的体外自组装及热稳定性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验原料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 巯基化胶原的制备 |
| 3.2.4 巯基化胶原接枝密度的测定(TNBS) |
| 3.2.5 巯基化胶原的分子结构表征 |
| 3.2.6 巯基化胶原自组装行为表征 |
| 3.2.7 巯基化胶原自组装程度表征 |
| 3.2.8 巯基化胶原自组装所得纤维产物热稳定性表征 |
| 3.2.9 巯基化胶原自组装所得纤维产物的形貌表征 |
| 3.2.10 巯基化胶原自组装产物的机械性能表征 |
| 3.2.11 巯基化胶原自组装产物的细胞相容性表征 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 巯基化胶原的接枝密度测定 |
| 3.3.2 巯基化胶原三螺旋结构完整性分析 |
| 3.3.3 巯基化胶原自组装动力学行为研究 |
| 3.3.4 巯基化胶原自组装程度研究 |
| 3.3.5 巯基化胶原热稳定性研究 |
| 3.3.6 巯基化胶原自组装所得纤维产物的形貌研究 |
| 3.3.7 巯基化胶原自组装产物的机械性能研究 |
| 3.3.8 巯基化胶原自组装产物的细胞相容性研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）天然交联剂对脱细胞猪角膜基质的交联及其性能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 APCS临床应用的并发症分析 |
| 前言 |
| 第一章 实验材料和方法 |
| 第二章 实验结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 天然交联剂对APCS的交联及其性能的研究 |
| 前言 |
| 第一章 实验材料和方法 |
| 第二章 实验结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 角膜的生物力学及其提高的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（3）金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽抗皮肤光老化活性及作用机制差异（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 综述 |
| 1.1 皮肤光老化 |
| 1.2 胶原蛋白与胶原多肽 |
| 1.3 口服胶原多肽的安全性与生物利用度 |
| 1.3.1 口服胶原多肽的安全性 |
| 1.3.2 胶原多肽的生物利用度 |
| 1.4 胶原多肽的抗皮肤光老化活性 |
| 1.4.1 改善水分含量 |
| 1.4.2 防止黑色素过量产生 |
| 1.4.3 抗氧化活性 |
| 1.4.4 胶原多肽对光老化皮肤组织形态的改善作用 |
| 1.4.5 信号通路 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽的制备及性质研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 原料与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原料的预处理 |
| 2.2.2 原料胶原蛋白含量的测定 |
| 2.2.3 胶原多肽的制备 |
| 2.2.4 水解度(DH)的测定 |
| 2.2.5 胶原多肽分子量分布的测定 |
| 2.2.6 氨基酸组成分析 |
| 2.2.7 游离氨基含量的测定 |
| 2.2.8 DPPH·清除率的测定 |
| 2.2.9 超氧阴离子(O_2~-·)清除率的测定 |
| 2.2.10 羟自由基(·OH)清除率的测定 |
| 2.2.11 氧自由基吸收能力(ORAC)的测定 |
| 2.2.12 保湿性的测定 |
| 2.2.13 吸湿性的测定 |
| 2.2.14 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原蛋白在不同蛋白酶作用下的水解度 |
| 2.3.2 TSCP和 TBCP的平均分子量分布以及游离氨基含量 |
| 2.3.3 TSCP和 TBCP的氨基酸组成 |
| 2.3.4 TSCP和 TBCP的抗氧化活性 |
| 2.3.5 TSCP和 TBCP的保湿吸湿性能 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽对光老化NIH/3T3 细胞的保护作用及机制 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 原料与试剂 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 NIH/3T3 细胞的培养 |
| 3.2.2 UVB照射剂量的筛选 |
| 3.2.3 最优TSCP和 TBCP的筛选 |
| 3.2.4 多肽处理分组 |
| 3.2.5 NIH/3T3 细胞的相对活力测定 |
| 3.2.6 NIH/3T3 细胞中ROS水平的测定 |
| 3.2.7 ELISA法测定MMP-1、TGF-β1和I型胶原蛋白表达量 |
| 3.2.8 实时荧光定量PCR检测细胞中MMP-1、TGF-β1和I型胶原蛋白的mRNA表达 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 UVB剂量及TSCP和 TBCP的筛选 |
| 3.3.2 TSCP和 TBCP对 NIH/3T3 细胞存活率的影响 |
| 3.3.3 TSCP和 TBCP对 NIH/3T3 细胞中ROS的清除作用 |
| 3.3.4 TSCP和 TBCP对 NIH/3T3 细胞中MMP-1的mRNA及其蛋白表达量的影响 |
| 3.3.5 TSCP和 TBCP对 NIH/3T3 细胞中TGF-β1的mRNA及其蛋白表达量的影响 |
| 3.3.6 TSCP和 TBCP对 NIH/3T3 细胞中I型胶原蛋白mRNA及其蛋白表达量的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽对光老化小鼠皮肤的保护作用及其机制 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 原料与试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验动物与分组 |
| 4.2.2 动物造模与取材 |
| 4.2.3 小鼠皮肤切片HE染色 |
| 4.2.4 小鼠皮肤切片Masson染色 |
| 4.2.5 小鼠皮肤水分含量测定 |
| 4.2.6 小鼠皮肤总抗氧化能力(T-AOC)测定 |
| 4.2.7 小鼠皮肤羟脯氨酸含量测定 |
| 4.2.8 小鼠皮肤组织中I型胶原蛋白、MMP-1和TGF-β1 蛋白表达量的测定 |
| 4.2.9 蛋白质免疫印迹 |
| 4.2.10 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 小鼠皮肤外观 |
| 4.3.2 小鼠体重变化及胸腺和脾脏指数 |
| 4.3.3 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤组织HE染色的影响 |
| 4.3.4 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤组织Masson染色的影响 |
| 4.3.5 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤水分含量的影响 |
| 4.3.6 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤总抗氧化能力的影响 |
| 4.3.7 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤中羟脯氨酸含量的影响 |
| 4.3.8 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤中MMP-1、TGF-β1和I型胶原蛋白表达量的影响 |
| 4.3.9 TSCP和 TBCP对小鼠皮肤中MAPK家族蛋白磷酸化水平的影响 |
| 4.3.10 TSCP和 TBCP抗光老化活性机制差异研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（4）微结构丝素蛋白薄膜的仿生制备及其在肌腱修复中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肌腱显微结构与力学性能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 仿生丝素蛋白薄膜的制备、改性与表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 微结构丝素蛋白薄膜在体内对损伤肌腱的修复作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs生物学行为的调控及分子机制 |
| 5.1 微结构丝素蛋白薄膜对TSPCs生物学行为的调控 |
| 5.1.1 引言 |
| 5.1.2 材料与方法 |
| 5.1.3 结果 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.1.5 小结 |
| 5.2 微结构丝素蛋白薄膜调控TSPCs的内在分子机制 |
| 5.2.1 引言 |
| 5.2.2 材料与方法 |
| 5.2.3 结果 |
| 5.2.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肌腱损伤及肌腱组织工程的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）病变胶原蛋白的靶向成像（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胶原蛋白相关疾病及检测方法 |
| 1.1 胶原蛋白概述 |
| 1.1.1 胶原蛋白的结构 |
| 1.1.2 胶原蛋白的稳定性 |
| 1.1.3 胶原蛋白的体内合成 |
| 1.1.4 胶原蛋白的分类 |
| 1.1.5 胶原蛋白的功能基序 |
| 1.2 胶原蛋白相关疾病 |
| 1.2.1 心血管病 |
| 1.2.2 肿瘤 |
| 1.2.3 关节炎 |
| 1.2.4 纤维化疾病 |
| 1.2.5 遗传疾病 |
| 1.3 胶原蛋白的溶液检测 |
| 1.3.1 胶原蛋白的结构鉴定 |
| 1.3.2 胶原蛋白的定量检测 |
| 1.3.3 胶原多肽溶液检测 |
| 1.4 胶原蛋白的组织成像 |
| 1.4.1 无标记光学组织成像 |
| 1.4.2 标记的光学组织成像 |
| 1.4.3 非光学显微成像 |
| 1.5 胶原蛋白的活体成像 |
| 1.5.1 胶原蛋白疾病的临床活体成像方法 |
| 1.5.2 胶原蛋白的靶向活体成像 |
| 1.6 论文研究意义和研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 大位阻分子介导的单链多肽探针用于结缔组织成像 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 FCMP多肽探针的合成 |
| 2.2.3 ssFCMP多肽探针的合成 |
| 2.2.4 多肽探针性质的表征 |
| 2.2.5 胶原纤维靶向成像 |
| 2.2.6 结缔组织靶向成像 |
| 2.2.7 抑制实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 荧光多肽探针ss FCMP的设计 |
| 2.3.2 荧光多肽探针ss FCMP的表征 |
| 2.3.3 胶原纤维的靶向成像 |
| 2.3.4 组织中胶原蛋白的特异性成像 |
| 2.3.5 ssFCMP在结缔组织成像中的应用 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 静电排斥作用去稳定化的靶向病变胶原多肽探针 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 多肽探针PCTP-Dn的合成 |
| 3.2.3 多肽探针PCTP-Dn的表征 |
| 3.2.4 蛋白结合实验 |
| 3.2.5 结缔组织染色实验 |
| 3.2.6 烫伤皮肤组织染色实验 |
| 3.2.7 肿瘤组织染色实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 F-PCTP-Dn多肽探针的设计 |
| 3.3.2 多肽探针三重螺旋结构的稳定性 |
| 3.3.3 多肽探针F-PCPT-D6 特异性染色病变胶原蛋白 |
| 3.3.4 烫伤组织中病变胶原蛋白的染色 |
| 3.3.5 肿瘤组织中病变胶原蛋白的染色 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 非三聚体多肽探针靶向检测结缔组织的病变胶原蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 多肽探针的合成 |
| 4.2.3 多肽探针的性质表征 |
| 4.2.4 多肽探针的组织染色 |
| 4.2.5 组织病理学染色 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 靶向多肽探针的设计 |
| 4.3.2 多肽探针的三重螺旋稳定性研究 |
| 4.3.3 多肽探针的组织染色能力 |
| 4.3.4 多肽探针F-GOP-10 特异性染色病变胶原蛋白 |
| 4.3.5 多肽探针F-GOP-10 染色病理组织 |
| 4.3.6 多肽探针长度对结合能力的影响 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 主-客体肽多色量子点探针用于细胞及外基质成像 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 主体肽的合成 |
| 5.2.3 客体肽的合成 |
| 5.2.4 主-客体肽量子点探针的合成 |
| 5.2.5 主-客体肽量子点探针的性质表征 |
| 5.2.6 细胞成像 |
| 5.2.7 组织成像 |
| 5.2.8 3D肿瘤细胞成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 主-客体肽体系的设计 |
| 5.3.2 主体肽量子点探针的稳定性研究 |
| 5.3.3 主-客体肽量子点探针的稳定性研究 |
| 5.3.4 主-客体肽多色量子点探针的性质表征 |
| 5.3.5 主-客体肽多色量子点探针的特异性 |
| 5.3.6 主-客体肽多色量子点探针的细胞成像 |
| 5.3.7 主-客体肽多色量子点探针的组织成像 |
| 5.3.8 3D肿瘤细胞成像 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 胶原蛋白结构和分型鉴定的量子点工具箱 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 胶原蛋白靶向多肽的合成 |
| 6.2.3 胶原蛋白量子点探针的合成 |
| 6.2.4 胶原蛋白量子点探针的表征 |
| 6.2.5 胶原蛋白量子点探针的组织染色 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 QDs-Col探针的设计 |
| 6.3.2 QDs-Col探针的表征 |
| 6.3.3 QDs-Col探针的稳定性研究 |
| 6.3.4 QDs-Col探针的染色能力研究 |
| 6.3.5 量子点工具箱的病理组织成像 |
| 6.3.6 量子点工具箱的胚胎发育组织成像 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 论文总结 |
| 7.2 研究展望 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）基于肿瘤微环境的PEG化丹酚酸B脂质体与PEG化多西他赛脂质体联合用药相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 PEG化丹酚酸B脂质体的制备与质量评价 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 SAB体外分析方法的建立 |
| 2.1.1 标准储备液的制备 |
| 2.1.2 色谱条件 |
| 2.1.3 专属性考察 |
| 2.1.4 标准曲线的建立 |
| 2.1.5 精密度和准确度 |
| 2.1.6 回收率 |
| 2.1.7 重复性 |
| 2.1.8 稳定性 |
| 2.2 EE%测定方法的建立 |
| 2.2.1 EE%测定方法的选择 |
| 2.2.2 膜透过率考察 |
| 2.2.3 加样回收率 |
| 2.2.4 包封率和载药量的测定 |
| 2.3 PEG-SAB-Lip的制备工艺及处方研究 |
| 2.3.1 制备方法的选择 |
| 2.3.2 处方单因素考察 |
| 2.3.3 正交试验 |
| 2.4 PEG-SAB-Lip的质量评价 |
| 2.4.1 外观考察 |
| 2.4.2 TEM观察PEG-SAB-Lip形态 |
| 2.4.3 粒径和Zeta电位的测定 |
| 2.4.4 放置稳定性考察 |
| 2.4.5 体外释放研究 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 SAB体外分析方法的建立 |
| 3.1.1 专属性考察 |
| 3.1.2 标准曲线 |
| 3.1.3 精密度和准确度 |
| 3.1.4 回收率 |
| 3.1.5 重复性 |
| 3.1.6 稳定性 |
| 3.2 EE%测定方法的建立 |
| 3.2.1 膜透过率考察 |
| 3.2.2 加样回收率 |
| 3.3 PEG-SAB-Lip的制备工艺及处方研究 |
| 3.3.1 制备方法的选择 |
| 3.3.2 处方单因素考察 |
| 3.3.3 正交试验 |
| 3.4 PEG-SAB-Lip的质量评价 |
| 3.4.1 外观考察 |
| 3.4.2 PEG-SAB-Lip形态 |
| 3.4.3 粒径和Zeta电位 |
| 3.4.4 放置稳定性考察 |
| 3.4.5 体外释放研究 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 PEG-SAB-Lip对 PEG-DTX-Lip在三维多细胞肿瘤球体中渗透和细胞毒性的影响 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 实验细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 SAB、PEG-SAB-Lip和 PEG-B-Lip细胞无毒给药浓度的筛选 |
| 2.2 SAB和 PEG-SAB-Lip对激活的NIH3T3细胞中TGF-β1/Smad信号的影响 |
| 2.2.1 细胞给药 |
| 2.2.2 蛋白提取 |
| 2.2.3 BCA蛋白定量 |
| 2.2.4 Western blot 分析TGF-β1及其下游相关蛋白的表达 |
| 2.3 纳米粒在三维多细胞球体中的渗透 |
| 2.3.1 三维多细胞球体模型的建立 |
| 2.3.2 PEG-DTX-Lip和 PEG-DiD-Lip的制备 |
| 2.3.3 纳米粒在三维多细胞球体中的渗透 |
| 2.3.4 三维多细胞球体的毒性评估 |
| 2.4 数据处理与分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 TGF-β1 激活NIH3T3 细胞 |
| 3.2 SAB、PEG-SAB-Lip和 PEG-B-Lip细胞无毒给药浓度的筛选 |
| 3.3 SAB和 PEG-SAB-Lip对激活的NIH3T3细胞中TGF-β1/Smad信号的影响 |
| 3.4 三维多细胞球体模型建立方法的优化 |
| 3.5 PEG-DiD-Lip在三维多细胞球体中的渗透 |
| 3.6 细胞毒性研究 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 PEG-SAB-Lip对乳腺癌微环境的影响 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 实验细胞 |
| 1.6 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠乳腺癌模型的建立 |
| 2.2 免疫荧光观察肿瘤组织中血管和TAFs |
| 2.2.1 溶液配制 |
| 2.2.2 具体步骤 |
| 2.3 Masson's三色染色观察肿瘤组织胶原沉积 |
| 2.4 PEG-SAB-Lip重塑肿瘤微环境研究 |
| 2.4.1 实验动物分组及给药 |
| 2.4.2 免疫荧光染色观察各组肿瘤组织中α-SMA的表达 |
| 2.4.3 Masson's三色染色观察各组肿瘤组织中胶原沉积 |
| 2.4.4 Western blot分析各组肿瘤组织中蛋白表达 |
| 2.4.5 RT-qPCR分析各组肿瘤组织中细胞因子的变化 |
| 2.4.6 免疫荧光染色观察肿瘤组织中免疫细胞群的变化 |
| 2.5 纳米粒在乳腺癌中分布和渗透的研究 |
| 2.5.1 实验分组及给药 |
| 2.5.2 荧光显微镜观察PEG-DiD-Lip在小鼠肿瘤模型中的分布和渗透 |
| 2.6 数据处理与分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 小鼠乳腺癌模型的建立 |
| 3.1.1 免疫荧光观察肿瘤组织α-SMA表达 |
| 3.1.2 免疫荧光观察肿瘤组织血管压缩情况 |
| 3.1.3 Masson's三色染色观察肿瘤组织胶原沉积 |
| 3.2 PEG-SAB-Lip对小鼠乳腺癌微环境的影响 |
| 3.2.1 PEG-SAB-Lip抑制TAFs激活 |
| 3.2.2 PEG-SAB-Lip减少肿瘤组织胶原沉积 |
| 3.2.3 PEG-SAB-Lip抑制肿瘤组织中TGF-β1/Smad信号 |
| 3.2.4 PEG-SAB-Lip对肿瘤免疫微环境的影响 |
| 3.2.5 PEG-SAB-Lip对肿瘤区域免疫细胞群的影响 |
| 3.3 PEG-SAB-Lip增强PEG-DiD-Lip在肿瘤中的分布和渗透 |
| 3.3.1 PEG-SAB-Lip增强PEG-DiD-Lip在肿瘤区域的分布 |
| 3.3.2 PEG-SAB-Lip增强PEG-DiD-Lip在肿瘤区域的渗透 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 PEG-SAB-Lip和 PEG-DTX-Lip联合治疗的药效学与初步安全性研究 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 实验细胞 |
| 1.6 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 PEG-SAB-Lip和 PEG-DTX-Lip联合抗肿瘤研究 |
| 2.1.1 实验分组及给药 |
| 2.1.2 抗肿瘤效率研究 |
| 2.1.3 TUNEL评估肿瘤细胞凋亡 |
| 2.1.4 HE染色 |
| 2.2 PEG-SAB-Lip和 PEG-DTX-Lip的联合治疗对肿瘤微环境的影响 |
| 2.2.1 免疫荧光染色观察各组肿瘤组织中α-SMA的表达 |
| 2.2.2 Masson's三色染色观察各组肿瘤组织中胶原沉积 |
| 2.2.3 Western blot分析各组肿瘤组织中蛋白表达 |
| 2.2.4 RT-qPCR分析各组肿瘤组织中细胞因子的变化 |
| 2.2.5 免疫荧光染色观察各组肿瘤组织中免疫细胞群的变化 |
| 2.3 初步安全性评估 |
| 2.3.1 小鼠体重变化 |
| 2.3.2 PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗对肝肾功能的影响 |
| 2.3.3 HE染色 |
| 2.4 数据处理与分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 PEG-SAB-Lip和 PEG-DTX-Lip联合使用抑制肿瘤生长 |
| 3.2 PEG-SAB-Lip和 PEG-DTX-Lip联合治疗增强肿瘤细胞凋亡 |
| 3.3 HE染色 |
| 3.4 PEG-SAB-Lip和 PEG-DTX-Lip联合治疗对肿瘤微环境的影响 |
| 3.4.1 免疫荧光观察肿瘤区域α-SMA的表达 |
| 3.4.2 Masson's三色染色观察肿瘤区域胶原沉积 |
| 3.4.3 Western blot分析肿瘤组织相关蛋白的表达 |
| 3.4.4 RT-qPCR分析各组肿瘤组织中细胞因子的变化 |
| 3.4.5 免疫荧光观察肿瘤组织免疫细胞群的变化 |
| 3.5 初步安全性评估 |
| 3.5.1 PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗过程中小鼠体重变化 |
| 3.5.2 PEG-SAB-Lip和PEG-DTX-Lip联合治疗对肝肾功能的影响 |
| 3.5.3 HE染色观察各治疗组处理后对主要组织的毒性 |
| 4 本章小结 |
| 全文讨论与总结 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 不足之处及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 Emerging strategies against tumor-associated fibroblast for improved the penetration of nanoparticle into desmoplastic tumor |
| References |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录及参加课题研究情况 |
（7）氟化物对发育性髋关节发育不良发病易感性的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 生命早期高氟暴露对DDH发病率的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂的配制 |
| 2.2.2 发育性髋关节发育不良联合饮水型氟中毒大鼠动物模型的建立 |
| 2.2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 生命早期高氟暴露对大鼠体重的影响 |
| 3.2 生命早期高氟暴露对大鼠门齿氟斑牙患病率的影响 |
| 3.3 生命早期高氟暴露对大鼠DDH发生率的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 氟化物对大鼠髋关节囊形态结构及功能的影响及其作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂的配制 |
| 2.2.2 饮水型氟中毒大鼠动物模型的建立 |
| 2.2.3 髋关节病理玻片制作 |
| 2.2.4 扫描电子显微镜 |
| 2.2.5 透射电子显微镜 |
| 2.2.6 Masson染色 |
| 2.2.7 实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应 |
| 2.2.8 免疫蛋白印迹 |
| 2.2.9 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色 |
| 2.2.10 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 生命早期不同氟化物浓度对大鼠体重发育的影响 |
| 3.2 各染氟组大鼠髋关节关节囊胶原纤维形态的改变 |
| 3.3 各染氟组大鼠髋关节关节囊超微结构的改变 |
| 3.4 各染氟组胶原及凋亡相关基因mRNA表达差异 |
| 3.5 各染氟组关节囊组织凋亡程度不同 |
| 3.6 各染氟组关节囊胶原以及凋亡相关蛋白表达水平差异 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 氟化物对髋关节囊原代成纤维细胞胶原代谢的影响及其作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 大鼠关节囊成纤维细胞原代培养 |
| 2.2.3 大鼠关节囊成纤维细胞的传代培养 |
| 2.2.4 细胞鉴定 |
| 2.2.5 细胞存活率测定 |
| 2.2.6 大鼠关节囊原代成纤维细胞的氟化钠处理 |
| 2.2.7 透射电镜 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光 |
| 2.2.9 实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应 |
| 2.2.10 免疫蛋白印迹 |
| 2.2.11 线粒体膜电位水平(JC-10)检测 |
| 2.2.12 细胞内活性氧自由基水平检测 |
| 2.2.13 细胞内脂质过氧化水平检测 |
| 2.2.14 细胞总抗氧化能力检测 |
| 2.2.15 细胞过氧化氢酶活力水平检测 |
| 2.2.16 细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力检测 |
| 2.2.17 凋亡细胞的流式分析检测 |
| 2.2.18 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代成纤维细胞的鉴定 |
| 3.2 NaF对关节囊原代成纤维细胞形态的影响 |
| 3.3 NaF干预下关节囊原代成纤维细胞的存活率 |
| 3.4 NaF对关节囊原代成纤维细胞Col1a1和Col3a1表达的影响 |
| 3.5 NaF对关节囊成纤维细胞内线粒体膜电位水平的影响 |
| 3.6 NaF对关节囊成纤维细胞内超微结构的影响 |
| 3.7 NaF对关节囊原代成纤维细胞内ROS、MDA含量、CAT活力、SOD活力以及总AOC的影响 |
| 3.8 NaF对关节囊原代成纤维细胞凋亡情况的影响 |
| 3.9 NaF对关节囊原代成纤维细胞凋亡相关基因mRNA水平的影响 |
| 3.10 NaF对关节囊原代成纤维细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 长期摄入过量氟化物所致非骨相损害的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）硫酸钠和5-氟尿嘧啶基于TGF-β信号通路对驴皮肤伤口愈合的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 伤口愈合过程 |
| 3 伤口愈合影响因素 |
| 3.1 成纤维细胞对伤口的愈合影响 |
| 3.2 硫酸钠对伤口愈合的影响 |
| 3.3 5-FU对伤口愈合的影响 |
| 3.4 TGF-β/smad 信号通路及胶原蛋白研究现状 |
| 4 研究内容与技术路线 |
| 4.1 研究内容 |
| 4.2 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 硫酸钠对驴皮肤成纤维细胞增殖、凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞培养与鉴定 |
| 2.2 硫酸钠对成纤维细胞增殖、凋亡的影响 |
| 2.3 影响驴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白及相关基因的表达 |
| 2.4 影响驴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白及相关基因蛋白浓度 |
| 3 讨论 |
| 3.1 成纤维细胞培养鉴定 |
| 3.2 硫酸钠对细胞增殖、凋亡的影响 |
| 3.3 硫酸钠对胶原蛋白合成相关基因的影响 |
| 4 小结 |
| 试验二 硫酸钠对驴皮肤伤口愈合的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 伤口愈合 |
| 2.2 组织学观察 |
| 2.3 影响驴皮伤口愈合相关基因的表达 |
| 2.4 影响驴皮伤口愈合相关基因的蛋白浓度 |
| 3 讨论 |
| 3.1 硫酸钠对伤口愈合速度的影响 |
| 3.2 硫酸钠对驴皮伤口愈合相关基因的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 5-FU对驴皮肤成纤维细胞增殖、凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 5-FU干预成纤维细胞后细胞形态变化 |
| 2.2 5-FU对成纤维细胞增殖、凋亡的影响 |
| 2.3 影响驴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白及相关基因的表达 |
| 2.4 影响驴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白及相关基因的蛋白浓度 |
| 3 讨论 |
| 3.1 5-FU对成纤维细胞增殖、凋亡的影响 |
| 3.2 5-FU对合成胶原蛋白及相关基因的影响 |
| 4 小结 |
| 试验四 5-FU对驴皮肤伤口愈合的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 伤口愈合 |
| 2.2 组织学观察 |
| 2.3 影响驴皮伤口愈合相关基因的表达 |
| 2.4 影响驴皮伤口愈合相关基因的蛋白浓度 |
| 3 讨论 |
| 3.1 5-FU对伤口愈合速度的影响 |
| 3.2 5-FU对驴皮伤口愈合相关基因的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（9）上睑提肌与衰老（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 一、基本信息 |
| 二、组织染色结果 |
| 三、年龄、性别和标本来源(左右眼)对肌纤维面积比例以及胶原纤维面积比例影响的分析结果 |
| 1、年龄 |
| (1)、年龄对肌纤维面积比例的影响 |
| (2)、年龄对胶原纤维面积比例的影响 |
| (3)、相关性分析 |
| 2、性别 |
| (1)、性别对肌纤维面积比例的影响 |
| (2)、性别对胶原纤维面积比例的影响 |
| 3、标本来源(左右眼) |
| (1)、标本来源对肌纤维面积比例的影响 |
| (2)、标本来源对胶原纤维面积比例的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 上睑提肌与衰老 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）酶制剂在生皮脱脂过程的应用及性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 制革常用酶制剂 |
| 1.2.1 中性蛋白酶 |
| 1.2.2 碱性蛋白酶 |
| 1.2.3 酸性蛋白酶 |
| 1.2.4 工业胰酶 |
| 1.2.5 脂肪酶 |
| 1.3 酶制剂在制革过程中的应用 |
| 1.3.1 酶制剂在浸水中的应用 |
| 1.3.2 酶制剂在脱脂中的应用 |
| 1.3.3 酶制剂在脱毛中的应用 |
| 1.3.4 酶制剂在浸灰中的应用 |
| 1.3.5 酶制剂在软化中的应用 |
| 1.4 脱脂的目的及常用方法 |
| 1.4.1 脱脂的目的 |
| 1.4.2 脱脂的常用方法 |
| 1.4.3 影响脱脂的因素 |
| 1.5 多酶体系在制革过程中的协同作用理论基础及应用 |
| 1.5.1 皮层的构造 |
| 1.5.2 多酶体系在制革过程的应用 |
| 1.6 原料皮 |
| 1.6.1 猪皮 |
| 1.6.2 牛皮 |
| 1.6.3 羊皮 |
| 1.7 脱脂剂的发展前景 |
| 1.7.1 开发高活性易降解的表面活性剂 |
| 1.7.2 微乳液技术 |
| 1.7.3 超临界流体技术 |
| 1.7.4 开发新型高活性酶 |
| 1.7.5 提高复配增效技术 |
| 1.8 研究内容及意义 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 材料及药品 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.2 脱脂工艺 |
| 2.3 废水中总蛋白浓度和胶原蛋白浓度的测定 |
| 2.3.1 蛋白质标准曲线 |
| 2.3.2 羟脯氨酸标准曲线 |
| 2.3.3 总蛋白浓度吸光度测定 |
| 2.3.4 羟脯氨酸浓度吸光度测定 |
| 2.4 脱脂率测定 |
| 2.5 组织学观察 |
| 2.6 扫描电镜(SEM)观察 |
| 2.7 FITC标记脂肪酶 |
| 2.8 物理机械性能测定 |
| 2.9 收缩温度(Ts)测定 |
| 2.10 白度的测定 |
| 2.11 脱脂废水的BOD_5、COD_(Cr)、SS值测定 |
| 2.12 蛋白酶活力的测定 |
| 2.13 糖化酶活力的测定 |
| 2.14 脂肪酶活力的测定 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 蛋白质标准曲线与羟脯氨酸标准曲线的绘制 |
| 3.1.1 蛋白质标准曲线 |
| 3.1.2 羟脯氨酸标准曲线 |
| 3.2 复合酶配方的确定 |
| 3.2.1 碱性蛋白酶JRH用量的确定 |
| 3.2.2 糖化酶TH用量的确定 |
| 3.2.3 碱性脂肪酶JZ用量的确定 |
| 3.3 复合酶对皮组织结构的影响 |
| 3.4 复合酶的协同作用研究 |
| 3.4.1 脂肪酶JZ的渗透效果研究 |
| 3.4.2 协同脱脂效果研究 |
| 3.5 复合酶对猪皮物理机械性能的影响 |
| 3.6 复合酶对猪皮收缩温度的影响 |
| 3.7 复合酶对猪革染色效果的影响 |
| 3.8 复合酶对不同种类生皮脱脂效果比较 |
| 3.9 脱脂废水的环境影响评价 |
| 3.10 温度和pH对酶活性的影响 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文创新点 |
| 4.3 论文不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
四、对胶原纤维三色特殊染色过程的一点改进（论文参考文献）
- [1]海藻糖掺杂和巯基化合物接枝对胶原自组装及热稳定性的影响研究[D]. 谢吕琴. 武汉轻工大学, 2021(02)
- [2]天然交联剂对脱细胞猪角膜基质的交联及其性能的研究[D]. 李华. 山东大学, 2021(12)
- [3]金枪鱼鱼皮和鱼骨胶原多肽抗皮肤光老化活性及作用机制差异[D]. 黎重阳. 西南大学, 2021(01)
- [4]微结构丝素蛋白薄膜的仿生制备及其在肌腱修复中的应用[D]. 陆康. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]病变胶原蛋白的靶向成像[D]. 蔡向东. 兰州大学, 2021(09)
- [6]基于肿瘤微环境的PEG化丹酚酸B脂质体与PEG化多西他赛脂质体联合用药相互作用机制研究[D]. 陈云娜. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [7]氟化物对发育性髋关节发育不良发病易感性的影响及其作用机制的研究[D]. 周维政. 中国医科大学, 2021(02)
- [8]硫酸钠和5-氟尿嘧啶基于TGF-β信号通路对驴皮肤伤口愈合的影响[D]. 张媛. 石河子大学, 2020(05)
- [9]上睑提肌与衰老[D]. 杨慧华. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]酶制剂在生皮脱脂过程的应用及性能研究[D]. 李雅林. 天津科技大学, 2020(08)