一、卡那霉素抗性基因在三孢布拉霉菌种中的表达（论文文献综述）
李娜,曲音波,杨培龙,余晓斌,罗玮[1]（2021）在《三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用》文中提出为解决三孢布拉霉转化过程中原生质体转化率低、孢子细胞壁厚难以导入外源载体等问题,本研究中构建了根癌农杆菌侵染原生质体的转化体系,同时克隆了与非同源末端连接修复途径相关的ku80基因,并将该转化体系应用于ku80的敲除中。将ku80基因敲除框插入双元载体pDHt-sk上构建了重组敲除载体pDH-85H3,通过化学转化法将敲除载体pDH-85H3导入根癌农杆菌LBA4404,并基于农杆菌介导法转化三孢布拉霉原生质体。结果表明,经潮霉素筛选和PCR鉴定,得到的20株转化子中,有18株的基因组插入了敲除框,转化率达90%。经鉴定有2株转化子发生了同源重组,敲除率为10%。该结论表明了根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体转化技术的可行性。
李娜[2]（2020）在《基于ku基因背景的三孢布拉霉遗传操作系统的初步构建》文中进行了进一步梳理三孢布拉霉是一类已用于工业化生产类胡萝卜素的丝状真菌,具有很重要的经济价值。利用传统诱变策略选育三孢布拉霉优良菌株效率低下,基于代谢工程改造技术则有望提升菌株改造效果。然而,三孢布拉霉的DNA双链断裂修复以非同源末端连接修复（Non-homologous End Joining,NHEJ）为主,同源重组（Homologous Recombination,HR）频率极低,造成遗传改造困难。因此,阻止三孢布拉霉胞内非同源末端连接修复对于开发针对该菌株的高效遗传改造工具具有重要的意义。本论文克隆并分析了三孢布拉霉中涉及非同源末端连接修复途径的基因Btku70和Btku80,并尝试对这两个基因进行敲除,获得三孢布拉霉敲除菌株ΔBtku70和ΔBtku80,在此过程中,探究了三种转化方法介导敲除的效率、缺陷突变株ΔBtku70和ΔBtku80与野生型菌株的表型差异,以及为三孢布拉霉开发了反向筛选标记。本论文的主要研究结果如下:（1）三孢布拉霉Btku70和Btku80基因克隆与生物信息学分析。基于三孢布拉霉基因组序列信息,通过blastp比对,克隆了三孢布拉霉Btku70基因和Btku80基因,结果表明Btku70基因全长2686 bp,c DNA序列长1839 bp,编码613个氨基酸,有2个结构域,分别为v WFA、KU78;Btku80基因全长2716 bp,c DNA序列长2202 bp,编码734个氨基酸,有3个结构域,分别为v WFA、KU80、Ku-PK-bind。氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,三孢布拉霉ku基因与瓜笄霉更相似,同源性更高。（2）比较了三种转化方法在介导三孢布拉霉Btku70、Btku80基因敲除的效果,构建了根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体的遗传转化系统。研究发现Ca Cl2/PEG介导的原生质体转化法因再生率低,在筛选培养基上没有出现转化子,根癌农杆菌介导孢子转化法得到11个转化子,但均为假阳性,而农杆菌介导原生质体转化的方法有20-30个转化子生长,经PCR检测和测序验证,18-21个转化子存在敲除片段,转化率为70%-90%,获得了1株ΔBtku70、2株ΔBtku80,敲除率为3%-10%。（3）ΔBtku70和ΔBtku80的表型分析。与三孢布拉霉野生型菌株相比,ΔBtku70和ΔBtku80两缺陷株在生长速率较慢,产孢量较少,对DNA分子损伤剂（H2O2、MMS）、温度、渗透压敏感度基本一致。但在遗传稳定性检测时,发现ΔBtku70菌株、ΔBtku80菌株在传到第5代时出现敲除基因恢复情况。（4）为三孢布拉霉开发新的反向筛选标记。在致死基因HSVtk的研究中发现,野生型菌株的生长不受底物F2d U的抑制,而携带有致死基因HSVtk的转化子随着培养基中F2d U浓度提高,生长逐渐受到抑制,浓度为50μmol·L-1时转化子无法生长,表明致死基因HSVtk可应用于三孢布拉霉的反向筛选。
吴元庆[3]（2020）在《代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究》文中认为虾青素和β-胡萝卜素是两种重要的类胡萝卜素,均具有多种生物活性,被广泛用于水产业、畜牧业、医药保健业等。化学合成产品安全性不符合人体要求,直接从生物体提取产率低、成本高。随着生物技术的发展,构建高产微生物细胞工厂受到重视,多种微生物已能异源合成虾青素和β-胡萝卜素,其中大肠杆菌应用最多。本研究即是遗传改造工程大肠杆菌,使其高产这两种类胡萝卜素。首先,筛选不同来源的β-胡萝卜素羟化酶（Crt Z）基因和β-胡萝卜素酮化酶（Crt W）基因,优化设计了九个虾青素人工操纵子,转化入高产β-胡萝卜素的大肠杆菌ZF237T,获得九株重组ZF237T菌株,虾青素的产量从0.49 mg/L到8.07 mg/L。随后,基于产虾青素的操纵子,设计构建了Crt Z和Crt W的融合蛋白质,结果表明Crt Z在融合蛋白质的N-端时更有利于虾青素的生产,将不同的肽linker引入融合蛋白质,这一现象更明显,虾青素的产量也被提高,其中最优菌株ZF237T/Crt ZAs-（GS）1-WBs虾青素产量与菌株ZF237T/Crt ZAs-WBs和ZF237T/crt ZBsWPs相比分别提高了127.6%和40.2%,碳源优化后,该菌株虾青素产量达到26.16 mg/L。其次,在菌株ZF43Δgdh A中敲除zwf,所得菌株ECW1的生物量降低26.2%,β-胡萝卜素产量和胞内含量分别提高5.1%和32.5%。在菌株ECW1中敲除基因簇pts HIcrr,所得菌株ECW2的β-胡萝卜素产量提高61.8%,为197.44 mg/L,但β-胡萝卜素胞内含量降低。胞内辅因子含量测定表明,菌株ECW2胞内NADPH限制了其β-胡萝卜素胞内含量,随即,围绕NADPH的供给,多种组合被实施以提高菌株的β-胡萝卜素胞内含量,获得最优菌株ECW4/p5C-nad K,高细胞密度发酵,β-胡萝卜素最高产量2,579.1 mg/L。对菌株ECW1和ECW2进行了比较转录组学分析。zwf的敲除下调了菌株ECW1的嘌呤从头合成和核糖体大亚基合成途径,上调了菌株的TCA循环和回补途径而下调了糖酵解和磷酸戊糖途径大部分基因的表达,这些因素造成菌株ECW1生物量的下降;另一方面,zwf的敲除上调了ppc、pck、NADPH和异源途径相关基因的表达,这对提高菌株胞内β-胡萝卜素含量有利。zwf和pts HIcrr的双敲除下调了菌株ECW2中心碳代谢、能量代谢、辅因子代谢,使菌株的代谢网络达到一个新的平衡,协调了菌株碳流,有利于菌株的生物量和β-胡萝卜素的生产,而NADPH、MEP途径及异源途径相关基因的表达被显着下调是菌株ECW2的β-胡萝卜素产量下降的主要因素。最后,验证zwf的敲除提高了菌株ECW1的葡萄糖运输蛋白质基因pts G和gal P的相对转录水平后,通过启动子替换在菌株ECW1中过表达这两个基因,调整发酵方式,均提高了β-胡萝卜素产量和胞内含量。随后,将过表达引入菌株ZF43Δgdh A中,过表达pts G时,菌株β-胡萝卜素产量和胞内含量均提高。最后,利用过表达pts G和gal P的菌株生产芳樟醇,过表达pts G时菌株产量最高。证明大肠杆菌中过表达pts G有助于提高萜类化合物的生产。本文采用代谢工程策略,显着提高了工程大肠杆菌类胡萝卜素的产量,探寻了一般规律及菌株对改造的遗传响应,发现了新的可提高大肠杆菌萜类化合物产量的遗传改造位点。研究结果对其他天然产物的异源合成具有一定的指导意义,所得高产菌株具有一定的工业应用潜力。
黄之恒[4]（2020）在《农杆菌介导真姬菇节孢子遗传转化系统的构建与运用》文中进行了进一步梳理真姬菇是一种来自北温带的大型食用真菌,属于珍稀食用菌种。自上世纪八十年代自日本引入我国以来,历经数十年的产业培养,已成为我国食用真菌产业中不可或缺的一环。当前,真姬菇遗传转化系统的构建已经初步建立,但转化系统尚存在一定缺陷,使用的受体主要为原生质体,原生质体制备过程繁琐,需要使用溶壁酶消化菌丝体细胞壁,制备成功的原生质体需要保存在高渗溶液中以保持稳定的渗透压,由于原生质体非常脆弱,在离心收集原生质体时很容易因为过高的离心力而破裂。另外,部分原生质体在制备过程中有一定概率丢失细胞核,使得建立的转化体系效率过低,因此原生质体不是进行转化的理想材料,真姬菇节孢子因其制备方法简单,细胞不似原生质体般脆弱,且计数简单,可以更直观地表现转化效率且再生率较高,优于以原生质体作为受体的转化体系,因此本实验使用农杆菌介导转化法,以真姬菇节孢子作为受体进行转化,拟构建出一套成功的真姬菇遗传转化系统。本文的研究结果如下:1.对真姬菇单核菌丝产生节孢子数量的相关因素进行了研究,包括平板培养时间、菌株类型等。通过对比,最终确定不同的菌株类型产生的节孢子数量略有差异,但通过十天以上的培养通常可以获得106-108/ml数量级的节孢子。实验确定的最佳单核菌丝培养时间为20天。2.通过实验确定了农杆菌EHA105转化真姬菇节孢子的平板筛选条件,条件如下:萎锈灵2mg/L,头孢噻肟霉素300mg/L。3.实验以PCAMBIA2301为骨架,酶切切去卡那霉素抗性筛选基因并连接全新的β-胡萝卜素合成基因crt IBY,构建出全新的中间载体p001,进行酶切连接经过PCR扩增的来自杏鲍菇的完整萎锈灵抗性筛选基因获得重组质粒p Sdi-crt IBY,成功构建了携带Sdi筛选标记与GUS基因的转化质粒。4.将构建成功的重组质粒p Sdi-crt IBY转入到农杆菌菌株EHA105中,以真姬菇F4,F2,B5-15单核菌丝产生的节孢子作为受体材料,使用根癌农杆菌介导的转化方法进行实验。经过萎锈灵抗性筛选,PCR鉴定及GUS染色实验验证,证明了转化质粒上的外源基因成功转入真姬菇基因组中,实验成功得到了获得稳定遗传性状的转化子,构建了以真姬菇节孢子作为受体的农杆菌介导转化体系且转化效率相对目前所报道受体为原生质体的体系更高。5.实验选择了部分可能影响转化效率的条件并对这部分条件加以优化,条件分别为农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间及酚类物质作用。针对以上四个因素进行相关实验,最终优化结果为:最佳预培养农杆菌菌液浓度为OD6000.5,最佳节孢子侵染时间20min,最佳共培养时间48h,需要添加乙酰丁香酮。6.对转化子生长速度,菌丝表型加以测定并完成出菇实验。结果显示部分转化子生长速度与野生型菌丝相比出现变化,个别转化子菌落形态略有改变,这可能是由于在农杆菌转化过程中T-DNA的随机插入影响了DNA中与菌落形态的相关基因。同时菌丝颜色发生改变,接种块附近呈现淡黄色并逐渐向四周扩散,颜色随菌丝生长逐渐淡化。绝大多数转化子经过杂交配对后,在适宜的条件下可以正常出菇,子实体形态观察结果表明转化子形态较野生型未有较大区别。
牛诗佳[5]（2020）在《藏红花类胡萝卜素基因的原核表达》文中研究说明藏红花（Crocus sativus L.）作为一种名贵的中药材,以柱头所含丰富且特殊的类胡萝卜素物质被称为“植物黄金”。藏红花仅以柱头入药,人们始终希望通过各种方式解决其应用的资源瓶颈问题。已经阐明藏红花类胡萝卜素合成途径和相关基因,在此基础上本论文通过克隆藏红花柱头中类胡萝卜素合成的几个关键酶基因、并构建大肠杆菌的表达体系研究藏红花类胡萝卜素的合成问题。经反转录和聚合酶链式反应的方法获得了藏红花柱头表达的CsZCD（玉米黄素裂解酶基因）、CsCCD2（类胡萝卜素裂解双加氧酶2基因）以及醛脱氢酶（CsALDH）基因家族的CsALDH2、CsALDH3、CsALDH5、CsALDH6类胡萝卜素合成相关基因。采用同源重组的方法构建得到pET28a-Crt-ZCD和pET28a-Crt-CCD2玉米黄素合成载体以及pTRI-P-ALDH2、pTRI-P-ALDH3、pTRI-P-ALDH5、pTRI-P-ALDH6诱导型和组成型共12个表达型载体。在此基础上将质粒pET28a-Crt-ZCD或pET28a-Crt-CCD2单独以及分别与载体pTRI-P-ALDH2、pTRI-P-ALDH3、pTRI-P-ALDH5、pTRI-P-ALDH6共转化大肠杆菌,建立29个大肠杆菌类胡萝卜素合成体系。经有机溶剂萃取分离、高压液相分析大肠杆菌类胡萝卜素合成体系产物,获得较对照组保留时间为25 min,32 min,33 min的含量提高的三个类胡萝卜素物质、以及保留时间为16min,19min,21min,22min的四个类胡萝卜素新物质。本论文构建的体系为研究大肠杆菌中藏红花类胡萝卜素的合成提供了一定的理论和应用基础研究模型。
虞青蕙[6]（2020）在《利用运动发酵单孢菌基因元件构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株》文中研究说明β-胡萝卜素是天然的着色剂和营养增强剂,在食品行业受到广泛应用。目前,通过代谢工程菌株有望提高β-胡萝卜素的产量,从而替代天然提取或化学合成方法。由于β-胡萝卜素的生物合成涉及多个基因,构建高效合成代谢途径成为获得高产β-胡萝卜素工程菌株的关键。本论文利用合成生物学和代谢工程手段构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株,并联合理性改造、随机诱变和发酵优化技术建立了提高β-胡萝卜素产量的可行策略。主要研究内容及结果如下:1.β-胡萝卜素合成代谢途径组装及工程菌株构建。首先,分析运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4菌株的启动子元件活性,筛选出代表性的启动子和终止子元件分别构建元件库。其次,利用Golden Gate技术将来自成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC 1.2244的β-胡萝卜素合成基因簇与元件库进行随机组装并获得43株工程菌,其中Crt1-29的β-胡萝卜素产量最高为0.68 mg/g细胞干重（DCW）。2.理性设计优化β-胡萝卜素合成代谢。为进一步优化β-胡萝卜素生物合成途径,将β-胡萝卜素合成基因簇分为crtE、crtXYI和crtB三部分,分别与上述元件库组装成转录单元后再组装完整的代谢途径,最终获得46株工程菌,其中Crt2-20的β-胡萝卜素产量最高为0.83 mg/g DCW,相比Crt1-29提高了21.5%,这证明分别优化转录单元是提高生物合成的有效策略。此外,随机挑选出若干菌株对其β-胡萝卜素合成途径中组装的基因元件进行测序,各表达元件的使用频率和活性分析结果初步证实了优化启动子和终止子可以提高β-胡萝卜素产量。3.常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma,ARTP）诱变及筛选。为进一步提高β-胡萝卜素产量,利用ARTP对代谢工程菌株进行诱变处理,共筛选出65个突变株,产量有显着提升,较诱变之前分别提高了3-9%。4.产β-胡萝卜素工程菌株发酵过程优化。对发酵参数包括培养基种类、碳源、氮源和溶氧进行单因素实验,最终确定发酵培养基为2YT+1%蔗糖,发酵温度为37℃,发酵溶氧为30%。在此发酵条件下将突变株进行摇瓶发酵,突变株中A7和B8产量相比对照提升最高。接着将这两株菌进行发酵体积为3 L的批次发酵,结果显示,B8产量达到1.50 mg/g DCW,相比Crt2-22进一步提高了19.2%。综上所述,本研究采用代谢工程理性构建—ARTP随机诱变—发酵优化的策略,可有效提高β-胡萝卜素生物合成产量。
刘洋[7]（2019）在《三孢布拉霉发酵番茄红素的小分子代谢及工艺研究》文中提出番茄红素是一种广泛存在于自然界中的萜类衍生物。其作为一种功能性色素,目前被广泛用于食品和保健品中,为人们提供抗癌、抗衰老等功效。番茄红素的市场需求目前仍处于扩张阶段,相较于同属萜类衍生物的β-胡萝卜素,其价格居高不下。天然来源的番茄红素面临着植物来源受限、产能不稳定,纯度不高等问题。而化学合成的番茄红素虽然廉价易得,但是其副产物多,尤其在合成过程中形成的杂质对下游的应用安全带来了较大风险,难以达到食品和医药领域的使用要求。随着生物发酵工业的日趋成熟,利用微生物发酵生产番茄红素已成为工业界的首选技术。现阶段,三孢布拉霉（Blakesleatrispora）是在诸多能够合成番茄红素的菌株中唯一实现工业化生产的菌种。本课题以三孢布拉霉CBOM2014378（+）和CBOM2014379（-）为出发菌株,筛选出具有工业应用前景的阻断剂,并根据所选阻断剂相应建立了三孢布拉霉的番茄红素高产突变株选育策略,还建立了一种基于低安全风险阻断剂的发酵工艺,并在高产菌株基础上对发酵工艺进行了优化,并经中试验证。主要研究结果如下:1.阻断剂的筛选基于现行的国内外食品安全法规,有针对性的筛选允许在食品工业中有残留限量的物质,最终挑选出3种有效阻断剂,分别为尼古丁、咪唑、吡啶,其特点分别为尼古丁阻断效率高,足量添加时所产番茄红素纯度最高;咪唑已在国外用于工业生产,具有相对成熟的技术使用经验和市场法规接受度,其固体形态便于生产操作;吡啶最为廉价,且是唯一一个在国内食品安全法规中在列的物质,其使用成本和应用风险相对最低,但阻断效果最差。2.不同阻断剂对三孢布拉霉小分子代谢的影响在分别添加上述三种阻断剂的情况下,通过对三孢布拉霉发酵番茄红素过程中的小分子代谢物进行分析,发现使用尼古丁作为阻断剂的安全性风险相对较低,它不在菌体内代谢出有害衍生物,而咪唑在菌体内代谢出含苯环的衍生物,吡啶在菌体内生成含氮杂环衍生物。因此最终选择尼古丁为后续实验用阻断剂。3.番茄红素高产菌株的筛选通过N+诱变（+）菌,N+诱变、平阳霉素、氯化锂复合诱变（-）菌,使用乙烯利及尼古丁为筛选剂筛选（-）菌,其中乙烯利可在尼古丁存在时释放乙烯,从而刺激八氢番茄红素合成酶的表达,增强类胡萝卜素显色程度,后以（-）菌配对筛选（+）菌,得到高产菌株:BT-LYC2017802（+）菌和BT-LYC2017403（-）菌,摇瓶验证番茄红素最高发酵水平为2.3 g/L左右,较初始菌株提高44.2%。4.番茄红素高产菌株的50 L发酵罐小试工艺在50 L发酵罐水平建立基于新菌种的发酵工艺。以尼古丁为阻断剂,重新确立了其基础培养基,补料策略,阻断剂添加方式等,并建立溶氧控制模型,最终得到最高达到2.02 g/L的番茄红素产量,较初始发酵工艺1.21 g/L,提高了67%。通过通气量控制,节约能耗10%。使得番茄红素综合成本较初始下降85%。5.番茄红素高产菌株的1000 L发酵罐中试工艺验证基于50 L小试工艺进行等比例放大,以溶氧为主要控制参数,经124 h发酵得到1.83 g/L的番茄红素产量,工艺过程验证了溶氧控制模型的有效性,并确定发酵液中无尼古丁残留风险。
郭慧玲[8]（2018）在《Lactobacillus plantarum P-8适应抗生素环境过程中潜在分子机制的研究》文中指出近年来,研究者对于乳酸菌和抗生素联合用于胃肠道疾病的治疗产生了越来越浓厚的兴趣。乳酸菌常常出现于含有抗生素的环境中,它会发生怎样的适应性进化,以及是否会引发一系列的安全性问题成为了目前需要关注的焦点。本研究以分离自不同地区发酵乳制品中的53株乳杆菌为研究对象,首先对其常见抗生素的耐药性进行了分析。在此基础上,以其中一株乳酸菌Lactobacillus plantarum P-8（L.plantarum P-8）为出发菌,对乳酸菌在抗生素环境下的适应性分子机制进行了深入研究。试验过程中,将L.plantarum P-8在含有氨苄西林、克林霉素以及不含抗生素的培养基中连续培养12个月（2400代）。培养期间,对其活菌数、OD值和耐药性进行监测,并采用Illumina Hiseq技术对不同代菌株进行全基因组重测序。主要研究结果如下:（1）乳杆菌对15种抗生素的最小抑制浓度变化范围较大,表现出不同程度的耐药性;88.7%的菌株对一种或多种抗生素具有耐药性,只有6株乳杆菌对所有抗生素敏感;36株乳杆菌可检测出一定数量的抗性基因,但是都不会发生转移。（2）与不含抗生素的对照组相比,L.plantarum P-8在氨苄西林和克林霉素环境中的活菌数和OD值在24h时显着下降（p<0.05）,随着传代时间的延长逐渐与对照组趋于一致;L.plantarum P-8在氨苄西林环境和克林霉素环境中的最小抑制浓度变化趋势截然相反,前者从0.5μg/m L增加到16μg/m L,后者一直维持稳定。（3）在空白培养基、克林霉素和氨苄西林环境中,L.plantarum P-8不同代菌株（54株）共检出4、19和9处SNP突变位点,平均突变频率分别为7.68×10-7、1.64×10-6和2.52×10-6;三种环境共有突变谱包括CG->GC和CG->AT颠换,占总突变的37%和32%;CG->TA转换只发生在抗生素环境中,占总突变数的15%;空白培养基中菌株的转换与颠换比值（Ti/Tv）显着低于抗生素环境中连续培养的菌株（p<0.05）。上述结果表明,L.plantarum P-8在抗生素环境下可通过特定突变的累积提高菌株的适应性。（4）在空白培养基、克林霉素和氨苄西林环境中,L.plantarum P-8编码ABC转运蛋白均可检测到相同的突变位点,并从400代稳定遗传到2400代,侧面反映菌株在不同培养条件下发生着一种“趋同进化”;在氨苄西林环境中,青霉素结合蛋白与L.plantarum P-8适应性菌株耐药表型密切相关,且编码基因侧翼不存在可移动元件,说明点突变累积形成的耐药表型不存在安全隐患。综上所述,本研究结合实验室进化和全基因组重测序的方法,从基因组水平揭示乳酸菌在抗生素环境中的适应性进化分子机制,同时本论文从基因组水平对其安全性进行分析,可以为益生菌安全性评价提供新的见解和基础。
王岩岩[9]（2017）在《代谢工程方法提高大肠杆菌β-胡萝卜素产量的研究》文中研究说明β-胡萝卜素具有多种生理功能和生物活性,广泛应用于医药、食品添加剂、化妆品、保健品等领域。随着β-胡萝卜素代谢路径研究的不断深入,构建合成β-胡萝卜素的细胞工厂十分必要。本论文将来自成团泛菌P.agglomerans的基因簇crt EYIB引入大肠杆菌,构建出生产β-胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌,并从提高前体物、减少副产物以及优化代谢路径等方面出发,结合计算工程,获得一系列高产β-胡萝卜素的基因工程菌株,为大量生产β-胡萝卜素提供新的策略,本研究得到的主要结论如下:（1）敲除硫酯酶基因对MEP前体物丙酮酸的影响本文根据实验室已有的敲除合成脂肪酸相关基因（tes A、tes B、tes C）的菌株,即利用大肠杆菌无痕编辑方法——TRAGE（Tandem repeat assisted genome editing）,对相关菌株进行单敲除、双敲除、三敲除等操作,减少脂肪酸代谢路径对丙酮酸的消耗,使糖酵解产生的丙酮酸尽可能多地走向β-胡萝卜素合成方向。实验结果证明,MGKC、MGKCB和MGKCBA菌株对丙酮酸的积累量较高且三者相差不多,在此基础上,引入β-胡萝卜素外源基因——crt EYIB,WY006相比于出发菌株WY001提高了7倍,同时,WY006的乙酸含量最低。（2）敲除副产物乙酸合成基因在WY006的基础上,敲除副产物乙酸合成相关基因——磷酸乙酰转移酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack A）、丙酮酸氧化酶基因（pox B）,获得MGL1和WY010,后者乙酸含量明显低于前者为1.28 g/L,所得到的菌株WY011β-胡萝卜素产量为4.46 mg/L,相比于WY001提高11倍。（3）利用RBS Calculator对MEP途径和β-胡萝卜素合成路径相关基因进行RBS优化在菌株WY010的基础上重点对2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途经以及β-胡萝卜素合成途径进行基因改造。本文利用生物物理模型RBS Calculator辅助设计该代谢路径上相关基因的核糖体结合位点序列,同时结合TRAGE的方法完成了对MEP途径上限速基因dxs、idi,关键基因isp E、isp A、isp H的RBS改造,发酵结果显示Isp H的增强对β-胡萝卜素的产量造成不利影响。发酵得到β-胡萝卜素最高产量的菌株WY076为31.24 mg/L,随后对β-胡萝卜素合成路径上各基因crt E、crt Y、crt I、crt B分别进行RBS优化,获得WY077产量为38.18 mg/L,优化发酵条件得到最终产量为38.85 mg/L,而只含有β-胡萝卜素外源基因而没有作任何基因改造的原始工程菌株WY001β-胡萝卜素的含量仅为0.4 mg/L。补料分批发酵73 h得到β-胡萝卜素439.26 mg/L。
张映曈[10]（2017）在《卷枝毛霉生物合成番茄红素的研究》文中提出番茄红素是异戊二烯类化合物,属于类胡萝卜素的一种,是自然界最强的抗氧化剂之一,具有抗癌防癌、防治心血管疾病等多种生理功能。为了满足番茄红素在医药及营养领域的应用需求,通过生物技术大量生产高纯度、安全的番茄红素成为番茄红素合成技术的发展趋势。本论文在以类胡萝卜素为主要次级代谢产物的丝状真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）基础上,挑选产量较高的突变株为出发菌株,从改造番茄红素合成途径及调控路径两方面着手,通过分子生物学等手段获得了一株番茄红素高产菌株,并对其发酵条件进行初探,进一步提高了番茄红素产量。论文的主要研究结果如下:（1）解除卷枝毛霉类胡萝卜素合成途径的负调控因子crg A,提高卷枝毛霉类胡萝卜素合成:通过敲除卷枝毛霉MU206和MU218中限制类胡萝卜素合成的调控基因crg A,共获得了5株Δcrg A菌株,类胡萝卜素的主要成分（β-胡萝卜素）含量提高了4.847.6倍。相较于MU206,以MU218为背景构建的Δcrg A菌株类胡萝卜素产量提高更为显着,其中含量最高的是MU606,其β-胡萝卜素含量在黑暗和光照条件下分别达到3.00 mg/g和4.01 mg/g,是初始菌株MU218的47.6倍和5.4倍,是用于构建卷枝毛霉番茄红素高产菌株的潜力菌株;同时对卷枝毛霉MU206和MU218中潜在的类胡萝卜素调控机理进行了初步探索,发现MU218中存在类似于Crg A途径的新调控路径。（2）阻断番茄红素环化为β-胡萝卜素的反应,构建番茄红素生产菌株:在上述重组菌株MU606基础上,同时采用定点突变和化学诱变两种方式使番茄红素环化酶失活,最终获得三株红色突变株。测序结果显示三株突变株中编码番茄红素环化酶的car RP基因均发生了突变。突变导致MUt1和MUt2番茄红素环化酶活力部分丧失,而突变株MUt3的番茄红素环化酶则完全失活,其番茄红素含量在黑暗与光照条件下分别达到1.90 mg/g和3.64 mg/g,与MU606相比提高了30.6倍和21.4倍。根据不同突变株的类胡萝卜组成及含量对卷枝毛霉番茄红素环化酶的催化机制进行了研究:其蛋白结构中两个重复的R domain结构域分别负责γ-胡萝卜素到β-胡萝卜素和番茄红素到γ-胡萝卜素的反应,且第1个R domain的功能依赖于第2个R domain的作用。此外,发现番茄红素含量较高的菌株中存在反馈抑制效应。（3）强化番茄红素合成途径限速步骤,增加目的产物代谢流:首先通过转录组分析推测HMG-Co A还原酶（HMGr）是番茄红素合成途径的限速酶,在突变株MUt3基础上成功同源过量表达编码HMGr的三个拷贝（hmgr1,hmgr2,hmgr3）,揭示了HMGr在卷枝毛霉番茄红素合成过程中的作用:其中hmgr2、hmgr3的过量表达使番茄红素含量提高了2倍左右,说明其编码的HMGr是番茄红素合成途径的限速酶;而hmgr1的过表达并未造成番茄红素含量的变化,暗示其编码的HMGr可能参与了其他萜类物质的合成。本章获得了一株高产番茄红素的卷枝毛霉菌株MUhr3-1,在黑暗和光照条件下番茄红素含量分别达到3.75 mg/g和7.16 mg/g,是对照菌株的2倍。（4）抑制竞争代谢途径（脂肪酸合成途径）,为番茄红素合成增加底物:首先通过氮限制培养基考察了卷枝毛霉中脂肪酸和类胡萝卜素积累的关系:脂肪酸和类胡萝卜素的合成均受氮源的调控,积累同步,存在竞争关系;并通过转录组分析发现在类胡萝卜素产量较高的卷枝毛霉菌株中,编码脂肪酸合酶和乙酰辅酶A羧化酶（FAS和ACC）的基因转录水平较低,进一步证明脂肪酸与类胡萝卜素合成的竞争关系;最后在MUhr3-1基础上分别构建了FAS和ACC的RNAi菌株,通过下调FAS和ACC的表达水平使番茄红素的含量分别提高了14%43%和13%46%,然而菌体生长受到影响;为避免抑制FAS和ACC的表达导致的菌体生长受阻,在菌体积累完成后添加FAS和ACC抑制剂（浅蓝菌素、棕榈油、红花籽油和橄榄油）,进一步提高了番茄红素的含量。其中添加浅蓝菌素和棕榈油最高可使番茄红素含量提升至11.10和11.55 mg/g。（5）优化番茄红素合成发酵培养基碳源、氮源,提高番茄红素产量:以重组卷枝毛霉MUhr3-1为研究对象,考察碳源浓度、氮源的种类和浓度对番茄红素产量的影响,结果表明葡萄糖浓度为80 g/L、以大豆豆粕为氮源且浓度为25 g/L时番茄红素产量最高,与初始发酵条件相比提高了2.5倍。在发酵罐中进行扩大培养,发酵过程中添加棕榈油作为ACC抑制剂,发酵至120 h时番茄红素含量达到12.77±1.79 mg/g,与出发菌株MU218相比提高了386倍。同时番茄红素单位体积产量达到261.28±9.62 mg/L,是迄今为止报道的卷枝毛霉番茄红素最高产量的5倍。成功实现了在卷枝毛霉中番茄红素的高效合成。
二、卡那霉素抗性基因在三孢布拉霉菌种中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卡那霉素抗性基因在三孢布拉霉菌种中的表达（论文提纲范文）
（1）三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 抗生素和试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 三孢布拉霉ku80基因的克隆 |
| 1.2.2 敲除载体p DH-85H3构建 |
| 1.2.3 敲除载体转化根癌农杆菌LBA4404 |
| 1.2.4 三孢布拉霉原生质体的制备 |
| 1.2.5 根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体转化 |
| 1.2.6 三孢布拉霉转化子的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三孢布拉霉ku80基因的克隆 |
| 2.2 敲除载体p DH-85H3的验证 |
| 2.3 含敲除载体的根癌农杆菌阳性克隆子的鉴定 |
| 2.4 潮霉素B与头孢噻肟钠筛选压力的选择 |
| 2.5 三孢布拉霉转化子的鉴定 |
| 3 结语 |
（2）基于ku基因背景的三孢布拉霉遗传操作系统的初步构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 三孢布拉霉概述 |
| 1.2 DNA双链断裂修复机制 |
| 1.3 ku基因在丝状真菌中的研究进展 |
| 1.4 丝状真菌遗传转化系统 |
| 1.4.1 转化方法 |
| 1.4.2 筛选标记 |
| 1.5 提高丝状真菌基因打靶率的策略 |
| 1.5.1 设计合适的筛选标记策略 |
| 1.5.2 高效组装打靶载体 |
| 1.5.3 利用NHEJ缺陷株作为转化宿主 |
| 1.6 研究意义及主要内容 |
| 1.6.1 本论文的研究意义 |
| 1.6.2 本论文的主要内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和PCR引物 |
| 2.1.3 培养基及主要溶液 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 菌体培养及基因组的提取 |
| 2.2.1 菌体培养 |
| 2.2.2 三孢布拉霉总DNA和 RNA的提取 |
| 2.3 ku基因克隆与生物信息学分析 |
| 2.3.1 ku基因的克隆 |
| 2.3.2 ku基因的生物信息学分析 |
| 2.4 ku基因敲除载体的构建 |
| 2.4.1 ku70/ku80敲除片段的克隆 |
| 2.4.2 敲除载体的构建 |
| 2.5 三种转化方法介导ku基因的敲除 |
| 2.5.1 潮霉素B和头孢菌素的敏感度实验 |
| 2.5.2 碱裂解法快速提取基因组及转化子验证 |
| 2.5.3 CaCl_2/PEG介导的原生质体转化 |
| 2.5.4 根癌农杆菌LBA4404转化三孢布拉霉孢子 |
| 2.5.5 根癌农杆菌LBA4404转化三孢布拉霉原生质体 |
| 2.6 敲除株ΔBtku70和ΔBtku80 的表型分析 |
| 2.6.1 生长及产孢情况 |
| 2.6.2 对DNA分子损伤剂的敏感程度 |
| 2.6.3 温度、渗透压 |
| 2.6.4 遗传稳定性 |
| 2.7 反向筛选标记的开发 |
| 2.7.1 反向筛选标记表达载体的构建及转化 |
| 2.7.2 效果检验 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 三孢布拉霉ku基因的克隆和生物信息学分析 |
| 3.1.1 Btku70、Btku80 基因的克隆 |
| 3.1.2 ku基因的生物信息学分析 |
| 3.2 敲除载体构建 |
| 3.2.1 ku70/ku80敲除片段的克隆 |
| 3.2.2 敲除载体pDH-5H3的构建 |
| 3.3 三种转化方法介导ku基因的敲除 |
| 3.3.1 抗生素敏感实验 |
| 3.3.2 碱裂解法快速提取三孢布拉霉基因组条件优化 |
| 3.3.3 原生质体转化法介导ku基因的敲除 |
| 3.3.4 农杆菌侵染孢子转化法介导ku基因的敲除 |
| 3.3.5 农杆菌侵染原生质体转化法介导ku基因的敲除 |
| 3.4 ΔBtku70、ΔBtku80 的表型分析 |
| 3.4.1 生长及产孢情况 |
| 3.4.2 对DNA损伤剂的敏感程度 |
| 3.4.3 温度、渗透压 |
| 3.4.4 遗传稳定性 |
| 3.5 反向筛选标记的开发 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 萜类化合物的天然生物合成途径 |
| 1.2.1 异戊二烯单元的生物合成途径 |
| 1.2.2 萜类化合物生物合成的下游途径 |
| 1.3 萜类化合物合成的生物技术 |
| 1.3.1 天然宿主萜类化合物的生物合成 |
| 1.3.2 异源微生物合成萜类化合物 |
| 1.3.3 萜类化合物的无细胞体系合成 |
| 1.4 类胡萝卜素 |
| 1.4.1 类胡萝卜素的概述 |
| 1.4.2 β-胡萝卜素 |
| 1.4.3 虾青素 |
| 1.5 选题背景及研究内容 |
| 1.5.1 大肠杆菌中组合生物合成调控虾青素生产 |
| 1.5.2 大肠杆菌碳代谢扰动提高β-胡萝卜素的生产 |
| 第2章 虾青素操作子的构建和表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌的CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.2 大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.4 DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 DNA片段的纯化和回收 |
| 2.2.7 DNA片段的切胶回收 |
| 2.2.8 DNA片段的酶切反应和连接反应 |
| 2.2.9 菌液PCR |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 菌株的培养及摇瓶发酵 |
| 2.2.12 AX的定量检测 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 大肠杆菌生产AX初探 |
| 2.3.2 AX操纵子的优化再设计与构建 |
| 2.3.3 优化的AX操纵子发酵表征 |
| 2.3.4 优化的AX操纵子表达分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 β-胡萝卜素羟化酶与β-胡萝卜素酮化酶的融合 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重叠延伸PCR |
| 3.2.2 同源建模 |
| 3.2.3 菌株的碳源优化发酵 |
| 3.2.4 高效液相色谱检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 融合蛋白质的设计与构建 |
| 3.3.2 融合蛋白质中添加肽linker对AX生产的影响 |
| 3.3.3 菌株ZF237T/Crt Z_(As)-(GS)_1-W_(Bs)发酵碳源的优化 |
| 3.3.4 融合蛋白的同源建模 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 中心碳代谢扰动与NADPH供应提高β-胡萝卜素生产 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌中I-Sce I介导的λ-red重组系统无痕敲除基因 |
| 4.2.2 大肠杆菌中的MAGE技术 |
| 4.2.3 大肠杆菌生理参数的测定 |
| 4.2.4 辅酶Ⅰ和II胞内含量检测 |
| 4.2.5 菌株ECW4/ p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.2.6 定量测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 中心碳代谢途径的阻断对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.2 PTS系统失活对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.3 中心碳代谢扰动菌株的生理参数测定 |
| 4.3.4 菌株ECW1和ECW2 的还原力分析 |
| 4.3.5 增加NADPH的供应对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.6 菌株ECW4/p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 菌株ECW1和ECW2 的转录组分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株培养 |
| 5.2.2 转录组学 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 基因表达水平相关性分析 |
| 5.3.2 基因差异表达分析 |
| 5.3.3 菌株ECW1与ZF43ΔgdhA的比较转录组学分析 |
| 5.3.4 菌株ECW2转录组学分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 过表达葡萄糖运输蛋白对萜类化合物的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 溶液 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 大肠杆菌基因组上过表达基因 |
| 6.2.2 β-胡萝卜素的生成 |
| 6.2.3 芳樟醇的生成 |
| 6.2.4 β-胡萝卜素和芳樟醇的测定 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 zwf的敲除对基因ptsG和 galP转录的影响 |
| 6.3.2 菌株ECW1中过表达ptsG、galP对 β-胡萝卜素生产的影响 |
| 6.3.3 在菌株ZF43ΔgdhA中过表达ptsG和 galP |
| 6.3.4 葡萄糖运输蛋白基因的过表达对芳樟醇合成的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）农杆菌介导真姬菇节孢子遗传转化系统的构建与运用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 食用菌概述 |
| 1.1 中国食用菌产业情况概述 |
| 1.2 真姬菇概述 |
| 1.2.1 真姬菇简介 |
| 1.2.2 真姬菇营养成分 |
| 1.2.3 真姬菇形态特征 |
| 1.2.4 子实体发育过程 |
| 1.2.5 生长要素 |
| 2 根癌农杆菌介导的食用菌遗传转化研究 |
| 2.1 根癌农杆菌介导法的原理及研究现状 |
| 2.2 影响农杆菌转化效率的因素 |
| 2.2.1 农杆菌菌株 |
| 2.2.2 受体材料 |
| 2.2.3 活化vir区基因的酚类诱导物 |
| 2.2.4 共培养条件 |
| 3 β-胡萝卜素概述 |
| 3.1 β-胡萝卜素介绍及功能 |
| 3.2 β-胡萝卜素的化学合成路径 |
| 3.2.1 C16+C8+C15路线 |
| 3.2.2 C19+C2+C19路线 |
| 3.2.3 C20+C20路线 |
| 3.2.4 C15+C10+C15路线 |
| 3.3 β-胡萝卜素的生物合成路径 |
| 3.3.1 三孢布拉霉途径合成β-胡萝卜素 |
| 3.3.2 大肠杆菌途径合成β-胡萝卜素 |
| 3.3.3 红酵母合成β-胡萝卜素 |
| 3.4 crt IBY基因功能介绍 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 5 本课题技术路线 |
| 第二章 转化载体p Sdi-crt IBY构建 |
| 1.试验材料 |
| 1.1 .材料与试剂 |
| 1.2 农杆菌菌株的选取 |
| 2 质粒构建 |
| 2.1 质粒构建方法 |
| 2.1.1 质粒p Sdi-crt IBY构建方法 |
| 2.1.2 酶切及同源重组 |
| 2.1.3 DH5-α受体细胞转化 |
| 2.1.4 制备农杆菌转化菌株 |
| 2.2 质粒的分子鉴定 |
| 2.3 结果分析与讨论 |
| 第三章 农杆菌介导的真姬菇节孢子遗传转化技术体系构建 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基及溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 真姬菇单核菌丝的活化培养 |
| 2.2 真姬菇菌株对萎锈灵的敏感性实验 |
| 2.3 真姬菇及农杆菌对头孢噻肟霉素敏感性实验 |
| 2.4 真姬菇节孢子的获取 |
| 2.5 农杆菌的活化培养 |
| 2.6 农杆菌介导真姬菇节孢子转化及条件优化 |
| 2.6.1 转化步骤 |
| 2.6.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 |
| 2.6.3 侵染时间对转化效率的影响 |
| 2.6.4 共培养时间对转化效率的影响 |
| 2.6.5 酚类物质对转化效率的影响 |
| 2.7 转化子的筛选 |
| 2.8 转化子分子鉴定 |
| 2.8.1 真姬菇转化子的PCR验证 |
| 2.8.2 真姬菇转化子的GUS染色验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 真姬菇野生型菌株对萎锈灵的敏感性实验 |
| 3.2 真姬菇及农杆菌对头孢噻肟霉素敏感性实验 |
| 3.3 节孢子获取 |
| 3.4 转化条件优化 |
| 3.4.1 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 |
| 3.4.2 侵染时间对转化效率的影响 |
| 3.4.3 共培养时间对转化效率的影响 |
| 3.4.4 酚类物质对转化效率的影响 |
| 3.5 初筛转化子的PCR验证 |
| 3.6 拟转化子gus染色验证 |
| 3.7 抗性转化子的复筛 |
| 3.8 转化效率统计 |
| 4 讨论 |
| 第三章 真姬菇转化子的相关分析及杂交出菇 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株与试剂 |
| 1.2 培养基及送测公司 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 转化子生物表征测定 |
| 2.1.1 转化子生长速度 |
| 2.1.2 转化子菌丝形态 |
| 2.1.3 转化子遗传性状稳定性 |
| 2.2 杂交配对 |
| 2.2.1 一对可亲和的转化子杂交 |
| 2.2.2 转化子和野生型单核体杂交 |
| 2.3 双核体出菇 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转化子生物表征 |
| 3.1.1 转化子生长速度 |
| 3.1.2 转化子菌丝形态观察 |
| 3.1.3 转化子遗传稳定性 |
| 3.2 杂交配对 |
| 3.3 结实性实验 |
| 3.4 HPLC分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 硕士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）藏红花类胡萝卜素基因的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 藏红花研究概况 |
| 1.2 类胡萝卜素研究进展 |
| 1.3 植物中的类胡萝卜素合成研究 |
| 1.4 真菌中类胡萝卜素合成研究 |
| 1.5 细菌中类胡萝卜素合成研究 |
| 1.6 类胡萝卜素提取及检测方法研究 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种及质粒材料 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 试剂与生产厂家 |
| 2.1.4 仪器与生产厂家 |
| 2.1.5 培养基及试剂配置方法 |
| 2.1.6 抗生素及诱导剂配置方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藏红花柱头RNA提取(TRIzol法) |
| 2.2.2 RNA反转录 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.4 关键酶基因克隆 |
| 2.2.5 表达载体的构建 |
| 2.2.6 表达载体的小量诱导 |
| 2.2.7 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.8 原核表达载体的诱导表达 |
| 2.2.9 类胡萝卜素萃取 |
| 2.2.10 HPLC分析检测 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 藏红花RNA的提取及反转录 |
| 3.2 目的基因克隆 |
| 3.3 诱导型表达载体的构建 |
| 3.4 表达载体的诱导条件的确定 |
| 3.5 组成型表达载体的构建 |
| 3.6 表达载体HPLC结果 |
| 3.6.1 诱导型表达载体的HPLC结果 |
| 3.6.2 组成型型表达载体的HPLC结果 |
| 3.7 HPLC-MS结果 |
| 第4章 讨论和展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）利用运动发酵单孢菌基因元件构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 β-胡萝卜素概述 |
| 1.1.1 β-胡萝卜素的功能与应用 |
| 1.1.2 β-胡萝卜素的合成 |
| 1.1.3 β-胡萝卜素生物合成代谢途径 |
| 1.1.4 β-胡萝卜素代谢工程研究现状 |
| 1.2 运动发酵单胞菌概述 |
| 1.2.1 运动发酵单胞菌生产生物基化学品 |
| 1.2.2 运动发酵单胞菌基因表达元件启动子和终止子的研究与应用 |
| 1.3 DNA元件组装技术 |
| 1.4 诱变育种 |
| 1.5 论文设计 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2 β-胡萝卜素合成代谢途径组装及工程菌株构建 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 培养基与溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 DNA片段的扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 DNA片段纯化 |
| 2.2.6 DNA浓度的测定 |
| 2.2.7 Golden Gate DNA分子组装 |
| 2.2.8 大肠杆菌转化 |
| 2.2.9 大肠杆菌培养条件 |
| 2.2.10 菌株保藏 |
| 2.2.11 β-胡萝卜素测定 |
| 2.2.12 运动发酵单胞菌表达元件使用率的计算 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 β-胡萝卜素合成基因开放阅读框(ORF)途径的生物元件克隆 |
| 2.3.2 运动发酵单胞菌基因元件的分析和克隆 |
| 2.3.3 产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株的构建 |
| 2.3.4 优化β-胡萝卜素合成代谢途径组装 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 产β-胡萝卜素工程菌株诱变筛选 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 培养基与溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ARTP诱变处理 |
| 3.2.2 测定β-胡萝卜素 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ARTP诱变大肠杆菌方法的确定 |
| 3.3.2 高产β-胡萝卜素突变株的筛选 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 产β-胡萝卜素工程菌株发酵 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 培养基与溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 测定β-胡萝卜素 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 培养基的优化 |
| 4.3.2 发酵条件的优化 |
| 4.3.3 最适发酵条件下筛选高产β-胡萝卜素突变株 |
| 4.3.4 批次发酵对突变株产量的影响 |
| 4.3.5 补料批次发酵对突变株产量的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A β-胡萝卜素合成基因序列 |
| 附录B 运动发酵单胞菌基因元件序列 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及科研成果 |
| 致谢 |
（7）三孢布拉霉发酵番茄红素的小分子代谢及工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 番茄红素的性质与功能 |
| 1.1.1 番茄红素的理化性质 |
| 1.1.2 番茄红素的生理功能 |
| 1.2 番茄红素的生产方法 |
| 1.2.1 天然来源提取法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 微生物发酵法 |
| 1.3 三孢布拉霉发酵生产番茄红素 |
| 1.3.1 三孢布拉霉的诱变育种和工程菌的遗传改造 |
| 1.3.2 发酵工艺的调控 |
| 1.4 三孢布拉霉发酵生产番茄红素目前存在的问题 |
| 1.5 本研究的意义及主要内容 |
| 1.5.1 本研究的意义 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 第2章 三孢布拉霉发酵番茄红素的阻断剂筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与试剂、仪器 |
| 2.2.2 培养基与摇瓶培养条件 |
| 2.2.3 50L发酵罐培养 |
| 2.2.4 番茄红素的HPLC检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 番茄红素环化酶抑制剂的初步筛选结果 |
| 2.3.2 三孢布拉霉生长曲线与阻断剂添加时间 |
| 2.3.3 阻断剂添加梯度及结果 |
| 2.3.4 三孢布拉霉50 L发酵验证阻断剂效果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 阻断剂对三孢布拉霉小分子代谢的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与试剂、仪器 |
| 3.2.2 发酵与样品制备 |
| 3.2.3 检测条件 |
| 3.2.4 数据分析方法 |
| 3.2.5 软件SPSS 16.0 PCA法参数设定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 对照组数据分析 |
| 3.3.2 尼古丁实验组数据分析 |
| 3.3.3 咪唑实验组数据分析 |
| 3.3.4 吡啶实验组数据分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 三孢布拉霉的番茄红素高产菌株选育 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 本章使用的培养基及培养方法 |
| 4.2.3 诱变方法 |
| 4.2.4 目的菌株筛选方法 |
| 4.2.5 紫外分光光度计检测方法 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 诱变育种中(+)/(-)菌的存活率曲线 |
| 4.3.2 高产番茄红素菌株的筛选结果 |
| 4.3.3 不同突变株的稳定性考察 |
| 4.3.4 基础发酵工艺参数验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 三孢布拉霉小试发酵番茄红素的工艺优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 主要原料 |
| 5.2.3 主要设备 |
| 5.2.4 菌株培养方法 |
| 5.2.5 三孢酸的纯化及检测方法 |
| 5.2.6 八氢番茄红素的检测方法及样品制备 |
| 5.2.7 尼古丁的检测方法及样品制备 |
| 5.2.8 基础培养基组分的优化 |
| 5.2.9 发酵工艺的调控 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 基础培养基的优化 |
| 5.3.2 50L小试发酵工艺的调控优化 |
| 5.3.3 发酵工艺优化前后单位番茄红素产量的能耗成本对比 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 三孢布拉霉发酵产番茄红素的中试验证 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株 |
| 6.2.2 主要原料 |
| 6.2.3 主要设备 |
| 6.2.4 菌株培养方法 |
| 6.2.5 关键指标检测方法 |
| 6.2.6 发酵工艺 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 本文的创新与贡献 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（8）Lactobacillus plantarum P-8适应抗生素环境过程中潜在分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 益生菌 |
| 1.1.1 乳杆菌属 |
| 1.1.2 L.plantarum P-8的研究背景 |
| 1.2 乳酸菌耐药性的研究 |
| 1.2.1 抗生素 |
| 1.2.2 乳酸菌耐药性的出现 |
| 1.2.3 乳酸菌耐药基因的转移 |
| 1.2.4 乳酸菌的耐药机制 |
| 1.3 益生菌及其制品与抗生素联合治疗抗生素相关性疾病 |
| 1.3.1 益生菌与抗生素联合使用 |
| 1.3.2 酸奶与抗生素联合使用 |
| 1.4 微生物适应性进化研究的概述 |
| 1.5 全基因组重测序技术 |
| 1.5.1 全基因组重测序技术的发展趋势 |
| 1.5.2 全基因组重测序技术在乳酸菌中的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义以及主要内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.4.1 乳杆菌耐药性检测 |
| 2.4.2 乳杆菌抗性基因的检测 |
| 2.4.3 乳杆菌抗性基因转移的检测 |
| 2.4.4 L.plantarum P-8在含有抗生素环境中连续培养的研究 |
| 2.4.5 基因组数据分析 |
| 2.4.6 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 乳杆菌的耐药性 |
| 3.2 乳杆菌耐药基因的检测 |
| 3.3 乳杆菌抗性基因转移的检测 |
| 3.4 L.plantarum P-8在抗生素环境中的适应性进化 |
| 3.4.1 L.plantarum P-8生长曲线的制作和生长代数的确定 |
| 3.4.2 L.plantarum P-8在连续培养过程中MIC值的变化 |
| 3.4.3 L.plantarum P-8在连续培养过程中活菌数的变化 |
| 3.4.4 L.plantarum P-8在连续培养过程中OD_(600)值的变化 |
| 3.4.5 L.plantarum P-8在连续培养过程中细胞形态的变化 |
| 3.5 L.plantarum P-8连续培养过程中菌株的基因组重测序 |
| 3.5.1 重测序样本DNA的质量控制 |
| 3.5.2 样品纯度的检测 |
| 3.5.3 高通量原始测序数据的质控 |
| 3.5.4 基因组组装 |
| 3.5.5 SNP突变位点的分析 |
| 3.5.6 从头突变的分析 |
| 3.5.7 突变频率的分析 |
| 3.5.8 突变谱的分析 |
| 3.5.9 进化速率的分析 |
| 3.5.10 直系同源簇和代谢通路分析 |
| 3.5.11 基因突变位点的验证 |
| 3.6 L.plantarum P-8突变基因转移性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（9）代谢工程方法提高大肠杆菌β-胡萝卜素产量的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述及课题研究目的 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 β-胡萝卜素的生理功能及应用 |
| 1.2.1 维生素A的前体物质 |
| 1.2.2 强抗氧化性 |
| 1.2.3 增强免疫力 |
| 1.2.4 β-胡萝卜素的应用 |
| 1.3 β-胡萝卜素合成的代谢路径 |
| 1.3.1 糖酵解途径 |
| 1.3.2 MVA途径 |
| 1.3.3 MEP途径 |
| 1.3.4 β-胡萝卜素合成途径 |
| 1.4 系统代谢工程改造工程菌的策略 |
| 1.4.1 基因操作手段 |
| 1.4.2 计算技术 |
| 1.4.3 普遍的策略 |
| 1.5 选题目的与主要思路 |
| 1.5.1 选题目的 |
| 1.5.2 主要思路 |
| 2 前体物质合成模块的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 主要药品和仪器 |
| 2.1.3 主要溶液和培养基的配制方法 |
| 2.1.4 菌株的活化与保藏 |
| 2.1.4.1 安瓿管菌种的活化 |
| 2.1.4.2 菌株的活化 |
| 2.1.4.3 保藏 |
| 2.1.5 分子克隆技术 |
| 2.1.5.1 质粒提取 |
| 2.1.5.2 PCR反应 |
| 2.1.5.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.1.5.4 切胶回收 |
| 2.1.5.5 DpnI酶切 |
| 2.1.5.6 连接 |
| 2.1.5.7 连接产物转化 |
| 2.1.5.8 热激感受态细胞的制备 |
| 2.1.5.9 电转化感受态细胞的制备与转化 |
| 2.1.6 工程菌株的摇瓶发酵方法 |
| 2.1.6.1 不含外源基因菌株的摇瓶发酵 |
| 2.1.6.2 含外源基因工程菌株的摇瓶发酵 |
| 2.1.7 发酵产物的测定 |
| 2.1.7.1 副产物的检测方法 |
| 2.1.7.2 β-胡萝卜素的检测方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 β-胡萝卜素合成基因簇crt EYIB在大肠杆菌中表达载体的构建 |
| 2.2.2 酯解酶删除后菌株对前体物产量的影响 |
| 2.2.3 酯解酶删除后工程菌株的构建 |
| 2.2.4 工程菌株的摇瓶发酵实验 |
| 2.2.4.1 β-胡萝卜素产量分析 |
| 2.2.4.2 副产物乙酸水平分析 |
| 2.3 小结 |
| 3 副产物模块的优化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 3.1.2 主要药品和仪器 |
| 3.1.3 主要溶液和培养基 |
| 3.1.4 电转化感受态细胞的制备与转化 |
| 3.1.5 基因重组无痕编辑--基因删除 |
| 3.1.5.1 引物设计方法 |
| 3.1.5.2 cat-sacB扩增 |
| 3.1.5.3 待删除片段的扩增 |
| 3.1.5.4 负筛过程 |
| 3.1.5.5 pKD46去除过程 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 基因poxB的删除 |
| 3.2.2 基因工程菌株的构建 |
| 3.2.3 工程菌株的摇瓶发酵 |
| 3.2.4 基因acs的增强 |
| 3.3 小结 |
| 4 MEP途径和β-胡萝卜素合成模块的RBS优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 4.1.2 主要药品和仪器 |
| 4.1.3 主要溶液和培养基 |
| 4.1.4 核糖体结合位点序列的设计方法 |
| 4.1.4.1 RBS序列的设计 |
| 4.1.4.2 RBS的整合 |
| 4.1.5 MEP途径和β-胡萝卜素合成模块菌株构建方法 |
| 4.1.5.1 β-胡萝卜素合成途径crtE、crtY、crtI、crtB的RBS优化后质粒构建方法 |
| 4.1.5.2 MEP途径基因dxs、idi、ispE、ispA、ispH的RBS区优化后菌株的构建 |
| 4.1.5.3 MEP途径改造后acs的 RBS区优化后菌株的构建 |
| 4.1.6 工程菌株发酵条件优化 |
| 4.1.6.1 发酵温度的优化 |
| 4.1.6.2 发酵IPTG浓度的优化 |
| 4.1.7 最优菌株发酵罐发酵 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 β-胡萝卜素合成基因RBS区改造菌株的构建 |
| 4.2.2 β-胡萝卜素合成基因RBS优化对β-胡萝卜素产量的影响 |
| 4.2.3 MEP途径相关基因dxs、idi、ispE、isp A、ispH的RBS优化 |
| 4.2.3.1 dxs的RBS区优化后菌株的构建 |
| 4.2.3.2 idi的RBS区优化后菌株的构建 |
| 4.2.3.3 dxs和idi的RBS区组合优化后菌株的构建 |
| 4.2.3.4 MEP途径限速基因--dxs和idiRBS改造对β-胡萝卜素的影响 |
| 4.2.3.5 ispE的RBS优化菌株的构建 |
| 4.2.3.6 ispA的RBS优化菌株的构建 |
| 4.2.3.7 ispH的RBS优化菌株的构建 |
| 4.2.3.8 ispA和ispE的RBS区组合优化后菌株的构建 |
| 4.2.3.9 ispA、ispE、ispH三基因RBS区组合优化后菌株的构建 |
| 4.2.3.10 ispA、ispE和 acs的RBS区组合优化后菌株的构建 |
| 4.2.3.11 MEP途径和β-胡萝卜素合成途径RBS优化后组合调控菌株的构建 |
| 4.2.4 最优工程菌株发酵条件的优化 |
| 4.2.4.1 发酵温度的优化 |
| 4.2.4.2 IPTG诱导剂浓度的优化 |
| 4.2.5 WY077菌株的补料发酵实验 |
| 4.3 小结 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（10）卷枝毛霉生物合成番茄红素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 番茄红素研究概述 |
| 1.1.1 番茄红素简介 |
| 1.1.2 番茄红素的生理功能 |
| 1.1.3 番茄红素的来源 |
| 1.2 卷枝毛霉研究概述 |
| 1.2.1 卷枝毛霉简介 |
| 1.2.2 卷枝毛霉遗传操作系统研究概况 |
| 1.2.3 卷枝毛霉番茄红素合成途径 |
| 1.2.4 卷枝毛霉番茄红素合成调控路径 |
| 1.3 立题意义与依据 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 第二章 调控因子crgA对卷枝毛霉类胡萝卜素合成的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基及试剂的配置 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 |
| 2.2.5 PCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.3.2 卷枝毛霉基因组DNA的提取 |
| 2.3.3 PCR扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳及切胶回收 |
| 2.3.5 卷枝毛霉电转化 |
| 2.3.6 转化子筛选及验证 |
| 2.3.7 卷枝毛霉总RNA的提取 |
| 2.3.8 cDNA第一链合成 |
| 2.3.9 基因转录水平的ddPCR检测 |
| 2.3.10 卷枝毛霉类胡萝卜素提取与检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 卷枝毛霉crgA基因敲除株的获得 |
| 2.4.2 卷枝毛霉crgA基因敲除株的 !-胡萝卜素含量分析 |
| 2.4.3 卷枝毛霉中类胡萝卜素合成新型调控机制的初步探索 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 番茄红素环化酶对卷枝毛霉番茄红素合成的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基及试剂的配置 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器和设备 |
| 3.2.5 PCR引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 carRP突变基因片段的扩增 |
| 3.3.2 carRP突变基因片段的转化及筛选 |
| 3.3.3 NTG致死实验 |
| 3.3.4 诱变与筛选 |
| 3.3.5 carRP全长基因片段的扩增和测序 |
| 3.3.6 突变株的生物量和生长特性 |
| 3.3.7 类胡萝卜素含量及组分的测定分析 |
| 3.3.8 基因转录水平的RT-qPCR检测 |
| 3.3.9 突变株的稳定性实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 卷枝毛霉crgA基因敲除株中番茄红素环化酶的定点突变 |
| 3.4.2 卷枝毛霉crgA基因敲除株中番茄红素环化酶的随机突变与鉴定 |
| 3.4.3 番茄红素环化酶突变株生长特性 |
| 3.4.4 番茄红素环化酶突变株的类胡萝卜素组成及含量分析 |
| 3.4.5 番茄红素环化酶突变株的遗传稳定性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 甲羟戊酸途径限速酶（HMGr）对卷枝毛霉番茄红素合成的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基及相关溶液配置 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器和设备 |
| 4.2.5 PCR引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 卷枝毛霉番茄红素合成途径相关酶转录组数据的分析比较 |
| 4.3.2 目的基因的亚克隆 |
| 4.3.3 质粒的酶切与连接 |
| 4.3.4 大肠杆菌感受态制备与转化 |
| 4.3.5 质粒的构建 |
| 4.3.6 卷枝毛霉番茄红素环化酶突变株Mut3对 5-FOA的耐受性测试 |
| 4.3.7 HMGr过表达质粒的转化 |
| 4.3.8 转化子的筛选与鉴定 |
| 4.3.9 基因转录水平的RT-qPCR |
| 4.3.10 番茄红素含量的测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 卷枝毛霉番茄红素合成途径相关酶表达水平分析 |
| 4.4.2 番茄红素合成途径限速酶HMGr表达质粒的获得 |
| 4.4.3 HMGr过表达重组菌株的获得及其番茄红素含量分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 脂肪酸合成途径关键酶（FAS和ACC）对卷枝毛霉番茄红素合成的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 培养基及相关溶液 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 主要仪器和设备 |
| 5.2.5 PCR引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 氮限制培养基中的发酵培养 |
| 5.3.2 卷枝毛霉中FAS和ACC表达水平的分析 |
| 5.3.3 FAS和ACC RNAi质粒的构建 |
| 5.3.4 FAS和ACC RNAi质粒的转化 |
| 5.3.5 转化子的筛选与鉴定 |
| 5.3.6 FAS和ACC抑制剂的添加 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 卷枝毛霉中类胡萝卜素与脂质合成的关系 |
| 5.4.2 脂肪酸合成关键酶（FAS和ACC）在卷枝毛霉中的表达水平分析 |
| 5.4.3 FAS和ACC RNAi重组菌株的获得及其番茄红素含量分析 |
| 5.4.4 FAS和ACC抑制剂对番茄红素含量的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 重组卷枝毛霉合成番茄红素培养基碳、氮源条件优化 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料与设备 |
| 6.2.1 菌株 |
| 6.2.2 培养基及相关溶液 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 主要仪器和设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 碳源的优化 |
| 6.3.2 氮源的优化 |
| 6.3.3 发酵罐培养 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 碳源（葡萄糖）对卷枝毛霉生长和番茄红素合成的影响 |
| 6.4.2 复杂氮源对卷枝毛霉生长和番茄红素合成的影响 |
| 6.4.3 重组卷枝毛霉在发酵罐中合成番茄红素 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：攻读博士学位期间发表论文及专利申请情况 |
四、卡那霉素抗性基因在三孢布拉霉菌种中的表达（论文参考文献）
- [1]三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用[J]. 李娜,曲音波,杨培龙,余晓斌,罗玮. 食品与生物技术学报, 2021(09)
- [2]基于ku基因背景的三孢布拉霉遗传操作系统的初步构建[D]. 李娜. 江南大学, 2020(04)
- [3]代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究[D]. 吴元庆. 天津大学, 2020(01)
- [4]农杆菌介导真姬菇节孢子遗传转化系统的构建与运用[D]. 黄之恒. 上海海洋大学, 2020(02)
- [5]藏红花类胡萝卜素基因的原核表达[D]. 牛诗佳. 上海师范大学, 2020(07)
- [6]利用运动发酵单孢菌基因元件构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株[D]. 虞青蕙. 成都大学, 2020(08)
- [7]三孢布拉霉发酵番茄红素的小分子代谢及工艺研究[D]. 刘洋. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [8]Lactobacillus plantarum P-8适应抗生素环境过程中潜在分子机制的研究[D]. 郭慧玲. 内蒙古农业大学, 2018(12)
- [9]代谢工程方法提高大肠杆菌β-胡萝卜素产量的研究[D]. 王岩岩. 河南农业大学, 2017(06)
- [10]卷枝毛霉生物合成番茄红素的研究[D]. 张映曈. 江南大学, 2017(03)