一、血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞(论文文献综述)
买买艾力·玉山[1](2020)在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中研究表明目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨(Distraction Osteogenesis,DO)模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB(rhPDGF-BB)基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术(骨传送技术)治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天(分两次),连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs(实验组),骨髓MSCs(实验对照组),PBS(空白对照组),活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束(术后天21天),矿化期2周(术后第35天),矿化期4周(术后第49天),矿化期8周(术后第77天)。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试(三点力学测试)结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨(骨传送)技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。
王璐[2](2019)在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中指出干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素(icaritin,ICT)预处理后的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF(肝细胞生长因子)/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组(正常培养组)、Serum free组(无血清培养组)、ICT组(淫羊藿素组)、HGF组(肝细胞生长因子组)的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼(crizotinib)的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II(MT-C02)、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml(0.1uM)、100ng/ml具有统计学意义(P<0.05)。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降(P<0.05),而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率(P<0.05)。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体(P<0.05)。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼(c-Met受体抑制剂)的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低(P<0.01),克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高(P<0.01),提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调(P<0.05),克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低(P<0.05)。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义(P<0.01)。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调(P<0.05),对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用(P<0.05),而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性(P<0.01)。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(MT-C02)均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”(被自噬小体包裹的线粒体)显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程(P<0.05)。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
李琳[3](2015)在《川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用》文中进行了进一步梳理目的 观察川芎嗪(Ligustrazine)预处理促进骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用,并探讨其可能作用机制。方法①采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代,流式细胞仪检测BMSCs阳性抗原(CD29和CD90)及阴性抗原(CD34和CD45)鉴定BMSCs纯度,不同终浓度BrdU(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)标记BMSCs24 h、48h和72 h,检测BrdU标记率。②采用线栓法诱导大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型,缺血90min,缺血24 h后除假手术组外,随机分为模型组,MCAO+未预处理BMSCs组(BMSCs组),MCAO+50 μM川芎嗪预处理BMSCs组(50μM川芎嗪组),MCAO+100μM川芎嗪预处理BMSCs组(100 μM川芎嗪组),50 μM川芎嗪预处理BMSCs+CXCR4拮抗剂AMD3100组(AMD3100),每组各12只,模型组和假手术组,经尾静脉缓慢注射1 mLPBS,其它各组经尾静脉缓慢注射1mL细胞悬液(1×106mmL)。③在缺血后第1、7、14和28d采用改良神经损伤严重程度评分、粘胶揭除试验和角试验进行神经功能评价。④缺血后第28 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量,采用甲苯胺蓝染色检测脑缺血梗死体积。⑤缺血后第14 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、血管性血友病因子(vWF)、血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。结果①采用全骨髓贴壁法,可得到生长良好,形态均一性的BMSCs,第3代BMSCs的表型鉴定CD29、CD90、CD34和CD45阳性表达率分别为99.0%、99.3%、0.2%和4.1%,符合BMSCs的特点,说明是分离培养纯度较高的BMSCs。②在缺血后第7 d、14 d和28 d,川芎嗪预处理(50 μM和100 μM)组显着改善大鼠脑缺血后神经症状(P<0.01或<0.05),减少大鼠黏胶揭除时间(P<0.01或P<0.05),大鼠右转次数显着减少(P<0.01或P<0.05)。③缺血后第28 d,与模型组和BMSCs组比较,川芎嗪预处理(50 μM和100 μM)组大鼠脑缺血的梗死体积显着性减少(P<0.01或P<0.05)。④缺血后第14 d,与模型组、BMSCs组和AMD3100组比较,川芎嗪预处理(50μM和100μM)组缺血周边区的BrdU、SDF-1、vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞明显增加(P<0.01)。结论 川芎嗪(50 μM和100 μM)预处理BMSCs治疗脑缺血的疗效优于BMSCs,川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移,促进神经功能恢复,缩小脑梗死体积,机制可能与促进脑缺血周边区血管生成及上调脑缺血周边区的SDF-1、VEGF和BDNF的表达有关。
何玉祥[4](2013)在《骨髓基质干细胞治疗淋巴水肿和RA-PTAS对血压、肾功能影响的研究》文中研究表明第一部分:骨髓基质干细胞治疗淋巴水肿的实验研究背景:淋巴水肿(Lymphedema)是指机体的某些部位,由于淋巴引流障碍而引起组织和器官的肿胀。1983年,国际淋巴学会主席Casley-Smith JR估计,全世界大约有1亿4千万人患有各种类型的淋巴水肿,其中大约有四千五百万是肢体的淋巴水肿,并且人数越来越多。遗憾的是,目前从国内到国际淋巴水肿的研究没有引起医学界的重视,WHO也没有发布权威的专门的淋巴水肿性疾病的发病人数统计、分布、治疗等方面的数据,相对于其他疾病的研究,严重滞后。然而我们仍然可以从其它方面获得一些此类疾病的相关情况。1994年以前,我国淋巴水肿的病人主要为丝虫病所致象皮肿病人,1994年我国终于实现了“全国基本上消除了丝虫病流行”。此时我国没有此病的权威统计资料,据多年从事淋巴回流障碍性疾病治疗和研究的中国工程院张涤生院士估计,全国象皮肿的病人数在500万以上。另外,乳癌术后继发上肢淋巴水肿需外科治疗的病人每年新增至少1万人。现在我国淋巴水肿的发病率越来越高,从乳腺癌术后淋巴水肿的情况,便可推知一二。据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的GLOBOCAN2008报道,中国2003-2007年全国32个肿瘤登记点的数据显示中国乳腺癌发病率为29.18/10万,每年中国乳腺癌新发病例数约为38万人。据2008年的数据显示乳腺癌手术后,有4%-56%的患者会发生患侧上肢的淋巴水肿。据此估计我国仅乳癌术后淋巴水肿病人每年新增1.5-21万人。由此可见,我国每年新增各种类型的淋巴水肿病例数将远超过1.5-21万人次。迄今为止,在淋巴水肿的治疗方面尚无理想措施,国内外在临床上治疗淋巴水肿的方法主要是各种手术方法、物理按摩、电热和微波、苯吡喃酮药物治疗等方法,但这些方法均不理想,效果短暂、复发率高或者并发症多,都不能从根本上治愈淋巴水肿。这些淋巴水肿的病人每天忍受着肢体肿胀带来的生活和心理的双重折磨,因为组织间隙内蛋白的积聚,更易发生淋巴管炎和肢体的溃烂,使病人苦不堪言。骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)是成体骨髓细胞中,除造血干细胞之外的另一类骨髓干细胞,是多能或全能干细胞,来源于中胚层的间充质,属成体干细胞。1968年,Friendenstein等首次从骨髓中分离出。可在特定的体内为微环境下,能够诱导分化为多种组织细胞,其主要优点有:1.骨髓基质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能;2.骨髓基质干细胞易于分离、培养、扩增、纯化,不存在免疫排斥的特点,多次传代扩增和冷冻保存后仍具有干细胞特性;3.骨髓基质干细胞为成体干细胞,在应用方面涉及较少的伦理问题;4.可以转染外源基因并稳定高效表达。因此,骨髓基质干细胞在组织器官再生研究,组织器官老化和功能衰退,先天性或者遗传性疾病等方面均有广阔的发展空间,是目前公认的最理想的细胞治疗和基因治疗工具。1996年,VEGF-C (vascular endothelial growth factor C)被瑞典的Joukov等人首次分离出,他们从前列腺癌的细胞中克隆了VEGF-C的cDNA。它的基因定位在人染色体4q34上,分子量约为46.9KD。Joukov等研究认为它是VEGF家族的成员,并命名为VEGF-C,同时提出了VEGF-C的受体为FLT-4(即VEGFR-3)。VEGF-C的信使RNA几乎在整个人体的组织中表达,包括胚胎。成体组织中,心脏,胎盘,卵巢癌和小肠的VEGF-C是高表达的。从1996年开始,VEGF-C的研究进度飞快,使其得到了深入的研究。有很多研究资料证明并阐述了它的基因构成,而且转录表达后其产物的微观结构以及生物学功能等也已经有很多报道。目前,此研究的热点还集中于受体、表达调节等方面,同时随着研究的深入,研究者发现VEGF-C与淋巴管内皮标志物的表达有很紧密的联系,它能够促进淋巴管内皮细胞的增生,调节其生物学活性。众多关于其受体的研究发现,VEGF-C的受体为VEGFR-2、VEGFR-3。它与VEGFR-2结合激活后,能够促进血管新生;当它与其另外一种受体-VEGFR-3结合激活后,能够促进淋巴管新生。大鼠VEGF-C152S是一点突变型VEGF-C,其第二个保守的半胱氨酸残基被丝氨酸残基所替代,与人的VEGF-C156S突变体相似,与野生型VEGF-C相比,它只能结合VEGFR-3,无法结合VEGFR-2,从而达到只促进淋巴管增生的目的。骨髓基质干细胞在淋巴水肿的治疗方面,以及在干细胞向淋巴管内皮细胞诱导方面尚处于起始阶段。因此,为了获得VEGF-C152s在大鼠淋巴管内皮细胞的调节作用和在淋巴管生成作用中的有关线索,我们利用重组的大鼠VEGF-C152S诱导大鼠骨髓基质干细胞,并通过RT-PCR、免疫印迹法及免疫荧光技术,来观察VEGF-C152S诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的情况,然后利用大鼠后肢环形切除部分皮肤并清扫深部淋巴管和淋巴结构建大鼠继发性淋巴水肿模型,并将经VEGF-C152S诱导分化后的骨髓基质干细胞移植入模型中,观察其治疗效果,为淋巴水肿性疾病的研究提供新的思路,以及理论和实验基础。目的:本实验旨在探讨VEGF-C152S诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的情况,以及骨髓基质干细胞对大鼠淋巴水肿模型的治疗作用及对淋巴管新生的作用。为淋巴水肿性疾病的研究提供新的思路,以及理论和实验基础。方法:1、体外获取、分离、培养、扩增、鉴定大鼠骨髓基质干细胞。2、取第三到五代细胞,利用重组的大鼠VEGF-A和VEGF-C152S在体外诱导分化大鼠骨髓基质干细胞,并通过RT-PCR.免疫印迹法及免疫荧光技术,观察确定大鼠骨髓基质干细胞是否表达淋巴管内皮细胞特异性的标志物Prox-1和LYVE-1,以及血管内皮细胞标志物CD34和CD31,来观察VEGF-A和VEGF-C152S诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的可能性。3、制作大鼠继发性淋巴水肿模型,将VEGF-C152S诱导后的骨髓基质干细胞注射到模型大鼠手术处的皮下组织,用测量水肿体积、B超、免疫荧光等方法检测,观察对淋巴水肿的治疗作用。结果:1、体外利用贴壁培养法成功培养、扩增了大鼠骨髓基质干细胞,并用流式细胞术检测了细胞表型及经不同方向的诱导分化,证实培养的细胞是大鼠骨髓基质干细胞。2、应用大鼠VEGF-A与重组大鼠VEGF-C152S体外环境下,诱导大鼠骨髓基质干细胞,应用免疫荧光标记染色、Western Blot、RT-PCR等方法证实诱导后的细胞表达了淋巴管内皮标志物Prox-1和LYVE-1,而没有表达血管内皮标志物CD31和CD34。3、在以往制作淋巴水肿模型的基础上,我们创新出了“肌肉皮肤离断缝合后二次手术环切法”来制作大鼠肢体淋巴水肿模型,成模率较高。在此模型上我们应用经大鼠重组VEGF-C152S诱导分化后的大鼠骨髓基质干细胞进行移植治疗,发现淋巴管新生增加,并可以明显缓解模型动物肢体淋巴水肿,说明其对大鼠淋巴水肿模型有治疗作用。结论:1、利用贴壁培养法获得骨髓基质干细胞的方法是可行的;应用大鼠VEGF-A与重组大鼠VEGF-C152S体外环境下,可以诱导大鼠骨髓基质干细胞淋巴管内皮细胞。2、我们应用创新出的“肌肉皮肤离断缝合后二次手术环切法”来制作大鼠肢体淋巴水肿模型,效果可靠、成模率较高。3、在大鼠肢体淋巴水肿模型上,我们应用经大鼠重组VEGF-C152S诱导分化后的大鼠骨髓基质干细胞进行移植治疗,发现淋巴管新生增加,并可以明显缓解模型动物肢体淋巴水肿,说明其对大鼠淋巴水肿模型有治疗作用。并且其治疗效果与细胞移植量有关,5×10^6个/每次与1×10^6/每次的剂量均有效,但是5×10^6个/每次的剂量效果更明显。创新点:1、根据我们诱导细胞分化的结果,我们首次提出了VEGF-A促进淋巴管新生的机制的假设,就是其通过VEGFR-2信号通路,促进了VEGFR-2高表达从而引起了Prox-1的表达上调,从而引起了细胞表达淋巴管内皮标志物。此研究可以为治疗淋巴管缺陷性疾病和抑制肿瘤淋巴管新生方面的研究,提供新的思路和理论支持。2、我们创新出了“肌肉皮肤离断缝合后二次手术环切法”应用于制作大鼠肢体淋巴水肿模型,此法造模的成功率较高为68.1%,效果可靠。3、首次应用经大鼠重组VEGF-C152S诱导分化后的大鼠骨髓基质干细胞,进行移植治疗,发现淋巴管新生增加,并可以明显缓解模型动物肢体淋巴水肿,说明其对大鼠淋巴水肿模型有治疗作用。其治疗效果与细胞移植量有关,5×10^6个/每次的剂量与1×10^6/每次的剂量均有效,但是5×10^6个/每次的剂量效果更明显。为人类继发性淋巴水肿的治疗提供了新的思路和实验基础。第二部分:RA-PTAS对血压、肾功能影响的研究背景:肾动脉狭窄(RAS)被认为是继发性高血压的最常见的原因之一,多种因素可以导致肾动脉狭窄,如动脉粥样硬化,大动脉炎,肌纤维发育不良,支架内再狭窄等。肾动脉狭窄继续发展可引起肾血管性高血压和缺血性肾病,经常导致终末期肾功能衰竭,并增加心血管疾病的发病率和死亡率。由于肾动脉性高血压,有时口服降压药物没有反应。相比传统的手术方法,最近血管内介入治疗被作为治疗的肾动脉狭窄的主要手段,行经皮肾动脉成形术或支架植入术(Percutaneous renal artery angioplasty and/or stenting, RA-PTAS),以防止慢性肾功能不全。然而,此法是否能有效地控制血压,改善肾功能仍存在争议。目前,还没有明确的证据表明,这种方法可以防止肾功能逐渐恶化。经皮肾动脉成形术或支架植入术与经典的手术方法相比,因为它的微创和较高的技术成功率,目前使用较多,但对于其预后,仍没有确切可靠的结论。在这项研究中,我们对115例行血管内介入治疗的患者进行回顾性分析,评价PTA治疗RAS的安全性和有效性。目的:评价血管内介入治疗术后肾动脉狭窄(RAS)的高血压患者的血压控制和肾功能的临床效果。方法:2004年1月至2011年12月,115名高血压患者共120条肾动脉,对手术前、后的血压和肾小球滤过率(GFR)进行了监测。术后口服抗血小板和抗高血压药物治疗。所有患者术后随访至少6个月。结果:110例患者成功地进行球囊血管成形术,并放置了94例肾动脉支架。高血压治愈19例,减轻61例。血压平稳26例,恶化9例。肾功能改善23例,肾功能稳定57例。肾功能恶化患者11例患者。出院6个月后多普勒超声检查,显示有87例病人肾动脉通畅。结论:经皮肾动脉成形术或支架植入术是有效和安全的,可以帮助控制血压,改善肾功能。创新点:我们的研究表明,对于高血压病人伴有肾动脉狭窄,应该进行积极的介入治疗,有助于控制血压和维持肾功能。
沈凌[5](2010)在《黄芪对低氧环境下血管内皮细胞生长因子/基质细胞衍生因子-1诱导人骨髓间充质干细胞分化、迁移的干预作用的研究》文中指出目的自体骨髓干细胞移植是将外周血或骨髓中的干细胞移植到缺血的肢体肌肉或闭塞的血管中,使其分化、形成新生毛细血管,改善甚至恢复下肢血流以达到治疗下肢缺血的目的。如何在下肢缺血缺氧的环境中,提高干细胞向VECs分化和迁移能力,成为研究的重点。目前以黄芪为代表的益气活血中药在中西医结合治疗下肢PAOD方面,发挥了重要作用。本研究模拟人体内低氧环境,研究黄芪和VEGF、SDF-1重要细胞因子对hBMSCs向VECs分化及迁移能力的影响,探讨中药干预的主要靶点、作用时机等关键因素,为临床运用提供科学依据。方法1黄芪对低氧环境下VEGF诱导hBMSCs分化的干预作用的研究随机将hBMSCs分为七组,分别为VEGF+常氧组、黄芪+常氧组、VEGF+黄芪+常氧组、低氧对照组、VEGF+低氧组、黄芪+低氧组、VEGF+黄芪+低氧组。将常氧三组置于普通C02细胞培养箱(21%02)中;低氧四组置于三气培养箱(5%O2)中培养。培养7天后,免疫细胞化学法检测CD34、CD31、vWF、VEGFR-2. HIF-la标记物。2 AMI对低氧条件下SDF-1诱导hBMSCs迁移的干预作用的研究随机分为7组,分别为SDF+常氧组、黄芪+常氧组、SDF+黄芪+常氧组、低氧对照组、SDF+低氧组、黄芪+低氧组、SDF+黄芪+低氧组共七组。将hBMSCs细胞悬液放入Transwell系统的上室,将含不同药物的细胞培养液加入到Transwell系统的下室中。将常氧三组Transwell系统置于普通CO2细胞培养箱(21%02)中;低氧四组Transwell系统置于三气培养箱(5%O2)中培养。培养48h后,取上室,酒精棉球擦掉上室膜上未迁移的细胞,95%酒精固定10min,苏木素染色5min,随机选择3个连续显微镜视野(×200)计数迁移到上室膜下的细胞,取平均数。结果1黄芪对低氧条件下VEGF诱导hBMSCs分化的干预作用的研究(1)CD34阳性率(%)1)在常氧培养三组中,VEGF+黄芪+常氧组与其他两组相比较,显着升高(p<0.01,p<0.05)。2)在低氧培养四组中,VEGF+黄芪+低氧组与其他三组相比较,显着升高(p<0.01,p<0.05);低氧对照组与其他三组相比较,显着降低(p<0.01)。3)常氧和低氧相对应组间比较,低氧各组显着升高(p<0.01)。(2)CD31阳性率(%)1)在常氧培养三组中,VEGF+黄芪+常氧组与其他两组相比较,显着升高(p<0.01)。2)在低氧培养四组中,VEGF+黄芪+低氧组组与其他三组相比较,显着升高(p<0.01);低氧对照组组与其他三组相比较,显着降低(p<0.01,p<0.05)。3)常氧和低氧相对应组间比较,低氧各组显着升高(p<0.01,p<0.05)(3)vWF阳性率(%)1)在常氧培养三组中,VEGF+黄芪+常氧组与其他两组相比较,显着升高(p<0.01)。2)在低氧培养四组中,VEGF+黄芪+低氧组与其他三组相比较,显着升高(p<0.01);低氧对照组组与其他三组相比较,显着降低(p<0.01)。3)常氧和低氧相对应组间比较,低氧各组显着升高(p<0.01)。(4) VEGFR-2阳性率(%)1)在常氧培养三组中,VEGF+黄芪+常氧组与其他两组相比较,显着升高(p<0.01)。2)在低氧培养四组中,VEGF+黄芪+低氧组与其他三组相比较,显着升高(p<0.01);低氧对照组与其他三组相比较,显着升高(p<0.01)。3)与VEGF+常氧组相比较,VEGF+低氧组显着升高(p<0.05);与黄芪+常氧组相比较,黄芪+低氧组显着升高(p<0.01);VEGF+黄芪+常氧组与VEGF+黄芪+低氧组组间无统计学意义(p>0.05)。(5)HIF-1α阳性率(%)1)在常氧培养三组中,各组间无统计学意义(p>0.05)。2)在低氧培养四组中,各组间无统计学意义(p>0.05)。3)常氧和低氧相对应组间比较,低氧各组显着升高(p<0.01)。2黄芪对低氧条件下SDF-1诱导hBMSCs迁移的干预作用的研究(1)在常氧培养三组中,SDF+黄芪+常氧组与其他两组相比较,显着升高(p<0.01,p<0.05)。(2)在低氧培养四组中,SDF+黄芪+低氧组与其他三组相比较,显着升高(p<.01);与SDF+低氧组相比较,低氧对照组显着升高(p<0.01);低氧对照组与黄芪+低氧组无统计学意义(p>0.05)。(3)与SDF+黄芪+常氧组相比较,SDF+黄芪+低氧组组间显着升高(p<0.05);SDF+常氧组与SDF+低氧组、黄芪+常氧组与黄芪+低氧组组间无统计学意义(p>0.05)。结论1低氧环境下黄芪可能对BMSCs向VECs分化有促进作用,可能与对HIF-1α和VEGF的影响有关。2在常氧和低氧环境中黄芪与SDF-1联合使用可促进BMSCs迁移:而在低氧环境中,单独应用黄芪没有明显的促进作用。
刘敬霞[6](2007)在《脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响》文中研究指明背景与目的缺血性脑血管疾病的高致残率严重影响患者的生存质量,脑缺血损伤引起的神经元结构破坏和缺失是引起功能障碍的病理关键。针对脑缺血损伤引起的生化、代谢改变,保护神经元免于受损,或促进脑缺血损伤后神经细胞再生成为干预损伤、恢复功能的重要策略。目前药物性的神经保护研究和临床应用仍欠理想。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)具有较强的增殖能力和多向分化潜能,可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞,成为脑缺血损伤后神经细胞再生理想的种子来源。鉴于骨髓间充质干细胞体外诱导剂的毒副作用和体外分化后移植脑内较弱的存活能力,近年来,对体外纯化、扩增培养的骨髓间充质干细胞移植脑内以治疗脑缺血损伤成为研究的热点。因此,开展骨髓间充质干细胞移植在神经细胞再生和神经功能修复方面的研究对脑缺血损伤具有重要意义。近年来渐有中医药在骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的报道,但研究多集中于对其体外的诱导分化方面,所选药物以单味中药或提取物为主,而中药复方对BMSCs移植后在活体内影响其存活、分化方面的研究少见。脑梗死属中医“中风”范畴,其病机复杂,以浊毒、血瘀和气虚表现尤为突出:气虚血瘀、毒损脑络为脑梗死的主要病机。解毒降浊、益气化瘀为脑梗死的主要治法。据此研制的中药复方脑脉通(大黄川芎人参葛根)具有解毒降浊、益气活血通络功效,可对脑缺血损伤发挥保护作用。动物实验和临床观察表明,脑脉通治疗脑梗死的效果肯定,可显着改善患者的生存质量。鉴于上述,开展中医药联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤研究具有重要意义。本研究从脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生方面评价脑脉通、BMSCs移植及其联合的脑保护作用,并从脑脉通对BMSCs移植后脑组织神经营养因子水平、向神经细胞分化的比率及对促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的影响方面探讨其可能的作用机制。方法本研究以SD大鼠为研究对象,体外全骨髓贴壁筛选培养法获取骨髓间充质干细胞;移植前48 h用Brdu对骨髓间充质干细胞进行体外标记;栓线阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血再灌注动物模型;脑缺血3 h再灌注24 h由颈内动脉移植骨髓间充质干细胞悬液。动态观察移植后早期(7 d)、中期(14 d)、后期(28 d)大鼠的神经功能和生存状况变化;采用病理形态学、免疫组织化学法以及免疫组织化学双标法,从神经功能综合评分、脑组织含水量、脑梗塞灶、神经细胞超微结构变化方面观察脑脉通对骨髓间充质干细胞移植保护脑缺血损伤的影响;从神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白以及与之相关的神经营养因子表达的变化方面探讨脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对神经细胞的保护作用及可能的作用机制;观察骨髓间充质干细胞移植后在脑内的存活、迁移和分化特点以及脑脉通对其的影响;进一步从神经元突触标志性蛋白表达的变化方面观察骨髓间充质干细胞移植后对神经元突触重建的作用以及脑脉通对其作用的影响。主要研究结果如下:结果1.脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1.1体外全骨髓贴壁筛选培养法纯化骨髓的效果理想,可在短期内获取移植所需的骨髓间充质干细胞;颈动脉移植骨髓间充质干细胞操作易行,细胞悬液少有外漏,移植途径可取。1.2脑缺血再灌注损伤后大鼠体重变化呈现由减轻到增加的趋势,且体重的变化与大鼠全身状况一致;大鼠神经功能随脑缺血再灌注时间的延长逐渐恢复;脑组织水肿程度、梗塞灶的大小及神经细胞超微结构的改变随脑缺血再灌注时间的延长出现由加重到减轻的改变。1.3骨髓间充质干细胞由颈内动脉移植对脑缺血损伤的保护作用与其移植脑内后的时间相关,BMSCs移植后早期未显出明显的保护作用;移植中期的神经功能恢复,脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构有改善趋势;移植后期的神经功能恢复和神经细胞超微结构的改善明显。1.4脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同时间的均有不同程度的改善作用;BMSCs移植联合脑脉通对脑缺血再灌注损伤的保护作用较单纯BMSCs移植的作用提前,联合应用对神经功能的修复和对神经细胞病理损伤的改善作用明显增强,且随移植后BMSCs在脑内时间的延长,联合应用的保护作用更为显着。2脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞再生及神经营养因子的影响2.1随着脑缺血再灌注时间的延长,脑组织神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达减弱;神经生长因子和胶质源性神经营养因子的变化随脑缺血再灌注时间的延长呈现先增高再降低特点。2.2 BMSCs移植后早期神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白无明显增高;随BMSCs移植脑内时间的延长,神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达增强,其中神经元特异性烯醇化酶的增强较胶质纤维酸性蛋白明显,以移植后期的增强更为显着。BMSCs移植后早期对神经生长因子和胶质源性神经营养因子的水平变化无明显影响,随移植后时间的延长,其上调神经营养因子的作用增强。2.3脑脉通联合BMSCs移植后早期神经元特异性烯醇化酶的表达较单纯移植组增强;联合组后期的神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达均有增强。脑脉通联合BMSCs可明显提高移植中期胶质源性神经营养因子水平,并使移植后期神经生长因子的表达明显增强。3.脑脉通对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞移植后向神经细胞分化的影响3.1 BMSCs移植后在脑实质内和血管腔内的分布比例随移植后时间的延长而增加。移植后早期,大多BMSCs位于血管腔内,黏附血管内皮呈丛簇样聚集,脑实质内有少量散在的BMSCs,分布未见明显规律;移植后中期,BMSCs大多从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内,并向缺血侧部位迁移,血管腔内可见到少数标记的BMSCs;移植后期,血管腔内未见Brdu细胞,存活的BMSCs全部由血管进入脑实质,并迁移至缺血侧,对侧少有Brdu细胞;联合脑脉通可使OBMSCs移植后在脑实质内存活的数量明显增多,但脑实质和血管腔内BMSCs的比例及进入脑实质后的迁移方向未见明显改变。3.2 BMSCs移植后向神经细胞的分化随植入时间的延长出现分化率和分化方向的改变。BMSCs移植后早期在脑实质内的分化率低,未显示出分化方向的差异性;移植后中期的分化率明显增高,以向神经胶质细胞的分化明显;移植后期,BMSCs向神经元细胞的分化明显增强,而向神经胶质细胞的分化相对减弱;脑脉通对BMSCs移植后不同阶段在促进BMSCs向神经细胞分化方面的作用具有差异性,表现为在移植中期促进神经胶质细胞分化,而移植后期则使BMSCs向神经元方向的分化增强。4.脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的影响4.1脑缺血再灌注损伤后神经元结构破坏,神经丝排列紊乱,变短,数量减少,稀疏,分布不均匀,且随脑缺血再灌注时间的延长而加重;促进受损后神经元突触重建的生长相关蛋白-43和标志神经元突触重建的蛋白表达减弱,且随脑缺血再灌注时间的延长呈现递减趋势。脑脉通对脑缺血再灌注早期的神经元结构受损具有保护作用,神经元突触素蛋白的表达增强,但对生长相关蛋白-43的表达无显着影响。4.2 BMSCs移植后早期对神经元结构受损未显出明显的保护作用;移植后中期,神经元突触重建特异性标志蛋白显示增加趋势;移植后期神经丝蛋白、促突触重建的生长相关蛋白-43和神经元突触素蛋白的表达增强。BMSCs对脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的促进作用与移植脑内存活的时间相关,该作用随移植后时间的延长而增强。4.3脑脉通联合BMSCs移植可使早期神经丝蛋白表达增强、神经元结构破坏减轻;神经生长相关蛋白-43的表达提前,并增强其后期的表达;移植后期神经元突触素蛋白的表达增强。结论综合上述研究,结果提示,①体外全骨髓贴壁筛选纯化、培养和扩增BMSCs的方法可行,Brdu标记BMSCs的效果理想,由颈内动脉移植BMSCs悬液易于操作,移植后的BMSCs可在脑内存活、迁移,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。②脑缺血再灌注损伤后神经功能、脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构改变可随脑缺血再灌注时间延长有不同程度恢复;脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同阶段具有不同程度的保护作用,以早期的作用明显;BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用与其移植后的时间相关,移植后早期未显出明显的脑保护作用,但随着BMSCs移植脑内时间的延长,其保护作用逐渐增强。③神经细胞随脑缺血再灌注损伤时间的延长持续受损、数量减少,神经营养因子出现先增高再降低特点,其在早期的升高对神经细胞受损具有保护作用,后期水平降低则不利于神经细胞的再生和修复;脑脉通对神经细胞的保护作用与其早期和中期上调胶质源性神经营养因子、后期上调神经生长因子表达有关;BMSCs移植对保护神经细胞和上调神经营养因子表达的作用随移植后时间的延长而增强;脑脉通联合BMSCs移植可使其对神经细胞的保护作用提前,并使后期的作用增强,以对神经元的作用尤为明显,这可能与脑脉通促进BMSCs移植后上调神经营养因子表达的作用有关。④随移植后时间的延长,BMSCs逐渐从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内存活、向缺血侧迁移,出现神经细胞分化,但未显示出分化方向的差异性;脑脉通可使移植后BMSCs在脑内的存活增强,并在促进其向神经细胞分化方面显示出差异性,表现为促进中期BMSCs向神经胶质细胞分化和后期向神经元细胞分化。⑤神经元突触重塑是其结构重建与功能修复的基础,神经元突触重塑功能随脑缺血再灌注时间的延长有减弱趋势,这可能与促进神经元突触重建生长相关蛋白的表达下调有关;脑脉通在脑缺血再灌注早期可保护神经元结构受损,后期可增强神经元突触重建;BMSCs对神经元突触重建作用随移植后时间的延长逐渐增强;脑脉通联合BMSCs可使脑缺血再灌注损伤后早期神经元突触重建提前,并可增强中期与后期的神经元突触重建,其作用可能是通过上调促神经元突触重建的生长相关蛋白-43的表达实现。因此认为,脑脉通联合BMSCs移植对脑缺血再灌注神经细胞再生具有促进作用,其作用与脑脉通使BMSCs移植后上调神经营养因子、促进向神经细胞分化及增强促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的作用在早期提前和在后期增强有关。研究可为BMSCs移植治疗脑缺血损伤以及相关领域中药的深入研究提供科学依据,并对进一步中医药学及其与细胞治疗学应用的研究具有重要价值。
王海萍[7](2007)在《骨髓间充质干细胞和P19细胞体外诱导向心肌分化及细胞移植修复梗死心肌的研究》文中进行了进一步梳理急性心肌梗死是严重危害中老年人身体健康的常见病、多发病。目前临床缺乏针对患者梗死心肌的再造和再生的根本性治疗方法,虽然发病4-6小时内及时溶栓、介入治疗使梗死相关血管早期持续开通可挽救濒临死亡的心肌细胞,但绝大多数患者就诊时缺血心肌已有坏死,此时再灌注治疗只能防止梗死范围的扩大,而对于已坏死的心肌无效。由于成人心肌组织无分化再生能力,其坏死心肌细胞只能由成纤维细胞取代而形成无收缩功能的瘢痕组织,终致心衰,甚至猝死,严重影响患者生活质量和寿命。在这种情况下,有人提出可以通过再生心肌细胞,即心肌细胞成形术,来治疗缺血性心肌病导致的心肌梗死甚至心力衰竭,也就是通过移植外源性细胞到损伤的心肌中,用足量的具有收缩功能的细胞恢复和改善病变区域心肌的功能。目前在动物实验中有多种细胞被用来进行心肌细胞成形术,如胚胎心肌细胞、胚胎干细胞、成肌细胞(即骨骼肌卫星细胞)及骨髓间充质干细胞等被陆续用来做细胞移植治疗研究。来源于自身的骨髓间充质干细胞( marrow mesenchymal stem cells, MSCs)可在体外大量扩增,且具有多向分化潜能,能在适当的微环境中,分化为骨、软骨、脂肪、肝、神经、内皮、平滑肌、骨骼肌细胞和心肌样细胞。MSCs的应用由于没有医学伦理和免疫排斥等问题,目前是研究得较多的进行细胞移植以治疗缺血性心肌病的供体细胞。胚胎畸瘤细胞(embryonal carcinoma cells, EC)细胞与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)在分化潜能、超微结构、细胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性,同时与ES细胞相比, EC细胞在无需饲养层和白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factory, LIF)条件下培养即可保持未分化状态,更易于培养,且易于进行基因操作,而且通过分化培养过程EC细胞可从恶性表型转化为非恶性表型,因此EC细胞的研究应用日益受到广大研究者的青睐。P19EC细胞系是McBurney等从C3H/He小鼠畸胎瘤中分离得到的具有多向分化潜能的胚胎性干细胞,其在体外培养中单层生长无需饲养层即可迅速大量扩增,经多次传代仍保持胚胎干细胞特有标记,如表面糖蛋白SSEA-l及转录因子Oct-3等。在体外,通过条件培养P19细胞被诱导为包括心肌细胞、骨骼肌细胞、神经元等多种类型的细胞,且分化过程类似于胚胎细胞的早期分化。因此P19细胞常被作为研究细胞早期发育的体外模型系统。P19细胞向心肌细胞分化过程中,其发育相关基因的表达及电生理学特征基本模拟了正常小鼠心肌发育过程,被认为是研究心肌细胞发育的良好体外模型系统,其向心肌细胞的分化过程日益引起人们的关注。本课题拟通过应用不同方法、不同化学试剂体外诱导MSCs和P19细胞向心肌细胞分化,观察其分化过程中的形态学变化、心肌细胞早期转录因子及特异基因的表达,研究其生物学特性,摸索适宜骨髓间充质干细胞和P19细胞向心肌细胞分化的诱导方法,提高心肌细胞分化率,为建立高度标准化和最适宜的培养条件奠定基础;为大规模筛选心肌化干细胞的研究奠定基础;将胶体金标记的MSCs移植到SD大鼠冠脉结扎心梗模型的心肌组织中,观察移植细胞的生长分化情况和其在治疗心梗中的作用,探讨其作为进行细胞移植的供体细胞来治疗缺血性心肌病的可行性。本实验共分三部分。1探讨了大鼠MSCs的体外分离、纯化、扩增和向心肌细胞的定向诱导分化条件利用贴壁培养的方法从成年SD大鼠股骨和胫骨骨髓中分离纯化MSCs。MSCs培养于由IMDM培养液,10%特等优质胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和青霉素100 ug/ml、链霉素100μg/ml组成的完全培养基,首次于接种后24h换液,以后每3d换一次液。在相差显微镜下观察到:接种到培养瓶的原代细胞于接种后4小时开始贴壁,24小时后明显贴壁,3-5天后逐渐融合成片,细胞融合达80%-90%;原代培养的细胞较混杂,MSCs的形态大部分为梭形的成纤维细胞状,扁平状的细胞为其他基质细胞;随着换液次数的增加,悬浮的造血细胞逐渐减少,梭形的成纤维细胞状细胞逐渐增多。为了诱导MSCs向心肌分化,取材48小时后,将融合至70-80%的MSCs置入诱导培养基:10%优质胎牛血清、100 ug/ml青霉素、100μg/ml链霉素的IMDM中分别添加不同实验浓度的5-氮胞苷(5、10、15、μmol/L5aza)、二甲基亚砜(0.6%、0.8%、1.0% DMSO)、催产素(1×10-7、3×10-7、5×10-7μmol/L OT)、骨形态蛋白2(0.1、0.2、0.4ng/mL BMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(0.8、1.0、1.2ng/mL FGF-2)诱导剂。依次于24h、24 h、96 h、72 h、72 h后更换为完全培养基,阴性对照组采用完全培养基培养,每3天换一次液。为了鉴定各种诱导剂诱导分化的大鼠MSCs中是否含有心肌样细胞,进行了形态学观察和分子标志的检测。相差显微镜下观察到:在诱导后1-2w,少量成纤维细胞样的MSCs逐渐变长和变宽大,转变为具有肌管形成细胞形态特点的杆状或球状,椭圆形单核或多核细胞,到第3-4w部分细胞与周围细胞聚在一起。免疫细胞化学检测:诱导后的MSCs中均可见结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)阳性细胞,5μmol/L 5aza、1.0% DMSO、1×10-7μmol/L OT、0.2 ng/mL BMP-2、1.0 ng/mL FGF-2组阳性细胞明显较其他组多,细胞分化率最高(P<0.01),desmin、α-sarcomeric actin阳性率较高,而c-TnT阳性率较低。激光共聚焦扫描显微镜观察:可见细胞质内desmin的表达呈红色,cTnT的表达呈绿色,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。同样细胞质内有α-sarcomeric actin表达的呈红色,有C-TnT表达的呈绿色,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。透射电镜观察:分化细胞的细胞核位于细胞中央,细胞质内可见到平行排列的肌丝,大量的粗面内质网和线粒体,富含糖原和核糖体。半定量RT-PCR结果显示:诱导7d后,MSCs弱表达GATA4,21d时表达增强,28d时表达减弱。诱导7d后,MSCs不表达α-MHC,21d弱表达,28d表达明显。各时间点BMP-2诱导组基因表达均明显强于其它各组(P<0.01)。2骨形态蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子对P19细胞向心肌细胞分化的影响将P19细胞接种于铺有0.5%软琼脂的培养皿中,分别用含0.2 ng/mL BMP-2和1.0 ng/mL FGF-2的分化培养基培养P19细胞, 24h后即可见多个悬浮的细胞团形成。细胞团呈球形,形状较规则,直径随时间延长不断增大,至第4天形成细胞聚集体/EBs。将细胞聚集体/EBs接种于预置有盖玻片的24孔培养板中,用不含BMP-2和FGF-2的培养基继续培养。倒置显微镜下观察可见EB样结构形状规则,位于EB中央的细胞密集、颜色较深,为EB的内核。EB开始贴壁生长后,中央细胞多层排列,增殖速度较快,细胞体积较小,具有高核质比,为未分化细胞;由EB边缘逐渐爬出细胞,在周边形成单层的生长晕。细胞生长晕中一些细胞变形,胞体伸长,体积增大,细胞呈放射状排列。免疫细胞化学鉴定:EB边缘生长晕中变形的细胞表达α-sarcomeric actin和cTnT。α-sarcomeric actin阳性率较高,而c-TnT阳性率较低。激光扫描共聚焦显微镜观察:在激光的激发下,各实验组EB边缘生长晕的部分细胞胞质中有α- sarcomeric actin表达的连接通道呈红色丝状免疫荧光标记,有cTnT表达的连接通道呈绿色丝状免疫荧光标记,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。透射电镜观察未经诱导的P19细胞胞核较大,细胞器丰富分布于细胞核周围,胞质中可见大量糖原颗粒。诱导后的细胞接近心肌细胞,具有心肌细胞发育早期的特征:单一卵圆细胞核;细胞器丰富,有较多的线粒体、内质网和高尔基体;胞浆中有较成熟的平行排列的成束肌丝,尚未形成肌节样结构。3观察大鼠MSCs同种异体移植后在梗死心肌中的存活、分化及对左室功能的影响采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。按照对MSCs的处理方式和心肌内注射的成分不同随机分为3组:A组12只,大鼠心肌梗死后接受MSCs移植治疗;B组12只,大鼠心肌梗死后移植经5-aza体外诱导的MSCs;C组12只,列为对照组,大鼠心肌梗死后注射等量培养基。纳入分组的对象排除了建模和心肌内注射等任一环节失败的实验动物。分别于干细胞移植后2周、4周,常规取材,通过HE染色观察移植细胞的存活和分布,通过心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)和α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色观察细胞形态学变化。HE染色观察到移植细胞分布于心外膜下、梗死区及与正常心肌的交界处。免疫细胞化学染色结果显示:(1)在移植2周,移植部位有较少的α-sarcomeric actin阳性细胞,在移植后4周,阳性细胞数量较多。(2)移植后2周,仅见个别移植细胞cTnT阳性表达。移植后4周,在位于移植区与正常心肌交界处的部分移植细胞胞质中cTnT表达阳性。免疫细胞化学鉴定结果证明在移植2周,MSCs开始向成肌细胞方向分化,4周后MSCs向心肌细胞分化。4周后通过血流动力学各项指标评价MSCs移植对大鼠心功能的改善情况。结果:与对照组C组相比,移植组A, B两组LV功能显着改善(P<0.01)。A, B两组之间无显着性差异。移植组左心室收缩压(LVSP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp/dtmax)明显高于对照组(P<0.01),左心室舒张末期压(LVEDP)明显低于对照组(P<0.01)。结果提示:同种异体MSCs移植入大鼠心肌梗死区后能明显改善心肌梗死后大鼠的心功能。小结1大鼠MSCs在体外经5-aza、DMSO、OT、BMP-2、FGF-2诱导可定向分化为心肌样细胞。电镜及免疫细胞化学研究显示分化的心肌细胞具有早期心肌细胞的结构特征。2 5-aza、DMSO、OT、BMP-2、FGF-2诱导分化过程中MSCs内心肌细胞分化相关转录因子GATA4的表达随诱导时间变化提示它可能参与MSCs向心肌样细胞分化的转录调控。3 BMP-2、FGF-2暴露结合悬浮培养可有效的促使P19细胞聚集形成囊性EBs,并诱导P19细胞向心肌细胞分化。4同种异体MSCs可在梗死大鼠心脏存活、迁移分布,并能分化为心肌样细胞。5 MSCs在被移植到缺血心肌组织中后,周围的微环境可以诱导MSCs向功能肌细胞分化,导致移植后动物心功能明显增加。与未诱导的MSCs相比,5-aza诱导的MSCs移植并未表现出更多的优越性。
高全文[8](2006)在《携带VEGF165的腺病毒转染骨髓基质干细胞与煅烧骨复合的实验研究》文中研究说明研究目的: 1.研究大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)生长特点和诱导条件下向成骨细胞分化的能力及其成骨特点。2.成功构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),重组腺病毒转染大鼠MSCs,观察细胞内VEGF165的表达情况以及重组腺病毒对MSCs生长的影响。3.探索Ad-VEGF165转染的MSCs在胶原中的生长能力,以及VEGF165在胶原中的分泌状况。4.观察经胶原涂层处理的煅烧骨(CCB)对大鼠MSCs的贴附、增殖及分化的影响。5.观察大鼠MSCs/煅烧骨/Ⅰ型胶原复合物修复颅骨骨缺损的能力。6.探索Ad-VEGF165转染的MSCs和煅烧骨复合植入体内异位成骨和血管再生的能力。 研究方法: 1.大鼠MSCs用全骨髓贴壁法培养,并经矿化液诱导,行ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原的测定,以及行MSCs矿化结节形成能力检测和细胞生长曲线测定。2.构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,并转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy—1的BJ5183感受态细胞中,成功构建pAdEasy—VEGF165质粒,并用pAdEaSy—VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒,荧光显微镜下观察绿色荧光表达。构建成功的重组腺病毒转染MSCs,行PT-PCR、免疫组化和ELISA,测定VEGF165的表达。3.Ad-VEGF165转染的MSCs行DAPI标记,与胶原混合并培养。行HE染色和免疫荧光观察。4.煅烧骨表面以鼠尾胶原行涂层处理,将矿化液诱导的MSCs滴加支架材料上,扫描电镜下观察细胞形态,并绘制生长曲线,检测成骨细胞的ALP活性。5.大鼠颅骨上制作直径8mm圆形全层骨缺损,用诱导培养的MSCs与煅烧骨
方秀统[9](2006)在《BMP-2和VEGF-165双基因共转染大鼠骨髓基质干细胞体内成骨的实验研究》文中研究说明因创伤及病理因素导致的骨缺损、骨不连的治疗,一直是一个棘手的难题。探索新的方法提高骨愈合和促进骨形成是治疗骨缺损骨不连的最佳途径。基因治疗的研究是最有前途的领域之一,故成为最近几年的研究焦点。具有提高骨愈合能力的各种因子已被研究,在众多骨生长因子中,骨形态发生蛋白(BMP)是其中最重要的一种,它已被公认为是目前最强的骨诱导因子,也是最有前途的。而骨组织的发育、改建、愈合均离不开血管生成,血管生成与早期骨形成密切相关。但关于VEGF是否是BMP诱导成骨过程中的必要条件,应用VEGF基因促进血管生成能否促进成骨、提高骨愈合未见报道,BMP基因和VEGF基因在成骨过程中的关系未见报道,是否给予外源性的VEGF能够进一步加速骨形成及愈合,是否影响骨形成和骨修复的其他重要环节,目前尚未研究清楚。本研究主要探讨VEGF和BMP在骨形成过程中的相互关系及对骨形成的作用,这样我们可以发现一个新的方法去提高骨愈合,修复骨缺损。本研究的设计正是通过观察BMP2基因及VEGF-165基因转染大鼠BMSC的体内成骨模型,阐明VEGF和BMP在骨形成过程中相互关系,是否存在协同效应,为进一步进行该方面的研究提供实验基础,同时也为BMP2及VEGF-165双基因共转染BMSC将来用于其他更广泛的基因治疗积累经验。总结如下:1.VEGF-165和BMP2单基因及双基因共表达质粒的成功构建、鉴定。2.BMSC在体外具有明确的成骨分化能力。3.脂质体介导BMP2和VEGF-165双基因表达质粒转染体外培养的大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)可有效表达。4.VEGF独自不能诱导骨形成,但具有促进和提高BMP2诱导骨形成的作用。
张年春[10](2004)在《重组BMP2和Angiopoietin-1腺病毒诱导肌源性干细胞成骨的实验研究》文中研究说明骨缺损和骨不连仍然是目前临床面临的难题。骨组织工程的研究达到的修复效果尚不尽如人意。目前尚未找到理想的运送成骨诱导因子的种子细胞及其载体。近来从啮齿类动物肌肉中分离的肌源性干细胞(muscle-derived stem cells, MDSCs) 来源广泛, 体外扩增快, 具有成骨潜能, 可能成为组织工程的种子细胞.。BMP2?具有强大的诱导成骨能力 , 而VEGF(vascular endothelial growth factor,VEGF)参与了BMP2诱导的骨形成,,提示成骨诱导因子与血管形成诱导因子之间可能存在协同作用。Angiopoietin-1 (Ang1)是一种新的血管诱导因子,它在骨愈合中的作用尚不清楚。因此,本研究设计用重组BMP2和 Ang1腺病毒转染的MDSCs诱导成骨。本研究分为以下六部分:第一部分研究兔桡骨骨折后不同时相点Ang1和Tie-2受体的表达,免疫组化染色表明,骨折后骨折端成骨细胞,成骨前体细胞,新生血管内皮细胞和周细胞,骨髓腔有核细胞表达Ang1和Tie-2受体。RT-PCR和ELISA检测结果表明,骨折后8小时即可检测到Ang1和Tie-2受体的表达,Ang1和Tie-2受体的表达分别于骨折后72小时1周到达峰值,以后逐渐下降,8周恢复到基线水平。Ang1和Tie-2受体的表达与血肿机化期和原始骨痂形成期吻合,提示Ang1和Tie-2受体在骨折愈合过程的新生血管形成中起重要作用。第二部分包括兔原代MDSCs的分离,鉴定和诱导分化。改进了小鼠MDSCs的分离方法,分离兔MDSCs,用Bcl-2和desmin免疫细胞化学染色法进行鉴定,并用成骨细胞分化培养基诱导MDSCs分化,诱导2周后能表达碱性磷酸酶,骨钙素和Ⅰ型胶原,表明分离的MDSCs在体外能被诱导分化为成骨细胞样细胞;用成肌细胞分化培养基诱导2周后形成多核细胞或核链,表明分离的MDSCs在体外可向成肌细胞分化。本研究结果表明肌肉组织中存在成骨前体细胞; MDSCs具有多向分化潜能,是一种组织特异性干细胞;MDSCs具有成骨潜能,可作为骨组织工程和基因治疗的种子细胞。第三部分构建了重组人Ang1的腺病毒载体AdAng1,并用该载体在体外转染分离培养的MDSCs, 免疫细胞化学染色显示转染细胞中Ang1的表达。提取细胞总RNA和总<WP=13>蛋白, 用RT-PCR和ELISA检测转染细胞中Ang1的表达量的变化。结果表明,AdAng1能在MDSCs中有效表达,转染后3天免疫细胞化学染色即显示转染细胞中存在Ang1阳性染色颗粒;Ang1的表达峰值在转染后9天,表达时间可持续到18天以上。对腺病毒转染MDSCs生长状态的观察,表明腺病毒对MDSCs的生长有一定的抑制。第四部分构建了重组人BMP2腺病毒载体AdBMP2, 体外转染MDSCs,用免疫细胞化学染色显示转染细胞中BMP2蛋白的表达以及转染细胞表面标志的变化,提取细胞总RNA和总蛋白,用RT-PCR 和ELISA检测转染细胞中目的基因的表达量变化。RT-PCR和ELISA检测表明AdBMP2转染MDSCs后转染9天表达为峰值,表达时间至少可持续18天。转染后3天可见细胞中存在BMP2阳性染色颗粒;转染后14天,转染细胞碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性,表明它们向成骨细胞样细胞分化。说明分离的MDSCs具有诱导成骨潜能,可作为骨组织工程和基因治疗诱导成骨的种子细胞。第五部分用AdBMP2和AdAng1转染MDSCs以不同比例混合培养, 观察其体外诱导成骨的效率。用免疫细胞化学染色显示目的基因的表达以及转染后细胞表面标志的变化,检测培养上清中ALP含量表示成骨活性。用茜素红染色显示钙结节形成的分布范围和大小。结果表明,单纯AdAng1转染的MDSCs不能在体外诱导骨形成。只有AdBMP2转染MDSCs/AdAng1转染MDSCs(4:1)混合培养和单纯AdBMP2转染的MDSCs在体外能诱导钙结节形成, 2周时大部分细胞ALP,骨钙素和Ⅰ型胶原免疫染色阳性,3周时形成钙结节,表明它们分化为成骨细胞,二者ALP含量相差不显着,而前者形成的钙结节更大,数量更多。结果提示AdBMP2转染MDSCs/AdAng1转染MDSCs(4:1)混合培养,在体外诱导成骨效果最好。第六部分体内诱导成骨实验。把AdBMP2和AdAng1,以及两种腺病毒体外转染的MDSCs以不同比例肌注到成年兔腓肠肌中以诱导异位骨形成。用光镜观察和X线片评价异位骨形成的效率。SPECT检测注射局部血流量的变化。免疫组化显示腺病毒转染后目的基因的表达,阿尔新蓝染色显示软骨内骨化。结果表明,AdBMP2/AdAng(4:1) 和单纯AdBMP2肌注后4周出现组织学可见的异位骨形成,8周少数动物(1/5)出现X线片可见的云雾状异位骨形成; AdBMP2转染MDSCs/AdAng1转染MDSCs(4:1)以及单纯AdBMP2转染的MDSCs肌注,4周时组织学上可见明显的骨样组织,8周时多数动物(分别为4/5和3/5)出现X线片可见的异位骨形成。表明腺病毒体外转染MDSCs后肌注诱导异位骨形成的效率明显高于腺病毒直接肌注的效率。免疫组化显示,腺病毒在体内表达BMP2和Ang1达 4周以上。部分纤维组织中的骨形成,阿尔新<WP=14>蓝染色显示软骨细胞呈阳性染色,表明AdBMP2和AdAng1 通过膜内骨化和软骨内骨化两种途径诱导异位骨形成。AdBMP2转染MDSCs/AdAng1转染MDSCs(4:1)混合的细胞与单纯AdBMP2转染MDSCs比较,肌注后,前者诱导异位骨形成的效率稍高于后者,提示BMP2是诱导骨形成的主要细胞因子,Ang1在BMP2诱导的异位骨形成中可能起一定作用。通过本课题的研究,得出如下主要结论:1. 首次研究了骨折后Ang1和Ti
二、血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞(论文提纲范文)
(1)rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一部分 大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立 |
1 研究内容与方法 |
1.1 实验试剂 |
1.2 实验设备 |
1.3 实验动物及伦理 |
1.4 单边可延长式微型外固定架的设计与研制 |
1.5 大鼠股骨牵张成骨模型的建立 |
1.6 观察与检测指标 |
1.7 统计学方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及慢病毒介导RHPDGF-BB体外转染 |
1 内容与方法 |
1.1 实验材料与试剂 |
1.2 实验设备 |
1.3 实验动物 |
1.4 实验方法 |
1.5 统计学分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三部分 rh PDGF-BB基因转染BMSCS促进大鼠股骨牵张成骨区新生骨矿化的作用 |
1 内容与方法 |
1.1 实验试剂 |
1.2 实验设备 |
1.3 实验方法 |
1.4 实验动物及分组 |
1.5 观察与检测指标 |
1.6 统计学方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读博士学位期间获得的学术成果 |
个人简历 |
导师评阅表 |
(2)淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 研究背景 |
一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
1. HGF的概述 |
2. HGF对干细胞的影响 |
三、线粒体自噬的研究进展 |
1. 线粒体自噬的概述 |
2. 中药调控线粒体自噬 |
第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
一、实验材料 |
1. 实验细胞 |
2. 实验仪器 |
3. 实验试剂与耗材 |
4. 主要试剂的配制 |
二、实验方法 |
1. 细胞培养 |
2. MTS法测细胞活力 |
3. CCK8法测细胞活力 |
4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
8. 质粒提取与细胞转染 |
9. ELISA法测蛋白表达 |
10. 统计学方法 |
三、实验结果 |
1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
四、讨论 |
第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
1. MTS法测细胞活力 |
2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
6. 电镜检测 |
7. 统计学方法 |
三、实验结果 |
1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
四、讨论 |
第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
1. 蛋白浓度测定结果 |
2. 差异蛋白筛选结果 |
3. 生物信息学分析 |
四、讨论 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文情况 |
致谢 |
附件 |
(3)川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一部分 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血的治疗作用 |
一、实验材料与方法 |
(一) 实验动物 |
(二) 实验试剂 |
(三) 实验仪器 |
(四) 实验方法 |
1. 骨髓间充质干细胞分离培养 |
2. 骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 |
3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
4. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
5. 动物分组及BMSCs移植 |
6. 行为学评价 |
7. 梗死体积检测 |
8. 统计学分析 |
二、结果 |
(一) 骨髓间充质干细胞的形态学观察 |
(二) BMSCs表面标记物鉴定 |
(三) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠mNSS评分的影响 |
(四) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠粘胶揭除试验评分的影响 |
(五) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠角试验的影响 |
(六) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响 |
三、分析与讨论 |
(一) 骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
1. 骨髓间充质干细胞的分离、培养 |
2. 骨髓间充质干细胞的的鉴定 |
3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
(二) 川芎嗪预处理BMSCs移植改善脑缺血大鼠的神经功能 |
1. 川芎嗪预处理BMSCs移植改善了大鼠的行为学功能 |
2. 川芎嗪预处理BMSCs移植减少大鼠的梗死体积 |
四、小结 |
第二部分 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
一、实验材料与方法 |
(一) 实验动物 |
(二) 实验试剂 |
(三) 实验仪器 |
(四) 实验方法 |
1. BrdU标记骨髓间充质干细胞 |
2. BMSCs预处理 |
3. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
4. 动物分组及BMSCs移植 |
5. BMSCs向脑缺血损伤区归巢的检测 |
6. SDF-1免疫荧光检测 |
7. BrdU和SDF-1免疫阳性细胞计数 |
8. 统计学分析 |
二、结果 |
(一) BrdU标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率 |
(二) 川芎嗪预处理对BMSCs向脑缺血损伤周边区迁移的影响 |
(三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区SDF-1表达的影响 |
三、分析与讨论 |
(一) BMSCs体外BrdU标记的最佳时间和浓度的筛选 |
(二) 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
1. 川芎嗪预处理促进BMSCs归巢 |
2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后SDF-1的表达 |
四、小结 |
第三部分 川芎嗪预处理BMSCs移植治疗脑缺血的机制研究 |
一、实验材料与方法 |
(一) 实验动物 |
(二) 实验试剂 |
(三) 实验仪器 |
(四) 实验方法 |
1. BMSCs预处理 |
2. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
3. 动物分组及BMSCs移植 |
4. 脑缺血损伤周边区血管生成检测 |
5. VEGF和BDNF免疫荧光检测 |
6. vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞计数 |
7. 统计学分析 |
二、结果 |
(一) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠血管生成的影响 |
(二) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区VEGF表达的影响 |
(三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区BDNF表达的影响 |
三、分析与讨论 |
(一) 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血治疗作用的机制探讨 |
1. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的血管生成 |
2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的神经营养因子分泌 |
四、小结 |
结论 |
参考文献 |
附图 |
致谢 |
文献综述 |
参考文献 |
(4)骨髓基质干细胞治疗淋巴水肿和RA-PTAS对血压、肾功能影响的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 骨髓基质干细胞治疗淋巴水肿的实验研究 |
试验一 大鼠骨髓基质干细胞的分离、培养、鉴定 |
前言 |
材料 |
方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
试验二 诱导骨髓基质干细胞向淋巴管内皮细胞分化 |
前言 |
材料 |
方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
试验三 骨髓基质干细胞移植治疗动物模型淋巴水肿 |
前言 |
材料 |
方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
第二部分 RA-PTAS对血压、肾功能影响的研究 |
前言 |
材料 |
方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
致谢 |
在读期间发表论文 |
英文论文1 |
英文论文2 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
(5)黄芪对低氧环境下血管内皮细胞生长因子/基质细胞衍生因子-1诱导人骨髓间充质干细胞分化、迁移的干预作用的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词表 |
综述一 低氧对骨髓间充质干细胞影响的研究进展 |
参考文献 |
综述二 黄芪对干细胞的影响 |
参考文献 |
综述三 中医药干预骨髓间充质干细胞的研究进展 |
参考文献 |
前言 |
参考文献 |
第一部分 黄芪对低氧环境下VEGF诱导HBMSCS分化的干预作用的研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 黄芪对低氧环境下SDF-1诱导HBMSCS迁移的干预作用的研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图 |
致谢 |
个人简历 |
(6)脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩略语 |
第一部分 文献综述 |
1 干细胞治疗脑缺血损伤的研究进展 |
2 骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的研究概况 |
3 中医药影响骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的研究述评 |
4 中医药促进脑缺血损伤神经元重塑的研究 |
第二部分 研究思路 |
中医药联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤研究的思路与策略 |
第三部分 实验研究 |
前言 |
1 流行病学概况 |
2 脑缺血神经细胞损伤的级联反应机制 |
3 脑缺血损伤后神经细胞保护与修复策略 |
4 骨髓间充质干细胞移植保护神经细胞的基础和潜能 |
5 中医药保护脑缺血神经细胞损伤的优势 |
6 中医药对骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的影响 |
7 脑脉通对脑缺血神经细胞损伤保护作用的探索 |
参考文献 |
实验一 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
实验二 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞及神经营养因子的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
实验三 脑脉通对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞移植后向神经细胞分化的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
实验四 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
第四部分 结语 |
结语 |
第五部分 附录 |
病理照片 |
致谢 |
个人简历 |
(7)骨髓间充质干细胞和P19细胞体外诱导向心肌分化及细胞移植修复梗死心肌的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩写 |
研究论文 骨髓间充质干细胞和P19 细胞体外诱导向心肌分化及细胞移植修复梗死心肌的研究 |
引言 |
第一部分 骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌样细胞分化 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二部分 骨形态蛋白2 和碱性成纤维细胞生长因子对P19细胞向心肌细胞分化的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第三部分 骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的在体研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
综述一 |
综述二 |
综述三 |
致谢 |
个人简历 |
(8)携带VEGF165的腺病毒转染骨髓基质干细胞与煅烧骨复合的实验研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
实验研究 |
实验一 大鼠骨髓基质干细胞的生物学特性研究 |
实验二 应用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165重组腺病毒 |
实验三 重组腺病毒介导血管内皮生长因子165在骨髓基质干细胞中的表达 |
实验四 重组腺病毒转染的MSCs与胶原复合的体外实验 |
实验五 煅烧骨/胶原与诱导的MSCs复合的体外实验 |
实验六 煅烧骨粉/Ⅰ型胶原/MSCs复合物修复大鼠颅骨骨缺损的实验研究 |
实验七 Ad-VEGF165转染的MSCs与煅烧骨复合体内成骨和血管再生的研究 |
综述 |
全文总结 |
简历及攻读学位期间发表文章情况 |
致谢 |
(9)BMP-2和VEGF-165双基因共转染大鼠骨髓基质干细胞体内成骨的实验研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
绪论 |
第一章 文献综述8MP 基因和VEGF 基因的基因治疗研究进展、发展前景及在骨形成过程中的作用 |
参考文献 |
第二章 BMP-2 和VEGF-165 双基因共转染大鼠骨髓基质干细胞及转染细胞的鉴定 |
前 言 |
第一节 单基因及双基因共表达质粒的构建及鉴定 |
第二节 大鼠骨髓基质干细胞(Bone mesenchymal stem cell, BMSc)的体外培养及成骨分化的研究 |
第三节 脂质体介导的BMP-2和VEGF-165双基因转染大鼠骨髓基质干细胞及转染细胞的鉴定 |
参考文献 |
第三章 脂质体介导的BMP-2、VEGF-165 体外单基因及双基因在大鼠肌间隙成骨的初步观察 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
结论(创新点) |
讨论 |
参考文献 |
攻读博士学位期间发表的学术论文 |
中文摘要 |
英文摘要 |
致谢 |
(10)重组BMP2和Angiopoietin-1腺病毒诱导肌源性干细胞成骨的实验研究(论文提纲范文)
英文缩写一览表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
论文正文 |
第一部分 兔骨折后 Angiopoietin-1及其受体Tie-2的表达及其意义 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
照片 |
第二部分 兔肌源性干细胞的分离、鉴定及诱导分化 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
照片 |
第三部分 复制缺陷的重组Angiopoietin-1腺病毒的构建及其在肌源性干细胞中的表达 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
照片 |
第四部分 复制缺陷的重组BMP2腺病毒的构建及在肌源性干细胞中的表达 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
照片 |
第五部分 AdAng1和AdBMP2转染的兔肌源性干细胞体外诱导成骨的研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
照片 |
第六部分 重组腺病毒AdAng1和AdBMP2转染MDSCs诱导兔骨骼肌异位骨形成 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
照片 |
全文总结 |
致谢 |
文献综述 |
参考文献 |
研究生期间发表的论文 |
四、血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞(论文参考文献)
- [1]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)
- [2]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)
- [3]川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用[D]. 李琳. 浙江中医药大学, 2015(01)
- [4]骨髓基质干细胞治疗淋巴水肿和RA-PTAS对血压、肾功能影响的研究[D]. 何玉祥. 山东大学, 2013(10)
- [5]黄芪对低氧环境下血管内皮细胞生长因子/基质细胞衍生因子-1诱导人骨髓间充质干细胞分化、迁移的干预作用的研究[D]. 沈凌. 北京中医药大学, 2010(10)
- [6]脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响[D]. 刘敬霞. 北京中医药大学, 2007(04)
- [7]骨髓间充质干细胞和P19细胞体外诱导向心肌分化及细胞移植修复梗死心肌的研究[D]. 王海萍. 河北医科大学, 2007(06)
- [8]携带VEGF165的腺病毒转染骨髓基质干细胞与煅烧骨复合的实验研究[D]. 高全文. 中国人民解放军军医进修学院, 2006(09)
- [9]BMP-2和VEGF-165双基因共转染大鼠骨髓基质干细胞体内成骨的实验研究[D]. 方秀统. 吉林大学, 2006(10)
- [10]重组BMP2和Angiopoietin-1腺病毒诱导肌源性干细胞成骨的实验研究[D]. 张年春. 第三军医大学, 2004(01)