一、缺血心肌细胞核DNA染色法观察（论文文献综述）
洪丽英[1]（2021）在《CHIP对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响》文中研究指明背景:目前,心血管疾病的发病率越来越高,已成为严重威胁人类健康的疾病之一,因此,如何防治心血管疾病已成为重要任务。然而,在心血管疾病的治疗中极易发生心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤。当心肌发生I/R损伤时,将极大的加重心肌纤维化,扩大梗死面积,促进炎症反应,致使心功能下降和心力衰竭,从而诱发患者死亡。因此,越来越多的研究致力于探讨如何减少心肌I/R损伤,进而促进心血管疾病的治疗。目前研究发现心肌I/R损伤的病理生理机制非常复杂,除了细胞内发生钙超载、炎症、氧化应激、凋亡等外,焦亡也参与了心肌I/R损伤的病理过程。焦亡是一种特殊的程序性死亡方式,主要通过NLRP3炎性小体的触发以及ASC、Caspase-1的活化诱发,因此,研究中要证实细胞是否发生焦亡多采用检测细胞NLRP3、ASC以及Caspase-1基因和蛋白的表达。此外,细胞焦亡伴有炎症级联反应,通过激活NLRP3炎症小体并介导一系列的下游反应,形成有活性的炎症因子IL-1β和IL-18,从而导致细胞损伤。而CHIP是E3泛素连接酶中的成员之一,高表达于人心血管系统组织,CHIP通过加快异常蛋白质的修复,维持心肌Ca2+稳定,抑制氧化应激,抑制细胞凋亡、自噬等对心肌发挥保护效应。此外,CHIP除了具有这些作用外,还具有抗炎作用。因此,我们推测CHIP可能也具有抗焦亡作用,为了验证这一假设,本研究中我们通过对心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）处理,建立心肌I/R损伤的体外模型,从而探讨CHIP对H/R诱导的心肌细胞焦亡的影响,明确CHIP的具体作用机制,为进一步改善患者心肌I/R后的临床预后及减轻心肌I/R损伤提供新的治疗思路。第一部分CHIP下调对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响目的:探索CHIP下调对缺氧/复氧介导大鼠心肌细胞焦亡的影响并初步探究其分子机制。方法:（1）选用10只出生1-3天的Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠,从中提取原代心肌细胞。分成4组:1组:N+siRNA NC组,2组:N+siRNA CHIP组,3组:H/R+siRNA NC组,4组:H/R+siRNA CHIP组。应用LV-CHIP-RNAi和LV-NC慢病毒转染原代心肌细胞;通过将原代心肌细胞先放在缺氧小室中8h,之后放于常规培养箱中复氧2h,构建该细胞缺氧/复氧损伤模型。（2）实验处理完毕后,收集各组上清液,检测其乳酸脱氢酶（LDH）水平、CCK-8试剂盒检测各组细胞活力及细胞增殖率、ELISA试剂盒检测IL-1β的表达;Hoechst 33342/PI双重染色法检测细胞焦亡染色、RT-PCR实验检测心肌细胞NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA水平。蛋白印迹检测NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、CHIP以及HSF1蛋白表达水平。结果:1、在显微镜下观察,体外培养的原代心肌细胞,形态呈三角形或不规则多边形,培养3天后大部分细胞融合生长,细胞融合约达80%,视野内可见大部分细胞同步有力搏动,搏动频率约为60次/分。各组细胞经不同处理后观察形态及数量变化。可见H/R培养介导心肌细胞形态改变,细胞数量较对照组减少;与H/R+siRNA GFP组相比,H/R+siRNA CHIP组心肌细胞形态改变更明显,细胞数量减少。各实验结果（1）与N+siRNA GFP组相比:H/R+siRNA GFP组心肌细胞上清液LDH水平增高;CCK8试剂盒检测结果显示,细胞活力下降,心肌细胞增殖率显着降低,Hoechst 33342/PI双染色法检测结果进一步提示,心肌细胞焦亡指数明显增加,NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA表达水平上升,NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1β蛋白表达水平上调,统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。（2）与N+siRNA GFP组相比:N+siRNA CHIP组心肌细胞上清液LDH、细胞活力无明显差别;Hoechst 33342/PI双染色法检测结果提示,心肌细胞焦亡指数无明显变化;NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA水平无明显改变;NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平无明显改变。统计分析发现:以上差异均无统计学意义。CHIP、HSF1以及β-catenin蛋白表达水平明显下降,有统计学意义（p<0.05）。（3）与H/R+siRNA GFP组相比:H/R+siRNA CHIP组心肌细胞上清液LDH水平进一步增高;CCK8试剂盒检测结果显示,细胞活力进一步下降,心肌细胞增殖率显着降低;Hoechst 33342/PI双染色法检测结果进一步提示,心肌细胞焦亡指数进一步明显增加,NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA水平上调,NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平上调,CHIP、HSF1以及β-catenin蛋白表达水平明显下降。统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:缺氧/复氧可介导心肌焦亡损伤,下调CHIP表达加重缺氧/复氧介导的心肌焦亡。第二部分CHIP过表达对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响目的:探索CHIP过表达对缺氧/复氧介导的心肌焦亡的影响。方法:（1）选用10只出生1-3天的SD大鼠乳鼠,从中提取原代心肌细胞。分成4组:1组:空白对照+慢病毒载体（N+GFP）组、空白对照+重组CHIP（N+CHIP-GFP）组、缺氧/复氧+慢病毒载体（H/R+GFP）组、缺氧/复氧+重组CHIP（H/R+CHIP-GFP）组。应用慢病毒载体介导原代心肌细胞过表达CHIP,建立过表达CHIP的原代心肌细胞。通过将原代心肌细胞先放在缺氧小室中8h,之后放于常规培养箱中复氧2h,构建该细胞缺氧/复氧损伤模型。（2）检测各组上清液中指标同上一部分。结果:（1）与N+GFP组相比:H/R+GFP组心肌细胞Hoechst 33342/PI双染色法检测结果进提示,心肌细胞焦亡指数明显增加;NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、ASC mRNA水平上调;NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平上调。统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。（2）与N+GFP组相比:N+CHIP-GFP组心肌细胞Hoechst 33342/PI双染色法检测结果提示,心肌细胞焦亡指数无明显变化,NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、ASC mRNA水平无明显改变,NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平无明显改变,统计分析发现以上差异均无统计学意义。（3）与H/R+GFP组相比:H/R+CHIP-GFP组心肌细胞Hoechst 33342/PI双染色法检测结果提示,心肌细胞焦亡指数明显降低;NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、ASC mRNA水平下降;NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β蛋白表达水平下降。统计分析发现:以上差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:过表达CHIP可减轻缺氧/复氧介导的心肌焦亡,从而对心肌具有保护作用。
刘畅[2]（2021）在《重组谷胱甘肽过氧化物酶1与4的抗氧化作用及其机制研究》文中认为活性氧（ROS）是细胞氧化呼吸过程中正常的代谢产物,它通常以自由基或非自由基的形式存在,包括超氧阴离子(O2.-)、羟自由基（OH●）、过氧化氢（H2O2）以及单线态氧等。在正常生理浓度下,ROS能够参与如转录因子激活、信号通路传导以及细胞凋亡与分化等一系列生理过程,在维持人体内环境稳定中发挥着重要作用。但是,当细胞内产生的ROS高于细胞自身抗氧化防御能力时,ROS会造成细胞中核酸、蛋白质以及膜脂质的氧化损伤并导致机体氧化与抗氧化系统失衡,从而引起氧化应激的发生,氧化应激会影响心血管疾病、糖尿病、皮肤病以及神经退行性疾病等人体多种疾病的发生与发展。因此,有效清除ROS是防治氧化应激相关疾病的关键。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是人体抗氧化防御系统中重要的含硒抗氧化酶。谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx1）又名细胞内GPx,它在人体内含量最高且分布最广,几乎存在于所有细胞的细胞质与线粒体中。在哺乳动物细胞中,GPx1可以将谷胱甘肽（GSH）作为还原底物,不仅能够将有毒的H2O2催化为无毒的水,还可以催化其它水溶性氢过氧化物,从而清除ROS保护细胞免受氧化应激损伤。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）又名磷脂氢过氧化物GPx,它是唯一以单体形式存在的GPx,由于其结构的特殊性,使它不仅可以催化H2O2,还可以直接还原生物膜上的磷脂氢过氧化物从而抑制细胞脂质过氧化。研究表明,GPx1与GPx4可以直接或间接参与生殖发育、衰老、糖尿病、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤以及炎症反应等多种正常生理或病理过程,具有良好的药物开发前景。由于天然GPx来源有限,因此需要进行重组GPx的研发,但GPx的活性位点是硒代半胱氨酸（Sec）,Sec的插入需要一套特殊的编码机制,这给重组GPx药物开发增加了难度。本课题组在前期工作中研发出一种利用新型的嵌合tRNAUTuT6在琥珀型终止缺陷大肠杆菌中表达重组GPx的方法,该方法成本低廉,使用普通的LB培养基,每升培养基可获得4-8 mg的目的蛋白;操作简单,便于大规模生产。另外,用该方法表达的重组人谷胱甘肽过氧化物酶1（hGPx1）与重组人谷胱甘肽过氧化物酶4（hGPx4）具有天然GPx结构与较高的催化活力,这极大促进了重组GPx1与重组GPx4的药物开发。但是,hGPx1与hGPx4在细胞和动物水平上的抗氧化作用还没得到验证。本文旨在研究hGPx1与hGPx4在细胞和动物水平上的抗氧化作用及其机制并对其药用价值深入探究,具体实验结果如下所示:（1）重组GPx1与GPx4的制备在本章研究中,通过对比hGPx1与重组小鼠谷胱甘肽过氧化物酶1（m GPx1）的氨基酸序列、结构、酶学性质以及稳态动力学,确定选用小鼠模型来研究hGPx1的抗氧化作用。同时为了准确反映出同源重组GPx1的抗氧化作用,将m GPx1作为hGPx1的对照应用于小鼠模型的抗氧化研究。按照本实验室已报道的经典方法,利用新型的嵌合tRNAUTuT6在琥珀型终止缺陷大肠杆菌中成功制备出hGPx1、hGPx4以及m GPx1,为后续抗氧化实验奠定基础。（2）重组hGPx1的抗氧化作用及其机制研究在本章研究中,分别建立了异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌H9C2细胞氧化应激损伤模型与BALB/c小鼠心脏氧化应激损伤模型,研究hGPx1在细胞与动物水平上的抗氧化作用及其机制并观察hGPx1与m GPx1在抗氧化实验中的差异。细胞实验结果表明,hGPx1能够通过及时清除ROS有效防止ISO诱导的心肌H9C2细胞氧化应激损伤,并通过间接抑制线粒体依赖性凋亡途径防止细胞凋亡。动物实验结果表明,hGPx1能够通过清除ROS减少ROS对心肌组织的持续损伤,改善小鼠心脏的病理损伤,对于ISO诱导的小鼠心脏氧化应激损伤具有良好的治疗作用,由于hGPx1与m GPx1在细胞模型中的抗氧化作用相同,但在动物模型中m GPx1的抗氧化作用要强于hGPx1,为了探究原因,进行了体内抗体检测与体外中和性抗体分析,实验结果表明,hGPx1在小鼠体内存在免疫原性,它所产生的抗体能够抑制其原有的抗氧化活性。尽管如此,本章实验还是为hGPx1作为治疗心脏氧化应激损伤药物的开发提供了可靠的理论基础。（3）重组hGPx1的抗紫外线损伤作用及其机制研究在本章研究中,为了进一步探讨hGPx1的药用价值,建立了紫外线B（UVB）诱导的Ha Ca T细胞紫外线氧化应激损伤模型,来研究hGPx1在的抗紫外线损伤作用及其机制。实验结果表明,hGPx1能够通过及时清除ROS有效防止UVB诱导的皮肤表皮Ha Ca T细胞氧化应激损伤,并通过间接抑制线粒体依赖性凋亡途径防止细胞凋亡。此外,hGPx1还能够通过及时清除ROS间接抑制皮肤表皮Ha Ca T细胞中MMP-1和MMP-9蛋白的过度表达及分泌,从而减少MMP-1和MMP-9蛋白对胶原的过度降解,防止由紫外线过度照射引起的胶原流失。本章研究为hGPx1作为预防紫外线损伤药物的开发与应用提供了可靠的理论依据。（4）重组hGPx4的抗氧化作用及其机制研究在本章研究中,选用单体结构的hGPx4,即磷脂氢过氧化物GPx,较小的分子量使其可能具有较低的免疫原性与较好的组织渗透性,分别建立了大鼠心肌缺血损伤模型与心肌细胞体外氧化应激损伤模型,来研究hGPx4对心肌缺血损伤的保护作用及其机制。动物实验结果表明,hGPx4能够通过及时清除ROS有效防止大鼠的心肌缺血病理损伤,预防大鼠心率失常与心肌肥大,对于大鼠心肌缺血损伤具有良好的预防作用。细胞体外实验结果表明,hGPx4能够通过及时清除ROS有效防止心肌细胞氧化应激损伤,并通过间接抑制线粒体依赖性凋亡途径抑制心肌细胞凋亡。hGPx4还能够通过清除ROS间接抑制心肌细胞核中Nrf2和心肌细胞质中HO-1的过度消耗,维持心肌细胞中Nrf2和HO-1的基本正常水平,确保其信号通路正常发挥抗氧化应激的调节作用,减少心肌细胞氧化应激损伤。虽然hGPx4的催化活力不如hGPx1,但它具有广泛的反应底物,还能够还原生物膜上的磷脂氢过氧化物,因此同样具有良好的抗氧化作用。由于动物实验设计为短周期的预防实验,所以不需要做免疫学对照。总之,hGPx4能够在预防心肌缺血损伤中发挥重要作用,具有巨大的应用潜力。综上所述,本研究通过hGPx1对心肌氧化应激损伤的治疗作用、紫外线损伤的预防作用以及hGPx4对心肌缺血损伤的预防作用,探讨了hGPx1与hGPx4的药用价值,并证明了它们在细胞和动物水平上具有良好的抗氧化作用,为hGPx1与hGPx4作为防治氧化应激相关疾病药物的开发与应用提供了数据支持并奠定了理论基础。
孙艺英[3]（2020）在《PARP调控线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景随着人口老龄化的加重和人们生活方式的改变,缺血性心脏病的发病率也逐年升高。缺血性心脏病现已成为严重威胁人类生命健康的心血管疾病。对于急性缺血性心脏病的最佳有效治疗是尽快恢复缺血组织的血流,然而临床研究及动物实验发现,随着血流灌注的重建,部分心脏的功能和结构不仅未得到恢复,反而出现更为严重的损伤,这种现象被称为心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤。如何做到既尽早恢复缺血组织的血流,又同时减轻甚至解除再灌注引起的损伤,便成为缺血性心脏病治疗中的关键;而明确I/R损伤的发病机制就成为首要的前提条件。现有研究证明:线粒体产生过量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,被认为是导致心肌I/R损伤的最重要的原因和机制。过量的ROS亦导致线粒体自身的损伤,并会引起线粒体损伤与ROS产生之间的恶性循环。为了维持线粒体的稳态平衡,细胞将通过线粒体自噬机制有选择性地清除损伤的线粒体,以保证线粒体功能得以正常进行。多腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）为一类通过对损伤 DNA 进行多聚ADP-核糖基化来行使DNA修复功能的蛋白酶家族,其中PARP-1所发挥的作用约占整个PARP家族的90%。研究证实,ROS造成的大量DNA链损伤而导致PARP-1的过度激活在心肌I/R损伤中起重要的作用。PARP-1的过度激活将会引起细胞内NAD+和ATP的过度消耗,导致心肌细胞因能量供应不足而凋亡或坏死。PARP-1属于NAD+依赖性的ADP-核糖基聚合酶,其活性依赖于辅因子NAD+的水平;而NADH/NAD+作为线粒体呼吸链上代谢过程的重要底物,其过度消耗将会影响到线粒体氧化呼吸和ATP合成等细胞生物学功能,造成并加重线粒体功能障碍。为维持线粒体功能正常进行及自身稳态,线粒体自噬机制进一步被激活,以消除功能障碍的线粒体,达到对线粒体的质量控制。但已有研究表明,线粒体自噬具有双刃剑作用,适度的线粒体自噬可以促进细胞存活,然而线粒体自噬的过度激活则可导致细胞死亡。因此我们推测:过度活化的PARP-1可以诱发线粒体自噬的过度激活,从而介导着心肌I/R损伤的发生。因此,本课题旨在从PARP调控线粒体自噬现象方面开始,对抑制PARP活性减少线粒体自噬的发生在心肌I/R损伤中所起的心脏保护作用及其机制进行研究。目的1.明确在心肌缺血再灌注中PARP调控线粒体自噬通路的存在;2.确定在心肌缺血再灌注中PARP调控线粒体自噬所起的作用;3.探讨在心肌缺血再灌注中PARP调控线粒体自噬的作用机制。方法1.小鼠心脏缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）模型的建立和分组:采用开胸结扎和松开左冠状动脉前降支的方法（缺血时间30 min,再灌注时间2 h）建立小鼠I/R模型。分为假手术组（Sham组）,缺血再灌注组（I/R组）,缺血再灌注+DPQ（DPQ+I/R组）三组。2.H9C2 细胞及 AC16 细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型的建立和分组:H9C2细胞在乏氧箱中缺氧（1%O2/5%CO2/94%N2）10 h后,在细胞培养箱复氧（5%CO2/95%空气）2 h来构建H9C2细胞H/R模型。分为Control组、H/R组、DPQ+H/R组3组。AC16细胞H/R模型的建立和分组与H9C2细胞相同。3.在H9C2细胞中感染以Parkin为靶点的shRNA慢病毒（Lv-Parkin-RNAi）以降低Parkin蛋白表达水平,蛋白印迹法检测其蛋白敲低的效率。4.在电镜下观察各组小鼠心肌细胞、各组H9C2细胞及感染了Lv-Parkin-RNAi的各组H9C2细胞的线粒体自噬水平。5.细胞免疫荧光法检测各组H9C2细胞线粒体自噬关键通路关键蛋白Parkin与MitoTracker Deep Red FM（线粒体荧光探针）的共定位程度。6.蛋白印迹法检测各组H9C2细胞总蛋白中的COX Ⅳ蛋白、TOM 20蛋白及VDAC蛋白的表达;蛋白印迹法检测各组H9C2细胞、AC16细胞及感染了 Lv-Parkin-RNAi、分别孵育了 CsA和FCCP的各组H9C2细胞的线粒体蛋白中Parkin蛋白的表达。7.DCFH-DA法测定各组H9C2细胞及孵育了 NAC的各组H9C2细胞的ROS水平。8.JC-1染色检测各组H9C2细胞及分别孵育了 NAC、NAD+、CsA、FCCP 的各组 H9C2 细胞的线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,ΔΨm）水平。9.用NAD与ATP试剂盒检测感染Lv-Parkin-RNAi前后的各组H9C2细胞中NAD+与ATP的水平。10.蛋白印迹法分别测定各组小鼠心肌细胞及H9C2细胞、AC16细胞中PAR蛋白的表达及各组H9C2细胞线粒体中PAR蛋白的表达。11.测定TTC染色后的各组小鼠心肌梗死面积。12.各组小鼠的心脏功能的超声测量。13.TUNEL法分别检测各组小鼠心肌细胞、H9C2细胞、AC16细胞及感染Lv-Parkin-RNAi后各组H9C2细胞的凋亡率;流式细胞术检测各组H9C2细胞的凋亡率。14.免疫共沉淀法检测各组H9C2细胞中线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）的有效构成蛋白 CypD、TSPO与PAR蛋白的相互作用;免疫共沉淀法检测各组CypD、TSPO蛋白与PARP蛋白的相互作用。结果1.抑制PARP活性减少了心肌缺血再灌注中线粒体自噬的发生（1）抑制PARP活性减少了 I/R诱导的小鼠心肌细胞的线粒体自噬水平①在小鼠心脏I/R中PARP明显激活,应用DPQ后,PARP活性降低。PAR蛋白为PARP的活性产物,其表达量的增加代表着PARP被激活。研究结果表明,sham组小鼠心肌细胞中只有微弱的PAR蛋白表达;I/R组小鼠心肌细胞中的PAR蛋白表达明显增加;应用DPQ后,PAR蛋白表达显着降低,与I/R组相比,具有显着性差异（p<0.05）。②抑制PARP活性减少了 I/R诱导的小鼠心肌细胞的线粒体自噬水平。I/R促进了包裹线粒体（完整或几乎降解）的自噬囊泡的形成及线粒体数量的减少,与sham组相比,具有显着性差异（p<0.05）;抑制PARP激活缓解了 I/R诱导的线粒体数目的减少,同时抑制了包裹线粒体的自噬囊泡的形成,具有显着性差异（p<0.05）。（2）抑制PARP活性减少了 H/R诱导的H9C2细胞的线粒体自噬水平;抑制Parkin蛋白表达降低了 H/R诱导的H9C2细胞的线粒体自噬水平①Control组H9C2细胞中只有微弱的PAR蛋白表达;H/R组H9C2细胞中的PAR蛋白表达明显增加;应用DPQ以后,PAR蛋白表达显着降低,与H/R组相比,具有显着性差异（p<0.05）。②在电镜下观察包裹线粒体的自噬囊泡数量,H/R组较Control组明显增多,而DPQ+H/R组较H/R组显着减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）。③在激光共聚焦显微镜下观察发现,H/R组Parkin蛋白与MitoTracker Deep Red FM的共定位增加,而应用DPQ后Parkin蛋白与MitoTracker Deep Red FM的共定位则减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）。④蛋白印迹法检测结果表明,H/R组线粒体蛋白中的Parkin蛋白较Control组表达增加,而DPQ+H/R组较H/R组则表达减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）;此外,总蛋白中的COX IV蛋白、TOM 20蛋白及VDAC蛋白的检测结果显示,H/R组较Control组表达减少,而DPQ+H/R组较H/R组则表达增加,且差异具有统计学意义（p<0.05）。⑤Lv-Parkin-RNAi感染的H9C2细胞与Control组相比,其Parkin蛋白表达水平发生显着下调,且差异具有统计学意义（p<0.05）。⑥蛋白印迹法检测各组Parkin蛋白的表达情况,发现H/R组、Lv-NC+H/R组较Control组明显增多,H/R组与Lv-NC+H/R组之间无明显差异,无统计学意义;而Lv-Parkin-RN Ai+H/R组较H/R组及Lv-NC+H/R组显着减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）。⑦在电镜下观察各组包裹线粒体的自噬囊泡的数量,发现H/R组、Lv-NC+H/R组的自噬囊泡较Control组明显增多,H/R组与Lv-NC+H/R组之间变化不明显,无统计学意义,而Lv-Parkin-RNAi+H/R组的自噬囊泡较H/R组及Lv-NC+H/R组显着减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（3）抑制PARP活性减少了 H/R诱导的AC16细胞的线粒体自噬水平①在AC16细胞中,H/R组PAR蛋白的表达较Control组明显增加;应用DPQ以后,PAR蛋白表达显着降低,与H/R组相比,具有显着性差异（p<0.05）。②在AC16细胞线粒体蛋白中,H/R组的Parkin蛋白表达较Control组明显增加,而DPQ+H/R组较H/R组表达显着减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）。2.PARP的激活促进了 H9C2细胞H/R中ROS的产生;ROS促进了H9C2细胞H/R中ΔΨm的下降H9C2细胞H/R组的ROS水平较Control组明显升高,NAC+H/R组、DPQ+H/R组的ROS水平较H/R组显着降低,且差异具有统计学意义（p<0.05）;H/R 组的ΔΨm 较 Control 组明显降低,NAC+H/R 组的ΔΨm较 H/R组显着升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）。3.抑制PARP活性能够升高H/R处理后H9C2细胞中NAD+和ATP水平;抑制线粒体自噬激活没有改变H9C2细胞H/R后NAD+和ATP水平;外源性NAD+能够逆转H/R诱导H9C2细胞ΔΨm的降低（1）NAD+和ATP水平检测结果表明,H/R组、Lv-NC+H/R组、Lv-Parkin-RNAi+H/R组较Control组表达明显降低,而DPQ+H/R组较H/R组则表达显着升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）;而H/R组、Lv-NC+H/R组、Lv-Parkin-RNAi+H/R组三组间表达无差异。（2）H/R显着诱导了ΔΨm的降低,而外源性NAD+则阻止了 H/R诱导的ΔΨm的下降,且差异具有统计学意义（p<0.05）。4.抑制PARP活性具有保护心脏及心肌细胞的作用（1）抑制PARP活性可减少I/R诱导的小鼠心肌梗死面积、降低小鼠心肌细胞凋亡率及改善小鼠的心脏功能DPQ+I/R组与I/R组相比,小鼠心肌梗死面积明显减少（p<0.05）。与sham组相比,I/R显着降低了小鼠的心脏射血分数（p<0.05）;与I/R组相比,应用DPQ以后,小鼠的心脏射血分数得到明显改善（p<0.05）。I/R组与sham组相比,心肌细胞凋亡率明显增加（p<0.05）;DPQ+I/R组的心肌细胞凋亡率明显少于I/R组的凋亡率（p<0.05）。（2）抑制PARP活性减轻了 H/R诱导的H9C2细胞凋亡采用TUNEL法及流式细胞仪测定各组H9C2细胞的凋亡率:H/R显着增加了细胞凋亡,而应用DPQ后降低了细胞凋亡,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（3）抑制PARP活性减轻了 H/R诱导的AC16细胞凋亡TUNEL法测定各组AC16细胞的凋亡率:H/R显着增加细胞凋亡,而DPQ应用后细胞凋亡减少,差异具有统计学意义（p<0.05）。5.线粒体自噬的过度激活促进了 H/R诱导的H9C2细胞凋亡TUNEL法测定各组H9C2细胞的凋亡率:研究结果发现H/R组、Lv-NC+H/R组的细胞凋亡率较Control组明显增高,H/R组与Lv-NC+H/R组之间的细胞凋亡率无明显差异,无统计学意义;而Lv-Parkin-RNAi+H/R组的细胞凋亡率较H/R组及Lv-NC+H/R组显着减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）。6.抑制PARP活性通过调节ΔΨm调控H/R诱导的线粒体自噬（1）ΔΨm的检测结果表明,H/R组较Control组显着下降,而CsA+H/R组较H/R组则明显升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）;DPQ+H/R组较H/R组明显升高,而FCCP+DPQ+H/R组较DPQ+H/R组显着降低,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（2）Parkin蛋白的表达结果表明,H/R组较Control组显着升高,而CsA+H/R组较H/R组则明显降低,且差异具有统计学意义（p<0.05）;DPQ+H/R组较H/R组明显降低,而FCCP+DPQ+H/R组较DPQ+H/R组显着升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）。7.PARP可能通过对CypD和TSPO的多聚ADP-核糖基化修饰调节ΔΨm（1）线粒体蛋白中PAR蛋白的表达,H/R组较Control组显着升高,而DPQ+H/R组较H/R组则明显降低,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（2）CypD和TSPO可以被多聚ADP-核糖基化修饰;而应用DPQ后显着阻止了这种修饰作用。（3）CypD和TSPO蛋白与PARP蛋白无直接相互作用。结论1.在心肌I/R中,PARP的过度激活促进了线粒体自噬的过度发生;2.抑制PARP活性具有保护心脏及心肌细胞的作用;3.线粒体自噬的过度激活参与了 H/R引起的H9C2细胞凋亡;4.PARP通过调控线粒体自噬参与了 H/R引起的H9C2细胞凋亡;5.PARP通过CypD和TSPO的多聚ADP-核糖基化修饰调节ΔΨm而调控线粒体自噬。
马璐璐[4]（2020）在《丹酚酸A通过补体作用途径抑制血小板及中性粒细胞活化作用研究》文中研究表明背景和目的:心肌梗死是严重威胁人类健康的心血管疾病之一。在心血管疾病中,血管功能障碍是首要环节,血小板在血管稳态中起着重要作用。此外,中性粒细胞在心肌损伤后被募集到心肌缺血区,通过吞噬、快速降解和脱颗粒等方式介导急性炎症反应,并和血小板形成中性粒细胞-血小板聚集体,进一步增加其在缺血区的募集,发挥抗炎作用。补体系统是存在于人和脊椎动物血清和组织液中活化后具有酶活性的蛋白质。补体系统作为固有免疫的重要组成部分,在心肌缺血引起的组织损伤中起着重要作用。补体在组织损伤过程中被激活,介导炎症反应和组织再损伤。丹参作为传统活血化瘀药,其水溶性酚酸类化合物具有抗血栓、抗血小板聚集等作用。因此,本研究探讨了丹酚酸A（Salvianolic acid A,SAA）通过补体作用途径抑制血小板及中性粒细胞活化。方法:1、结扎C57BL/6小鼠左前降支冠状动脉建立急性心肌梗死模型。采用超声多普勒系统检测小鼠心功能;采用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosinstaining,HE）染色,观察术后3天缺血心肌组织形态变化;应用流式细胞术检测术后3天丹酚酸A对心肌缺血小鼠外周血中血小板活化标志物CD62p表达的影响;应用免疫组化CD42c染色检测丹酚酸A对心肌缺血小鼠心肌组织缺血区血小板募集的影响;应用免疫组化CD45染色检测丹酚酸A对心肌缺血小鼠心肌组织缺血区白细胞浸润的影响;应用免疫组化Ly-6G染色检测丹酚酸A对心肌缺血小鼠心肌组织缺血区中性粒细胞浸润的影响;应用免疫组化染色检测丹酚酸A对心肌缺血小鼠心肌组织缺血区C3a R表达的影响;应用免疫荧光检测丹酚酸A对心肌缺血小鼠心肌组织缺血区的CXCL1、CXCL2表达的影响;应用剪尾法检测小鼠尾出血时间。2、利用SD大鼠全血制备血小板,应用比浊法检测血小板在二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate,ADP）、C3a诱导下的聚集率;应用流式细胞术检测ADP诱导的血小板表面活化标志物CD62p、C3a R（Complement C3a Receptor）表达;采用罗丹明标记的鬼笔环肽对血小板染色检测血小板在纤维蛋白原上的粘附;利用Western-blotting检测血管扩张刺激磷蛋白（Vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP）、磷脂酰肌醇三羟基激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、丝氨酸苏氨酸激酶（Serine threonine kinases,Akt）蛋白磷酸化表达;用小鼠中性粒细胞提取试剂盒提取C57BL/6小鼠中性粒细胞,应用缺氧（1%O2,4 h）条件构建中性粒细胞缺氧模型;应用比色法检测中性粒细胞髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）的释放;应用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9,MMP9）和乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）的释放。结果:术后3天,与模型组相比,丹酚酸A可以改善心肌缺血小鼠心功能,促进缺血组织损伤修复;丹酚酸A可以显着降低心肌缺血小鼠血小板活化标志物CD62p的表达,抑制活化的血小板在缺血区的募集,抑制心肌缺血小鼠白细胞及中性粒细胞等炎性细胞在缺血区的浸润及炎性趋化因子CXCL1、CXCL2的分泌,抑制补体成分C3a R在缺血区表达,且无出血的副作用。丹酚酸A可以抑制ADP诱导的血小板活化过程;可以通过下调PI3K/Akt和上调VASP蛋白磷酸化发挥抗血小板作用;丹酚酸A可以抑制ADP诱导的C3a R表达;C3a R抑制剂可以抑制ADP诱导的血小板聚集粘附释放及缺氧诱导的中性粒细胞脱颗粒;丹酚酸A可以抑制C3a诱导的血小板聚集及中性粒细胞脱颗粒;丹酚酸A可以抑制缺氧诱导的中性粒细胞脱颗粒反应中NE、MPO、MMP9和LF的释放。结论:丹酚酸A可以通过抑制补体途径中补体成分C3a R的表达抑制血小板和中性粒细胞活化,从而发挥抗血小板和抗炎的作用,促进心肌缺血组织恢复,改善心肌缺血损伤。
邓玲[5]（2020）在《表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制HDAC2改善心肌细胞肥大的机制》文中提出目的:探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）通过抑制组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2,HDAC2）改善苯肾上腺素（phenylephrine,PE）诱导的小鼠心肌细胞肥大的作用,为临床防治肥厚性心肌病提供新的思路。方法:一、选取1-3天龄新生昆明小鼠为研究对象,酶消化法分离获得新生小鼠心肌细胞,按照随机数字表法随机分为正常组、PE组、溶媒组（dimethylsulfoxide,DMSO）,收集各组心肌细胞进行以下检测:（1）分别采用CCK-8法检测小鼠心肌细胞活性、免疫细胞化学染色法鉴定纯度以及检测心肌细胞表面积;（2）Western blot检验方式检测小鼠心肌细胞的心肌肥大标记物心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）、β-心肌肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）的表达水平;（3）BCA蛋白定量法检测小鼠心肌细胞蛋白含量。二、将小鼠心肌细胞随机分为正常组,PE组,溶媒组,PE+EGCG组,收集各组小鼠心肌细胞进行以下检测:（1）实时荧光定量PCR（Real-time PCR）及western blot检测方式检测锌指转录因子（GATA binding protein 4,GATA4）mRNA及蛋白表达量;（2）Western blot检验方式检测小鼠心肌细胞的心肌肥大标记物ANP和β-MHC;（3）Western blot检验方式检测HDAC2蛋白的表达量,比色法检测HDAC2的活性;（4）免疫荧光化学染色法检测心肌细胞表面积。结果:（1）原代心肌细胞已经培养成功,且纯度超过90%以上。CCK-8法检测心肌细胞存活率结果进行比较,PE浓度小于100μmol/L干预心肌细胞存活率较对照组无显着变化（P>0.05）。（2）免疫荧光结果显示,PE组心肌细胞的表面积明显高于正常组（P<0.01）。与正常组比较,PE组中HDAC2蛋白表达量及活性较正常组升高（均P<0.01）;并且GATA4 mRNA和蛋白水平以及心肌肥大标记物ANP、β-MHC蛋白表达水平均明显上调（均P<0.01）。（3）免疫荧光化学染色法显示,与PE组及溶媒组比较,PE+EGCG组中心肌细胞表面积减少（P<0.01）。（4）Western blot检测显示,与PE组及溶媒组比较,PE+EGCG组中HDAC2蛋白表达量及活性明显降低（均P<0.01）。（5）Western blot检测显示,与PE组及溶媒组比较,PE+EGCG组中GATA4蛋白以及mRNA表达量均明显降低（均P<0.01）;心肌肥大标记物ANP、β-MHC蛋白表达量下调（均P<0.01）。结论:（1）EGCG能够改善苯肾上腺素诱导的小鼠心肌细胞肥大。（2）EGCG可能是通过下调HDAC2的表达改善苯肾上腺素诱导的小鼠心肌细胞肥大。
赵彦冰[6]（2020）在《仙茅苷对缺血/再灌注心肌的保护作用及其机制研究》文中研究指明目的:目前急性心肌梗死的主要治疗手段是及时的再血管化,以恢复血流。尽管再血管化治疗有效的降低了死亡率,但再灌注的血流经过缺血的区域会导致第二次的损伤,也就是所说的缺血/再灌注损伤[1-5]。线粒体通透性转换孔位于线粒体的内膜,在细胞的凋亡过程中起着重要的作用。在缺血后,再灌注会导致活性氧形成和Ca2+内流等病理生理变化,这些病理生理变化均可促使线粒体通透性转换孔的开放[6]。MPTP的开放就意味着线粒体通透性转换和线粒体内膜电位的降低,这是线粒体凋亡途径的关键事件[7-11]。自仙茅中提取的仙茅苷是一种酚苷,具有多种生物活性,例如抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用[12-15]。因此,在本研究中,我们的目的是通过体内和体外实验,来测试仙茅苷是否减轻心脏缺血/再灌注损伤,并进一步探讨其潜在的机制是否通过抑制MPTP的开放发挥作用。研究方法:1、培养的H9c2细胞每2-3天更换一次培养基,当细胞融合水平达到80-90%时,将细胞置于实验程序（接受实验处理）中,分别以5、10和15μmol/L的仙茅苷或相同体积的1‰二甲基亚砜预处理8小时,除对照组外,其余各组的培养基均用无糖和无FBS的培养基代替,然后在37℃温度下90%N2、5%CO2、5%O2（V/V/V）的三气室中孵育12小时,以诱导缺氧损伤。缺氧处置后,用正常培养基替换厄尔培养基,然后将细胞置于培养箱中,在37℃下用5%的CO2进行1小时的复氧。确定合适的仙茅苷浓度后,再加入苍术苷组重复上述的缺氧/复氧操作,以探索仙茅苷保护作用的机制。2、雄性Wistar大鼠均在标准实验条件下饲养,当大鼠适应生活环境后接受实验处理。分别以5mg/kg、10mg/kg和15 mg/kg的仙茅苷或者相同体积的1‰二甲基亚砜腹腔注射,连续7天。7天后离体大鼠心脏,应用Langendoff灌流系统对离体心脏缺血30min、再灌注60min,制备出缺血/再灌注模型。确定仙茅苷合适药量后,再加入苍术苷组重复上述的缺血/再灌注操作,以探索仙茅苷保护作用的机制。3、应用CCK8测定H9c2心肌细胞的活力。4、测定LDH判定H9c2心肌细胞的损伤程度。5、应用台盼蓝染色测定H9c2心肌细胞的生存率。6、应用流式细胞术测定H9c2心肌细胞的凋亡率。7、应用罗丹明123染色法评估H9c2心肌细胞线粒体膜电位的变化情况。8、应用Real time PCR测定H9c2心肌细胞中MPTP下游凋亡通路相关因子的mRNA表达情况。9、应用Western blot测定H9c2心肌细胞中MPTP下游凋亡通路相关因子的蛋白表达情况。10、应用钙诱导法评估H9c2心肌细胞MPTP的开放程度,计算min/max A540。11、应用Real time PCR测定H9c2心肌细胞中调控MPTP开放相关因子的mRNA表达情况。12、应用Western blot测定H9c2心肌细胞中调控MPTP开放相关因子的蛋白表达情况。13、应用Langendoff灌流系统,通过记录心率和冠脉流量,评估Wistar大鼠心功能。14、应用HE染色评估Wistar大鼠心肌显微结构的改变。15、应用TTC染色评估Wistar大鼠心肌梗死的面积。16、应用TUNEL染色法测定Wistar大鼠心肌的凋亡率。17、应用Real time PCR测定Wistar大鼠心肌中MPTP下游凋亡通路相关因子的mRNA表达情况。18、应用Western blot测定Wistar大鼠心肌中MPTP下游凋亡通路相关因子的蛋白表达情况。19、应用Real time PCR测定Wistar大鼠心肌中调控MPTP开放相关因子的mRNA表达情况。20、应用Western blot测定Wistar大鼠心肌中调控MPTP开放相关因子的蛋白表达情况。21、对实验结果进行统计分析,所有的研究结果以均数±标准差表示。3组或者3组以上的多样本间比较使用单因素方差分析,采用最小显着性差异检验进行两两间多重比较分析。如果P<0.05,被认为有显着的统计学意义的差异。结果:1、仙茅苷组H9c2心肌细胞的活力较缺氧/复氧组和溶剂组显着改善,其中较5μM比较,仙茅苷浓度在10μM和15μM时活力进一步显着改善。仙茅苷组H9c2心肌细胞的LDH活性较缺氧/复氧组和溶剂组显着降低,其中较5μM比较,仙茅苷浓度在10μM和15μM时LDH活性进一步显着降低。仙茅苷组H9c2心肌细胞的存活率较缺氧/复氧组和溶剂组显着改善,其中较5μM比较,仙茅苷浓度在10μM和15μM时存活率进一步显着改善。通过实验结果证明,上述三个药物浓度的仙茅苷对H9c2心肌细胞均有不同程度的保护作用,而且10μM和15μM保护效果相当,且均较5μM的保护保护作用更强,所以选择了10μM浓度作为下一步的机制研究所应用。2、在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中冠脉流量和心率较缺血/再灌注组和溶剂组显着升高,其中较5mg/kg比较,仙茅苷药量在10mg/kg和15mg/kg时冠脉流量和心率进一步显着升高。在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中梗死面积较缺血/再灌注组和溶剂组显着减小,其中较5mg/kg比较,仙茅苷药量在10mg/kg和15mg/kg时梗死面积进一步显着减小。在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中水肿和炎性细胞侵润等病理变化较缺血/再灌注组和溶剂组显着减少,其中较5mg/kg比较,仙茅苷药量在10mg/kg和15mg/kg时水肿和炎性细胞侵润等病理变化进一步显着减少。通过实验结果证明,上述三个药物剂量的仙茅苷对Wistar大鼠心肌均有不同程度的保护作用,而且10 mg/kg和15 mg/kg保护效果相当,且均较5 mg/kg的保护保护作用更强,所以选择了10 mg/kg的药物剂量作为下一步的机制研究所应用。3、仙茅苷组H9c2心肌细胞的凋亡率较缺氧/复氧组和溶剂组显着改善,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。仙茅苷组H9c2心肌细胞膜电位降低较缺氧/复氧组和溶剂组显着改善,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。4、在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,cytochrome C、APAF-1、caspase 9和caspase3的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着降低,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,cytochrome C、APAF-1、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3的蛋白表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显着降低,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。5、在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,MPTP开放的敏感性较缺氧复氧组和溶剂组显着降低,min/max A540显着高于缺氧复氧组和溶剂组,但应用苍术苷干预后可以显着逆转上述改变。6、在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,Bax的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着降低,Bcl-2的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着升高,Bcl-2/Bax的mRNA水平比值较缺氧/复氧组和溶剂组显着升高,但应用苍术苷干预后可以显着逆转上述改变。在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,Bax的蛋白表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着降低,Bcl-2的蛋白表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着升高,Bcl-2/Bax的蛋白水平比值较缺氧/复氧组和溶剂组显着升高,但应用苍术苷干预后可以显着逆转上述改变。7、在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌凋亡率较缺血/再灌注组和溶剂组显着改善,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。8、在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中,cytochrome C、APAF-1、caspase 9和caspase 3的mRNA表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显着降低,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中,cytochrome C、APAF-1、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3的蛋白表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显着降低,但应用苍术苷干预后可以显着逆转这种改变。9、在仙茅苷组Wistar大鼠心肌中,Bax的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着降低,Bcl-2的mRNA表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显着升高,Bcl-2/Bax的mRNA水平比值较缺血/再灌注组和溶剂组显着升高,但应用苍术苷干预后可以显着逆转上述改变。在仙茅苷组Wistar大鼠心肌中,Bax的蛋白表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显着降低,Bcl-2的蛋白表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显着升高,Bcl-2/Bax的蛋白水平比值较缺血/再灌注组和溶剂组显着升高,但应用苍术苷干预后可以显着逆转上述改变。结论:1、仙茅苷可有效地改善H9c2心肌细胞的缺氧/复氧损伤和Wistar大鼠心肌的缺血/再灌注损伤。2、仙茅苷通过上调Bcl-2和下调Bax,进而抑制线粒体MPTP的开放及其下游凋亡通路的激活,从而减轻了凋亡。
李婷婷[7]（2019）在《LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中研究表明研究背景 急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是世界范围内导致死亡的主要原因之一。及时再灌注策略,如药物溶栓和经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）已大大改善了 AMI 患者的预后。然而,心肌细胞缺血一段时间后,冠状动脉血流的恢复往往会导致进一步的组织损伤,这种现象称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）。心肌损伤可导致严重的临床后果,如无复流现象,心肌收缩性功能不可逆和可逆丧失,再灌注性心律失常,包括致命的室性心律失常等。另外MIRI可引起高达50%的成功实施PCI的患者出现微循环障碍,严重影响治疗效果及患者预后,因此如何减轻MIRI成为冠心病领域研究的重点及热点问题。 lncRNAs是一类长度大于200nt的非编码RNA,是继microRNA后发现的又一种细胞内源性的RNA分子。他们参与了细胞的许多生物学过程,如调控蛋白质编码基因,维护基因组的完整性,X染色体失活,基因组印记,转录后调节,细胞分化和发展等。LncRNAs在各种正常生理和病理条件中起重要作用,参与神经系统发育、新陈代谢和癌症发生发展等过程。近年的研究表明LncRNAs具有对多种心脏疾病的调节作用,如扩张型心肌病、心力衰竭、冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等。最近一项研究利用转录组芯片技术筛选小鼠缺血后早期再灌注心肌组织lncRNAs差异表达谱,筛选出与缺血再灌注损伤相关的100多个lncRNA,其中lncRNA Gm2691在梗死心肌中表达量显着降低,提示lncRNA Gm2691可能为缺血再灌注损伤心肌保护的新靶点。本课题旨在探讨lncRNA Gm2691减轻缺血再灌注损伤,保护心肌细胞的作用及具体机制。目的1.阐明lncRNA Gm2691抗炎、抗凋亡的作用及其对缺血再灌注诱导的心肌损伤的保护作用。2.探讨lncRNA Gm2691是否通过PI3K/Akt信号通路发挥其保护作用。研究方法一、体内实验1.建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型将雄性Wistar大鼠40只,随机分为假手术组（Sham）、缺血再灌注组（I/R）、缺血再灌注+lncRNA Gm2691过表达重组腺病毒组（I/R+Ad-Gm2691组）,缺血再灌注+空载体病毒组（I/R+Ad-con组）4组,每组10只。通过开胸结扎冠状动脉前降支30分钟,松开结扎线再灌注180分钟的方法,建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。手术前7天心脏注射过表达lncRNA Gm2691基因重组腺病毒及阴性对照病毒。Sham组大鼠只穿线不接扎。2.TTC染色法测定缺血再灌注后大鼠的心肌梗死面积。3.检测血清LDH的含量。4.超声检测心肌动力学的改变。5.蛋白印迹法（westernblot,WB）检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Bax、Bcl-2的表达。6.RT-PCR检测炎症因子IL-6、TNF-a和IL-8的表达。二、体外1.分离培养大鼠乳鼠心肌细胞（neonatal rat ventricular cardiomyocytes,NRCMs）,实验分为以下五组:（1）空白对照组（normoxia组）:心肌细胞在常氧条件下培养;（2）模型组（hypoxia组）:心肌细胞缺氧10小时后复氧4小时;（3）模型组+空载体组（hypoxia+Ad-con组）:心肌细胞转染阴性对照腺病毒后,缺氧10小时后复氧4小时;（4）模型组+lncRNA Gm2691腺病毒组（hypoxia+Ad-Gm2691组）:心肌细胞转染过表达lncRNAGm2691腺病毒后,缺氧10小时后复氧4小时。（5）模型组+lncRNAGm2691 腺病毒+PI3K/Akt抑制剂组（hypoxia+Ad-Gm2691+LY294002组）:心肌细胞转染过表达lncRNA Gm2691腺病毒后,加入浓度为20μmol/L LY294002,缺氧10小时后复氧4小时。2.TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。3.Werstern blot检测Akt、ERK1/2蛋白及凋亡相关蛋白Caspase 3、Bax、Bcl-2表达。4.qRT-PCR检测lncRNAGm2691 及炎症因子IL-6,TNF-a 和 IL-8的表达结果1.LncRNA Gm2691减少I/R大鼠心肌梗死面积与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691组心肌梗死面积明显减少（P=0.000）,而I/R+Ad-con组与I/R组相比心肌梗死面积无显着差异（P=0.294）。2.LncRNA Gm2691改善I/R大鼠心功能与Sham组相比,I/R组左室收缩期内径（LVIDs）、左室舒张期内径(（LVIDd）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV）明显增加（均P<0.01）,左室射血分数（LVEF）和左室缩短分数（FS）显着下降(（均P=0.000）。与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691 组LVIDs、LVIDd、LVEDV、LVESV显着降低（均P<0.01）,LVEF、FS显着升高（均P=0.000）。而I/R+Ad-con组与I/R组相比上述指标无显着差异（均P>0.05）。3.LncRNAGm2691降低I/R大鼠血清LDH水平I/R组大鼠血清LDH水平明显高于Sham组（P=0.002）,I/R+Ad-Gm2691组LDH水平显着低于I/R组（P=0.031）,I/R+Ad-con组与I/R组无显着差异（P=0.487）。4.LncRNA Gm2691降低I/R大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达Western-blot结果显示:相比Sham组,I/R组的Caspase-3及Bax的表达显着升高,Bcl-2的表达显着降低,相应的Bax/Bcl-2比值显着升高（均P0.01）;与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691组Caspase-3及Bax的表达显着降低,Bcl-2的表达显着升高,Bax/Bcl-2比值显着降低（均P<0.05）。而I/R组和I/R+Ad-con组之间几乎没有差异（均P>0.05）。5.LncRNAGm2691有效减少I/R大鼠心肌炎症因子的水平RT-PCR结果显示:与Sham组相比,I/R组心肌组织的IL-6,TNF-a和IL-8 mRNA的表达显着升高（均P=0.000）;与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691组上述炎症因子mRNA表达明显降低（均P<0.05）。而I/R组和I/R+Ad-con组之间几乎没有差异（均P>0.05）。6.腺病毒转染可以增加体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞（NRVMs）中lncRNA Gm2691的表达结果提示用过表达lncRNA Gm2691腺病毒预处理6小时后,缺氧诱导的NRVMs中lncRNA Gm2691的表达呈时间依赖性变化,缺氧后3小时lncRNA Gm2691的表达即显着升高,并在缺氧后9小时达到峰值。缺氧可导致心肌细胞中lncRNA Gm2691的表达降低,而缺氧前用过表达lncRNA Gm2691腺病毒预处理6h可显着增加lncRNA Gm2691的表达（均P<0.01）。7.LncRNAGm2691有效减少缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡TUNEL染色显示过表达lncRNA Gm2691腺病毒预处理可明显抑制缺氧/复氧过程诱导的心肌细胞凋亡（P=0.002）;Western-blot结果显示,相比正常组,hypoxia组的Caspase-3及Bax的表达显着升高,Bcl-2的表达显着降低,相应的Bax/Bcl-2比值显着升高（均P<0.01）;与hypoxia组相比,hypoxia+Ad-Gm2691 组Caspase-3、Bax的表达显着降低,Bcl-2的表达显着升高,Bax/Bcl-2比值显着降低（均P<0.05）。而hypoxia组和hypoxia+Ad-con组之间几乎没有差异（均P>0.05）。8.LncRNA Gm2691有效减少缺氧/复氧造成的心肌细胞炎症因子的表达RT-PCR结果显示:与正常组相比,hypoxia组的IL-6、TNF-a和IL-8 mRNA的表达显着升高（均P=0.000）;与hypoxia组相比,hypoxia+Ad-Gm2691组上述炎症因子mRNA表达明显降低（均P<0.05）。而hypoxia组和hypoxia+Ad-con组之间没有显着差异（均P>0.05）。9.LncRNA Gm2691通过PI3K/Akt信号转导通路发挥其对缺氧/复氧造成的心肌细胞损伤的保护作用Western-blot结果表明,与正常组相比,hypoxia组的p-Akt的表达显着降低（P=0.000）,p-ERK1/2的表达显着升高（P=0.005）;与hypoxia组相比,lncRNA Gm2691过表达显着升高p-Akt的表达水平（P<0.01）,而对p-ERK1/2的表达无显着影响（P=0.804）。在lncRNAGm2691过表达的基础上,加入PI3K-Akt通路的抑制剂LY294002后,lncRNA Gm2691抑制缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡及炎症因子表达的作用明显减弱（均P<0.05）。结论1.大鼠心肌缺血再灌注可造成心肌细胞凋亡、炎症因子释放增加,lncRNA Gm2691在梗死心肌组织中表达下降,腺病毒介导的lncRNA Gm2691在心肌组织的过表达可以减少炎症因子的表达,减轻细胞凋亡,显着减少大鼠心肌缺血再灌注引起的心功能下降、心肌组织坏死。2.LncRNA Gm2691过表达可以减少体外培养的原代大鼠乳鼠心肌细胞炎症因子的表达及细胞凋亡,PI3K/Akt信号通路介导lncRNAGm2691的心肌保护作用。研究背景 腺苷酸活化蛋白激（ AMP-activated protein kinase，AMPK）是细 胞和全身能量稳态的关键调节因子，当细胞能量耗尽时，其发挥恢复能量平 衡的作用，在过去的20年里，AMPK被发现能够调控多种细胞功能。在心血管 组织中起调节心脏代谢和收缩功能，以及促进止管组织抗收缩，抗炎，抗动 脉粥样硬化等作用，被认为是未来代断性疾及心血管疾病治疗的重要靶点之 一。近年研究发现，AMPK可通过其以上作用，在心肌缺血-再灌注损伤中发 挥保护作用。因此开发出能够在心肌组织中微活AMPK的高选择性、高特异性 药物，可能成为减少缺血再灌注损伤有效地治疗策略。为了直接有效地靶向 激活AMPK，最近有研究者开发了一种噻吩啶衍生复合物一G5K621，体外实验 发玩其持续激活AMPK，在细胞分析中，乙酰酶A羧化酶（ acetyl - CaA carboxylase，ACC）磷酸化水平测定表明，GSK621相比其他AMPK激动剂如A- 769662，诱导AMPK活化的能力更强。GSK621显着增加AMPK活化的标记物 AMPKαT172的磷酸化，同时也刺激了AMPK下游因子ACC（S79）和ULK（S555）的 磷酸化，这些结果表明GSK621是直接的强效的AMPK激活剂，随后的一项研究 发现GSK621可以增加成骨细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADPH）含量， 抑制H2O2诱导的活性氧（ROS）生成，诱导细胞保护性自噬。显着减了H2O2诱 导的细胞死亡和凋亡，然面GSK621能否对心肌细缺血再灌注损伤起到保护作 用至今向未见报道。本研究拟探讨GSK621对氧糖剥夺复氧( oxygen glucose depeivalien-re-oxygnstion，OGD/R》引起的心肌细胞损伤的保护作用及作 用机制。以期封AMPK及其新型激动剂GSK621对心肌细胞保护作用进行阐明， 为以AMPK为靶点的药物研发提供新的依据。目的1.明确GSK621能否激活心肌细胞中AMPK2.探讨GSK621能否抑制氯糖剥夺 /复氧引起的心机组胞氧化损伤及凋亡。3.阐明GSK621对氧糖剥夺/复氧引起 的心肌细胞保护作用是否通过诱导AMPK活化产生,井进一步探讨其下游信号 分子Nrf2在其中的作用.研究方法1.建立AC16人心肌组胞及大鼠乳鼠心肌细 胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型将上述两种细胞分为对照组、氧糖剥夺/复氧 组（OGD/R）、GSK621各种剂量组 （OGD/R +0.5 HμM GSK621、OGD/R+2μM GSK621、 OGD/R+5μM GSK621、OGD/R+10μM GSK621）。以100,000个孔铺6 孔板，用的是DMEM高糖培养基，24小时以后模型相换成DMEM无糖培界基，放 入厌氧罐内密闭，37℃恒温培养箱中孵育4小时。4小时后，将细胞取出复氧 ，并换成DMEM高糖培养基，行下一步检测。2.CCK-8法检测OGD/R后各组心肌 细胞的活力。3.通过测定培养基乳酸脱氢酶（LDH）含量，检测细胞死亡。4. 细胞段亡检测：包括caspase-3活性检测，ELISA法检测抗单链（ssDNA抗体 DNA）， TUNEL染色和 Annexin V/PI流式细胞仪细胞凋亡检测方法。5. Westerm blottiing检测AMPKα1、 p-AMPKα1 、ACC、 p-ACC.、Cle- caspase-3、Cle-caspase-9、 Cle- PARP、Nrf2、HoL、NQOL等表达。6.AMPK活性检。7.氧化应激ROS检测。8.TBASR法测定细胞内脂质过氧化物合 量。9.JC-1法测定各组心肌细胞OGD/R后线粒体的电势。10.实时定量PCR检 测Nrf-2，HO1、NQO1等mRNA的表达。11.利用AMRKα1 ?shRNA转染，沉默细 胞内AMPK表达后，再次检测细胞活力、凋亡等变化。12.利用crispr/cas9基 因编辑法敲除AMPKα1，再次检测细胞活力、调亡等变化。13.利用Nrf2 shRNA转染，沉默细胞内Nrf2表达后，再次检测下游HO1等表达及细胞活力、 凋亡等变化。结果 1.GSK621激活心肌细胞中的AMPK信号 Western blot检测证实GSK621 （2-10μM）以剂量依赖的方式诱导磷酸化AMPKa1（Thr-172）和其相关代谢通路 的下游靶分子乙酰辅酶A羧化酶（ACC，Ser79位点）表达（均P<001），SK621呈 剂量依赖性增加细胞内AMPK活性（P=0.000）2.GSK621抑制氧糖剥夺/复氧 （OGDR）锈导的心肌细胞毒性CCK-8细胞活性检测实验显示；氧糖剥夺/复氧 (0GD/R诱导心肌细存活率显着下降，LDH放量明显增加（均P=000.0）2μM和 10μM 0MGK621预处理，显着抑制OGD/R诱导的细底存活率降低及LDH释放（均 P=0.0000），进一步研究表明，OGDR组线粒体电势明显下降，caspse-3活性 增加， western blot显示caspase-3。 caspase-9和PARP剪切体显着增加， ELSA显示单链DNA（ssDNA）增加,TUNEL染色显示凋亡细胞增加（均P=0.000） GSK621（2μM和10μM）预处理显着抑制DGD/R诱导的心肌细图调亡：流式细胞 术分析结果进一步证实了GSK621可显着降低OGD/R诱导的心肌细胞亡（均 P=0.000）。3.GSK621抑制OGD/R诱导的心肌氧化损伤 OGDR显着诱导心肌细图 ROS产生和错质过氧化（均P=0.000），这种作用被GSK21（2μM和10μM）预处理 显着弱（均P＜0.01）4.AMPK活化介导GSK621诱导的心机组胞保护作用。为了 证明GSK621对OGD/R诱导的心肌细胞损伤的保护作用是通过AMPK活化介导的，Western blot证实GSK621诱导的AMPK活化或 AMPKα1-ACC磷酸化，几乎 被 AMPKα1 shRNA或AMPK1KO完全抑制，在“ sh-AMPKα1”及ko-AMPKα1细 胞，GSK621法抑制OGD/R诱导的细胞活性降低及细胞凋亡（P=0.002）。 5.GsK621激活心肌细胞核因子E2相关因子2（ nuclear facor erythroid-2-relatel factor2，Nrf2）信号通路并通过其发作用。qPCR检测结果表明在心 肌细胞，GSK621呈剂量依赖性诱导Nrf2依赖基园的mRNA表达，包括血红素氧 合伤1（ hemeoxygenase，HO1）和 NADPH氧化还原酶（ NADPH： quinoneoxidoreductase，NQO1），尽管Nrf2mRNA水平无明显变化，其蛋白水 平显着升高。HO1和NQO1的蛋白水平也显着提高。qPCR结果显示GSK621诱导 的心肌细胞中HO1和NQO1的表达完全被 AMPKα1沉默或敲除所抑制。携带 Nrf2 shRNA的慢病毒载体转染心细胞后，GSK621诱导的HO1和NQO1表达受抑 制，GSK621预处理对OGD/R诱导的细胞活性下降、凋亡增加的抑制作用消失（ 均P<0.01）.结论1.GSK621能够激活心肌细胞中的AMPK信号通路。2.氧糖剥夺/复氧较好 地模拟了在体缺血/再灌注对细胞造成的损害，GSK621能够通过抗凋亡、抗 氧化等作用对抗OGD/R诱导的心肌细胞损伤。3.AMPK活化介导GSK621诱导的 心肌细跑保护作用。4.GSK621可通过激活AMPK进一步活化下游的 Nrf2信号通路，并通过AMPKN/Nrf2/HO1轴发挥心机组胞保护作用。
苟江敏[8]（2019）在《莲子心生物碱对Aβ诱导PC12细胞损伤的保护及其抗阿尔茨海默病作用研究》文中研究指明阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种常见的神经退行性疾病。AD的病理特征主要包括胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑内堆积引起的老年斑（SP）,胞内Tau蛋白过度磷酸化造成的神经原纤维缠结（NFTs）及神经元缺失,并伴有明显的突触丢失等。本研究考察了莲子心生物碱（甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱及莲心总碱）对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护及其抗阿尔茨海默病作用。本文的第一部分体外活性研究首先采用MTT法考察了甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱（0.1-10μM）及莲心总碱（0.06-6μg/mL）单独或与Aβ25-35联合作用24 h后对PC12细胞存活率的影响。实验结果表明,莲子心生物碱可显着抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞存活率的降低,并且其单独作用不影响细胞存活率。采用HE染色法在倒置显微镜下观察PC12细胞形态变化,实验结果表明,Aβ25-35损伤的细胞数量减少,细胞呈现不规则的梭形,固缩,间隙变大,部分细胞核固缩、染色加深。莲子心生物碱可抑制Aβ25-35损伤的PC12细胞形态的变化。进一步采用AO-EB和Annexin V-FITC/PI荧光染色法检测PC12细胞凋亡,实验结果表明,甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱（10μM）及莲心总碱（6μg/mL）均能够抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。本文的第二部分体外机制研究首先采用荧光分光光度计,以Fura-2/AM为荧光探针,考察了莲子心生物碱对Aβ25-35损伤的PC12细胞内[Ca2+]i浓度的影响,实验结果表明,Aβ25-35损伤的PC12细胞内[Ca2+]i浓度显着增高,给药24h后细胞内[Ca2+]i浓度显着降低。采用流式细胞仪,以Fluo-3/AM为荧光染料,进一步验证了莲子心生物碱可显着抑制Aβ25-35损伤的PC12细胞内[Ca2+]i浓度的增高。采用荧光分光光度计,以DCFH-DA为荧光探针,设置甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱的药物浓度为1、3、10μM,莲心总碱的药物浓度为0.6、2、6μg/mL,考察了药物对Aβ25-35损伤的PC12细胞内活性氧（ROS）水平的影响,结果表明,随着药物浓度的增加,细胞内ROS水平显着降低。采用Western blot分析法,考察了莲子心生物碱对Aβ25-35诱导PC12细胞中Tau蛋白磷酸化、总Tau蛋白及钙调蛋白（CaM）表达的影响,结果表明,莲子心生物碱与Aβ25-35共同作用,可显着抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞内Tau磷酸化,降低细胞内CaM的表达。本文的第三部分体内实验主要考察了莲心总碱的抗阿尔茨海默病作用。将APP/PS1双转基因AD小鼠连续灌胃给予莲心总碱（50 mg/kg·d）28天,之后取脑组织进行石蜡切片并染色,提取海马和皮质总蛋白进行Western blot实验。实验分别设置三组,野生型小鼠组,APP/PS1模型组以及APP/PS1给药组。首先采用HE染色观察小鼠脑组织石蜡切片海马锥体细胞形态,结果表明,APP/PS1模型AD小鼠锥体细胞胞核深染、固缩,呈三角形或不规则形;APP/PS1给药组海马锥体细胞形态规则,排列整齐密集,胞核大而圆,呈均匀淡染。采用TUNEL染色法观察小鼠脑组织细胞凋亡的变化,实验结果表明,给药后小鼠脑内神经元细胞凋亡数目减少,表明药物可抑制小鼠神经元细胞凋亡。采用Western blot分析法检测小鼠海马和皮质组织中Tau蛋白磷酸化、总Tau蛋白及CaM的表达水平,实验结果表明,莲心总碱可显着抑制APP/PS1转基因AD小鼠海马和皮质组织中Tau蛋白的异常磷酸化,并且降低CaM的表达。综上所述,莲子心生物碱（甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱及莲心总碱）可通过抑制Aβ25-35损伤的PC12细胞内Ca2+水平、CaM表达和ROS水平进而抑制细胞内Tau蛋白的过度磷酸化,从而减少细胞凋亡,对细胞产生保护作用。此外,莲心总碱可抑制APP/PS1转基因AD小鼠海马和皮质组织中CaM的表达,进而抑制Tau蛋白的磷酸化,并抑制神经元细胞凋亡。甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱及莲心总碱可能对阿尔茨海默病具有潜在的防治作用。
赵彬[9]（2019）在《110例猝死病例的死亡原因分析及早期心肌梗死检测方法的探讨及其评价》文中研究说明研究背景:猝死（sudden death,SD）是指发病后24小时内自然发生的、出乎意料的、非暴力性的突然死亡。心源性猝死（sudden cardiac death,SCD）是指由于潜在的心脏疾病在某些因素刺激下发生突然的、意外的自然死亡,通常发生在症状出现后的1小时内,可以没有任何征兆,是成人中最为主要的猝死类型。引起SCD最常见原因是冠状动脉性心脏病,简称冠心病（coronary heart disease,CHD）,其他原因包括心肌病、心肌炎、瓣膜病和通道病等。在某些情况下,心源性猝死往往是是法医尸检面临的疑难问题,这是因为心肌组织至少要在持续缺血缺氧6个小时以后甚至更晚的时间才会出现形态学的变化,如心肌细胞的嗜酸性变、颗粒样变性,多灶性纤维波浪样改变,以及心肌细胞核固缩,收缩带坏死、凝固性坏死和炎性细胞浸润等。然而在法医实际案例中,相当数量的猝死者其死亡时间通常发生在心肌缺血缺氧的16小时内,且生前并没有明显的心脏病史以及相应的诱因,或者缺乏直观的证据和有效的目击证人,这就给死因的判断带来很大的困难,为此,探讨检测缺血心肌病变的辅助方法,不仅非常必要,而且为明确死因提供依据具有十分重要的意义。组织化学技术及免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）因具有操作简单、敏感性及特异性好等优点成为国内外学者研究的热点。研究表明,组织化学和IHC可以成为早期缺血心肌判断的较好方法。炎性物质如补体、炎症介质,心肌细胞蛋白、血浆蛋白、缺氧诱导因子和与心力衰竭有关的蛋白质可以通过组织化学或者IHC的方法进行评估。本课题旨在应用组织化学和IHC的方法对猝死心肌组织进行检测,探讨其在缺血心肌尤其是早期缺血心肌组织中实际应用价值,寻找适用于诊断早期心肌梗死,且敏感性和特异性较好的检测方法。第一部分:对滇西地区110例猝死病例的临床分析。目的:分析110例猝死病例的发生原因及其临床特征,探究猝死发病特点及死亡原因,为此类疾病的防治提供依据。方法:收集2010年至2017年大理滇西司法鉴定中心和大理大学第一附属医院猝死病例共110例。所有病例均经过系统尸体解剖、组织学及血清IgE检查,排除外伤、中毒、过敏、电击、高低温、窒息等因素致死。诊断猝死的条件:（1）符合WHO对SD的诊断标准,即从症状开始到死亡时间不超过24小时。（2）SCD:确诊心血管系统存在致死性病变。（3）其他系统疾病猝死,尸检发现中枢神经、呼吸、消化等系统存在致死性病变。结果:110例猝死病例中,男女之比为1:0.53,中位年龄44.5岁,其中心源性猝死（SCD）率为50%（55/110）,以CHD最多见;非心源性猝死（NSCD）占比50%（55/110）,呼吸系统疾病为NSCD的主要原因。结论:SCD是成人猝死的主要类型,冠心病为主要疾病;NSCD中以肺部疾病最为常见。第二部分:早期心肌梗死的检测方法的探讨及其评价。目的:探讨早期缺血心肌检测方法的敏感性。方法:1.材料:收集20例心源性猝死、10例非心源性猝死的心肌标本,分别选取左室壁、室间隔和心尖部;2.方法:（1）应用苏木素-碱性复红-苦味酸染色（HBFP染色法）、变色酸2R-亮绿染色（C-2R染色法）和铁钒-苏木素-伊红染色（Heidenhain染色法）等三种组织化学方法对SCD缺血心肌进行染色并观察;（2）IHC方法检测心肌中JunB、MMP-2和Leptin的表达;（3）比较三种组织化学方法和免疫组化方法在早期缺血心肌组织中敏感性。结果:1.组织化学染色:（1）20例SCD心肌组织标本,HBFP染色左室壁、室间隔和心尖部阳性着色病例共9例,阳性率为45%（9/20）;C-2R染色左室壁、室间隔和心尖部阳性着色病例20例,阳性率为100%（20/20）;Heidenhain染色左室壁、室间隔和心尖部阳性着色病例分别为20例（100%）、20例（100%）和19例（95%）。（2）对照组NSCD组织标本共10例,HBFP染色左室壁、室间隔和心尖部的阳性着色分别为3例、3例和9例,阳性率分别为30%、30%和90%;C-2R染色左室壁、室间隔和心尖部的阳性着色分别为8例、9例和8例,阳性率分别为80%、90%和80%;Heidenhain染色左室壁、室间隔和心尖部的阳性着色,分别为6例,8例和7例,阳性率分别为60%、80%和70%。2.免疫组化染色:（1）JunB、MMP-2和Leptin在SCD心肌中均未出现阳性表达。（2）JunB在对照组结直肠癌中呈阳性表达,MMP-2和Leptin在胃癌阳性对照组中呈阳性表达。结论:1.组织化学HBFP法与C-2R法、Heidenhain法着色比率和程度差异性较大,C-2R法与Heidenhain法的阳性着色比率及着色程度差异性较小,表明C-2R法和Heidenhain法敏感性较好;HBFP法与C-2R法和Heidenhain法相比,心肌细胞阳性着色的敏感性较差。2.免疫组化JunB、MMP-2和Leptin检测在人体SCD心肌组织均不表达,不能作为长时间固定的SCD心肌组织特异性标记物进行检测。
孙佳音[10]（2013）在《培哚普利和氨氯地平对糖尿病伴心肌梗死后内皮祖细胞动员和机制的研究》文中研究说明背景与目的糖尿病是心肌梗死患者预后不佳的独立危险因素,这与糖尿病状态下内皮祖细胞自骨髓中动员被削弱,致使缺血诱导的血管新生功能减弱相关。培哚普利等血管紧张素转换酶抑制剂可以增加内皮祖细胞的动员,并改善心肌梗死患者的预后,但其是否可促进糖尿病状态下已被削弱的缺血诱导的内皮祖细胞动员暂不可知。氨氯地平作为可以部分抑制血管紧张素转换酶活性的钙离子拮抗剂类药物,已被证明可以增加一氧化氮的释放,改善血管内皮的功能,但具体机制尚不明确。因此,本研究即是探讨培哚普利与氨氯地平对糖尿病伴心肌梗死后内皮祖细胞的动员作用,并初步探讨可能机制。方法选取急性心肌梗死并行急诊冠状动脉介入术的患者,根据患者病情选择性给予培哚普利治疗。在急性心肌梗死后不同时间点（PCI后1,3,5,7,14和28天）抽取患者外周血,检测外周血中CD45/low+CD133+KDR+内皮祖细胞数量,以及血浆中血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子以及超敏C反应蛋白的浓度。所有患者都接受为期6个月的随访,来观察临床心血管事件及心功能的变化。将糖尿病伴心肌梗死大鼠随机分至培哚普利组、氨氯地平组和对照组。测量治疗后大鼠外周血CD45-/low+CD133+KDR+内皮祖细胞数量和血浆中血管内皮生长因子水平。检测治疗1月后大鼠心功能和心脏纤维化程度,并用CD31、vWF和a-SMA染色法检测微血管和小动脉密度,TUNEL法检测心肌细胞凋亡。最后,通过western blotting法观察骨髓细胞中eNOS/Akt/MMP-9的表达及活化来初步探讨氨氯地平和培哚普利影响内皮祖细胞动员的可能机制。结果我们的研究发现：1、接受培哚普利治疗可以显着改善糖尿病伴心肌梗死患者外周血中内皮祖细胞数量,并增加血浆中血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子的水平,降低血浆超敏C反应蛋白的浓度；2、糖尿病培哚普利组患者心肌梗死后心血管相关死亡率及心衰症状的发生率均下降,同时左室收缩心功能亦被改善；3、氨氯地平和培哚普利可以显着增加糖尿病大鼠心肌梗死后循环中内皮祖细胞的数量,并增加心梗周围区新生血管的密度：4、氨氯地平和培哚普利治疗后可显着改善糖尿病心肌梗死后心室重构,减少心肌细胞凋亡,改善心肌收缩能力；5、氨氯地平和培哚普利治疗可以使血浆中VEGF表达增多,心梗周围区Akt、eNOS和MMP9活性增强。结论培哚普利和氨氯地平可以显着改善糖尿病时已被削弱的缺血诱导的内皮祖细胞的动员,促进心肌梗死区血管新生,抑制心室重构,改善心肌梗死后心功能。这种作用可能和促进骨髓VEGF/Akt/eNOS通路激活有关。我们的研究为氨氯地平和培哚普利在糖尿病伴心肌梗死后的应用提供了理论基础。
二、缺血心肌细胞核DNA染色法观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、缺血心肌细胞核DNA染色法观察（论文提纲范文）
（1）CHIP对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表及中文对照 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 器械准备 |
| 2.2.2 相关溶液配制 |
| 2.2.3 心肌细胞的分离及培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 缺氧/复氧模型建立 |
| 2.2.6 实验分组 |
| 2.2.7 CCK8 检测各组细胞活力 |
| 2.2.8 检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性 |
| 2.2.9 ELISA法检测各组心肌细胞IL-1β |
| 2.2.10 蛋白质印迹分析 |
| 2.2.11 荧光定量PCR法检测各组心肌细胞焦亡基因NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA的表达。 |
| 2.2.12 细胞焦亡检测 |
| 2.3 统计学数据分析 |
| 第3章 结果 |
| 第一部分 CHIP下调对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响 |
| 目的 |
| 方法 |
| 结果 |
| 3.1 慢病毒下调CHIP时原代心肌细胞表达情况 |
| 3.2 各组原代心肌细胞的形态及数量特点 |
| 3.3 CHIP下调时心肌细胞损伤变化 |
| 3.4 CHIP下调时细胞焦亡染色结果 |
| 3.5 CHIP下调对心肌细胞焦亡及可能通路的影响 |
| 结论 |
| 第二部分 CHIP过表达对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响 |
| 目的 |
| 方法 |
| 结果 |
| 3.6 慢病毒过表达CHIP时原代心肌细胞表达情况 |
| 3.7 CHIP上调时细胞焦亡染色结果 |
| 3.8 CHIP上调对心肌细胞焦亡的影响 |
| 结论 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 焦亡在心血管疾病中的作用 |
| 参考文献 |
（2）重组谷胱甘肽过氧化物酶1与4的抗氧化作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 硒蛋白 |
| 1.1.1 硒蛋白功能与分类 |
| 1.1.2 硒蛋白与心血管疾病 |
| 1.2 GPx1与GPx4 |
| 1.2.1 GPx1的概述 |
| 1.2.2 GPx1的结构与功能 |
| 1.2.3 GPx1与ROS |
| 1.2.4 GPx1的应用前景 |
| 1.2.5 GPx4的概述 |
| 1.2.6 GPx4的结构与功能 |
| 1.2.7 GPx4的应用前景 |
| 1.3 ROS |
| 1.3.1 ROS与氧化应激 |
| 1.3.2 ROS与细胞损伤 |
| 1.3.3 ROS与细胞凋亡 |
| 1.4 心脏氧化应激损伤 |
| 1.4.1 钙离子与心脏氧化应激 |
| 1.4.2 心肌缺血损伤 |
| 1.4.3 异丙肾上腺素建模 |
| 1.5 紫外线损伤 |
| 1.5.1 紫外线损伤概述 |
| 1.5.2 紫外线损伤机制 |
| 1.6 立题依据及研究策略 |
| 第二章 重组GPx1与GPx4的制备 |
| 2.1 序言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验抗体 |
| 2.2.3 主要试剂配方 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 目的菌株的构建 |
| 2.3.2 目的蛋白的表达 |
| 2.3.3 目的蛋白的纯化 |
| 2.3.4 目的蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 2.3.5 目的蛋白的Western blot检测 |
| 2.3.6 目的蛋白的浓度测定 |
| 2.3.7 目的蛋白的活力测定 |
| 2.3.8 hGPx1与mGPx1的酶学性质分析 |
| 2.3.9 hGPx1与mGPx1的稳态动力学分析 |
| 2.3.10 hGPx1与mGPx1的结构分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 目的蛋白的鉴定 |
| 2.4.2 目的蛋白的产率与活力 |
| 2.4.3 hGPx1与mGPx1的酶学性质比对 |
| 2.4.4 hGPx1与mGPx1的稳态动力学比对 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 重组hGPx1的抗氧化作用及其机制研究 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 手术器械 |
| 3.2.3 实验抗体 |
| 3.2.4 细胞株 |
| 3.2.5 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞分组及处理 |
| 3.3.3 细胞形态学分析 |
| 3.3.4 细胞MTT分析 |
| 3.3.5 细胞乳酸脱氢酶(LDH)检测 |
| 3.3.6 细胞ROS检测 |
| 3.3.7 细胞MDA检测 |
| 3.3.8 线粒体膜电位分析 |
| 3.3.9 Hoechst 33258 染色分析 |
| 3.3.10 Annexin V-FITC/PI分析 |
| 3.3.11 细胞内Ca~(2+)浓度检测 |
| 3.3.12 免疫荧光染色实验 |
| 3.3.13 动物分组及处理 |
| 3.3.14 血清心肌酶检测 |
| 3.3.15 血清与组织MDA检测 |
| 3.3.16 心脏组织形态学分析 |
| 3.3.17 免疫组化实验 |
| 3.3.18 Western blot实验 |
| 3.3.19 体内抗体检测与体外中和性抗体分析 |
| 3.3.20 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的H9C2细胞损伤的影响 |
| 3.4.2 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的H9C2细胞氧化应激的影响 |
| 3.4.3 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的H9C2细胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.4 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的H9C2细胞凋亡的影响 |
| 3.4.5 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的H9C2细胞Bcl-2、Bax及Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 3.4.6 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的小鼠血清心肌酶的影响 |
| 3.4.7 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的小鼠心肌脂质过氧化的影响 |
| 3.4.8 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的小鼠心脏组织形态学的影响 |
| 3.4.9 hGPx1与mGPx1对ISO诱导的小鼠心肌组织Bcl-2、Bax及Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 3.4.10 hGPx1与mGPx1在小鼠体内产生免疫抗体的情况 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 重组hGPx1的抗紫外线损伤作用及其机制研究 |
| 4.1 序言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验抗体 |
| 4.2.3 细胞株 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 UVB细胞模型 |
| 4.3.3 细胞分组及处理 |
| 4.3.4 细胞形态学分析 |
| 4.3.5 细胞MTT分析 |
| 4.3.6 细胞LDH检测 |
| 4.3.7 细胞ROS检测 |
| 4.3.8 细胞MDA检测 |
| 4.3.9 线粒体膜电位分析 |
| 4.3.10 Annexin V-FITC/PI分析 |
| 4.3.11 单细胞凝胶电泳实验 |
| 4.3.12 基质金属蛋白酶分析 |
| 4.3.13 Western blot实验 |
| 4.3.14 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 hGPx1对UVB诱导的HaCaT细胞损伤的影响 |
| 4.4.2 hGPx1对UVB诱导的HaCaT细胞氧化应激的影响 |
| 4.4.3 hGPx1对UVB诱导的HaCaT细胞DNA损伤的影响 |
| 4.4.4 hGPx1对UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的影响 |
| 4.4.5 hGPx1对UVB诱导的HaCaT细胞Bcl-2、Bax及CleavedCaspase-3 蛋白表达的影响 |
| 4.4.6 hGPx1对UVB诱导的HaCaT细胞MMP-1 与MMP-9 蛋白表达及分泌的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 重组hGPx4的抗氧化作用及其机制研究 |
| 5.1 序言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 |
| 5.2.2 手术器械 |
| 5.2.3 实验抗体 |
| 5.2.4 细胞株 |
| 5.2.5 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 细胞分组及处理 |
| 5.3.3 细胞形态学分析 |
| 5.3.4 细胞MTT分析 |
| 5.3.5 细胞LDH检测 |
| 5.3.6 细胞ROS检测 |
| 5.3.7 细胞MDA检测 |
| 5.3.8 线粒体膜电位分析 |
| 5.3.9 Hoechst 33258 染色分析 |
| 5.3.10 Annexin V-FITC/PI分析 |
| 5.3.11 细胞内Ca~(2+)浓度检测 |
| 5.3.12 动物分组及处理 |
| 5.3.13 心电图检测 |
| 5.3.14 心脏与体重比率分析 |
| 5.3.15 血清生化标志物检测 |
| 5.3.16 心肌DHE染色 |
| 5.3.17 血清与组织MDA检测 |
| 5.3.18 组织形态学检查 |
| 5.3.19 TTC染色分析 |
| 5.3.20 TUNEL染色分析 |
| 5.3.21 免疫组化实验 |
| 5.3.22 Western blot实验 |
| 5.3.23 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 hGPx4对ISO诱导的心肌细胞损伤的影响 |
| 5.4.2 hGPx4对ISO诱导的心肌细胞氧化应激的影响 |
| 5.4.3 hGPx4对ISO诱导的心肌细胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.4 hGPx4对ISO诱导的心肌细胞凋亡的影响 |
| 5.4.5 hGPx4对ISO诱导的心肌细胞Bcl-2、Bax及CleavedCaspase-3 蛋白表达的影响 |
| 5.4.6 hGPx4对ISO诱导的心肌细胞Nrf2与HO-1 蛋白表达的影响 |
| 5.4.7 hGPx4对心肌缺血大鼠心律失常的影响 |
| 5.4.8 hGPx4对心肌缺血大鼠心肌肥大的影响 |
| 5.4.9 hGPx4对心肌缺血大鼠血清生化标志物的影响 |
| 5.4.10 hGPx4对心肌缺血大鼠心肌氧化应激的影响 |
| 5.4.11 hGPx4对心肌缺血大鼠心肌组织Nrf2与HO-1 蛋白表达的影响 |
| 5.4.12 hGPx4对心肌缺血大鼠心脏组织形态学的影响 |
| 5.4.13 hGPx4对心肌缺血大鼠心肌坏死的影响 |
| 5.4.14 hGPx4对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 5.4.15 hGPx4对心肌缺血大鼠大鼠心肌组织Bcl-2、Bax及CleavedCaspase-3 蛋白表达的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）PARP调控线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 创新性与限制性 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 综述 线粒体自噬的分子调控机制及在心肌缺血再灌注损伤中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）丹酚酸A通过补体作用途径抑制血小板及中性粒细胞活化作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究内容一 丹酚酸A抗心肌缺血小鼠心肌组织损伤及血小板和中性粒细胞活化作用研究 |
| 实验1 丹酚酸A对心肌缺血小鼠心功能的影响 |
| 实验2 丹酚酸A对心肌缺血小鼠心肌组织血小板及中性粒细胞浸润的影响 |
| 实验3 丹酚酸A对心肌缺血小鼠血小板活化的影响 |
| 实验4 丹酚酸A对心肌缺血小鼠尾出血时间的影响 |
| 研究内容二 丹酚酸A抑制血小板及中性粒细胞活化作用机制研究 |
| 实验1 丹酚酸A对ADP诱导的CD62p表达、聚集、粘附的影响 |
| 实验2 丹酚酸A对ADP诱导血小板PI3K、Akt、VASP表达的影响 |
| 实验3 丹酚酸A通过抑制C3aR表达抗血小板活化作用研究 |
| 实验4 丹酚酸A通过抑制C3aR表达抗中性粒细胞脱颗粒作用研究 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 血小板活化对固有免疫的调节作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制HDAC2改善心肌细胞肥大的机制（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）仙茅苷对缺血/再灌注心肌的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstact |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:仙茅苷对于心肌缺血/再灌注损伤的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验药物和试剂的制备 |
| 2.2 实验操作 |
| 2.2.1 H9c2细胞培养 |
| 2.2.2 H9c2细胞分组 |
| 2.2.3 用CCK-8检测H9c2细胞的活力 |
| 2.2.4 用台盼蓝染色法测定H9c2细胞的存活率 |
| 2.2.5 检测LDH活性评估H9c2细胞损伤 |
| 2.2.6 对Wistar大鼠心脏进行缺血/再灌注处置 |
| 2.2.7 Wistar大鼠分组 |
| 2.2.8 检测Wistar大鼠的心率和冠脉血流量 |
| 2.2.9 用HE染色法观察Wistar大鼠心肌显微结构的改变 |
| 2.2.10 用TTC染色法观察Wistar大鼠的心肌梗死面积 |
| 2.2.11 实验结果的统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 仙茅苷对缺氧/复氧H9c2心肌细胞活力的影响 |
| 3.2 仙茅苷对缺氧/复氧H9c2心肌细胞存活率的影响 |
| 3.3 仙茅苷对缺氧/复氧H9c2心肌细胞损伤的影响 |
| 3.4 仙茅苷对缺血/再灌注Wistar大鼠心肌心率和冠脉流量的影响 |
| 3.5 仙茅苷对缺血/再灌注Wistar大鼠心肌病理变化的影响 |
| 3.6 仙茅苷对缺血/再灌注Wistar大鼠心肌梗死面积的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:仙茅苷对于心肌缺血/再灌注损伤保护作用的机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验药物和试剂的制备 |
| 2.2 实验操作 |
| 2.2.1 H9c2细胞分组 |
| 2.2.2 Wistar大鼠分组 |
| 2.2.3 用流式细胞仪测定H9c2细胞的凋亡率 |
| 2.2.4 用罗丹明 123 法测定 H9c2 心肌细胞的线粒体膜电位变化 |
| 2.2.5 用钙诱导法测定H9c2心肌细胞线粒体的开放程度 |
| 2.2.6 检测H9c2 心肌细胞mRNA的表达 |
| 2.2.7 检测H9c2心肌细胞蛋白的表达 |
| 2.2.8 用TUNEL法测定心肌组织的凋亡率 |
| 2.2.9 检测心肌组织mRNA的表达 |
| 2.2.10 检测心肌组织蛋白的表达 |
| 2.2.11 实验结果的统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 仙茅苷对缺氧/复氧H9c2心肌细胞凋亡率的影响 |
| 3.2 仙茅苷对缺氧/复氧H9c2心肌细胞线粒体膜电位变化的影响 |
| 3.3 在体外实验中仙茅苷对线粒体凋亡通路的影响 |
| 3.3.1 在体外实验中仙茅苷对线粒体凋亡通路促凋亡因子mRNA表达的影响 |
| 3.3.2 在体外实验中仙茅苷对线粒体凋亡通路促凋亡因子蛋白表达的影响 |
| 3.4 仙茅苷对缺氧/复氧H9c2心肌细胞线粒体开放程度的影响 |
| 3.5 在体外实验中仙茅苷对Bcl-2和Bax表达的影响 |
| 3.5.1 在体外实验中仙茅苷对Bcl-2和Bax的 mRNA表达影响 |
| 3.5.2 在体外实验中仙茅苷对Bcl-2和Bax的蛋白表达影响 |
| 3.6 仙茅苷对缺血/再灌注Wistar大鼠心肌凋亡率的影响 |
| 3.7 在体内实验中仙茅苷对线粒体凋亡通路的影响 |
| 3.7.1 在体内实验中仙茅苷对线粒体凋亡通路促凋亡因子mRNA表达的影响 |
| 3.7.2 在体内实验中仙茅苷对线粒体凋亡通路促凋亡因子蛋白表达的影响 |
| 3.8 在体内实验中仙茅苷对Bcl-2和Bax表达的影响 |
| 3.8.1 在体内实验中仙茅苷对Bcl-2和Bax的 mRNA表达影响 |
| 3.8.2 在体内实验中仙茅苷对Bcl-2和Bax的蛋白表达影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ LncRNA Gm2691通过激活PI3 K/AKT信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤 |
| 中文摘要 Ⅰ |
| Abstract Ⅰ |
| 符号说明 Ⅰ |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA Gm2691对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 LncRNA Gm2691对缺氧/复氧诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用及机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ GSK621通过激活AMPK信号通路减轻氧糖剥夺/复氧引起的心肌细胞损伤 |
| 中文摘要 Ⅱ |
| Abstract Ⅱ |
| 符号说明 Ⅱ |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）莲子心生物碱对Aβ诱导PC12细胞损伤的保护及其抗阿尔茨海默病作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文对照一览表 |
| 前言 |
| 0.1 淀粉样蛋白β蛋白与阿尔茨海默病 |
| 0.2 Tau蛋白磷酸化与阿尔茨海默病 |
| 0.3 神经元凋亡与阿尔茨海默病 |
| 0.4 钙超载与阿尔茨海默病 |
| 0.5 钙调蛋白与阿尔茨海默病 |
| 0.6 莲子心生物碱的化学结构、种类及重要药理作用 |
| 0.6.1 甲基莲心碱 |
| 0.6.2 莲心碱 |
| 0.6.3 异莲心碱 |
| 0.6.4 莲子心总碱 |
| 0.7 莲子心生物碱的神经保护及抗阿尔茨海默病作用 |
| 第1章 莲子心生物碱对Aβ诱导PC12 神经元细胞过度损伤的活性研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验用细胞 |
| 1.1.2 实验药品与试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养和药物配制 |
| 1.2.2 MTT法检测PC12 细胞存活率 |
| 1.2.3 荧光分光光度计法检测不同浓度的Aβ~(25-35)对PC12 细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响 |
| 1.2.4 流式细胞仪法检测不同浓度的Aβ~(25-35)对PC12 细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响 |
| 1.2.5 HE染色法观察细胞形态学改变 |
| 1.2.6 AO-EB荧光染色法检测细胞凋亡 |
| 1.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 不同浓度的β-淀粉样蛋白(Aβ~(25-35))对PC12 细胞存活率的影响 |
| 1.3.2 不同浓度的Aβ~(25-35)对PC12 细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响(荧光分光光度计法) |
| 1.3.3 不同浓度的Aβ~(25-35)对PC12 细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响(流式细胞仪) |
| 1.3.4 莲子心生物碱对PC12 细胞存活率的影响 |
| 1.3.5 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 损伤PC12 细胞形态学改变的影响 |
| 1.3.6 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 诱导PC12 细胞凋亡的保护作用(AO-EB荧光染色法) |
| 1.3.7 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 诱导PC12 细胞凋亡的保护作用(Annexin V-FITC/PI双染法) |
| 1.4 分析与讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 莲子心生物碱对Aβ诱导PC12 神经元细胞过度损伤的机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用细胞 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 莲子心生物碱及其配制方法 |
| 2.2.2 荧光分光光度计检测胞浆内游离钙离子变化 |
| 2.2.3 流式细胞仪检测胞浆内游离钙离子变化 |
| 2.2.4 荧光分光光度计检测细胞内活性氧(ROS)水平 |
| 2.2.5 Western blot分析法 |
| 2.2.6 PC12 细胞内Tau磷酸化及总Tau的检测 |
| 2.2.7 PC12 细胞内钙调蛋白(CaM)表达的检测 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 损伤的PC12 细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响(荧光分光光度计法) |
| 2.3.2 莲子心生物碱对Aβ~(25-35)损伤的PC12 细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响(流式细胞仪) |
| 2.3.3 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 损伤的PC12 细胞内ROS水平的影响(荧光分光光度计法) |
| 2.3.4 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 诱导PC12 细胞中Tau磷酸化及总Tau的影响 |
| 2.3.5 莲子心生物碱对Aβ~(25-35) 诱导PC12 细胞中钙调蛋白表达的影响 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 莲心总碱对阿尔茨海默病小鼠的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用动物 |
| 3.1.2 实验药品与试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 药物混悬液的配制 |
| 3.2.2 小鼠给药方式及分组 |
| 3.2.3 石蜡切片的制作 |
| 3.2.4 HE染色观察小鼠海马病理学改变 |
| 3.2.5 TUNEL染色观察脑内神经元细胞凋亡 |
| 3.2.6 Western blot分析法 |
| 3.2.7 小鼠海马和皮质组织匀浆中Tau磷酸化及总Tau的检测 |
| 3.2.8 小鼠海马和皮质组织匀浆中钙调蛋白(CaM)表达的检测 |
| 3.2.9 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠脑组织切片HE染色结果 |
| 3.3.2 小鼠脑组织切片TUNEL染色结果 |
| 3.3.3 莲心总碱对APP/PS1 小鼠海马和皮质组织匀浆中Tau磷酸化及总Tau的影响 |
| 3.3.4 莲心总碱对APP/PS1 小鼠海马和皮质组织匀浆中钙调蛋白表达的影响 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（9）110例猝死病例的死亡原因分析及早期心肌梗死检测方法的探讨及其评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 滇西地区110例猝死病例的死亡原因分析 |
| 引言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 早期心肌梗死检测方法的探讨及其评价 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）培哚普利和氨氯地平对糖尿病伴心肌梗死后内皮祖细胞动员和机制的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 一、内皮祖细胞的生物学功能及调控 |
| 二、糖尿病EPCs功能障碍 |
| 三、对糖尿病诱发EPCs损伤的治疗 |
| 四、与糖尿病EPCs治疗相关的临床实验 |
| 参考文献 |
| 第二章 培哚普利对糖尿病患者心肌梗死预后的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 培哚普利可改善糖尿病患者被削弱的内皮祖细胞动员 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 氨氯地平和培哚普利促进糖尿病大鼠心肌梗死后内皮祖细胞动员及血管新生 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 氨氯地平和培哚普利对糖尿病大鼠心肌梗死后心功能和心室重构的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 氨氯地平和培哚普利改善糖尿病大鼠缺血诱导的骨髓内皮祖细胞动员机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、缺血心肌细胞核DNA染色法观察（论文参考文献）
- [1]CHIP对缺氧/复氧介导的心肌细胞焦亡的影响[D]. 洪丽英. 南昌大学, 2021(01)
- [2]重组谷胱甘肽过氧化物酶1与4的抗氧化作用及其机制研究[D]. 刘畅. 吉林大学, 2021
- [3]PARP调控线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究[D]. 孙艺英. 山东大学, 2020(04)
- [4]丹酚酸A通过补体作用途径抑制血小板及中性粒细胞活化作用研究[D]. 马璐璐. 天津中医药大学, 2020
- [5]表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制HDAC2改善心肌细胞肥大的机制[D]. 邓玲. 遵义医科大学, 2020(12)
- [6]仙茅苷对缺血/再灌注心肌的保护作用及其机制研究[D]. 赵彦冰. 中国医科大学, 2020(01)
- [7]LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 李婷婷. 山东大学, 2019(03)
- [8]莲子心生物碱对Aβ诱导PC12细胞损伤的保护及其抗阿尔茨海默病作用研究[D]. 苟江敏. 辽宁大学, 2019(07)
- [9]110例猝死病例的死亡原因分析及早期心肌梗死检测方法的探讨及其评价[D]. 赵彬. 大理大学, 2019(01)
- [10]培哚普利和氨氯地平对糖尿病伴心肌梗死后内皮祖细胞动员和机制的研究[D]. 孙佳音. 南京大学, 2013(08)