一、抗氧化酶对生殖细胞的影响(论文文献综述)
冯天雨[1](2021)在《白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响》文中进行了进一步梳理精原干细胞(SSCs)位于雄性动物睾丸曲细精管的基底膜,是唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs既能自我更新以维持干细胞池的稳定,又能分化参与精子发生,因而SSCs的研究对于了解雄性生殖细胞的分化机制具有重要意义,并且在转基因动物生产和男性不育症治疗方面具有临床应用价值。细胞的冷冻保存能够保持细胞的生物学特性并保障细胞的长期供应,而SSCs冷冻保存是保存优质未成熟雄性奶山羊生殖能力的重要方法。但是,冷冻-解冻过程会增加细胞内活性氧(ROS)的产生,引起SSCs氧化应激,并导致细胞凋亡,降低冻后细胞活力,因而SSCs冷冻保存过程中所受的氧化损伤是一个亟待解决的问题。白藜芦醇是一种天然植物多酚类化合物,具有广泛的生物和药理活性,包括抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、神经保护、心血管疾病防治等作用。目前对于家畜SSCs冷冻保存的研究较少,且尚未有白藜芦醇对SSCs冷冻保存效果方面的研究报道。因此,本研究首先对不同年龄奶山羊的睾丸进行切片观察和蛋白检测,以确定SSCs的表达情况,再通过两步酶消化和差速贴壁从奶山羊睾丸分离和纯化SSCs;其次用含有不同浓度白藜芦醇的冷冻保存液重悬SSCs并利用液氮进行超低温冷冻保存,解冻后检测SSCs活力,筛选最适白藜芦醇浓度;最后通过试剂盒检测、流式细胞术、Western blot、透射电镜等方法探究冷冻-解冻细胞的抗氧化、抗凋亡以及AMPK激活情况,初步揭示白藜芦醇对奶山羊SSCs冷冻保存的保护机制。本试验主要研究结果如下:1.通过不同月龄(15日龄、1月龄、3月龄、6月龄、10月龄)奶山羊睾丸的苏木精-伊红(HE)染色和PGP9.5免疫组织化学染色观察发现,随着奶山羊年龄的增长,曲细精管直径变大,睾丸细胞种类增加,精原细胞总量增多但所占比例下降。Western blot检测不同日龄(15、30、45、60、75、90、180日龄)奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1的蛋白表达量显示,60日龄前的奶山羊睾丸中精原细胞含量显着高于75日龄后(P<0.05),适合用于提取SSCs。2.通过机械分离和两步酶消化分离睾丸细胞,再经差速贴壁纯化收集奶山羊SSCs。利用免疫荧光染色对细胞进行鉴定显示,纯化后的细胞高表达分子标记GFRα1、PLZF、PGP9.5和THY1,表示本研究方法可获得纯度较高的SSCs。3.在冷冻保存液中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100μmol/L)白藜芦醇,使用缓慢冷冻法保存奶山羊SSCs,37℃解冻后对细胞的活力和抗氧化能力进行测定。利用CCK-8和台盼蓝染色检测SSCs活力,结果显示当白藜芦醇浓度为10μmol/L时冻后细胞活力显着高于对照组和其他试验组(P<0.05)。与对照组相比较,冷冻保存液中添加白藜芦醇显着提高了冷冻-解冻后SSCs的总抗氧化能力(T-AOC)、线粒体膜电位和抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性(P<0.05),同时显着降低了细胞内ROS水平和丙二醛(MDA)含量(P<0.05),其中10μmol/L白藜芦醇组SSCs的抗氧化效果显着优于其他试验组(P<0.05),而ROS水平和MDA含量与100μmol/L组差异不显着(P>0.05)。4.选取对照组和10μmol/L白藜芦醇处理组进一步探究白藜芦醇在冷冻-解冻过程中保护SSCs的机制。Annexin V-FITC流式细胞检测结果表明,白藜芦醇组中SSCs的凋亡比例显着低于对照组(P<0.05)。白藜芦醇可极显着抑制促凋亡蛋白Bax的表达并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.01);抑制细胞色素C从线粒体释放至细胞质,从而减少caspase 3和caspase 9的表达(P<0.05)。此外,白藜芦醇可激活细胞AMPK磷酸化,且此种作用可被AMPK抑制剂Compound C部分抵消。透射电镜对细胞超微结构的观察结果显示,冷冻保存液中白藜芦醇的添加显着降低了冷冻-解冻后SSCs的线粒体肿胀空泡化、膜起泡以及核变的比例(P<0.05)。以上研究结果表明,冷冻保存液中添加白藜芦醇能够有效提高冷冻-解冻后奶山羊SSCs的质量,且其最适浓度为10μmol/L。白藜芦醇通过提高细胞抗氧化能力,抑制线粒体途径凋亡,并且激活生物能量代谢调节关键因子AMPK磷酸化,从而在冷冻-解冻过程中减少损伤,发挥保护SSCs的作用。
孙晓凤[2](2021)在《细胞自噬及凋亡在五倍子酸影响雄性布氏田鼠繁殖性能中的作用》文中认为布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)是一种栖息于草原上的小型植食性啮齿类动物。已知其取食的植物中含有单宁类物质,单宁酸(Tannic acid,TA)为其中的一种。我们先前的研究已证明TA可影响布氏田鼠的繁殖性能,但其作用机制仍然未知。TA会在哺乳动物消化道中分解为五倍子酸(Gallic acid,GA)及葡萄糖等。而GA属于酚酸,是一种酚类化合物,也是在自然界中广泛存在的一种植物次生代谢物(Plant secondarymetabolism,PSMs),其结构中含有多羟基基团,具有较强的抗氧化能力。同时酚类化合物可影响细胞自噬、凋亡及动物的生殖能力。基于以上原因,我们推测单宁酸影响布氏田鼠繁殖性能可能与其分解产物GA有关。因此,本研究将探讨GA对雄性布氏田鼠繁殖性能的影响。青春期及成年期雄性布氏田鼠随机分为对照组(0.5%CMC-Na),低剂量组(100mg.kg-1 GA)和高剂量组(200 mg.kg-1 GA),分别在田鼠出生后的第40天及90天开始通过灌胃的方式给予GA,持续两周。实验期间每日记录取食量,每三天记录一次体重。通过台盼蓝染色检测布氏田鼠的精子质量(精子浓度,正常精子、畸形精子及死亡精子的比率),采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测布氏田鼠血清、睾丸组织中促卵泡素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)及睾酮(Testosterone,T)水平;睾丸组织中过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量。制备睾丸组织切片并采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测睾丸组织形态学变化。使用透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)检测睾丸组织内的自噬状况,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)检测睾丸组织内凋亡状况。实时荧光定量PCR(Real-timequantitative PCR,RT-qPCR)检测雄性布氏田鼠生殖腺内自噬及凋亡基因的表达水平。蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测雄性布氏田鼠生殖腺内自噬、凋亡及其相关通路上蛋白的表达。研究将为阐明TA影响布氏田鼠繁殖性能的原因及机制提供依据,丰富动植物协同进化理论,同时为布氏田鼠种群数量控制提供新的思路。研究结果如下:1.GA对青春期及成年期雄性布氏田鼠体重及取食量均无显着影响。2.与对照组相比,低剂量GA处理后布氏田鼠的性腺指数,精子浓度显着提高,异常精子的比率显着降低;而高剂量组异常精子比率显着增加。HE染色结果表明,低剂量GA可促进青春期雄性布氏田鼠睾丸组织发育,而高剂量GA组中可见曲细精管管壁萎缩;成年期雄性布氏田鼠睾丸组织内曲细精管内径在两个处理组中均显着增大,但其组织结构未见显着变化。ELISA结果表明低剂量GA显着提高雄性布氏田鼠FSH、LH水平,高剂量GA引起T水平降低。3.青春期田鼠抗氧化水平在低剂量GA组中增加,在高剂量GA组中降低。成年期田鼠抗氧化水平在两处理组中均增加,但高剂量GA组的效果弱于低剂量组。4.TEM结果表明,GA处理可增强青春期雄性布氏田鼠睾丸组织自噬活性,而成年期组自噬被抑制。TUNEL结果表明,青春期雄性布氏田鼠凋亡细胞数量在低剂量组中显着减少,在高剂量组中显着增加;成年期雄性布氏田鼠凋亡细胞数量无明显变化。5.RT-qPCR结果表明,青春期布氏田鼠LC3基因表达水平在两处理组中均显着上调,Caspase-3基因表达量在低剂量组中显着下调。WB结果表明,青春期低剂量GA组,p-AKT蛋白水平增加,Cleaved-Caspase-3蛋白水平降低,高剂量组p-mTOR 水平降低,LC3水平增加。成年期高剂量GA组p-AKT,p-mTOR水平增加,LC3水平降低。表明AKT/mTOR通路参与GA对布氏田鼠睾丸细胞自噬及凋亡的调节。以上研究结果表明,GA对雄性布氏田鼠的生殖能力的影响具有剂量效应。较低剂量的GA可能通过提高精子质量、抗氧化能力,促进生殖激素的分泌等促进雄性布氏田鼠的生殖器官的发育,较高剂量的GA则可能引起生殖功能受损。GA对生殖系统的影响基于AKT/mTOR通路对细胞自噬和凋亡的调控。
张潇逸[3](2021)在《活性氧诱发的遗传毒性应激介导砷所致雄性生殖细胞增殖抑制和精子质量下降》文中提出目的本研究重点关注砷暴露对雄性小鼠精子质量的影响,并探讨遗传毒性应激在砷所致雄性生殖细胞增殖抑制和精子质量下降中的作用和机制。方法本研究包括体内实验和体外实验,体内实验由三个独立的实验构成。实验一、将40只雄鼠随机分为对照组和As组,对照组饮用超纯水,As组饮用含15mg/L Na As O2的超纯水,70天后处死小鼠、收集睾丸并计数精子。TUNEL实验检测睾丸生殖细胞凋亡;Ki67、PCNA等指标检测睾丸生殖细胞增殖。实验二、将48只小鼠随机分为4组,对照组腹腔注射生理盐水,As组腹腔注射4mg/kg Na As O2,分别在砷注射6、24、72h后收集睾丸。Western blotting检测HO-1和p-ATR蛋白水平。实验三、将48只小鼠随机分为4组,对照组饮用超纯水,As和As+NAC组饮用含15mg/L Na As O2的超纯水,NAC和As+NAC组注射200mg/kg NAC,35天后收集睾丸并计数精子,免疫组化检测PCNA水平。体外实验:RTCA和Ki67免疫染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Western blotting检测CDK1、Cyclin B1、p-ATR、p53、p21等蛋白水平;彗星实验和γH2AX免疫染色检测DNA损伤;DCFH-DA检测ROS水平;NAC干预实验检测HO-1、p21、Ki67等指标。结果动物实验显示砷暴露小鼠生精小管发育延缓、精子数量减少;Ki67、PCNA等增殖标志物蛋白表达降低;CDK1、Cyclin B1等G2/M期检测点蛋白表达降低;HO-1、p-ATR等细胞应激蛋白表达升高;γH2AX的免疫染色显示,As组小鼠睾丸出现了明显的DNA损伤;NAC干预保护砷所致DNA损伤、增殖抑制和精子数量减少。体外实验中,RTCA和Ki67免疫染色均显示砷抑制GC-1细胞增殖。流式细胞术显示砷诱导GC-1细胞G2/M期阻滞,CDK1和Cyclin B1蛋白表达降低。彗星实验和γH2AX的免疫染色显示砷引起GC-1细胞DNA损伤,p-ATR及其下游靶基因p-p53和p21表达均升高。As组细胞活性氧生成增加,HO-1表达升高。NAC干预减轻砷所致遗传毒性应激和细胞周期阻滞。结论综上所述,活性氧诱发的遗传毒性应激介导砷所致雄性生殖细胞增殖抑制和精子质量下降。
谭鹤[4](2021)在《锌对少弱精子症大鼠生殖功能影响的机制研究》文中研究说明目的:本研究构建少弱精大鼠动物模型并进行硫酸锌干预,通过分析锌稳态的动态改变以及检测睾丸组织中氧化应激通路相关蛋白(NRF2、KEAP1、HO-1、HDAC2)和睾酮生成相关调节蛋白(LHR、St AR、CYP11A1和HSD3β1)的表达和分布,旨在探讨补锌对少弱精大鼠生殖功能的改善作用及机制。方法:23只SD雄性大鼠(SPF级、6周龄)适应性喂养一周后,随机分为三组:对照组(control,C)7只、模型组(model,M)9只、硫酸锌组(Zn SO4)7只,均使用普通饲料喂养,每周周一上午测量体重。模型组和Zn SO4组同时给予雷公藤多苷40 mg/(kg·d)灌胃造模,对照组给予等量的生理盐水灌胃,每天上午8:00-10:00为灌胃时间。4周末,随机解剖模型组两只大鼠确定少弱精模型是否造模成功,最终成功14只。从第5周开始,Zn SO4组在雷公藤多苷灌胃4 h后,给予Zn SO4(25mg/kg·d)灌胃行保护治疗,连续给药4周,同时对照组和模型组也增加第二次灌胃,给予等量的生理盐水。最终,C组7只,M组7只,Zn SO4组7只。8周后,取大鼠双侧睾丸和附睾分别称重,取新鲜附睾尾部精子检测其浓度和活力;测定血清锌、睾酮和组织锌;ELISA检测睾丸组织中氧化应激相关蛋白及组织含锌酶的含量;HE染色观察睾丸组织病理学变化;免疫组织化学技术观察睾酮生成相关调节蛋白和氧化应激相关蛋白在睾丸组织中的定位;实时荧光定量PCR和Western Blot检测睾酮生成相关调节蛋白和氧化应激相关蛋白在睾丸组织中mRNA和蛋白表达。结果:1.大鼠一般情况比较各组体重、体长、双侧睾丸和附睾平均重量无统计学差异(P>0.05)。2.大鼠精子参数比较与C组相比,M组和Zn SO4组精子浓度和活力均显着降低(P<0.05);与M组相比,Zn SO4组精子浓度和活力均显着升高(P<0.05)。3.各组大鼠血清锌、组织锌和睾酮的比较⑵睾酮生成相关调节蛋白在各组大鼠睾丸中的定位IHC结果显示,LHR集中表达于间质细胞,St AR、CYP11A1和HSD3β1主要表达于间质细胞,生精小管基底部的精原细胞和精子中也可见。7.氧化应激相关蛋白和睾酮生成相关调节蛋白在各组大鼠睾丸中的m RNA表达⑴氧化应激相关蛋白在各组大鼠睾丸中的m RNA表达与C组相比,M组睾丸中NRF2、KEAP1和HO-1m RNA表达减少(P<0.05),HDAC2 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05);Zn SO4组睾丸中NRF2、KEAP1、HO-1和HDAC2 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与M组相比,Zn SO4组睾丸中NRF2、KEAP1和HO-1 m RNA表达增加(P<0.05),HDAC2 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。⑵睾酮生成相关调节蛋白在各组大鼠睾丸中的m RNA表达与C组相比,M组LHR、St AR、CYP11A1和HSD3β1 m RNA表达降低(P<0.05);Zn SO4组睾丸中LHR、St AR、CYP11A1和HSD3β1 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与M组相比,Zn SO4组LHR,St AR、CYP11A1和HSD3β1 m RNA表达升高(P<0.05)。⑶锌转运蛋白Zn T4、Zn T8、ZIP1和ZIP6在各组大鼠睾丸组织中m RNA表达与C组相比,M组睾丸中Zn T4、Zn T8和ZIP6 m RNA表达降低(P<0.05),ZIP1 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05);Zn SO4组睾丸中Zn T4、Zn T8、ZIP1和ZIP6 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与M组相比,Zn SO4组睾丸中Zn T4、Zn T8和ZIP6 m RNA表达升高(P<0.05),ZIP1 m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。8.氧化应激相关蛋白和睾酮生成相关调节蛋白在各组大鼠睾丸中的蛋白表达⑴氧化应激相关蛋白在各组大鼠睾丸中的蛋白表达与C组相比,M组睾丸中NRF2、HO-1和KEAP1蛋白表达减少(P<0.05),HDAC2蛋白表达增加(P<0.05);Zn SO4组睾丸NRF2和HO-1蛋白表达减少(P<0.05),KEAP1和HDAC2差异无统计学意义(P>0.05)。与M组相比,Zn SO4组睾丸中NRF2、HO-1和KEAP1蛋白表达增加(P<0.05),HDAC2蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。⑵睾酮生成相关调节蛋白在各组大鼠睾丸中的表达与C组相比,M组LHR、St AR、CYP11A1和HSD3β1蛋白表达均显着降低(P<0.05);Zn SO4组睾丸中LHR、CYP11A1和HSD3β1蛋白表达升高(P<0.05),St AR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与M组相比,Zn SO4组LHR、St AR、CYP11A1和HSD3β1蛋白表达显着升高(P<0.05)。结论:硫酸锌处理后少弱精大鼠精液质量回升,睾丸组织结构恢复,血清锌、睾丸组织锌和含锌酶含量升高,氧化应激通路相关蛋白表达量升高以及睾丸组织抗氧化酶含量升高,睾酮生成相关蛋白表达基本恢复正常。结果提示硫酸锌可能是通过修复被破坏的锌稳态,从而激活KEAP1-NRF2/ARE信号通路并促进下游的抗氧化物质的合成,进一步调节睾酮生成相关酶的功能来改善少弱精大鼠的雄性生殖功能。
陈思同[5](2021)在《低强度脉冲超声波对环磷酰胺致小鼠睾丸损伤的保护和机制研究》文中指出低强度脉冲超声波(LIPUS)已经成功应用于治疗男性勃起功能障碍,在临床中应用LIPUS的过程中,治疗区域集中在男性生殖器官,同时超声波具有能量发散性,能量的发散会辐射至睾丸、附睾等器官。这些器官对于各种条件都非常敏感,已有研究表明小剂量的电离辐射、睾丸局部温度升高均有诱发生精细胞凋亡,引起生精功能障碍的可能。为了探究LIPUS在辐照中对生精功能的影响,探究LIPUS是否可调节或增强生精功能,为少/弱精症提供一种新的治疗办法。目的:探究不同能量强度下LIPUS对小鼠生精功能的影响,同时建立一种有效简便、经济的环磷酰胺腹腔灌注少/弱精症小鼠模型,再使用2.5W能量强度LIPUS辐照探究LIPUS能否抑制环磷酰胺所导致的生精功能障碍,从而为LIPUS治疗男性生精功能障碍提供理论支持。第一部分:不同能量强度低能量脉冲超声波对小鼠精液的研究方法:1.将40只SPF级雄性昆明小鼠根据不同能量强度将小鼠按数字随机法随机分为对照组、2.5W组、10W组、17.5W组;2.对照组采用LIPUS,输出能量强度为0W,每次15min,连续14天辐照小鼠腹侧区域,实验组采用LIPUS 2.5W、10W、17.5W能量强度对小鼠进行辐照小鼠腹侧区域,每次15min,连续14天;3.处死小鼠后收集其睾丸组织、精液、血清;4.制备小鼠精浆并进行精液常规检测;5.观察各组睾丸组织病理学变化,电镜检查;结果:1.三个辐照组的血清睾酮含量均显着升高。2.与对照组相比,2.5W组和10W组精子计数、精子畸形率均无明显变化,而辐照组III相比对照组精子数量明显下降、精子畸形率明显升高。3.但是辐照组III睾丸切片出现明显的形态学变化。虽然曲细精管的形态较完整,但部分曲细精管中可观察到异常膨大的生殖细胞,同时,在曲细精管靠近基底侧可以观察到异常的精母细胞,有细胞质和细胞核的核固缩状态。4.2.5W组及10W组与对照组相比亚细胞结构仅受轻微影响。但是17.5W强度辐照下,曲细精管内部分细胞出现线粒体空泡化,还可检测到空泡形成。结论:17.5W组出现的睾丸生精功能有明显的抑制作用,可能导致抑制作用的原因是局部高温,但2.5W及10W能量强度下对生精功能影响较小。第二部分:腹腔注射环磷酰胺对昆明小鼠生精功能损伤效应研究实验一:少弱精症小鼠动物模型建立及精液质量检测方法:1.将40只SPF级雄性昆明小鼠按数字随机法随机分为实验组和对照组;按65mg/kg给予环磷酰胺腹腔灌注和生理盐水腹腔灌注。每天1次,连续5d,之后常规饲养20天。2.处死小鼠后收集其睾丸组织、精液;3.制备小鼠精浆并进行精液常规检测;4.切片后对小鼠睾丸进行常规切片观察其形态变化;5.用流式细胞仪检测精子凋亡情况;6.使用TUNEL法观察小鼠睾丸细胞凋亡。结果:1.实验组较对照组精子密度、精子活力明显下降,精子凋亡率明显上升;2.模型组小鼠生精上皮的界膜厚度减小并可见部分脱落,生精小管内精子数量减少,部分生精细胞脱落或排列紊乱,睾丸间质细胞排列紊乱没有规则,部分间质细胞出现透明样变性;少部分生精小管支持细胞也可见变性。结论:以65mg/kg每日一次,连续5d腹腔灌注环磷酰胺可以导致小鼠精子凋亡率显着增加,精子活性下降,睾丸细胞的凋亡增加,同时,建模期间小鼠未出现死亡现象,提示是一种安全有效的建模方式。实验二:LIPUS对环磷酰胺致小鼠生精功能障碍的保护作用和机制研究方法:1.将30只SPF级雄性昆明小鼠按数字随机法随机分为三组,分别为对照组(NS组),环磷酰胺组(CP组)、环磷酰胺+LIPUS组(CP+LIPUS组)。对照组每日腹腔灌注生理盐水65mg/kg,共5d,环磷酰胺组每日腹腔灌注环磷酰胺65mg/Kg,共5d,环磷酰胺+LIPUS组每日腹腔灌注环磷酰胺65mg/Kg,共5d,期间使用LIPUS辐照小鼠腹侧区域,能量参数为2.5W,每日辐照15min,持续20天。2.处死小鼠后收集其睾丸组织、精液、血清;3.制备小鼠精浆并进行精液常规检测;4.测定小鼠血清睾酮含量;5.HE染色观察小鼠睾丸细胞变化;6.使用免疫组化及免疫荧光染色观察β-catenin、PP2A与SET的阳性表达。结果:1.CP组血清睾酮水平明显低于NS组,而CP+LIPUS组血清睾酮含量高于NS组(P<0.05);2.与CP组相比,CP+LIPUS组精子计数、精子存活率有明显改善;3.相比于NS组,CP组睾丸组织β-catenin表达增多,尤其在精子细胞中更加明显;CP+LIPUS组β-catenin表达与CP组相比较浅;4.相比于NS组,CP组睾丸组织β-catenin表达增多,尤其在精子细胞中更加明显;CP+LIPUS组β-catenin表达与CP组相比较浅。CP组睾丸组织PP2A表达增多;CP+LIPUS组PP2A表达与CP组相比较浅,CP组睾丸组织SET表达较少,CP+LIPUS组SET染色明显较深。结论:LIPUS辐照可以降低睾丸细胞的PP2A表达,从而抑制β-catenin的过度表达,对环磷酰胺引起的睾丸组织损伤起到保护作用。
苑洋洋[6](2020)在《精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究》文中进行了进一步梳理离子通道调节胞内钙离子浓度和膜电位,并调控多种细胞的生理功能。精子是一种特殊的细胞,从男性生殖道射出的精子只有经历获能、超活化、顶体反应等生理变化才能具备受精卵子的能力。而男性生殖道和女性生殖道的离子浓度、渗透压、酸碱度存在差异,精子适应上述新环境必须要有离子通道的参与,其中Cat Sper和KSper作为精子特异性的离子通道,在精子成功受精卵子过程中起到至关重要的作用。钙通道Cat Sper的激活介导Ca2+内流,从而细胞胞内Ca2+([Ca2+]i)浓度的增加诱导随后的获能、超活化、顶体反应等利于精子成功受精。已有报道,Cat Sper易于响应外界的刺激,一些内分泌干扰物通过作用Cat Sper扰乱精子的功能,而全氟辛酸(PFOA)作为主要的环境污染物,其对雄性动物生殖有某种程度的损伤作用,但PFOA对人成熟精子的影响及机制还未被报道。另外,通过什么方式预防和缓解PFOA诱导的生殖毒性也还没被报道。众所周知,槲皮素(Que)是一种具有抗炎症、增强免疫、抗氧化等多种生物学效应的天然物质,被选用缓解PFOA毒性的研究。小鼠精子钾通道KSper是由主亚基Slo3介导,Slo3通道响应胞内p H碱化开放,K+外流从而控制膜电位的超级化。已有报道,Slo3-/-小鼠的精子质膜不能进行超级化而是去极化,并且在精卵结合必要的获能条件下,精子运动异常、精子尾部类似于“发卡结构”,未进行顶体反应,更严重的后果是雄性小鼠不育。KSper在成熟精子被研究的很充分,但其是否在精子发生中发挥作用还没被报道。精子发生分为三个阶段:有丝分裂、减数分裂和精子的形成,整个过程生精细胞的种类主要分为:精原细胞、初级精母细胞(细线期、偶线期、粗线期和双线期精母细胞)、精子细胞(圆形精子和长形精子)。如果KSper在生精细胞中发挥作用,又是哪一个时期呢?由KSper异常引起的小鼠精子不育,是否可以由精子发生正常的生精细胞体外培养来弥补。实验目的:(1)离子通道Cat Sper是否是PFOA毒性的靶点和参与机制;(2)天然物质预防和缓解PFOA引起的生殖毒性;(3)KSper在精子发生中有什么作用。实验方法:(1)穿透人工粘性介质和顶体反应检测技术评价PFOA对人精子功能的影响;(2)钙信号的测定技术评价PFOA毒性作用的靶点是否和Cat Sper有关;(3)活性氧产生检测的技术评价是否参与PFOA扰乱人精子的功能;(4)苏木精-伊红染色染色法用于观察小鼠睾丸组织病理学和附睾精子数的变化,评定PFOA对睾丸的毒性及Que的营救作用;(5)实时荧光定量核酸扩增法结合氧化应激产物和抗氧化酶的定量评定氧化应激的程度;(6)免疫印迹法检测细胞凋亡是否参与PFOA的毒性作用;(7)流式细胞仪检测法:分离不同阶段的生精细胞,并用GFP荧光小鼠验证分离的结果。并观察Slo3+/+、Slo3+/-和Slo3-/-小鼠生精细胞的Slo3表达量、精子的膜电位变化以及Slo3表达量高的细胞对胞内碱化的膜电位变化;(8)免疫荧光法用于观察Slo3在生精细胞中的表达及定位;(9)膜片钳实验技术:记录PFOA及PFOA和孕酮(P4)联合灌流下Cat Sper的电流;在p H 6.0和胞内碱化条件下,记录粗线期精原细胞和圆形精子Slo3的电流,并检测p H 8.0两种细胞的Slo3电流。结果:(1)高剂量PFOA(25μg/ml)单独暴露导致人精子穿透人工合成黏液的能力下降,以及其4 h的连续孵育增加活性氧(ROS)的产生;(2)PFOA暴露剂量依赖性激活人精子Cat Sper,介导细胞外的Ca2+内流,从而[Ca2+]i浓度升高。然而,人精子预处理PFOA(2.5-25μg/ml)显着抑制P4诱导的细胞外Ca2+内流;(3)PFOA(0.25-25μg/ml)预处理明显阻碍了P4诱导精子的顶体反应和穿透粘稠介质的能力。与单独PFOA暴露的小鼠相比,Que的补充(4)减少由PFOA诱导的组织学变化,包括:生精上皮细胞排列不规则,管腔中精子数减少,精原细胞的消失和生殖细胞的脱落;改善由PFOA引起的小鼠睾丸绝对重量和附睾精子数;(5)上调睾丸转录因子NRF2及其下游靶点抗氧化基因:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和血红素加氧酶-1(Ho-1)的表达,同时也增加了抗氧化酶SOD和CAT的活性,降低氧化产物丙二醛(MDA)的生成;(6)增强了抗凋亡蛋白BCL-2的表达,相反降低了促凋亡蛋白p53和BAX的表达;(7)Slo3+/+小鼠中,精原细胞中几乎没有Slo3的表达,初级精母细胞有高水平的Slo3表达,减数第二次分裂(MII)Slo3表达量最高,而随后的精子细胞Slo3的表达量下降;与Slo3+/+生精细胞Slo3的表达相比较,(8)Slo3-/-小鼠生精细胞中几乎无Slo3蛋白的表达,而Slo3+/-生精细胞后期(双线期、MII、和精子细胞)Slo3的表达量会下降;(9)NH4Cl可以使MII细胞胞内碱化,膜电位发生超级化;而NH4Cl使粗线期精母细胞微微碱化,膜电位发生去极化;(10)Slo3蛋白定位到粗线期精母细胞的细胞质和细胞膜上;(11)胞内溶液在p H 6.0下,不能记录到粗线期精母细胞的Slo3电流,并且不响应NH4Cl。在该条件下,能记录到圆形精子微小的Slo3电流,部分可以响应胞内的碱化。而胞内溶液在p H 8.0下,同样不能记录到粗线期精母细胞的Slo3电流,能记录到圆形细胞微小的Slo3电流。结论:(1)Cat Sper是PFOA的作用靶点,PFOA可能通过诱导氧化应激以及扰乱P4诱导的Ca2+信号影响人精子功能,而Que可以通过减轻氧化应激和抑制细胞凋亡,来改善PFOA暴露引起的雄性生殖毒性;(2)KSper在第二次减数分裂后期发挥作用。
陈燕霞[7](2020)在《补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究》文中指出研究背景随着人们生活方式和生育观念的改变,女性生育年龄不断后移,全球生育率呈逐年下降的趋势,而不孕不育的发病率呈逐年攀升的趋势。流行病学调查结果显示,在我国育龄人群中不孕不育的发病率高达15%~20%,患者累计超过6000万,尤其是在我国二孩政策开放后,高龄妇女成为不孕不育的主要就诊人群。其中,卵巢储备功能低下(Diminished Ovarian Reserve,DOR)是造成育龄女性发生不孕不育的重要致病因素,若未能及时干预则可在1~6年内进一步恶化并发展成为卵巢早衰。DOR不仅影响患者的生殖和心理健康,远期还可增加骨折、骨质疏松、心血管事件的发生风险。现代医学主要采用激素替代疗法改善患者临床症状和预防远期并发症,并通过辅助生殖技术进行人工助孕,但由于许多患者无法获得成熟的卵子进行体外受精,因此最终不能获得成功妊娠。中医药在防治不孕不育方面具有悠久的历史并积累了丰富的经验。前期通过查阅相关文献发现,肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机,补肾活血是治疗DOR的重要治法。导师马堃研究员三十余年来一直致力于补肾活血中药治疗排卵障碍性不孕不育的临床及基础研究,根据多年临床诊疗经验,以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方,长期应用于临床以治疗DOR,效果颇佳。现代药理研究显示,补肾促卵方可以通过抑制卵泡颗粒细胞凋亡,减少卵泡闭锁,增加原始卵泡,从而起到保护卵巢储备功能的作用。对于大多数雌性哺乳动物而言,卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的,因此不论何种因素诱导DOR的发生,最终都可将其归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭,导致卵巢储备衰减,因而不能提供充足数量的原始卵泡以被募集进入生长卵泡池,卵泡发育障碍,最终无法形成具有受精能力的成熟卵子。因此,寻求有效治疗药物,积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一,而这正是中医“治未病”思想的体现。随着研究的不断深入,越来越多的证据支持原始卵泡过度激活是诱导卵巢储备提前耗竭的重要病理机制。为了维持生殖寿命,卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态,每个周期中只有极少一部分原始卵泡会被激活进入生长卵泡池。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持原始卵泡静息状态和启动募集过程中发挥着至关重要的作用,对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池,将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁,而颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的中心环节,其中Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用,而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要刺激因素。细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果,其中,Nrf2/ARE信号通路是体内最为重要的抗氧化应激防御体系,在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。因此,本研究拟从PI3K/AKT/mTOR信号通路、Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路以及Nrf2/ARE信号通路探讨补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR的作用机制。在此基础上,并对补肾促卵方进行了急性毒性实验研究,以评价其用药安全性,以期为临床应用提供科学依据。研究目的本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型,筛选出最适补肾促卵方给药浓度后,观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用,进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制,以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路的激活,减少颗粒细胞凋亡,防止生长卵泡过度闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。与此同时,本研究开展了补肾促卵方急性毒性实验研究,以期为临床用药安全性提供客观依据。研究方法一、补肾促卵方急毒实验为了验证补肾促卵方的安全性,以小鼠为研究对象,进行急性毒性实验研究。在预实验中将20只小鼠随机分为给药组和对照组,灌胃前12h每组小鼠均禁食不禁水,给药组予最高给药浓度和小鼠可承受的最大给药体积的补肾促卵方溶液,1日灌胃3次,每次间隔约4h,对照组予等体积生理盐水灌胃,连续观察7天,测定LD50值。根据预实验结果,正式急毒实验采用药物最大耐受量实验的方法进行研究,将40只小鼠随机分为给药组和对照组,给药组灌胃当日予小鼠可承受最大给药体积和最高给药浓度的补肾促卵方浓溶液3次,对照组灌胃给予等体积生理盐水,每次间隔约4h,连续观察14天,密切观察小鼠的死亡情况、反应症状、体重变化、饲料消耗量,以及主要脏器大体形态改变和脏器指数情况。二、补肾促卵方浓度筛选实验雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方低剂量组、补肾促卵方中剂量组、补肾促卵方高剂量组和戊酸雌二醇组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方低剂量、中剂量和高剂量组分别予浓度为0.13g/mL、0.27g/mL和0.53g/mL补肾促卵方混悬液0.2mL灌胃;戊酸雌二醇组予0.015mg/mL戊酸雌二醇混悬液0.2mL灌胃;空白组和模型组予0.2mL生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,计算性腺指数,测定血清性激素(FSH、LH、E2)含量,并通过HE染色观察卵巢组织形态及卵泡计数情况。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方组和激素序贯组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方组予0.27g/mL补肾促卵方混悬液灌胃;激素序贯组予戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮进行序贯治疗;空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,测量并计算各个脏器指数情况,检测血清性激素(AMH、INHB、FSH、LH、E2)水平,并通过HE染色观察子宫、卵巢形态学改变以及卵泡计数情况。为了进一步明确补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡池的作用机制,采用Western blot法检测卵巢组织PI3K/AKT/mTOR 信号通路关键蛋白 PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表达水平,并采用RT-PCT分别检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制在实验三的基础上,研究发现雷公藤多苷除了诱导原始卵泡发生过度激活外,还可引起卵泡发生过度闭锁。为了深入探讨雷公藤多苷诱导DOR是通过使原始卵泡过度激活、致使生长卵泡闭锁增加,还是直接诱导原始卵泡发生闭锁。在此基础上本实验对小鼠卵巢组织进行了 TUNEL荧光染色,并通过免疫组化法观察卵巢组织Cyt C、Caspase-3表达情况。为了进一步明确补肾促卵方抑制雷公藤多苷引起卵泡过度闭锁的作用机制,本实验采用Western blot法检测卵巢组织凋亡相关蛋白CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,同时采用RT-PCT检测Bax、Bcl-2mRNA表达水平。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制在上述实验基础上,研究发现雷公藤多苷可通过诱导原始卵泡过度激活,并使进入生长卵泡池的颗粒细胞发生过度凋亡,促使卵泡异常闭锁,从而造成DOR。基于氧化应激是启动细胞凋亡程序的重要调控因素,为了进一步探索雷公藤多苷诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制以及补肾促卵方对其保护作用,本实验对卵巢组织8-OHdG、MDA、CAT、GSH-Px、SOD的水平进行了测定,同时采用Western blot和RT-PCT对卵巢组织Nrf2/ARE信号通路关键蛋白和基因Bach 1、Nrf2、Keap 1、HO-1的表达水平进行了检测。研究结果一、补肾促卵方急毒实验预实验结果提示补肾促卵方测不出LD50,故正式急毒实验采用最大耐受量实验的方法进行研究,结果显示补肾促卵方灌胃给药后,所有动物均未见死亡并且存活至实验结束。除给药组小鼠在灌胃后2h内出现静伏、活动减少、D0粪便色黑以及D1摄食量减少外,各组小鼠在其他时间点的一般状况良好。实验过程中两组小鼠日均饲料消耗量无明显差异,小鼠体重呈稳定上升趋势。两组小鼠主要脏器大体解剖均未见异常现象,主要脏器指数也无明显差异。二、补肾促卵方浓度筛选实验各组小鼠在实验期间进食、活动和大小便均无明显异常,补肾促卵方干预后小鼠体毛致密有光泽:除空白组外,各组小鼠予雷公藤多苷灌胃后,体重先呈下降趋势,随后逐渐增加至正常水平,至实验结束,各组小鼠体重无明显差异。补肾促卵方中、高剂量组能有效地改善小鼠动情周期,升高子宫和卵巢指数(P<0.05),下调血清FSH、LH水平(P<0.01),并增加原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数(P<0.01),减少闭锁卵泡计数(P<0.01)。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制各组小鼠一般情况、体重及动情周期变化趋势与实验二结果一致。补肾促卵方干预后小鼠卵巢指数升高(P<0.01),血清AMH和INHB水平上升(P<0.01),FSH、FSH/LH值下降(P<0.01,P<0.05);补肾促卵方能增加卵巢原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数(P<0.01,P<0.05,P<0.01),减少次级卵泡和闭锁卵泡数目(P<0.01),同时下调早期生长卵泡与原始卵泡比值(P<0.01)。补肾促卵方能增加小鼠子宫内膜厚度并使子宫内膜腺体数目增多。进一步研究发现补肾促卵方能下调卵巢组织 P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR 值(P<0.01),同时减少 AKT和mTOR mRNA表达水平(P<0.01),并使PI3K mRNA表达呈下降趋势。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制卵巢组织TUNEL荧光染色主要出现在各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而位于皮质区的原始卵泡未见明显荧光着色,补肾促卵方干预后卵巢荧光面积和数量明显减少。免疫组化结果显示Cyt C和Caspase-3蛋白也主要表达于各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而原始卵泡表达较少,补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C和Caspase-3阳性表达面积比(P<0.01)。Western blot结果显示补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C、Caspase-3和Bax蛋白表达水平(P<0.05),增加Bcl-2和Bcl-2/Bax值(P<0.05,P<0.01),同时补肾促卵方能使Bax mRNA表达水平呈下调趋势,增加Bcl-2mRNA和Bcl-2/Bax值(P<0.01)。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制补肾促卵方能减少卵巢8-OHdG、MDA含量(P<0.05,P<0.01),增加CAT、GSH-Px和SOD活力(P<0.01)。Western blot结果显示,补肾促卵方能下调Bach 1核蛋白和Keap1蛋白表达水平(P<0.01,P<0.05),上调Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平(P<0.05),同时补肾促卵方能下调Bach 1核易位率并上调Nrf2核易位率(P<0.01)。RT-PCT结果显示,模型组和补肾促卵方组Bach 1和Nrf2 mRNA水平均升高(P<0.01),但补肾促卵方能下调Keap 1 mRNA并上调HO-1 mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。研究结论1.补肾促卵方最大耐受量为660.00g生药/kg/d,相当于临床用药量的240倍,该方临床用量安全无毒。2.补肾促卵方中、高剂量能够有效地保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠的卵巢储备功能,且两者疗效相当,故在后续实验中选择中剂量进行研究。3.补肾促卵方能通过抑制卵巢PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡过度激活,减少卵泡异常闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用。4.补肾促卵方能通过抑制卵巢Bax/Cyt C/Caspases-3信号通路,上调Bcl-2表达,减少生长卵泡颗粒细胞过度凋亡,从而防止雷公藤多苷诱导DOR小鼠出现生长卵泡异常闭锁。5.补肾促卵方能通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Keap1过表达,促进Nrf2核易位,激活下游抗氧化酶活性,从而减轻雷公藤多苷诱导DOR小鼠卵巢出现氧化应激,防止卵泡颗粒细胞过度凋亡。
李秦[8](2020)在《抗坏血酸在牦牛卵母细胞和体外受精胚胎DNA甲基化调控中的应用》文中研究表明牦牛作为青藏高原上的特有物种,对农牧民具有重要的经济价值,但其因为自然繁殖率低,体外受精(IVF)无疑成为解决这一问题的主要手段。然而,牦牛卵母细胞的质量是成功受精以及影响胚胎发育的关键因素。黄曲霉素B1(AFB1)作为饲料中最危险的霉菌毒素,对饲料的污染无法完全避免,且污染后高度稳定。误食因AFB1污染的饲料会导致哺乳动物的生殖毒性,破坏卵母细胞表观遗传修饰和质量,并影响受精。因此,预防和缓解因AFB1诱导的毒性最有效的方法是补充药物或抗氧化剂。抗坏血酸(AA)作为一种抗氧化剂被广泛的应用于细胞培养,并且已被证实是DNA甲基化调节中TET双加氧酶不可替代的辅助因子。然而,AA对牦牛IVF胚胎DNA甲基化调控的作用以及是否能够保护牦牛卵母细胞免受AFB1的毒性影响仍然未知。本实验通过DNA甲基化评估了AA对牦牛植入前胚胎的发育影响,以及AA对暴露在AFB1中卵母细胞的保护作用,旨在阐明其可能发生的具体机制。1.添加不同浓度的AA培养IVF胚胎,统计卵裂率和囊胚率以及通过凋亡染色(TUNEL)评估囊胚凋亡率和囊胚细胞数。结果显示,与对照组相比,添加50μg/mL AA显着增加了囊胚细胞数,降低了促凋亡基因BAX表达的同时增加了抑调亡基因BCL-2的表达,并且抑制囊胚的凋亡率。其它浓度的AA(100、200μg/mL)对这些指标均产生了不良的影响。因此,选用50μg/mL AA进行后续实验。2.通过第一极体率、精卵结合能力、孤雌激活胚胎发育率、ROS水平、早期凋亡、线粒体分布和肌动蛋白丝完整性七个指标评估AFB1对卵母细胞的毒性影响以及AA的保护作用。结果显示,首先,AFB1的暴露不利于卵母细胞的减数分裂成熟,阻碍卵母细胞第一极体率,降低精卵结合能力和孤雌激活胚胎发育率,导致成熟卵母细胞的质量下降。其次,AFB1的毒性对肌动蛋白丝的完整性具有破坏作用。最后,AFB1对卵母细胞产生了氧化应激损伤,干扰线粒体均匀分布,促进卵母细胞的早期凋亡。添加50μg/mL AA之后,这些指标可恢复到与对照组接近的水平,表明AA可以保护卵母细胞免受AFB1的毒性影响。此外,通过DNA甲基化免疫荧光(5mC)和甲基化转移酶(DNMT1、DNMT3b、DNMT3b)的检测发现,与对照组相比,AFB1对成熟卵母细胞的毒性影响改变了DNA甲基化的水平,添加50μg/mL AA可以显着改善成熟卵母细胞的DNA甲基化水平。3.利用免疫荧光染色法和荧光定量PCR对IVF胚胎发育各阶段DNA甲基化的动态表达(5mC、5hmC、TET3)以及相关甲基化基因(DNMT1、DNMT3b、DNMT3b、TET3)进行检测。荧光染色结果显示,牦牛植入前胚胎仍然遵循DNA去甲基化和再次甲基化的经典模式,而再次甲基化发生在囊胚阶段。其次,TET3在细胞质中的独特表达对去甲基化机制起到关键作用。与对照组相比,添加50μg/mL AA增强了胚胎各阶段5mC,5hmC的荧光信号强度,改变了甲基化转移酶DNMT1和DNMT3a的表达水平,但没有改变甲基化转移酶DNMT3b的表达水平。与对照组相比,添加50μg/mL AA显着增强了TET3在2细胞、4细胞、8细胞和桑葚胚阶段的荧光信号强度,而囊胚阶段的信号强度显着降低,荧光信号强度趋势与自身的mRNA转录丰度相似。4.利用甲基化测序和荧光定量PCR对囊胚阶段多能性基因(CDX2、POU5F1、SOX2、NANOG)进行检测。结果显示,在牦牛IVF囊胚阶段多能性基因CDX2启动子区域呈低甲基化水平,而多能性基因SOX2、POU5F1和NANOG启动子区域呈中等甲基化水平。与对照组相比,添加50μg/mL AA降低了多能性基因NANOG启动子区域的甲基化水平,但没有改变其他多能性基因启动子区域的甲基化水平。荧光定量结果显示,与对照组相比,添加50μg/mL AA增加了多能性基因CDX2、POU5F1和NANOG的表达量,但对多能性基因SOX2的表达没有产生显着影响。以上研究结果表明,抗坏血酸可以保护牦牛卵母细胞免受黄曲霉素B1暴露引起的质量下降和DNA甲基化异常,从而有助于调节牦牛植入前胚胎的DNA甲基化,增加囊胚细胞数。
鹿倩[9](2020)在《基于秀丽隐杆线虫的甲草胺生殖毒性识别方法的构建》文中研究指明研究背景环境雌激素类物质(EESs)是继温室效应、臭氧层破坏之后的全球第三大环境问题,大量具有雌激素效应的物质如农药、重金属、工业化学品等,可引起生物体的生殖障碍及发育异常。EES可通过各种途径在水和土壤中富集,在生物体(鱼类、哺乳类等)及人体(血液、尿液)中也被广泛检测出来,因其具有难降解性、生物蓄积等特点,可对生物体的生殖系统产生长期影响。因此,对EESs的毒性识别与评价是安全管理的核心关键。而现有EES识别方法存在通量低、周期长、费用高、生态保护程度低等问题,难以满足潜在生殖毒性物质的筛选及机制研究的需求。而无脊椎动物秀丽隐杆线虫,具有遗传背景清晰、生命周期短、生殖系统对环境激素类物质应答效率高等优势,有望成为环境雌激素类物质生殖毒性识别的新的生物模型。研究目的本研究以秀丽线虫为活体模型,构建环境雌激素类物质生殖毒性识别方法,筛选差异敏感的生物标志。在此基础上进行酰胺类除草剂甲草胺的生殖毒性及机制研究,同时采用BMD模型进行甲草胺生殖毒性的基准剂量拟合。研究方法与结果1.环境雌激素类物质生殖毒性识别方法的构建以17β-雌二醇(E2)作为环境雌激素代表物质,将L1期秀丽线虫暴露于1,10,100,1000,104,105ng/L E2 48h,M9缓冲液作为空白对照,构建环境雌激素类物质整体、雄性及雌性生殖毒性识别方法,并筛选出差异敏感的毒性指标。结果显示,N2线虫后代数目、世代时间、排卵速率、生殖系统畸形率、性腺发育、基因重组线虫RT130卵黄蛋白发育情况变化显着,且具有明显的剂量-效应关系,提示上述指标可定量反映E2对秀丽线虫的整体生殖毒性。E2可致各剂量组him-5雄虫杂交后代数目、总生殖细胞数、有丝分裂区及减数分裂区细胞数、精细胞直径及数目显着减少,非圆形精细胞百分比显着增加,且具有明显的剂量-效应关系,提示上述指标可定量反映E2的雄性生殖毒性。E2可导致fog-2雌虫杂交后代数目、排卵速率、有丝分裂区细胞数、卵母细胞数、-2卵母细胞相对长度变化显着,且具有明显的剂量-效应关系,提示上述指标可定量反映E2的雌性生殖毒性。2.甲草胺对秀丽线虫的毒性研究2.1甲草胺的生殖毒性研究甲草胺浓度设定为0.08,0.8,8,80,800,8000μg/L,将构建的生殖毒性识别方法应用于甲草胺的毒性评价。结果显示,在0.08μg/L即可观察到N2线虫后代数目明显减少、排卵速率降低、性腺发育迟缓、生殖系统异常及RT130品系卵黄蛋白荧光强度增加,且具有明显的剂量-效应关系,提示上述指标可作为反映其整体生殖毒性的敏感指标。甲草胺可显着降低him-5雄虫杂交后代数目、性腺面积、总生殖细胞数、有丝分裂区及减数分裂区细胞数、精细胞直径及数目,且生殖细胞数及精细胞数目在0.8μg/L减少最为显着;同时可诱导him-5雄虫非圆形精细胞百分比显着升高,且在0.8μg/L升高更为显着。上述结果提示甲草胺可通过影响精细胞形态及数目,最终导致其后代数目减少,低剂量的甲草胺对精细胞发生的毒效应可能更加显着。甲草胺可导致fog-2雌虫杂交后代数目、排卵速率、总生殖细胞数、有丝分裂区及减数分裂区细胞数、-2卵母细胞相对长度显着减少,80μg/L均达到最低水平。提示甲草胺可抑制卵原细胞增殖、导致卵母细胞形态发生及功能发育障碍,进而导致其生育力减弱,卵子发生途径的相关损伤可能是甲草胺诱导生殖毒性的重要途径之一。2.2甲草胺的跨代毒性研究采用亲代(P0)暴露于不同浓度的甲草胺(0.08,0.8,8,80,800,8000μg/L)48h,子代(F1-F2)不暴露的方式研究甲草胺对秀丽线虫的跨代毒性。定量评估多个亚致死终点,包括生殖(后代数目、世代时间、子宫内受精卵数、排卵速率、生殖系统畸形情况、性腺发育)及发育终点(体长、体宽及体型)。结果显示,甲草胺可导致剂量依赖性的生殖缺陷和发育障碍;可导致子代(F1-F2)后代数目减少,F2下降最为显着;F1-F2生殖系统畸形率在0.08μg/L及800μg/L均显着高于P0;F1-F2线虫在0.08,0.8μg/L成虫期线虫比例显着低于P0。提示甲草胺可能具有蓄积毒性,其诱导的生殖毒性可通过亲代接触而传递给子代。与此同时,F1线虫体长及体型在0.08μg/L显着减少;而F2体长及体型则在80μg/L下降最为显着,提示甲草胺具有跨代发育毒性。3.甲草胺对秀丽线虫的毒作用机制研究3.1甲草胺对秀丽线虫的氧化损伤通过测定甲草胺对秀丽线虫氧化应激水平(ROS、脂褐质水平、LDL及MDA含量)、抗氧化酶活性(CAT、SOD、GSH-Prdx)及非酶类物质(GSH)的影响,探索其诱导的生殖毒性与氧化损伤的关系。实验结果显示,各剂量组ROS水平无明显变化,但脂褐质水平、乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA)含量显着增加;8,80μg/L的甲草胺可导致SOD活性降低,80μg/L剂量组该酶活性降低更显着;其他剂量组SOD活性均显着升高;CAT活性变化呈明显的U型曲线,80μg/L达到最低水平;非酶类抗氧化剂GSH及GSH:GSSG比值的变化与GSH-Prdx活性变化一致,均在80μg/L达到最低水平。抗氧化酶及非酶类抗氧化剂的变化同后代数目、排卵速率及生殖系统畸形率的变化一致,提示秀丽线虫的生殖缺陷可能与其抗氧化能力降低有关。3.2甲草胺诱导的生殖毒性与内质网应激及未折叠蛋白反应的关系RT-qPCR检测内质网应激相关基因的m RNA表达情况,探索甲草胺诱导的生殖毒性与内质网应激的关系;采用转基因线虫SJ4005(hsp-4::GFP)荧光强度指示内质网未折叠蛋白反应。结果显示,秀丽线虫内质网应激相关基因hsp-4、pdi-3的表达及SJ4005线虫荧光强度的变化呈现明显的U型曲线,80μg/L均表达下调,其他剂量组均表达上调。表明除80μg/L之外,其他剂量的甲草胺可诱导线虫内质网应激,并可通过内质网未折叠蛋白反应(UPR)修复错误折叠的蛋白质;80μg/L剂量组线虫生殖能力的严重缺陷可能与其无法诱导未折叠蛋白反应有关。3.3甲草胺对卵黄蛋白原基因表达的影响RT-qPCR检测甲草胺对秀丽线虫卵黄蛋白原基因(vit-2、vit-6)表达的影响。结果显示,甲草胺可显着上调vit-2及vit-6基因m RNA水平的表达,且呈明显的倒U型曲线,80μg/L上调最为显着;其变化情况与卵黄蛋白荧光强度的变化基本一致,提示卵黄蛋白荧光强度及卵黄蛋白原基因可作为甲草胺诱导的生殖毒性的敏感指标。4.甲草胺对秀丽线虫生殖毒性的基准剂量拟合采用BMDS 3.12模型,对特异、敏感且具有剂量-效应关系的毒性指标进行基准剂量拟合,以获得甲草胺对秀丽线虫生殖毒性的基准剂量下限值(BMDL)。结果显示,卵黄蛋白荧光强度拟合的BMDL10最低,可作为甲草胺整体生殖毒性的最佳BMDL10(0.0285μg/L);him-5雄虫精细胞直径拟合的BMDL10最低,可作为雄性生殖毒性的最佳BMDL10(0.0187μg/L);fog-2雌虫杂交后代数目拟合的BMDL10最低,可作为雌性生殖毒性的最佳BMDL10(0.041μg/L)。本研究拟合的整体、雄性及雌性生殖毒性的最佳BMDL10均远低于LOAEL值(0.08μg/L)及美国EPA规定的饮用水中甲草胺的最大限值(2ppb),表明线虫能够敏感的反映甲草胺的毒性,本研究方法的构建能够较好地应用于甲草胺的生殖毒性评价。结论1.秀丽线虫生殖系统对环境雌激素类物质具有较高的应答能力,N2线虫的后代数目、世代时间、排卵速率、生殖系统畸形情况、性腺发育情况、RT130品系卵黄蛋白荧光强度可作为环境雌激素类物质整体生殖毒性的定量指标。2.him-5雄虫杂交后代数目、总生殖细胞数、有丝分裂区及减数分裂区细胞数、非圆形精细胞百分比、精细胞直径及数目等指标,能特异性的反映外源性化学物的雄性生殖毒性。3.fog-2雌虫杂交后代数目、排卵速率、总生殖细胞数、有丝分裂区细胞数、卵母细胞数、-2卵母细胞相对长度等指标,可反映外源性化学物质对雌性生殖系统的影响。4.甲草胺可通过影响精子发生及卵子发生途径,对秀丽线虫的雄性及雌性生殖系统产生影响。同时甲草胺具有跨代毒性,可致子代(F1-F2)后代数目、排卵速率显着降低,生殖系统畸形率增加,性腺发育迟缓,对体长、体宽及体型的变化也产生不利影响。5.甲草胺可导致线虫氧化损伤,其生殖毒性可能与内质网应激及未折叠蛋白反应有关。6.甲草胺可诱导秀丽线虫卵黄蛋白荧光强度增加、卵黄蛋白原基因(vit-2,vit-6)表达上调,提示卵黄蛋白荧光强度、vit-2及vit-6基因可作为甲草胺诱导的生殖毒性的敏感指标。7.本研究构建了环境雌激素类物质生殖毒性识别方法,并基于BMDS模型进行甲草胺生殖毒性基准剂量拟合。明确了以秀丽线虫卵黄蛋白荧光强度为效应的整体生殖毒性BMDL10为0.0285μg/L;以him-5雄虫精细胞直径为效应的雄性生殖毒性BMDL10为0.0187μg/L;以fog-2雌虫杂交后代数目为效应的BMDL10为0.041μg/L。上述BMDL10远低于美国EPA规定的饮用水中甲草胺的最大限值(2ppb),表明线虫可敏感的反映甲草胺的毒性。
刘雅洁[10](2020)在《艾烟对弱精子症大鼠精子质量的影响和抗氧化机制研究》文中指出背景弱精子症是以精子活力下降为主要表现的病症,是引起男性不育症的常见病因之一。氧化应激时产生的过量活性氧是造成男性弱精子症的重要原因。现代医学对于弱精子症的发病机理还没有明确定论,目前主要采用口服抗氧化剂的方法减轻弱精子症的氧化应激损伤,缺乏针对性强的靶向治疗手段。因此,探索安全高效的临床医治方法,对于改善弱精子症患者的精子质量具有重要意义。艾灸的治疗作用是一种综合效应,艾燃烧生成物作为艾灸疗法的起效因素之一,不仅具有独特的芳香气味,还拥有丰富的生物活性,具有杀菌、抗病毒,调节免疫反应,清除自由基、抗氧化,调节脂质代谢,降低炎性反应等多种作用,逐渐成为艾灸防治疾病的关键环节。目的研究不同浓度的艾烟对弱精子症大鼠精子参数的影响和对生殖系统氧化应激损伤产生的作用,探讨艾烟改善弱精子症大鼠生殖机能的作用途径,比较艾烟与香烟对机体产生的不同效应,以期为艾烟的作用和安全性提供实验依据。方法选用72只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠作为实验动物,将其随机分为溶剂对照组、模型组、香烟组、低浓度艾烟组、中浓度艾烟组和高浓度艾烟组6组,每组12只。除溶剂对照组使用0.2%羧甲基纤维素钠溶液灌胃之外,其余各组均使用奥硝唑溶液灌胃建立弱精子症大鼠模型。从奥硝唑溶液灌胃的第11天开始,使用不同浓度的艾烟和香烟进行干预。烟雾浓度以遮光率表示,溶剂对照组和模型组的遮光率均为0%,低、中、高浓度艾烟组的遮光率分别为0.4%、2%和15%,香烟组与中浓度艾烟组的遮光率保持一致。各组每日干预1次,每次进行20分钟,每周6天,共干预8周。干预结束后,每组随机选取8只进行体重增量、睾丸质量、睾丸指数、精子质量和氧化应激等指标的检测,剩余4只对其睾丸组织的形态病理学变化进行检测。结果1.体重增量:溶剂对照组大鼠的体重增长最快,其余各组大鼠的体重增量均有不同程度的减少。与溶剂对照组相比,除中浓度艾烟组表现出一定差异(P<0.05)外,其余各组大鼠的体重增量无显着差别(P>0.05)。2.睾丸质量和睾丸指数:溶剂对照组大鼠的睾丸质量最重,其余各组大鼠的睾丸质量均有不同程度的减轻。与溶剂对照组相比,各组大鼠的睾丸质量和睾丸指数均无明显差异(P>0.05)。3.精子参数:与溶剂对照组相比,模型组大鼠的精子活力和精子活率显着降低(P<0.01,P<0.01),VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、WOB 和 STR 等精子动力学参数也明显下降(P<0.01或P<0.05)。不同浓度的艾烟干预后,可以改善弱精子症大鼠的精子活力、精子活率和运动能力,具体表现为低、中、高浓度的艾烟提高了弱精子症大鼠的精子活力(P<0.01,P<0.01,P<0.01)和精子活率(P<0.01,P<0.01,P<0.01),VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、WOB和SRT等精子动力学参数也显着上升(P<0.01或P<0.05),并且在实验设定的浓度范围内,随着艾烟浓度的升高,精子质量的改善效果呈现递增趋势。香烟对弱精子症大鼠的精子活力和精子活率也表现出一定的促进作用(P<0.05,P<0.05),但VCL、VSL、VAP、ALH、WOB和SRT等大部分精子动力学参数与模型组相比无显着差别(P>0.05)。4.睾丸组织GSH-Px、SOD、CAT、MDA和NOS含量:与溶剂对照组相比,模型组大鼠的睾丸组织抗氧化酶GSH-Px和CAT活性显着降低(P<0.05,P<0.01),SOD活性无明显变化(P>0.05),氧化产物MDA和NOS含量明显增加(P<0.01,P<0.01)。不同浓度的艾烟干预后,可以显着提高弱精子症大鼠睾丸组织抗氧化酶的活性,降低氧化产物的含量,具体表现为低浓度艾烟可以提高抗氧化酶SOD和CAT的活性(P<0.05,P<0.01),降低氧化产物MDA和NOS的含量(P<0.01,P<0.05);中浓度艾烟可以提高抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT的活性(P<0.05,P<0.05,P<0.05),降低氧化产物NOS的含量(P<0.05);高浓度艾烟可以提高抗氧化酶GSH-Px和CAT的活性(P<0.01,P<0.01)。不同浓度的艾烟在改善氧化应激损伤的过程中,没有表现出确切的浓度-效应规律。香烟未能改善弱精子症大鼠睾丸组织的氧化应激反应,各项指标与模型组相比无显着差别(P>0.05)。5.睾丸组织形态病理学变化:与溶剂对照组相比,模型组大鼠睾丸组织内生精小管萎缩,各级生精细胞排列紊乱、连接松散,层次和数目均减少;管腔间隙增宽,管腔内精子细胞和成熟精子减少;间质细胞轻度水肿。低、中浓度艾烟干预后,睾丸组织形态结构有不同程度的恢复,生精小管呈圆形或卵圆形,结构基本饱满;各级生精细胞数量增多,层次增加,管腔内可见精子细胞和成熟精子增多。高浓度艾烟和香烟在一定程度上加重了睾丸组织的形态结构损伤,香烟组的损伤表现更为明显。结论1.不同浓度的艾烟改善了弱精子症大鼠的精子活力、精子活率和运动能力,并且在实验设置的浓度范围内,随着艾烟浓度的升高,精子质量的改善效果呈递增趋势。2.不同浓度的艾烟提高了弱精子症大鼠睾丸组织抗氧化酶的活性,降低了氧化产物的含量,低、中浓度艾烟改善了睾丸组织形态结构损伤,推测艾烟可能通过提高机体抗氧化能力的方式,改善弱精子症大鼠的精子质量。3.香烟未能改善弱精子症大鼠的精子质量和睾丸组织的氧化应激反应,加重了睾丸组织形态结构损伤,与艾烟产生的效应不同。
二、抗氧化酶对生殖细胞的影响(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗氧化酶对生殖细胞的影响(论文提纲范文)
(1)白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 精原干细胞概述 |
1.1.1 精原干细胞与精子发生 |
1.1.2 精原干细胞的分离与纯化 |
1.1.3 精原干细胞的标记物 |
1.1.4 精原干细胞微环境 |
1.1.5 精原干细胞的体外培养 |
1.2 精原干细胞的冷冻保存 |
1.2.1 冷冻保存原理 |
1.2.2 冷冻及解冻方法 |
1.2.3 冷冻保护剂 |
1.2.4 冷冻保存与氧化应激 |
1.2.5 冷冻保存与细胞凋亡 |
1.2.6 冷冻保存与细胞自噬 |
1.3 白藜芦醇的研究进展 |
1.3.1 白藜芦醇的主要信号通路 |
1.3.2 白藜芦醇的抗氧化作用 |
1.3.3 白藜芦醇的抗凋亡作用 |
1.3.4 白藜芦醇与细胞自噬 |
1.3.5 白藜芦醇与AMPK |
1.3.6 白藜芦醇对细胞冷冻保存的研究 |
1.4 本研究的目的和意义 |
试验研究 |
第二章 奶山羊精原干细胞的分离与鉴定 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试验材料 |
2.2.2 试验方法 |
2.2.3 数据分析 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 奶山羊睾丸的HE染色 |
2.3.2 奶山羊睾丸的PGP9.5 免疫组织化学染色 |
2.3.3 不同日龄奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1 蛋白的表达 |
2.3.4 奶山羊SSCs的分离与纯化 |
2.3.5 SSCs的免疫荧光染色鉴定 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 白藜芦醇对冷冻保存奶山羊精原干细胞活力及抗氧化能力的影响 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验材料 |
3.2.2 试验方法 |
3.2.3 数据分析 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活性的影响 |
3.3.2 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活率的影响 |
3.3.3 白藜芦醇对冷冻保存SSCs T-AOC的影响 |
3.3.4 白藜芦醇对冷冻保存SSCs内 ROS水平的影响 |
3.3.5 白藜芦醇对冷冻保存SSCs MDA含量的影响 |
3.3.6 白藜芦醇对冷冻保存SSCs线粒体膜电位的影响 |
3.3.7 白藜芦醇对冷冻保存SSCs抗氧化酶活性的影响 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 白藜芦醇保护冷冻保存奶山羊精原干细胞机制的研究 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 试验材料 |
4.2.2 试验方法 |
4.2.3 数据分析 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 流式细胞术检测SSCs凋亡 |
4.3.2 SSCs凋亡相关蛋白的表达 |
4.3.3 SSCs自噬相关蛋白的表达 |
4.3.4 SSCs的 AMPK磷酸化水平 |
4.3.5 SSCs的超微结构观察 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 结论与创新点 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(2)细胞自噬及凋亡在五倍子酸影响雄性布氏田鼠繁殖性能中的作用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语词汇表 |
1. 文献综述 |
1.1 植物次生代谢物 |
1.1.1 植物次生代谢物与酚类化合物 |
1.1.2 酚类化合物影响动物生殖能力 |
1.1.3 酚类化合物影响氧化应激 |
1.1.4 单宁酸与五倍子酸 |
1.2 自噬与生殖细胞发育 |
1.3 凋亡与生殖细胞发育 |
1.4 AKT/mTOR信号通路 |
1.5 布氏田鼠 |
2. 研究目的与意义 |
3. 材料与方法 |
3.1 实验仪器 |
3.2 主要试剂 |
3.3 试剂配制 |
3.4 动物饲养及样品采集 |
3.5 实验方法 |
3.5.1 精子质量检测 |
3.5.2 生殖激素及抗氧化酶含量测定 |
3.5.3 形态学检测 |
3.5.4 TEM观察 |
3.5.5 TUNEL染色 |
3.5.6 RT-qPCR实验 |
3.5.7 Western-blot实验 |
3.6 数据分析 |
4. 结果 |
4.1 GA对雄性布氏田鼠体重和取食量的影响 |
4.2 GA对雄性布氏田鼠生殖腺功能的影响 |
4.2.1 GA对雄性布氏田鼠生殖腺指数的影响 |
4.2.2 GA对雄性布氏田鼠精子质量的影响 |
4.2.3 GA对雄性布氏田鼠生殖激素的影响 |
4.2.4 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织的影响 |
4.2.5 GA对雄性布氏田鼠曲细精管内径的影响 |
4.3 GA对雄性布氏田鼠抗氧化性能的影响 |
4.4 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织自噬及凋亡的影响 |
4.4.1 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织自噬的影响 |
4.4.2 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织凋亡的影响 |
4.5 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织基因转录水平的影响 |
4.6 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织蛋白表达水平的影响 |
5. 讨论 |
5.1 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织抗氧化性能的影响 |
5.2 GA对雄性布氏田鼠生殖能力的影响 |
5.3 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织自噬及凋亡的影响 |
5.4 GA对雄性布氏田鼠睾丸组织AKT/mTOR通路的影响 |
6. 结论 |
参考文献 |
附录 |
攻读学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
(3)活性氧诱发的遗传毒性应激介导砷所致雄性生殖细胞增殖抑制和精子质量下降(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
1.前言 |
2.材料与方法 |
2.1 主要试剂和抗体 |
2.2 动物饲养和处理 |
2.3 细胞培养和处理 |
2.4 砷含量的测定 |
2.5 精子质量评价 |
2.6 睾丸组织病理 |
2.7 TUNEL染色 |
2.8 免疫组织化学染色 |
2.9 CCK8 实验 |
2.10 Annexin V/PI实验 |
2.11 RTCA实验 |
2.12 免疫荧光染色 |
2.13 细胞周期分析 |
2.14 彗星实验 |
2.15 细胞内活性氧检测 |
2.16 蛋白质免疫印迹 |
2.17 统计分析 |
3.结果 |
3.1 砷暴露对小鼠精子数量的影响 |
3.1.1 砷暴露对小鼠饮食饮水量、体重和睾丸重量的影响 |
3.1.2 砷暴露对小鼠精子数量和生精小管发育的影响 |
3.2 砷暴露对小鼠睾丸和GC-1 细胞增殖的影响 |
3.2.1 砷暴露对小鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响 |
3.2.2 砷暴露对小鼠睾丸生殖细胞增殖的影响 |
3.2.3 砷暴露对GC-1 细胞凋亡的影响 |
3.2.4 砷暴露对GC-1 细胞增殖的影响 |
3.2.5 砷暴露对GC-1 细胞细胞周期的影响 |
3.2.6 砷暴露对小鼠睾丸生殖细胞细胞周期的影响 |
3.3 砷暴露对GC-1 细胞和小鼠睾丸遗传毒性应激反应和DNA损伤的影响 |
3.3.1 砷暴露对GC-1 细胞遗传毒性应激反应的影响 |
3.3.2 砷暴露对GC-1 细胞DNA损伤的影响 |
3.3.3 砷暴露对小鼠睾丸遗传毒性应激反应和DNA损伤的影响 |
3.4 砷暴露对GC-1 细胞和小鼠睾丸活性氧生成的影响 |
3.4.1 砷暴露对GC-1 细胞活性氧生成的影响 |
3.4.2 砷暴露对小鼠睾丸活性氧生成的影响 |
3.5 NAC干预对砷所致遗传毒性应激反应、增殖抑制和精子数量减少的影响 |
3.5.1 NAC干预对砷所致GC-1 细胞活性氧生成增加的影响 |
3.5.2 NAC干预对砷所致GC-1 细胞增殖抑制和遗传毒性应激反应的影响 |
3.5.3 NAC干预对砷所致小鼠睾丸DNA损伤和增殖抑制的影响 |
3.5.4 NAC干预对砷所致生精小管发育不成熟和精子质量下降的影响 |
4.讨论 |
5.结论 |
6.参考文献 |
附录 |
致谢 |
综述 砷的雄性生殖毒性的研究进展 |
参考文献 |
(4)锌对少弱精子症大鼠生殖功能影响的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩写 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 微量元素锌与雄性生殖功能的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(5)低强度脉冲超声波对环磷酰胺致小鼠睾丸损伤的保护和机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
前言 |
技术路线图 |
第一部分 低强度脉冲超声波对小鼠精液的影响研究 |
1 动物和材料 |
2 实验方法 |
3 统计方法 |
4 结果 |
5 小结 |
第二部分 低强度脉冲超声波对环磷酰胺致小鼠生精功能障碍的保护作用和机制研究 |
实验一 少弱精症小鼠动物模型建立及精液质量检测 |
1 动物和材料 |
2 实验方法 |
3 统计方法 |
4 结果 |
5 小结 |
实验二 低强度脉冲超声波对环磷酰胺致小鼠生精功能障碍的作用和机制研究 |
1 动物和材料 |
2 实验方法 |
3 统计方法 |
4 结果 |
5 讨论 |
第三部分 结论与展望 |
1 结论 |
2 展望 |
参考文献 |
文献综述 低强度脉冲超声在泌尿系统应用进展 |
1 LIPUS的作用机制 |
2 LIPUS在肾疾病方面的应用 |
3 LIPUS在膀胱疾病中的应用 |
4 LIPUS在慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征中的应用 |
5 LIPUS对精子生成的应用研究 |
6 LIPUS在勃起功能障碍中的应用 |
7.展望 |
参考文献 |
在学期间的研究成果 |
致谢 |
(6)精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 引言 |
1.1 哺乳动物精子发生的过程 |
1.1.1 精原细胞的大小及特征 |
1.1.2 减数分裂前期精母细胞的大小及特征 |
1.1.3 减数分裂后精子细胞的大小及特征 |
1.1.4 生精细胞的分选 |
1.2 附睾中精子的成熟 |
1.3 女性生殖道精子的成熟及成功受精的必备事件 |
1.3.1 女性生殖道精子的成熟-获能 |
1.3.2 超活化 |
1.3.3 顶体反应 |
1.3.4 趋化反应 |
1.3.5 超极化 |
1.4 精子特异性的钙通道CatSper |
1.4.1 CatSper通道在精子调控中的作用 |
1.4.2 环境内分泌干扰物和CatSper的关系 |
1.5 精子特异性的钾通道KSper |
1.5.1 人精子KSper |
1.5.2 小鼠精子KSper-Slo3 |
1.5.3 生精细胞与离子通道的联系 |
1.6 环境内分泌干扰物对男性生殖的影响 |
1.6.1 全氟辛酸的基本性质 |
1.6.2 全氟辛酸对男性生殖的危害 |
1.7 研究的意义 |
第2章 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.2 主要实验试剂 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.1.4 主要溶液配方 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 人精液标本的收集与处理 |
2.2.2 .实验动物建模 |
2.2.3 小鼠生殖细胞的收集与处理 |
2.2.4 主要实验方法 |
2.2.5 数据统计分析及作图 |
第3章 结果 |
3.1 体外不同浓度PFOA孵育对精子功能的影响及机制 |
3.1.1 PFOA抑制P4诱导的精子穿透人工粘性介质的能力 |
3.1.2 PFOA镇压P4诱导的顶体反应 |
3.1.3 PFOA诱导人精子胞外Ca~(2+)内流 |
3.1.4 PFOA抑制P4引起的胞外钙离子内流 |
3.2 Que恢复PFOA诱导的氧化应激和细胞凋亡 |
3.2.1 Que恢复PFOA诱导的小鼠睾丸组织学形态损伤 |
3.2.2 Que改善PFOA诱导的睾丸绝对重量和附睾精子数的降低 |
3.2.3 Que对 PFOA诱导的过氧化指标和抗氧化酶的影响 |
3.2.4 Que对 PFOA诱导的抗氧化调节因子NRF2 的恢复 |
3.2.5 Que增加PFOA诱导的抗氧化基因的表达 |
3.2.6 25μg/ml PFOA孵育4h增加ROS的产生 |
3.2.7 Que保护PFOA诱导的细胞凋亡 |
3.3 KSper在小鼠生精细胞中的表达、作用及定位 |
3.3.1 生精细胞的分离及验证 |
3.3.2 生精细胞群Slo3蛋白的表达 |
3.3.3 Slo~(3-/-)鼠验证生精细胞Slo3 表达的准确性 |
3.3.4 精子中Slo3的表达及作用 |
3.3.5 MII和粗线期细胞Slo3 的作用 |
3.3.6 生精细胞Slo3蛋白的定位 |
3.3.7 pH6.0和8.0下粗线期、圆形细胞Slo3的电流 |
第4章 讨论 |
4.1 体外不同浓度PFOA孵育对精子功能的影响及机制 |
4.2 Que缓解PFOA诱导的氧化应激和细胞凋亡 |
4.3 生精细胞中功能性的Slo3的表达 |
第5章 结论和展望 |
5.1 结论 |
5.2 进一步工作 |
致谢 |
参考文献 |
附录 |
攻读学位期间研究成果 |
(7)补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩略词 |
第一章 文献研究 |
综述一 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下的研究进展 |
1 原始生殖细胞形成、迁移和增殖 |
2 性腺发育与性别决定 |
3 原始卵泡形成 |
4 原始卵泡激活 |
5 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下 |
综述二 卵巢储备功能低下中医研究进展 |
1 病名的阐释 |
2 病因 |
3 病机 |
4 治疗 |
结语 |
参考文献 |
第二章 实验研究 |
前言 |
第一部分 补肾促卵方安全性评价的研究 |
实验一 补肾促卵方急毒实验 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
第二部分 补肾促卵方保护雷公藤多普诱导DOR小鼠卵巢储备功能的机制研究 |
实验二 补肾促卵方浓度筛选实验 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
实验三 补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR通路保护原始卵泡池的作用机制 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
实验四 补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3通路保护生长卵泡的作用机制 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
实验五 补肾促卵方调控Nrf2/ARE通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
结论 |
创新点与展望 |
致谢 |
个人简历 |
附件 |
(8)抗坏血酸在牦牛卵母细胞和体外受精胚胎DNA甲基化调控中的应用(论文提纲范文)
摘要 |
SUMMARY |
英文缩写词表Ⅰ |
英文缩写词表Ⅱ |
第一部分 文献综述 |
第一章 哺乳动物的DNA甲基化 |
1 DNA甲基化的建立与维持 |
2 DNA去甲基化 |
2.1 被动去甲基化机制 |
2.2 主动去甲基化机制 |
3 哺乳动物基因组中5mC的分布 |
4 哺乳动物基因组中5hmC的分布 |
5 胚胎的DNA甲基化 |
6 卵母细胞的DNA甲基化 |
6.1 卵母细胞甲基化分布 |
6.2 卵母细胞甲基化功能 |
7 DNA甲基化对基因组的作用 |
7.1 甲基化对印记基因和X染色体失活的作用 |
7.2 甲基化对转座子的作用 |
7.3 甲基化对特异性基因表达的作用 |
8 小结 |
第二章 抗坏血酸对DNA甲基化的影响 |
1 TET双加氧酶与Fe~(2+)和2OG |
2 AA是TET双加氧酶的辅助因子 |
3 AA对DNA去甲基化的作用 |
4 AA对产后发育的影响 |
5 AA的有效性变化 |
6 小结 |
第三章 黄曲霉素B1对DNA甲基化的影响 |
1 化学环境与DNA甲基化 |
2 黄曲霉素B_1与DNA甲基化 |
3 胚胎中ROS的产生 |
3.1 外源性因素导致的ROS |
4 活性氧对胚胎的损伤 |
5 活性氧的防御系统 |
5.1 非酶物质与ROS |
5.2 酶促防御 |
5.3 氧化应激的修复 |
6 体外胚胎技术与ROS |
6.1 气体环境 |
6.2 共培养环境 |
6.3 温度环境 |
6.4 培养基中的抗氧化物 |
6.5 金属螯合物 |
6.6 巯基化合物 |
6.7 蛋白质类 |
6.8 维他命 |
7 小结 |
第二部分 实验研究 |
第一章 不同浓度AA对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
1 材料与试剂 |
1.1 实验样品 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要耗材 |
1.4 主要试剂 |
2 试验方法 |
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养 |
2.2 牦牛卵母细胞的体外受精和胚胎培养 |
2.3 囊胚细胞的凋亡染色与计数 |
2.4 囊胚微量RNA的提取 |
2.5 反转录(cDNA) |
2.6 Real Time PCR引物设计与合成 |
2.7 Real Time PCR |
2.8 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 不同浓度AA对胚胎发育的影响 |
3.2 不同浓度AA对囊胚阶段凋亡基因表达的影响 |
3.3 不同浓度的AA对囊胚细胞凋亡的影响 |
4 讨论 |
5 小结 |
第二章 抗坏血酸保护牦牛卵母细胞免受黄曲霉素B_1暴露引起的DNA甲基化异常 |
1 材料与试剂 |
1.1 实验样品 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要耗材 |
1.4 主要试剂 |
2 试验方法 |
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养 |
2.2 AFB1的暴露和AA的添加 |
2.3 卵母细胞孤雌激活发育能力的评估 |
2.4 精卵结合能力的评估 |
2.5 氧化应激检测 |
2.6 凋亡检测 |
2.7 线粒体分布评估 |
2.8 肌动蛋白动力学评估 |
2.9 卵母细胞的微量RNA提取 |
2.10 反转录(cDNA) |
2.11 Real Time PCR引物设计与合成 |
2.12 Real Time PCR |
2.13 卵母细胞的甲基化染色 |
2.14 图像分析法 |
2.15 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 AA改善了暴露在AFB_1中卵母细胞的减数分裂成熟 |
3.2 AA改善了暴露在AFB_1中卵母细胞的孤雌发育能力 |
3.3 AA提高了暴露在AFB_1中卵母细胞与精子的结合能力 |
3.4 AA降低了暴露在AFB_1 中卵母细胞的ROS水平 |
3.5 AA抑制了暴露在AFB_1中卵母细胞的早期凋亡 |
3.6 AA改善了暴露在AFB_1中卵母细胞的线粒体分布状态 |
3.7 AA恢复了暴露在AFB_1中卵母细胞的肌动蛋白 |
3.8 AA改善了暴露在AFB_1 中卵母细胞的DNA甲基化水平 |
4 讨论 |
5 小结 |
第三章 AA对牦牛IVF胚胎发育过程中DNA甲基化的影响 |
1 材料与试剂 |
1.1 实验样品 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要耗材 |
1.4 主要试剂 |
2 试验方法 |
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养 |
2.2 牦牛卵母细胞体外受精和体外培养 |
2.3 囊胚微量RNA的提取 |
2.4 反转录(cDNA) |
2.5 Real Time PCR引物设计与合成 |
2.6 Real Time PCR |
2.7 胚胎的甲基化免疫荧光染色 |
2.7.1 对不同浓度下各阶段胚胎进行5mC和5hmC的免疫荧光染色分析,具体步骤: |
2.7.2 对不同浓度下各阶段胚胎进行TET3的免疫荧光染色分析,具体步骤 |
2.8 图像分析法 |
2.9 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 AA对植入前胚胎DNA甲基化基因表达的影响 |
3.2 AA对植入前胚胎5mC/5hmC动态表达的影响 |
3.3 AA对植入前胚胎TET3基因表达的影响 |
3.4 AA对植入前胚胎TET3动态表达的影响 |
4 讨论 |
5 小结 |
第四章 AA对牦牛IVF囊胚阶段多能性基因启动子区域的甲基化影响 |
1 材料与试剂 |
1.1 实验样品 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要耗材 |
1.4 主要试剂 |
2 试验方法 |
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养 |
2.2 牦牛卵母细胞体外受精和体外培养 |
2.3 囊胚微量RNA的提取 |
2.4 反转录(cDNA) |
2.5 Real Time PCR引物设计与合成 |
2.6 Real Time PCR |
2.7 多能性基因启动子区域的甲基化检测 |
2.8 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 AA对囊胚阶段多能性基因表达的影响 |
3.2 AA对囊胚阶段多能性基因启动子区域甲基化水平的影响 |
4 讨论 |
5 小结 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
在读期间发表论文和研究成果等 |
导师简介 |
(9)基于秀丽隐杆线虫的甲草胺生殖毒性识别方法的构建(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
主要缩略词 |
前言 |
第一章 环境雌激素类物质生殖毒性识别方法的构建 |
第一节 环境雌激素类物质整体生殖毒性识别方法的构建 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第二节 环境雌激素类物质雄性生殖毒性识别方法的构建 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第三节 环境雌激素类物质雌性生殖毒性识别方法的构建 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第二章 甲草胺对秀丽线虫的生殖毒性研究 |
第一节 甲草胺对秀丽线虫的整体生殖毒性研究 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第二节 甲草胺对秀丽线虫的雄性生殖毒性研究 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第三节 甲草胺对秀丽线虫的雌性生殖毒性研究 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第四节 甲草胺对秀丽线虫的跨代毒性研究 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第三章 甲草胺对秀丽线虫生殖毒性的机制研究 |
第一节 甲草胺对秀丽线虫氧化应激水平的影响 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第二节 甲草胺对秀丽线虫抗氧化酶活性及非酶类物质的影响 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第三节 甲草胺诱导的生殖毒性与内质网应激的关系 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第四节 甲草胺对秀丽线虫卵黄蛋白原基因表达的影响 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
第四章 甲草胺对秀丽线虫生殖毒性基准剂量的拟合 |
1.材料及方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
总结 |
参考文献 |
综述 甲草胺的生殖毒性研究进展 |
参考文献 |
作者简介 |
致谢 |
(10)艾烟对弱精子症大鼠精子质量的影响和抗氧化机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 文献综述 |
综述一 弱精子症的现代研究进展 |
1 弱精子症的病因 |
2 弱精子症的发病机制 |
3 弱精子症的治疗 |
4 思考与展望 |
参考文献 |
综述二 氧化应激与男性不育研究进展 |
1 氧化应激的产生 |
2 氧化应激的分子机制 |
3 氧化应激的病理影响 |
4 氧化应激损伤的治疗 |
5 总结与展望 |
参考文献 |
综述三 艾烟在氧化应激中的作用探讨 |
1 艾烟的抗氧化研究 |
2 衰老的自由基学说 |
3 艾烟抗氧化的作用机制 |
4 艾烟的安全性 |
5 总结与展望 |
参考文献 |
前言 |
第二部分 实验研究 |
实验一 艾烟干预弱精子症模型大鼠的实验研究 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
实验二 艾烟对弱精子症大鼠氧化应激损伤的保护机制研究 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
第三部分 结语 |
1 结论 |
2 创新性 |
3 不足与展望 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间主要研究成果 |
四、抗氧化酶对生殖细胞的影响(论文参考文献)
- [1]白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响[D]. 冯天雨. 西北农林科技大学, 2021
- [2]细胞自噬及凋亡在五倍子酸影响雄性布氏田鼠繁殖性能中的作用[D]. 孙晓凤. 扬州大学, 2021
- [3]活性氧诱发的遗传毒性应激介导砷所致雄性生殖细胞增殖抑制和精子质量下降[D]. 张潇逸. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]锌对少弱精子症大鼠生殖功能影响的机制研究[D]. 谭鹤. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]低强度脉冲超声波对环磷酰胺致小鼠睾丸损伤的保护和机制研究[D]. 陈思同. 兰州大学, 2021(09)
- [6]精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究[D]. 苑洋洋. 南昌大学, 2020(02)
- [7]补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究[D]. 陈燕霞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [8]抗坏血酸在牦牛卵母细胞和体外受精胚胎DNA甲基化调控中的应用[D]. 李秦. 甘肃农业大学, 2020
- [9]基于秀丽隐杆线虫的甲草胺生殖毒性识别方法的构建[D]. 鹿倩. 东南大学, 2020
- [10]艾烟对弱精子症大鼠精子质量的影响和抗氧化机制研究[D]. 刘雅洁. 北京中医药大学, 2020(04)