一、鸭疫里默氏杆菌培养特性的研究（论文文献综述）
任晓梅[1]（2021）在《鸭疫里默氏杆菌生物素合成相关基因的鉴定及功能研究》文中研究指明鸭疫里默氏杆菌（Riemerella antipestifer）属黄杆菌科、黄杆菌属,革兰氏阴性菌,无鞭毛,不形成孢子。主要感染鸭、火鸡、鹅等,感染动物出现腹泻、嗜睡、呼吸道和神经症状,严重感染可引起鸭死亡,属于高致病性的禽病,对我国养鸭业造成了重大经济损失。截目前临床上大多采用各种抗生素预防和控制R.antipestifer感染,这就加速了耐药菌株的出现。一旦在鸭群中发生感染,这种细菌就会成为地方病,反复发生感染,根除变得困难。为了有效预防和控制R.antipestifer感染,近年来研究者们对R.antipestifer感染的分子机制进行了深入研究。已发现的毒力因子包括外膜蛋白、脂多糖、铁代谢、生物膜形成等。在之前研究中,我们通过随机转座子筛选到一株AS87＿RS05355基因突变株的致病性与野生株Yb2相比减弱了2,040,000倍,生物信息学分析预测AS87＿RS05355基因编码Bio B蛋白,命名突变株为Yb2Δbio B。本研究首先对Yb2Δbio B突变株生物学特性进行了鉴定,发现Yb2Δbio B不能在缺乏生物素的培养基中生长、生物素依赖酶的表达量降低、乙酰辅酶A含量降低,证明AS87＿RS05355基因与生物素合成相关;同时与野生株相比,突变株Yb2Δbio B细胞壁的渗透性发生改变,抵抗消毒剂的能力减弱,提示细胞壁脂质改变可能引起细胞对消毒剂的敏感性增加;对其差异代谢物测定发现,bio B基因缺失主要引起代谢物氨基酸改变。突变株Yb2Δbio B感染樱桃谷鸭后,血液载菌量在感染后12小时开始下降,24小时已检测不到菌,这与体外测定对血清的抵抗力减弱结果相一致,说明突变株Yb2Δbio B对宿主不能建立感染。以上结果表明,AS87＿RS05355基因缺失破坏细菌体内生物素的合成,进而引起氨基酸、脂质代谢的改变,引起毒力明显下降,说明AS87＿RS05355基因对于R.antipestifer建立全身感染至关重要。为了研究生物素在体内合成的调控机制,本研究鉴定出两个与生物素合成调控相关的基因AS87＿RS05840和AS87＿RS09325。AS87＿RS05840编码缺乏N端螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域的Bir A蛋白,通过序列比对分析发现,Bir A蛋白属于Ⅰ型生物素蛋白连接酶,只具有催化生物素连接至受体蛋白的功能,而不具有调控生物素合成的功能。通过体外酶学反应,证明Bir A能够催化生物素连接至受体蛋白Acc B;EMSA试验进一步证明Bir A不能与生物素合成操纵子结合,证明不能发挥转录抑制功能调控生物素体内合成。进一步探究发现,AS87＿RS09325基因编码螺旋-转角-螺旋转录因子（xenobiotic response element family,XRE）,命名为Bio X,EMSA试验证明Bio X能够与生物素合成操纵子结合,q PCR结果表明bio X基因能够调控生物素合成相关基因的表达。同时,我们的结果也表明缺失株Yb2Δbio X毒力减弱500倍。本研究定义了一种新的调节机制,XRE家族因子Bio X作为抑制因子调控生物素的合成。为了研究生物素合成受损的下游产物对毒力影响作用机制,我们从之前突变株Yb2Δbio F与野生株Yb2的转录组测序结果中发现了下调表达蛋白WP＿004917605,该蛋白由AS87＿RS06700基因编码,基因注释为酰基辅酶A硫酯酶。通过构建Yb2ΔAS87＿RS06700缺失株,对其毒力进行测定发现,缺失株较野生株没有明显毒力下降,说明生物素合成受损未通过AS87＿RS06700基因的下调表达从而影响毒力,关于AS87＿RS06700基因在体内的功能还有待进一步探究。
何晓花[2]（2021）在《鸭疫里默氏杆菌GL001858和GL001859基因缺失株的构建及其生物学特性分析》文中认为鸭疫里默氏杆菌感染,又称为鸭疫里默氏杆菌病。鸭、鹅、火鸡等多种禽类是主要的易感动物。因为该菌导致的高致病性、接触而大规模传染,使得鸭疫里默氏杆菌病变成了眼下危害养鸭业的一种主要疾病,世界各地养鸭产业也因该病的爆发蒙受了巨大的经济损失。1-8周龄的雏鸭最易感,发病率和死亡率高,一个鸭场一旦发生此病,难以彻底根除。据研究报道,本菌主要的常见血清型至少有21个,但互相之间的交叉保护性对于各血清型菌株基本上很少或者无明显出现。目前国内已有商业化的油乳剂灭活疫苗,为本病的防控起着重要的作用。但油乳剂灭活疫苗的成本高、接种雏鸭的应激反应较大,更重要的是,接种的樱桃谷鸭和北京鸭等肉鸭到上市日龄时体内还可能有油乳剂疫苗感染残留,存在食品安全上的风险,而接种弱毒疫苗就不存在上述缺点和风险。研制安全有效的弱毒活疫苗,尤其是基因缺失活疫苗,是未来此病疫苗的发展方向。本实验室前期构建了鸭疫里默氏杆菌血清1型WJ4株17个带不同标签的Tn4351转座子随机突变库,利用STM技术筛选获得了101株对雏鸭致病性降低的转座子插入突变株,其中GL001858基因插入突变株WJ4（Tn::GL001858）对雏鸭的致病性显着减低,用此突变株免疫雏鸭2周后,攻毒保护率达100%。Real-time PCR结果表明,其下游的GL001859基因的表达也受到影响。为了查明GL001858、GL001859基因在鸭疫里默氏杆菌WJ4致病过程中的作用,本研究分别构建了GL001858、GL001859基因缺失突变株,并评估这两个基因作为构建弱毒疫苗株缺失靶基因的可行性。先用PCR扩增GL001858基因左、右同源臂连入自杀质粒313,构建重组自杀质粒313-GL001858-LR,采用接合转导的方法,将重组自杀质粒313-GL001858-LR导入鸭疫里默氏杆菌WJ4中,通过抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定获得GL001858基因的缺失株WJ4ΔGL001858。然后用PCR扩增GL001858 ORF,基于E.coli-RA穿梭表达载体p RES2将扩增产物进行连入,再基于接合转导将互补质粒p RES2-GL001858送入缺失株WJ4ΔGL001858,经抗性筛选和PCR鉴定获得回复株c WJ4ΔGL001858。采用上述同样的方法构建获得了GL001859基因的缺失株WJ4ΔGL001859。生物学特性分析的结果表明,缺失株WJ4ΔGL001858和野生株WJ4在TSB中的生长曲线无显着性差异。Vero细胞的粘附和入侵结果表明缺失株WJ4ΔGL001858对Vero细胞的粘附和入侵能力与野生株相比,显着性降低;缺失株WJ4ΔGL001859对Vero细胞的粘附和入侵能力与野生株WJ4相比,也表现为显着性降低。蛋白酶水解试验结果表明,缺失株WJ4ΔGL001858的蛋白酶水解能力与野生株WJ4无明显差异。雏鸭的致病性实验结果表明,缺失株WJ4ΔGL001858和WJ4ΔGL001859对雏鸭的半数致死量均大于1010CFU,且缺失株WJ4ΔGL001858感染雏鸭后其血液中细菌载量显着低于野生株,缺失株WJ4ΔGL001858和WJ4ΔGL001859感染肝、脑组织中,细菌载量低于野生株,但无明显差异。以上结果表明GL001858基因和GL001859基因均与鸭疫里默氏杆菌的毒力相关。107、108、109、1010CFU缺失株WJ4ΔGL001858免疫雏鸭2周后的攻毒保护率为100%、100%、100%和83%;107、108、109、1010CFU缺失株WJ4ΔGL001859免疫雏鸭2周后的攻毒保护率为80%、44.4%、100%和100%。本研究对于鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗的研制,及该细菌分子致病机制的研究等具有重要意义。
牛朋飞[3]（2021）在《鸭疫里默氏杆菌Ⅸ型分泌系统效应分子MPPE的生物学特性分析及单克隆抗体制备》文中指出鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）主要感染雏鸭、雏鹅、雏火鸡等多种禽类,导致宿主产生急性或慢性、接触性、败血性传染病,该病主要的病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎等,感染鸭发病率高,死亡率高,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失,严重影响了家禽养殖业的健康发展。研究发现,细菌通过Ⅸ型分泌系统（T9SS）分泌的效应分子具有多种生物学功能,它们可以降解或分解宿主或环境中的营养物质,为自身生长繁殖提供营养,还可以直接对宿主产生致病作用。最近研究发现,鸭疫里默氏杆菌的基因组存在T9SS的组分基因,在本课题组的前期研究中,通过转座子随机突变筛选到了3株T9SS组份的突变株,发现它们的毒力都显着减弱。后续研究发现基因AS87＿RS08465、AS87＿08785分别编码Ⅸ型分泌系统核心组分蛋白Gld M、Gld K,它们均与RA的滑行运动、蛋白分泌、致病性相关。对野生株Yb2、突变株Yb2Δgld M和Yb2Δgld K的分泌蛋白进行质谱分析,结果发现,Yb2Δgld M和Yb2Δgld K的分泌蛋白中共有9个差异表达的T9SS效应分子,这些效应分子功能多样,大多都具有酶活性,可能参与细菌的各种生命过程,并与细菌的毒力相关,其中包括效应分子Metallophosphoesterase（MPPE）。在本研究中,我们构建了效应分子MPPE的突变株Yb2Δ00980并对其生物学特性进行了研究,在生长曲线测定中,我们发现突变株Yb2Δ00980与野生株Yb2和回复株c Yb2Δ00980在生长的各个时期均没有表现出显着的差异。但是在细菌的毒力实验中,突变株Yb2Δ00980的LD50为2.21×108CFU,野生Yb2的LD50为2.20×105CFU,即Yb2Δ00980的毒力较Yb2相比减弱超过1000倍,突变株Yb2Δ00980在感染雏鸭后的第6、12、24、36 h时,血液中的菌量均显着低于Yb2和c Yb2Δ00980,上述实验均表明效应分子MPPE与RA的毒力相关,我们还发现,在细菌黏附入侵细胞的实验中,Yb2Δ00980黏附和入侵细胞的能力均显着低于Yb2和c Yb2Δ00980,说明效应分子MPPE在RA黏附和入侵细胞过程中发挥重要作用。本研究构建了原核表达重组蛋白MPPE（r MPPE）并进行了酶活性测定,发现r MPPE具有磷酸酶活性,可以水解底物p-NPP;进一步研究发现野生株Yb2和回复株c Yb2Δ00980的分泌蛋白均具有磷酸酶活性,而突变株Yb2Δ00980仅有微弱的酶活性,验证了效应分子MPPE是金属磷酸酯酶。随后对r MPPE的酶活特性进行研究,r MPPE的最适p H为7.0,最适温度为60°C,其米氏常数为3.53 m M,最大反应速度为198.1 U/mg;r MPPE的酶活性会被Zn2+、Cu2+激活,但是会被Fe3+、Fe2+、EDTA抑制。生物信息学分析MPPE具有5个活性氨基酸,分别是第267位的天冬酰胺、第268位的组氨酸、第351位的组氨酸、第389位的组氨酸、第391位的组氨酸,通过原核表达5个活性氨基酸的点突变蛋白并以r MPPE作为对照进行酶活检测,结果显示突变蛋白Y267-r MPPE的酶活性为r MPPE的29.30%、突变蛋白Y268-r MPPE的酶活仅为r MPPE的19.81%,而突变蛋白Y351-r MPPE、Y389-r MPPE、Y391-r MPPE几乎完全失去了酶活性,说明第351位的组氨酸、第389位的组氨酸、第391位的组氨酸对r MPPE发挥酶活性是至关重要的。本研究成功制备6株MPPE的单克隆抗体。通过细胞融合,筛选得到了6株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为1、2、3、4、5、6号细胞株。对制备的单克隆抗体进行亚型鉴定,1、2、3、5号细胞株分泌的抗体重链类型Ig G1,6号细胞株分泌的抗体重链类型为Ig G2a,4号细胞株分泌的抗体重链类型为Ig G2b,1-6号细胞株分泌的抗体轻链类型均为κ;通过间接ELISA检测腹水单抗效价,6株腹水单抗效价均达到了1:204800;Western blotting鉴定单抗特异性良好,6株单抗不与其他禽源致病菌发生交叉反应。本研究成功研制出具有良好特异性的MPPE单克隆抗体,有助于RA致病机理的研究和快速诊断试剂盒的研制。
王燕萍[4]（2021）在《鸭疫里默氏杆菌RaeE-RaeF-RopN外排泵的鉴定及无痕敲除技术的建立》文中认为鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一种属于黄杆菌科、拟杆菌门和里默氏菌属的革兰氏阴性菌,主要侵害2周龄到8周龄的雏鸭,导致雏鸭的浆膜炎。目前养鸭业中常用抗生素防控RA感染,使得多重耐药菌株不断产生并播散,所以亟需对其耐药机制开展研究。至今为止,我们对鸭疫里默氏杆菌的致病机理和耐药机制知之甚少,很大一部分原因是因为缺少高效的遗传操作手段,因此开发新的高效的遗传操作技术也是当前研究的重点方向之一。迄今为止,国内外对于鸭疫里默氏杆菌的外排耐药系统知之甚少。我们根据RA-GD菌株的基因标注,得出在RA-GD菌株中的RIA1117-RIA1118-RIA1119操纵子编码一个假定的三组分RND外排系统,RIA1117、RIA1118和RIA1119基因分别编码外膜蛋白（OMP）、内部膜泵蛋白（泵转运蛋白）和膜周质蛋白（MFP）。在本次研究中,系统鉴定了RIA1117、RIA1118和RIA1119基因的生物学功能。抗生素敏感性试验表明,RIA1117、RIA1118和RIA1119基因的缺失均提高了菌株对阿米卡星、链霉素和SDS的敏感性;通过上述抗菌剂的诱导,使用q RT-PCR检测,RIA1117和RIA1118基因的转录水平显着上调,但是对于RIA1119基因的转录水平未观察到显着差异。CCCP抑制剂检测试验表明RIA1117、RIA1118和RIA1119蛋白利用质子驱动（PMF）介导阿米卡星、链霉素和SDS外排。链霉素累积测定试验证实RIA1117、RIA1118和RIA1119蛋白有助于外排链霉素,而CCCP增加了链霉素在菌体内的积累。此外,RIA1117、RIA1118和RIA1119蛋白也与RA-GD菌株的适应性和毒力有关。这些结果表明,RIA1117-RIA1118-RIA1119操纵子编码一个RND外排系统,该外排系统对链霉素、阿米卡星和SDS具有底物特异性,并与RA-GD的生长和毒力有关。RIA1117-RIA1118-RIA1119被命名为Rae E-Rae F-Rop N外排系统,基于以上结果和结构分析,RIA1117、RIA1118和RIA1119蛋白分别对应于Rop N（OMP）、Rae F（膜泵转运蛋白）和Rae E（MFP）。在本次研究中,利用Erm F基因作为正向标记和sac B基因作为反向标记进行RA-GD菌株中RIA1117基因的无痕敲除。通过构建携带RIA1117基因上下游同源臂和正反向标记基因的重组自杀质粒p RE112,利用结合转移和同源重组,进行染色体上的第一次敲除,用1μg/m L的红霉素作为选择压力筛选出RIA1117基因缺失突变株。然后通过构建携带RIA1117基因上下游同源臂的重组自杀质粒对基因缺失株进行第二次敲除,以13%（wt/vol）的蔗糖作为选择压力筛选把sac B-Erm F基因盒缺失掉的菌株。用两步重组法敲除靶标基因并且不留下任何标记,这种无痕敲除技术可以实现对RA-GD菌株基因组中多个靶标基因的连续敲除,为深入研究鸭疫里默氏杆菌的基因功能及其调控机制提供了技术平台。
秦明星[5]（2021）在《鸭疫里默氏杆菌RaeX-RaeY-RopM外排泵介导其对重金属离子产生耐受性的研究》文中认为鸭疫里默氏杆菌病是严重危害养禽业的重要细菌病之一,主要感染鸭、鹅、火鸡等禽类。鸭疫里默氏杆菌现已确定有21个血清型,在中国主要流行的血清型为1型,2型和10型,不同的血清型之间缺乏有效的交叉保护,给疫苗的有效预防增加了困难。目前对于该病主要通过抗菌素来进行治疗,但随着抗菌素的广泛使用,出现了多重耐药鸭疫里默氏杆菌菌株的流行,大大降低了抗菌素的治疗效果。因此,解析鸭疫里默氏杆菌的耐药机制,在分子水平上遏制细菌耐药,对促进养禽业的健康发展具有重要的理论和实践意义。耐药结节化分化超家族（resistance-nodulation-cell division,RND）的多重药物转运蛋白是引起革兰氏阴性菌多重药物最主要的原因之一,同时也存在于一些革兰氏阳性菌中。一般以三重外排复合体横跨细胞膜,直接将进入细胞内的抗菌药物排出,从而使细菌具有非常广泛的抗菌谱。本论文以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01基因组为研究对象,构建基因缺失株LZ01?1445和LZ01?1450和回复株LZ01::c?1445和LZ01::c?1450以及外源表达菌C43-p ET32a::1445-1450-1455,系统鉴定了鸭疫里默氏杆菌GE296＿RS01445-GE296＿RS01450-GE296＿RS01455外排泵在菌株生长、抗菌素耐药和重金属离子耐受性三个方面的功能。首先以红霉素抗性标记为正向筛选,通过融合PCR方法构建打靶片段,将其与自杀质粒p RE112连接,转化至大肠埃希菌X7213构建供体菌,随后将供体菌和野生株RA-LZ01共培养,然后利用结合转移和同源重组的方法构建基因缺失株（LZ01?1445和LZ01?1450）;利用大肠埃希菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭质粒p CPRA,将GE296＿RS01445和GE296＿RS01450基因重新导入缺失株中,构建回复株（LZ01::c?1445和LZ01::c?1450）;之后将三组分GE296＿RS01445-GE296＿RS01450-GE296＿RS01455插入质粒p ET32a中,并将重组质粒转化进大肠埃希菌C43中,构建外源表达菌C43-p ET32a::1445-1450-1455。通过测定12h内OD600的值绘制野生株和缺失株的生长曲线动态图,微量肉汤稀释法测定野生株和缺失株的抗菌素最小抑菌量（MIC）,点板试验测定野生株、缺失株、回复株以及表达菌对重金属离子的耐受程度。结果表明敲除GE296＿RS01445和GE296＿RS01450基因后,与野生株相比,缺失株的生长情况并未发生显着的变化,缺失株对11类抗菌素的MIC值也未发生明显变化;但与野生株和回复株相比,在重金属离子压力下,缺失株的生长能力明显降低;与大肠埃希菌C43和C43-p ET32a相比,C43-p ET32a::1445-1450-1455生长情况更好。上述研究结果表明,鸭疫里默氏杆菌基因座GE296＿RS01445-GE296＿RS01450-GE296＿RS01455与该菌生长及抗菌素外排无明显相关性,在金属镍离子、钴离子和锰离子外排方面发挥重要作用。将GE296＿RS01445-GE296＿RS01450-GE296＿RS01455外排泵命名为Rae X-Rae Y-Rop M,其中GE296＿RS01445、GE296＿RS01450和GE296＿RS01455分别对应于外排泵Rae X、外膜蛋白Rop M和周质蛋白Rae Y。本研究为鸭疫里默氏杆菌外排重金属机制的研究奠定了基础。
赵晓锦[6]（2021）在《鸭浆膜炎致病菌的分离鉴定及疫苗效果评估》文中研究指明疫病防控是畜牧生产中非常重要的一环,浆膜炎症作为困扰鸭养殖的一种疾病,亟待解决。本研究对临床收集的浆膜炎症病例进行细菌分离、病原血清型的分型鉴定和分析,对养殖过程中选择针对性的疫苗具有重要意义。此外,本研究分析了三种市售疫苗的效果,收集养殖户对疫苗效果的反馈,以期能够指导江苏徐州地区对传染性浆膜炎和大肠杆菌病的防控,提高鸭养殖经济效益。2019年度从徐州地区收集到疑似浆膜炎病例32份,经过细菌分离鉴定,明确鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌是引起浆膜炎的主因,徐州地区鸭疫里默氏杆菌的主要流行株为Ⅱ型和Ⅰ型,分离到的19种大肠杆菌血清型均不相同。此外,本研究分别选择不同血清型菌株进行毒力试验,结果显示,鸭疫里默氏杆菌Ⅰ型L-9株和大肠杆菌O1型D-17株毒力较强,选为疫苗试验攻毒菌株,通过试验确定两种菌株的最小完全致死剂量。值得注意的是,通过研究浆膜炎细菌对鸭生产性能的影响发现,低浓度的大肠杆菌和鸭疫里默式杆菌虽不能直接引起试验鸭死亡,但感染后鸭的体重显着下降（P<0.05）,料肉比提高。试验选择二种市售浆膜炎大肠杆菌二联传统疫苗A和B,一种黏膜免疫疫苗C,对疫苗进行常规质量检测、效力检验、免疫次数与免疫持续期检验对比,确定最佳免疫程序,研究免疫程序对鸭生产性能的影响,然后再进行临床试验。结果发现,A、B、C常规质量检测均合格;A对鸭疫里默氏杆菌I型L-9菌株免疫效果最好,达到完全保护,C对大肠杆菌O1型D-17菌株免疫效果最好,但仅达到40%保护;单次免疫疫苗两周后保护率均降低;两次免疫A、B对L-9保护率达到完全保护,两次免疫C对D-17保护率为50%。攻毒前后注射A+C、B+C的两组与对照组的平均体重差异均不显着（P>0.05）,表明免疫疫苗不影响鸭的体重增长。将疫苗使用方法推荐给养殖户供其选择,并收集养户反馈数据,结果显示,紧急免疫B均无效,紧急免疫A27.27%效果不明显。预防接种单独免疫A仅1户未发病,单独免疫B和单独免疫C 一次,免疫后有不同程度发病。1户免疫两次疫苗B并日常配合疫苗C使用,鸭子生长一切正常,未发病且无损失。基于本试验条件下,紧急免疫需选择对应血清型的疫苗才能保证较好效果;常规免疫情况下,建议徐州地区养殖户把大肠杆菌和鸭疫里默式杆菌分开免疫,鸭疫里默式杆菌疫苗选择含有Ⅰ型和Ⅱ型鸭疫里默式杆菌的疫苗;大肠杆菌血清型众多,无针对性疫苗,建议使用粘膜免疫疫苗C。
万明[7]（2020）在《一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药基因簇解析》文中提出鸭疫里默氏杆菌病又叫鸭传染性浆膜炎,是由鸭疫里默氏杆菌引起的水禽的一种接触性急性败血性传染病。1～8周龄的雏鸭易感,死亡率极高,成年鸭一般不感染此病。鸭疫里默氏杆菌的传播途径较多,可以通过饮水、垫料等传播,携带病原菌的成年鸭也成为该病的重要传播者。随着养鸭业的不断发展,对鸭疫里默氏杆菌病的防治工作越来越重视,疫苗、药物都是防控本病的重要方法,但是由于鸭疫里默氏杆菌的血清型众多,且各个血清型之间没有交叉保护,疫苗防控本病具有一定的局限性,所以药物是防控本病的主要方式。但随之也带来严重的耐药问题,不仅对养鸭业产生影响,也对人类公共健康带来潜在威胁。本研究从河北省、湖北省和浙江省部分种鸭场采集300余份血液和心、肝、脑等组织样品,分离鸭疫里默氏杆菌,进行生化鉴定及PCR鉴定、耐药性检测,同时对分离到的菌株进行平板计数,设计动物试验测定半数致死量,最后根据半数致死量的菌液浓度开展动物回归试验。对试验动物的肝脏、脾脏、脑、法氏囊组织HE染色观察病理学变化并测定血清转氨酶活性;利用测序技术对获得的菌株进行基因组测序并对测序结果进行生物信息学分析,筛选耐药基因、探讨其可能的耐药机制。试验结果显示,经分离鉴定成功获得1株鸭疫里默氏杆菌,命名为RBT-1株。测定其半数致死量是9.759×1010CFU/m L;攻毒后分别于1dpi（Day Post Infection,dpi）、3dpi、5dpi、7dpi采样检测发现,感染组雏鸭的肝、脾、法氏囊和脑等组织均有不同程度的损伤,肝细胞局部坏死、少量炎性细胞浸润,脾脏出血,法氏囊腔内上皮细胞变形脱落,而对照组雏鸭无明显组织病变;且从感染组雏鸭的脑组织中分离到鸭疫里默氏杆菌。耐药性分析结果显示,鸭疫里默氏杆菌分离株RBT-1对氨苄西林、链霉素、多粘菌素B和复方新诺明耐药,对头孢哌酮、阿米卡星、新霉素、多西环素、诺氟沙星、环丙氟哌酸高度敏感。全基因组测序结果显示,RBT-1株含有ATP结合盒（ABC）抗生素外排泵、介导抗生素耐药的fus E家族、ABC-F ATP结合盒核糖体保护蛋白、耐抗生素异亮氨酸-t RNA合成酶（ile S）、Lpx基因、抗氨基水杨酸胸苷合酶、介导磺胺耐药的fol P基因、介导抗生素外排系统的MFS家族和介导喹诺酮类耐药的gyr B基因。综上所述,本研究通过分离鉴定获得一株鸭疫里默氏杆菌RBT-1,经动物回归试验证明该菌株具有致病性;耐药性和全基因组测序分析发现,其携带的抗性基因与耐药性有一定关系,但其耐药现象较严重,提示河北省、湖北省和浙江省等地区鸭场在临床用药上存在不合理用药现象。本研究结果有望为这些地区防控鸭疫里默氏杆菌病提供技术指导。
邢娟娟[8]（2020）在《基于CRISPR序列分型的鸭疫里默氏杆菌疫苗菌株筛选方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）属接触类传染性疾病,感染多数禽类,发病后造成纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎等症状。侵害1-8周龄鸭,对养鸭业造成极大威胁。本研究旨在建立一种高效疫苗菌株筛选方法,和传统疫苗菌株筛选方法相比大幅度降低了工作量和成本,为疫苗研制工作提供有力的技术手段。具有强致病力的菌株通常免疫保护效果较好,在某种细菌研究背景知识模糊,毒力因子尚不明确时,疫苗菌株的筛选方法通常的是,依次对各个分离株进行毒力的测定,常用不同剂量的细菌感染动物,通过测定最小致死量（MLD）或半数致死量(LD50),还可以用最小感染量（MID）或半数感染量(EID50)来评价。这些方法都需要将临床分离的细菌一一测定,工作量较大,比较费时费力,限制了对比菌株的数量。因此建立一种高效疫苗菌株筛选方法对疫苗研制工作有举足轻重的影响。本研究方法以鸭疫里默氏杆菌为例,以某集团实验室保存的若干RA菌株为样本,利用鸭疫里默氏杆菌的CRISPR序列作为识别标签,设计引物RAC2-F/RAC2-R并能够成功扩增不同血清型RA的CRISPR序列,效率达94.74%;在此基础上建立了混合菌株感染的攻毒模型;为确定优势菌种突破鸭血脑屏障的最快速时间,混合感染后梯度设置从鸭脑部分离RA时间,分别为3h、6h、9h、12h,综合评价平板上分离RA效率和RA生长情况,攻毒后分离RA的时间确定为6h;利用3个不同血清型的4个RA菌株进行预试验,筛选优势菌种效率达100%。随后以1型RA菌株为例,进行了A-D 4组平行试验,各组最优势菌种为FJ-HJH、FJ-LYP、GD-DCR、R9,最优势菌种在各组分离RA的占比分别为83.3%、75%、100%、77.8%,筛选效率理想。为探究筛选出的优势菌种与毒力间是否存在对应关系,分别对四组最优势菌种进行LD50测定,FJ-HJH、FJ-LYP、GD-DCR、R9的LD50值分别为3.40×105、1.15×106、1.91×104、1.43×105 CFU/只;并将四株最优势菌种再次混合感染鸭,结果显示分离RA菌株序列与GD-DCR序列一致性达77.8%,与R9一致的序列占比11.1%,与FY-HJH一致的序列占比11.1%。筛选效率与菌株毒力呈现对应关系,可得出结论,优势菌株毒力较强;为探究菌株毒力与耐药性间关系,选取优势菌种与组内随机挑选出的其他菌种进行药敏试验,结果显示并无显着差异,从本研究结果显示毒力强弱与耐药性间可能无关联。综上所述,本研究成功建立起基于CRISPR序列分型的鸭疫里默氏杆菌疫苗菌株筛选方法,筛选效率较理想,为高效筛选疫苗菌株提供有力的技术手段;本试验所筛选的优势菌株可应用到鸭疫里默氏杆菌疫苗研发制备工作中;验证了优势菌种为强毒力菌株,在鸭的免疫反应中,优先突破血脑屏障;并且探究了菌株毒力与耐药性之间的联系。
韩文龙[9]（2020）在《鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及其免疫胶体金检测试纸条研制》文中研究说明鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）是一种重要的细菌性致病菌,可引起雏鸭感染发病或死亡。已报道的鸭疫里默氏杆菌血清型有21种,其中血清1、2、10型是国内优势血清型。外膜蛋白A（OmpA）是鸭疫里默氏杆菌的重要免疫原性蛋白,在不同血清型中保守性良好。为制备鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金检测试纸条,本研究选用OmpA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合后,用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,经腹腔注射BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过单克隆抗体效价及稳定性测定,秋水仙素法进行杂交瘤细胞的染色体分析以及Western blot法鉴定单克隆抗体特异性,共获得3株稳定分泌抗鸭疫里默氏杆菌OmpA的单克隆抗体,分别命名为2D5、2A6、4H8。3株单克隆抗体亚型均鉴定为IgG2a,腹水效价均测定为1:2048000;3株单克隆抗体均与鸭疫里默氏杆菌血清1型RA-CH3株、血清2型RA-NJ3株和血清10型RA-HXb2株发生特异性反应,与大肠杆菌、沙门菌和多杀性巴氏杆菌等其他禽致病菌不发生交叉反应,表明本研究制备的3株单克隆抗体具有良好的抗体效价和特异性,可用于鸭疫里默氏杆菌免疫胶体金检测试纸条的研制。对上述3株单克隆抗体进行的筛选实验,选择单克隆抗体2D5和2A6用作胶体金试纸条的金标抗体和捕获抗体（检测线）,将山羊抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜（NC膜）作为控制线,建立了一种用于快速检测鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金检测试纸条,可检测菌液培养物和感染鸭心脏中的鸭疫里默氏杆菌。金标抗体2D5的最佳标记pH是10.0,最佳蛋白标记量是18μg/mL。该试纸条特异性强,可用于鸭疫里默氏杆菌的检测,与大肠杆菌、沙门菌和多杀性巴氏杆菌均不出现交叉反应;灵敏度高,检测限度为1.0×106 CFU;性状稳定,4℃条件下能保持稳定至少8个月;反应时间短,15 min内完成反应。对临床样品的检测结果表明该试纸条对感染鸭心脏组织样品的检出率高于组织样品的细菌分离鉴定。综上所述,本研究成功研制了鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体和免疫胶体金检测试纸条;研制的试纸条可用于细菌培养物中鸭疫里默氏杆菌的检测和鸭疫里默氏杆菌感染病鸭的临床快速诊断。
刘玲俐[10]（2020）在《鸭疫里默氏杆菌利福平耐药株RA-WH9基因组及其质粒分析》文中研究说明鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestife,RA）是一种可引起鸭、鹅、鸡、火鸡等禽类急性或慢性败血症的黄杆菌科革兰氏阴性菌。该菌对水禽的感染在世界范围内均有报道,并由于其可造成家禽较高死亡率、低饲料转化率从而给家鸭养殖业造成严重的经济损失,由于RA血清型众多,彼此之间无交叉保护,因此,现阶段抗生素仍是防控RA的主要手段。利福平是对细菌性病原体最有效的广谱抗生素之一,目前主要用于治疗结核、麻风、结核性脑膜炎等疾病,此外也被用于许多兽医临床药物组方中。本研究从患病家鸭组织器官中分离纯化出一株鸭疫里默氏杆菌（命名为RA-WH9）,K-B药敏纸片法结果表明,该分离株对头孢唑肟、氯霉素、氟苯尼考、多西环素、红霉素和林可霉素敏感,对恩诺沙星、大观霉素和四环素中度敏感,对链霉素、多粘菌素B、氨苄西林、新霉素、青霉素、诺氟沙星以及利福平耐药,微量肉汤稀释法结果显示,该分离株对利福平最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）为50μg/mL。利用细菌基因组三代测序技术和生物信息学平台,我们构建并分析了RA-WH9基因组完成图,分析结果表明:RA-WH9染色体总长度为2488018 bp,GC含量34.58%,编码2563个基因,其中包含88个耐药基因,其耐药基因型与耐药表型一致。除此之外,RA-WH9携带一个全长10736bp的质粒（命名为pRA-59）,其质粒复制子属于Inc类型,与鸭疫里默氏杆菌现有报道的质粒pJX、pCFC1、pCFC2骨架结构相似,编码13个基因,其中包括3个拷贝的ISRa1转座酶。细菌接合转导实验证实,p RA-59可使同种属鸭疫里默氏杆菌CH3、Yb2、HXb2等菌株对利福平的MIC增大60倍,也可显着提高不同种属DH5α、BL21等菌株对利福平的MIC。由于无法从结合子中提取出pRA-59质粒,我们选取鸭疫里默氏杆菌CH3-59（p RA-59质粒电转至CH3所得到的结合子）进行细菌全基因组测序,测序结果表明,与母本CH3相比,CH3-59基因组中编码TonB依赖性受体基因（M9491173）被pRA-59的ISRa1转座酶及其上游启动子打断。因此,我们猜想p RA-59介导耐药机制可能为借助上游启动子,插入宿主菌染色体,导致宿主菌rpoB基因发生突变,从而引起宿主菌利福平药敏性发生改变。
二、鸭疫里默氏杆菌培养特性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸭疫里默氏杆菌培养特性的研究（论文提纲范文）
（1）鸭疫里默氏杆菌生物素合成相关基因的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 鸭疫里默氏杆菌病 |
| 1.1.2 鸭疫里默氏杆菌病原学及分类 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.4 耐药性形成及机制 |
| 1.1.5 防治策略 |
| 1.2 生物素 |
| 1.2.1 生物素的合成 |
| 1.2.2 蛋白的生物素化 |
| 1.2.3 生物素合成的调控 |
| 1.3 硫酯酶 |
| 1.3.1 硫酯酶的分类 |
| 1.3.2 硫酯酶功能 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 鸭疫里默氏杆菌bioB基因对细菌毒力影响的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、细胞和培养条件 |
| 2.1.2 主要仪器设备及试剂 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 抗生素及使用浓度 |
| 2.1.6 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 互补株的构建 |
| 2.2.1.1 S17 感受态的制备 |
| 2.2.1.2 互补质粒的构建 |
| 2.2.1.3 接合转导构建回复株 |
| 2.2.2 原核重组质粒的构建 |
| 2.2.3 蛋白表达纯化 |
| 2.2.4 兔多抗的制备 |
| 2.2.5 生长曲线的测定 |
| 2.2.6 生物素化蛋白表达量的测定 |
| 2.2.7 乙酰辅酶A含量测定 |
| 2.2.8 细胞壁通透性测定 |
| 2.2.9 抵抗力测定 |
| 2.2.10 黏附入侵能力测定 |
| 2.2.11 血液载菌量测定 |
| 2.2.12 非靶向代谢组学 |
| 2.2.13 数据统计与分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 互补株cYb2ΔbioB的构建 |
| 2.3.2 表达质粒的构建 |
| 2.3.3 蛋白表达纯化 |
| 2.3.4 bio B基因与生物素合成相关 |
| 2.3.5 Yb2ΔbioB细胞壁渗透性改变 |
| 2.3.6 Yb2ΔbioB抵抗力改变 |
| 2.3.7 Yb2ΔbioB黏附入侵能力增强 |
| 2.3.8 Yb2ΔbioB致病力降低 |
| 2.3.9 Yb2ΔbioB导致氨基酸代谢的改变 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 转录因子Bio X对鸭疫里默氏杆菌生物素合成的调控 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒、细胞和培养条件 |
| 3.1.2 主要仪器设备及试剂 |
| 3.1.3 主要试剂及耗材 |
| 3.1.4 抗生素及使用浓度 |
| 3.1.5 主要试剂的配制 |
| 3.1.6 引物设计 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原核质粒的构建 |
| 3.2.2 蛋白表达纯化 |
| 3.2.3 质谱鉴定 |
| 3.2.4 BirA蛋白连接酶功能 |
| 3.2.5 凝胶阻滞试验（EMSA） |
| 3.2.6 基因的共转录分析 |
| 3.2.7 5’RACE(rapid amplification of c DNA ends,RACE) |
| 3.2.8 Yb2Δbio X缺失株、c Yb2Δbio X互补株的构建 |
| 3.2.9 RNA的提取，RT-PCR及qRT-RCR分析 |
| 3.2.10 生长曲线测定 |
| 3.2.11 血液载菌量的测定 |
| 3.2.12 致病力的测定 |
| 3.2.13 数据统计与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BirA蛋白的鉴定 |
| 3.3.2 BirA蛋白催化生物素连接至生物素蛋白 |
| 3.3.3 生物素合成操纵子的研究 |
| 3.3.4 bio F、bio B基因转录起始位点的确定 |
| 3.3.5 BirA蛋白不具有调控生物素合成的功能 |
| 3.3.6 bioX基因与生物素合成启动子结合 |
| 3.3.7 bioX基因作为抑制子调控生物素相关基因合成 |
| 3.3.8 BioX蛋白调控抑制生物素合成与生物素有关 |
| 3.3.9 缺失株、回复株构建结果 |
| 3.3.10 Yb2Δbio X缺失株致病力减弱 |
| 3.3.11 Yb2Δbio X缺失株不影响细菌生长 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 硫酯酶 AS87_RS06700 基因缺失株生物学特性分析 及鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒、细胞和培养条件 |
| 4.1.2 主要仪器设备及试剂 |
| 4.1.3 抗生素及使用浓度 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.1.5 引物设计 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 缺失株、回复株的构建 |
| 4.2.2 生长曲线的测定 |
| 4.2.3 质粒的构建 |
| 4.2.4 蛋白表达纯化 |
| 4.2.5 酶活测定 |
| 4.2.6 疏水性测定 |
| 4.2.7 抵抗力测定 |
| 4.2.8 黏附入侵 |
| 4.2.9 致病性测定 |
| 4.2.9.1 LD_(50)测定 |
| 4.2.9.2 血液载菌量测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 原核表达质粒的构建 |
| 4.3.2 菌株构建结果 |
| 4.3.3 蛋白表达纯化 |
| 4.3.4 酶活测定 |
| 4.3.5 Yb2ΔAS87_RS06700 突变株黏附入侵能力减弱 |
| 4.3.6 Yb2ΔAS87_RS06700 突变株对去污剂、消毒剂的抵抗力减弱 |
| 4.3.7 Yb2ΔAS87_RS06700 突变株疏水性增强 |
| 4.3.8 Yb2ΔAS87_RS06700 突变株生长速度变快 |
| 4.3.9 Yb2ΔAS87_RS06700 致病性无明显减弱 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）鸭疫里默氏杆菌GL001858和GL001859基因缺失株的构建及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 流行特点 |
| 1.1.3 国内分离株的血清型 |
| 1.1.4 防治及临床诊断方法 |
| 1.1.5 相关毒力因子 |
| 1.2 当前鸭疫里默氏杆菌病疫苗研究进展 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒活疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 基因工程疫苗 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 鸭疫里默氏杆菌GL001858基因缺失株的构建及其生物学特性研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株及其培养方法 |
| 2.1.2 主要载体与工具酶 |
| 2.1.3 主要培养基及试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌株的复壮 |
| 2.2.2 氯化钙法感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 鸭疫里默氏杆菌基因组的提取 |
| 2.2.4 GL001858基因缺失株的构建 |
| 2.2.5 WJ4ΔGL001858缺失株回复株的构建 |
| 2.2.6 WJ4株GL001858基因突变株的生物学特性研究 |
| 2.2.7 YL4强毒攻毒保护实验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 WJ4株GL001858基因缺失株的构建 |
| 2.3.2 缺失株WJ4ΔGL001858回复株的构建 |
| 2.3.3 WJ4株GL001858基因突变株生物学特性的研究 |
| 2.3.4 强毒攻毒保护实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 鸭疫里默氏杆菌GL001859基因缺失株的构建及其生物学特性研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株及其培养方法 |
| 3.1.2 主要载体与工具酶 |
| 3.1.3 主要培养基及试剂的配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 菌株的复壮 |
| 3.2.2 氯化钙法感受态细胞的制备 |
| 3.2.3 鸭疫里默氏杆菌基因组的提取 |
| 3.2.4 GL001859基因缺失株的构建 |
| 3.2.5 WJ4株GL001859基因突变株生物学特性的研究 |
| 3.2.6 强毒攻毒保护实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 WJ4株GL001859基因缺失株的构建 |
| 3.3.2 WJ4株GL001859基因突变株生物学特性的研究 |
| 3.3.3 强毒攻毒保护实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）鸭疫里默氏杆菌Ⅸ型分泌系统效应分子MPPE的生物学特性分析及单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌概述 |
| 1.1.1 病原形态及特性 |
| 1.1.2 鸭疫里默氏杆菌病 |
| 1.1.3 流行病学及临床症状 |
| 1.2 Ⅸ型分泌系统及效应分子 |
| 1.2.1 细菌的分泌系统 |
| 1.2.2 Ⅸ型分泌系统的发现 |
| 1.2.3 T9SS的结构组成 |
| 1.2.4 T9SS的效应分子 |
| 1.3 鸭疫里默氏杆菌T9SS研究进展 |
| 1.4 磷酸酶概述 |
| 1.4.1 磷酸酶的分类 |
| 1.4.2 金属依赖型蛋白磷酸酶家族 |
| 1.5 单克隆抗体概述 |
| 1.5.1 单克隆抗体的出现 |
| 1.5.2 单克隆抗体的发展 |
| 1.5.3 单克隆抗体的应用 |
| 第二章 鸭疫里默氏杆菌突变株Yb2Δ00980 的生物学特性研究 |
| 2.1 目的及意义 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株、质粒、细胞系 |
| 2.2.2 细菌及细胞培养条件 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 实验试剂及耗材 |
| 2.2.5 试剂盒 |
| 2.2.6 引物设计 |
| 2.2.7 实验动物 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 突变株的构建 |
| 2.3.2 回复株的构建 |
| 2.3.3 突变株和回复株的多重PCR鉴定 |
| 2.3.4 效应分子的表达鉴定及亚细胞定位 |
| 2.3.5 生长曲线的测定 |
| 2.3.6 致病能力测定 |
| 2.3.7 黏附入侵能力测定 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 突变株的构建 |
| 2.4.2 回复株的构建及鉴定 |
| 2.4.3 效应分子的表达鉴定及亚细胞定位 |
| 2.4.4 细菌生长曲线的测定 |
| 2.4.5 效应分子 AS87_RS00980 与 RA 的致病性相关 |
| 2.4.6 黏附入侵能力测定 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 效应分子AS87_RS00980 的磷酸酶活性分析 |
| 3.1 目的及意义 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 效应分子AS87_RS00980 的生物信息学分析 |
| 3.3.2 重组蛋白AS87_RS00980 的原核表达与纯化 |
| 3.3.3 重组蛋白AS87_RS00980 及分泌蛋白的酶活测定 |
| 3.3.4 pH和温度对rAS87_RS00980 活性的影响 |
| 3.3.5 rAS87_RS00980 的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)的测定 |
| 3.3.6 金属离子及EDTA对 rAS87_RS00980 活性的影响 |
| 3.3.8 点突变蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.9 点突变蛋白的酶活性测定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 生物信息学分析 |
| 3.4.2 rAS87_RS00980 蛋白表达菌株的构建 |
| 3.4.3 rAS87_RS00980 蛋白的表达及纯化 |
| 3.4.4 rAS87_RS00980 及分泌蛋白的酶活测定 |
| 3.4.5 测定rMPPE的最适pH和最适温度 |
| 3.4.6 米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)的测定 |
| 3.4.7 金属离子及EDTA对 rMPPE活性的影响 |
| 3.4.8 点突变蛋白的表达及纯化 |
| 3.4.9 点突变蛋白的酶活性测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 效应分子MPPE的单克隆抗体制备 |
| 4.1 目的及意义 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株、质粒、细胞及实验动物 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 试剂及耗材 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 p-MPPE蛋白的表达及纯化 |
| 4.3.2 免疫小鼠 |
| 4.3.3 检测小鼠血清效价 |
| 4.3.4 抗原最佳包被量测定 |
| 4.3.5 细胞融合 |
| 4.3.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 4.3.8 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 4.3.9 腹水制备及效价检测 |
| 4.3.10 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 p-MPPE蛋白的表达及纯化 |
| 4.4.2 检测免疫小鼠的血清效价 |
| 4.4.3 抗原最佳包被量测定 |
| 4.4.4 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 |
| 4.4.5 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 4.4.6 腹水的单克隆抗体效价检测 |
| 4.4.7 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）鸭疫里默氏杆菌RaeE-RaeF-RopN外排泵的鉴定及无痕敲除技术的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌概述 |
| 1.1.1 病原特性 |
| 1.1.2 血清学特性 |
| 1.1.3 生化特性 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌的流行病学概况 |
| 1.3 鸭疫里默氏杆菌病的诊断技术 |
| 1.4 鸭疫里默氏杆菌病的防治 |
| 1.4.1 饲养环境的改善 |
| 1.4.2 药物防治 |
| 1.4.3 疫苗防控 |
| 1.5 鸭疫里默氏杆菌的耐药性研究 |
| 1.5.1 鸭疫里默氏杆菌的耐药机制 |
| 1.5.2 RND外排系统的研究现状 |
| 1.5.3 鸭疫里默氏杆菌RA-GD的RND外排系统的研究现状 |
| 1.6 鸭疫里默氏杆菌基因敲除技术的研究 |
| 1.6.1 革兰氏阴性菌基因无痕敲除技术的研究 |
| 1.6.2 鸭疫里默氏杆菌无痕敲除技术 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第二章 RIA_1117、RIA_1118和RIA_1119基因缺失株和回补株的构建 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 设备和仪器 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌X7213感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 重组自杀质粒的构建 |
| 2.2.4 RIA_1117、RIA_1118和RIA_1119基因缺失菌株的构建 |
| 2.2.5 大肠杆菌X7213 电转感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 重组回补穿梭质粒的构建 |
| 2.2.7 RIA_1117、RIA_1118和RIA_1119基因回补菌株的构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 成功构建了RIA_1117、RIA_1118和RIA_1119基因缺失菌株 |
| 2.3.2 成功构建了RIA_1117、RIA_1118 以及RIA_1119基因回补菌株 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 RaeE-RaeF-RopN外排泵的鉴定 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 菌株与试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂材料 |
| 3.1.3 溶液的配制 |
| 3.1.4 设备和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 最小抑菌浓度的测定 |
| 3.2.3 生长曲线的测定和体外竞争试验 |
| 3.2.4 实时定量PCR测定 |
| 3.2.5 CCCP抑制剂测定 |
| 3.2.6 斑点测定法 |
| 3.2.7 链霉素累积试验 |
| 3.2.8 致病性试验 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RIA_1117-RIA_1118-RIA_1119操纵子降低RA-GD对链霉素、阿米卡星和SDS的敏感性 |
| 3.3.2 RA-GDΔRIA_1117、RA-GDΔRIA_1118和RA-GDΔRIA_1119菌株生长速率下降 |
| 3.3.3 链霉素、阿米卡星和SDS对RIA_1117和RIA_1118基因转录的上调作用 |
| 3.3.4 CCCP对RIA_1117-RIA_1118-RIA_1119操纵子活性的抑制作用 |
| 3.3.5 RIA_1117-RIA_1118-RIA_1119操纵子提高了菌株对链霉素的耐受性 |
| 3.3.6 RIA_1117-RIA_1118-RIA_1119操纵子减少了链霉素在菌体的累积 |
| 3.3.7 致病性试验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 鸭疫里默氏杆菌无痕敲除技术的建立 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 设备和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 构建携带正反向标记基因的重组自杀质粒 |
| 4.2.3 构建携带正反向标记基因的RIA_1117基因缺失菌株 |
| 4.2.4 评估不同浓度的蔗糖对菌株的细胞毒性 |
| 4.2.5 构建用于二次敲除的重组自杀质粒 |
| 4.2.6 构建RIA_1117基因的无痕缺失菌株 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 构建了携带正反向标记基因的重组自杀质粒 |
| 4.3.2 构建了携带正反向标记基因的RIA_1117基因缺失菌株 |
| 4.3.3 不同浓度的蔗糖对菌株的细胞毒性 |
| 4.3.4 用于二次敲除的重组自杀质粒的构建 |
| 4.3.5 构建了RIA_1117基因的无痕缺失菌株 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）鸭疫里默氏杆菌RaeX-RaeY-RopM外排泵介导其对重金属离子产生耐受性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌研究进展 |
| 1.1.0 鸭疫里默氏杆菌病研究现状 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学及临床症状 |
| 1.1.3 诊断与防治 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌耐药性研究 |
| 1.3 RND外排泵 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 基因缺失株LZ01Δ1445、LZ01Δ1450 的构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基及试剂 |
| 2.1.3 试验设备 |
| 2.1.4 培养基及抗菌素的配置 |
| 2.1.5 制备化学感受态X7213 |
| 2.2 .LZ01Δ1445、LZ01Δ1450 菌株的构建 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 erm F抗性基因的扩增 |
| 2.2.3 GE296_RS01445、GE296_RS01450 基因上下游同源臂的扩增 |
| 2.2.4 打靶片段的构建 |
| 2.2.5 供体菌X7213-p RE112-1445、X7213-p RE112-1450 的构建 |
| 2.2.6 基因缺失株LZ01Δ1445、LZ01Δ1450 的构建 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 外源表达菌C43-p ET32a::1445-1450-1455 的构建 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、培养基及试剂 |
| 3.1.2 试验设备 |
| 3.2 引物设计 |
| 3.3 GE296_RS01445- GE296_RS01450-GE296_RS01455 基因扩增 |
| 3.4 C43-pET32a::1445-1450-1455 菌株的构建 |
| 3.5 试验结果 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 基因回复株LZ01::cΔ1445、LZ01::cΔ1450 的构建 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株及质粒 |
| 4.1.2 抗菌素配置 |
| 4.1.3 .主要试剂及设备 |
| 4.2 回复株LZ01::cΔ1445、LZ01::cΔ1450 的构建 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 构建供体菌X7213-p CPRA-1445、X7213-p CPRA-1450 |
| 4.2.3 构建回复株LZ01::cΔ1445、LZ01::cΔ1450 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455基因生物学特性的研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验菌株 |
| 5.1.2 培养基及试剂 |
| 5.1.3 培养基及抗菌素的配置 |
| 5.1.4 试验设备 |
| 5.2 生物学功能验证 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 菌株生长曲线测定 |
| 5.2.3 药敏试验 |
| 5.2.4 野生株、缺失株及回复株对重金属离子的敏感性试验 |
| 5.2.5 qRT-PCR 检测基因转录水平 |
| 5.2.6 C43-Pet32a::1445-1450-1455 对重金属离子的耐受性 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 菌株生长曲线 |
| 5.3.2 药敏试验 |
| 5.3.3 野生株、缺失株及回复株对重金属离子的敏感性试验 |
| 5.3.4 表达菌对重金属离子的耐受性 |
| 5.3.5 GE296_RS01445 、GE296_RS01450、 GE296_RS01455 转录水平测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6 章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 项目基金来源 |
| 硕士期间以参与者或第一作者身份署名或发表的文章 |
| 致谢 |
（6）鸭浆膜炎致病菌的分离鉴定及疫苗效果评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 鸭浆膜炎症 |
| 1.2.1 鸭传染性浆膜炎的研究概况 |
| 1.2.1.1 病原学 |
| 1.2.1.2 流行病学 |
| 1.2.1.3 临床症状和病理变化 |
| 1.2.1.4 诊断与防治 |
| 1.2.2 大肠杆菌的研究概况 |
| 1.2.2.1 病原学 |
| 1.2.2.2 流行病学 |
| 1.2.2.3 临床症状和病理变化 |
| 1.2.2.4 诊断与防治 |
| 1.3 疫苗的研究概况 |
| 1.3.1 使用疫苗的必要性 |
| 1.3.2 疫苗的免疫原理 |
| 1.3.3 疫苗的分类 |
| 1.3.3.1 蜂胶苗 |
| 1.3.3.2 油苗 |
| 1.3.3.3 口服疫苗 |
| 第2章 细菌的分离鉴定与攻毒菌株选择 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 材料来源 |
| 2.1.1.2 检测试剂 |
| 2.1.1.3 染色液 |
| 2.1.1.4 定型血清 |
| 2.1.1.5 试验仪器 |
| 2.1.1.6 试验动物 |
| 2.1.1.7 试验场地 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 细菌分离培养 |
| 2.1.2.2 细菌鉴定 |
| 2.1.2.3 血清型鉴定 |
| 2.1.2.4 细菌浓度测定 |
| 2.1.2.5 动物回归试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 细菌分离结果与分析 |
| 2.2.2 细菌鉴定结果与分析 |
| 2.2.2.1 细菌形态观察结果与分析 |
| 2.2.2.2 细菌培养基鉴定结果与分析 |
| 2.2.2.3 分子鉴定结果与分析 |
| 2.2.2.4 生化鉴定结果与分析 |
| 2.2.3 血清型鉴定结果与分析 |
| 2.2.3.1 鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定结果与分析 |
| 2.2.3.2 大肠杆菌血清型鉴定结果与分析 |
| 2.2.4 细菌浓度测定结果与分析 |
| 2.2.5 动物回归试验结果与分析 |
| 2.2.5.1 不同血清型菌株毒力试验结果与分析 |
| 2.2.5.2 候选攻毒菌株最小完全致死剂量试验结果与分析 |
| 2.2.5.3 菌株对鸭生产性能的影响结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌的疫苗效果比较 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 疫苗来源 |
| 3.1.1.2 试验试剂 |
| 3.1.1.3 试验仪器 |
| 3.1.1.4 试验动物 |
| 3.1.1.5 试验场地 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 疫苗质量检测 |
| 3.1.2.2 疫苗效力检验 |
| 3.1.2.3 免疫次数与免疫持续期检验 |
| 3.1.2.4 疫苗对鸭生产性能的影响 |
| 3.1.2.5 临床试验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 疫苗质量检测结果与分析 |
| 3.2.1.1 疫苗A质量检测结果与分析 |
| 3.2.1.2 疫苗B质量检测结果与分析 |
| 3.2.1.3 疫苗C质量检测结果与分析 |
| 3.2.2 疫苗效力检验结果与分析 |
| 3.2.2.1 疫苗A效力检验结果与分析 |
| 3.2.2.2 疫苗B效力检验结果与分析 |
| 3.2.2.3 疫苗C效力检验结果与分析 |
| 3.2.3 免疫次数与免疫持续期检验结果与分析 |
| 3.2.3.1 疫苗A免疫次数与免疫持续期检验结果与分析 |
| 3.2.3.2 疫苗B免疫次数与免疫持续期检验结果与分析 |
| 3.2.3.3 疫苗C免疫次数与免疫持续期检验结果与分析 |
| 3.2.4 疫苗对鸭生产性能的影响结果与分析 |
| 3.2.5 临床试验结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药基因簇解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌病发现历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 鸭疫里默氏杆菌分子生物学 |
| 1.4 鸭疫里默氏杆菌诊断方法 |
| 1.5 鸭疫里默氏杆菌流行病学特性 |
| 1.6 鸭疫里默氏杆菌病主要症状和病变 |
| 1.7 鸭疫里默氏杆菌的耐药检测 |
| 1.8 鸭疫里默氏杆菌病的防治 |
| 1.9 本试验研究的目的和意义 |
| 2 试验一 鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二 鸭疫里默氏杆菌分离株RBT-1的耐药性试验 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 试验三 鸭疫里默氏杆菌分离株RBT-1的全基因组测序及分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表文章 |
（8）基于CRISPR序列分型的鸭疫里默氏杆菌疫苗菌株筛选方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌特性 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行概况 |
| 1.1.3 致病机理 |
| 1.1.4 耐药机制 |
| 1.1.5 免疫应答 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌分型 |
| 1.2.1 血清型分型 |
| 1.2.2 分子分型 |
| 1.3 CRISPR序列分型研究进展 |
| 1.3.1 CRISPR起源及特征 |
| 1.3.2 CRISPR分型进展 |
| 1.4 疫苗菌株筛选方法 |
| 1.5 总结 |
| 第二章 RA培养鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂及培养基配置 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌复苏及培养 |
| 2.2.2 结晶紫染色 |
| 2.2.3 PCR鉴定 |
| 2.2.4 血清型鉴定 |
| 2.2.5 组织病变 |
| 2.2.6 病理组织切片观察 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细菌复苏培养 |
| 2.3.2 结晶紫染色 |
| 2.3.3 PCR鉴定 |
| 2.3.4 血清型鉴定 |
| 2.3.5 组织病变 |
| 2.3.6 病理组织切片观察 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 以RA的 CRISPR序列为识别标签 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 试剂及培养基配置 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 软件 |
| 3.1.5 PCR引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细菌复苏及培养 |
| 3.2.2 细菌基因组DNA提取 |
| 3.2.3 PCR反应 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 建立RA混合菌株攻毒感染模型 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 建立攻毒模型 |
| 4.2.2 细菌复苏及培养 |
| 4.2.3 活菌计数 |
| 4.2.4 菌液稀释 |
| 4.2.5 混合感染及分离RA |
| 4.2.6 细菌培养 |
| 4.2.7 基因组提取 |
| 4.2.8 PCR及电泳 |
| 4.2.9 胶回收及测序 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同时间梯度分离RA情况 |
| 4.3.2 PCR反应 |
| 4.3.3 CRISPR序列分析 |
| 4.3.4 筛选效率分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 攻毒模型建立依据 |
| 4.4.2 确定混合攻毒感染后分离RA的最佳时间 |
| 4.4.3 筛选效率分析 |
| 第五章 Ⅰ型RA菌株混合感染-筛选试验 |
| 5.1 A组筛选试验 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 结果与分析 |
| 5.2 B组筛选试验 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.3 结果与分析 |
| 5.3 C组筛选试验 |
| 5.3.1 材料 |
| 5.3.2 方法 |
| 5.3.3 结果与分析 |
| 5.4 D组筛选试验 |
| 5.4.1 材料 |
| 5.4.2 方法 |
| 5.4.3 结果与讨论 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 探究RA优势菌种特性 |
| 6.1 优势菌株LD_(50)测定 |
| 6.2 各组优势菌株混合感染-筛选试验 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 RA菌株耐药性 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 优势菌株LD_(50)测定 |
| 6.4.2 各组优势菌株混合感染-筛选试验分析 |
| 6.4.3 RA菌株耐药性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.5.1 优势菌种与毒力间的关系 |
| 6.5.2 优势菌种与耐药性的联系 |
| 第七章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及其免疫胶体金检测试纸条研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌及其流行病学 |
| 1.1.1 鸭疫里默氏杆菌概述 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 鸭疫里默氏杆菌的毒力因子 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌检测技术的研究 |
| 1.2.1 血清学诊断方法 |
| 1.2.2 分子生物学检测技术 |
| 1.3 免疫胶体金快速检测技术的概述 |
| 1.3.1 胶体金的概述 |
| 1.3.2 免疫胶体金的概述 |
| 1.3.3 免疫胶体金检测技术 |
| 1.3.4 胶体金免疫层析法 |
| 1.3.5 胶体金免疫层析技术的应用 |
| 1.4 目的和意义 |
| 第二章 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 主要仪器设备及试剂 |
| 2.1.3 所需溶液配制 |
| 2.1.4 实验引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小鼠免疫 |
| 2.2.2 骨髓瘤细胞准备 |
| 2.2.3 脾淋巴细胞的准备 |
| 2.2.4 饲养细胞的制备 |
| 2.2.5 细胞融合 |
| 2.2.6 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 |
| 2.2.7 杂交瘤细胞株的亚型鉴定 |
| 2.2.8 鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.2.9 鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的鉴定 |
| 2.2.10 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体腹水的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.3.2 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体亚型鉴定 |
| 2.3.3 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体腹水效价 |
| 2.3.4 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的染色体分析 |
| 2.3.5 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体特异性 |
| 2.3.6 鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 鸭疫里默氏杆菌免疫胶体金检测试纸条的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 培养基与缓冲液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 金溶液的制备及鉴定 |
| 3.2.2 胶体金标记蛋白的标记条件摸索及鉴定 |
| 3.2.3 反应体系的组合筛选 |
| 3.2.4 免疫胶体金试纸条组装及反应条件优化 |
| 3.2.5 免疫胶体金试纸条的性状评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 金溶液的制备及鉴定 |
| 3.3.2 胶体金标记蛋白的标记条件摸索及鉴定 |
| 3.3.3 反应条件的优化 |
| 3.3.4 免疫胶体金试纸条的性状评价 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 鸭疫里默氏杆菌免疫胶体金检测试剂条的临床应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株及实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器及材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 实验感染鸭的样品检测 |
| 4.2.2 临床动物样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 实验感染鸭的样品检测 |
| 4.3.2 临床样品检测 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）鸭疫里默氏杆菌利福平耐药株RA-WH9基因组及其质粒分析（论文提纲范文）
| 硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 鸭疫里默氏杆菌的生物学特性 |
| 1.1.2 鸭疫里默氏杆菌病及其流行情况 |
| 1.1.3 鸭疫里默氏杆菌的血清型 |
| 1.1.4 鸭疫里默氏杆菌的耐药性现状 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌耐药机制 |
| 1.2.1 外排泵系统 |
| 1.2.2 药物靶基因突变 |
| 1.2.3 产生灭活酶或钝化酶 |
| 1.2.4 产生修饰酶 |
| 1.3 利福平的研究进展 |
| 1.3.1 利福平简介 |
| 1.3.2 利福平抗菌机制 |
| 1.3.3 利福平耐药机制 |
| 第二章 RA-WH9的分离鉴定及染色体分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.2.5 引物 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 细菌分离纯化 |
| 2.3.2 细菌保存 |
| 2.3.3 基因组DNA提取 |
| 2.3.4 分离菌鉴定 |
| 2.3.5 分离菌血清型鉴定 |
| 2.3.6 体外药物敏感性实验 |
| 2.3.7 rpoB基因突变分析 |
| 2.3.8 生长曲线测定 |
| 2.3.9 全基因组测序和组装 |
| 2.3.10 基因预测与注释 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 细菌的分离鉴定 |
| 2.4.2 血清型鉴定结果 |
| 2.4.3 体外药物敏感性实验结果 |
| 2.4.4 rpoB基因突变分析结果 |
| 2.4.5 生长曲线测定结果 |
| 2.4.6 染色体分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 pRA-59的分离鉴定及基因组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株及质粒 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 质粒的提取 |
| 3.3.2 pRA-59的酶切 |
| 3.3.3 pRA-59的基因组测序 |
| 3.3.4 pRA-59的基因预测与注释 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 质粒的提取结果 |
| 3.4.2 质粒的酶切结果 |
| 3.4.3 pRA-59序列分析 |
| 3.4.4 基因预测与注释结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 pRA-59介导利福平耐药性的水平传播 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.2.5 引物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 pRA-59介导大肠杆菌对利福平耐药实验 |
| 4.3.2 pRA-59介导鸭疫里默氏杆菌对利福平耐药实验 |
| 4.3.3 CH3及其结合子体外药物敏感性比较分析 |
| 4.3.4 CH3-59三代测序 |
| 4.3.5 启动子活性验证 |
| 4.3.6 极性效应分析 |
| 4.3.7 数据统计与分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 pRA-59介导大肠杆菌对利福平产生耐药性 |
| 4.4.2 大肠杆菌rpoB基因突变分析结果 |
| 4.4.3 大肠杆菌及其结合子生长曲线测定结果 |
| 4.4.4 pRA-59介导鸭疫里默氏杆菌对利福平产生耐药性 |
| 4.4.5 鸭疫里默氏杆菌结合子rpoB基因突变分析结果 |
| 4.4.6 鸭疫里默氏杆菌及其结合子生长曲线测定结果 |
| 4.4.7 CH3及其结合子体外药物敏感性分析结果 |
| 4.4.8 CH3、CH3-59基因组比较分析结果 |
| 4.4.9 启动子活性验证结果 |
| 4.4.10 插入片段上下游基因表达量差异分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、鸭疫里默氏杆菌培养特性的研究（论文参考文献）
- [1]鸭疫里默氏杆菌生物素合成相关基因的鉴定及功能研究[D]. 任晓梅. 中国农业科学院, 2021
- [2]鸭疫里默氏杆菌GL001858和GL001859基因缺失株的构建及其生物学特性分析[D]. 何晓花. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]鸭疫里默氏杆菌Ⅸ型分泌系统效应分子MPPE的生物学特性分析及单克隆抗体制备[D]. 牛朋飞. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]鸭疫里默氏杆菌RaeE-RaeF-RopN外排泵的鉴定及无痕敲除技术的建立[D]. 王燕萍. 中国农业科学院, 2021(09)
- [5]鸭疫里默氏杆菌RaeX-RaeY-RopM外排泵介导其对重金属离子产生耐受性的研究[D]. 秦明星. 西北民族大学, 2021
- [6]鸭浆膜炎致病菌的分离鉴定及疫苗效果评估[D]. 赵晓锦. 扬州大学, 2021(09)
- [7]一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药基因簇解析[D]. 万明. 沈阳农业大学, 2020(05)
- [8]基于CRISPR序列分型的鸭疫里默氏杆菌疫苗菌株筛选方法的建立及应用[D]. 邢娟娟. 河北科技师范学院, 2020(12)
- [9]鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及其免疫胶体金检测试纸条研制[D]. 韩文龙. 中国农业科学院, 2020(01)
- [10]鸭疫里默氏杆菌利福平耐药株RA-WH9基因组及其质粒分析[D]. 刘玲俐. 中国农业科学院, 2020