一、天灸对哮喘患者血清可溶性IL-2受体及T淋巴细胞亚群的影响（论文文献综述）
郑炜东[1]（2021）在《麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究》文中研究说明目的:本研究使用卵清蛋白（OVA）复制过敏性哮喘模型大鼠,验证麻杏石甘汤的抗过敏作用,进而探究麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠辅助T淋巴细胞Th2、Th9、Th17的调控作用和主要调控细胞;并使用体外培养外周血淋巴细胞的方式探究麻杏石甘汤干预过敏性哮喘的作用靶点;探讨麻杏石甘汤干预过敏性哮喘细胞免疫的主要机制,为阐明麻杏石甘汤抗过敏性哮喘和作用机理提供实验依据。材料与方法:1.麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠的抗过敏作用观察。观察麻杏石甘汤对过敏性模型大鼠血清Ig E,肺组织病理（HE染色）,腹腔肥大细胞脱颗粒的调控作用。采用OVA致敏、激发的方法复制过敏哮喘模型大鼠,然后给予麻杏石甘汤经口灌胃干预,采用ELISA法检测大鼠血清中Ig E,HE染色法观察肺组织病理,腹腔肥大细胞脱颗粒实验观察麻杏石甘汤对肥大细胞膜的稳定作用。2.麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠Th2、Th9、Th17的调控作用观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠血清IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17含量的影响。观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9表达的影响。观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠外周血淋巴细胞Th2、Th9、Th17比例的影响。采用OVA致敏、激发的方法复制过敏性哮喘模型大鼠,然后给予麻杏石甘汤经口灌胃干预,采用ELISA法检测大鼠血清IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17的含量。采用Western-Blot及免疫组化法检测大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9的表达。采用流式细胞法检测大鼠外周血淋巴细胞Th2、Th9、Th17的比例。3.麻杏石甘汤调控CD4+T细胞Th2、Th9、Th17亚型的作用采用体外培养大鼠外周血淋巴细胞,使用细胞因子和含药血清体外干预CD4+T细胞发育,采用免疫荧光法和ELISA法观察麻杏石甘汤对PBMC中Th2、Th9、Th17阳性率和细胞因子含量,阐述麻杏石甘汤调控Th2、Th9、Th17的抗过敏机制。结果:1.动物体内实验部分1.1采用腹腔注射OVA后再行雾化吸入OVA可成功诱导大鼠过敏性哮喘模型。1.2麻杏石甘汤可明显改改善造模大鼠的一般状态,麻杏石甘组大鼠肺组织HE染色气管黏膜完整,未断裂,支气管黏膜慢性炎症较轻,黏膜增生突起、杯状细胞增生较轻,肺气肿及肺间质性炎性改变较轻,周围存在少数肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润。说明麻杏石甘汤可整体改善大鼠过敏性哮喘肺组织病变程度。1.3在肥大细胞脱颗粒检测中,西药对照组、麻杏石甘组大鼠肥大细胞计数、脱颗粒的肥大细胞计数、脱颗粒率均明显降低（p<0.05）;与西药对照组比较,麻杏石甘组大鼠肥大细胞计数、脱颗粒的肥大细胞计数、脱颗粒率差异无统计学意义（p>0.05）。提示麻杏石甘组可降低肥大细胞在肺组织中的募集、减少肥大细胞脱颗粒,缓解气道炎症。且与西药效果相当。1.4 OVA造模大鼠血清中Ig E含量明显增高,空白组大鼠血清Ig E未见明显变化与文献报道结果一致。其余两组经药物干预后与模型对照组比较,麻杏石甘组和西药对照组中大鼠血清Ig E水平均明显下调（p<0.05）。虽然组间差异无统计学意义（p>0.05）,但对比数据,麻杏石甘组对Ig E的调控效果略优于西药对照组。推测示中药复方颗粒剂可能是通过抑制Ig E,增强抗过敏作用,从而减轻气道炎症反应。1.5采用流式细胞术和ELISA分别测定辅助T淋巴细胞比例和细胞因子含量。结果显示与空白对照组相比,模型对照组的大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达明显上调（p<0.05）,Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞比例均增大。说明Th2、Th9、Th17及其主要细胞因子在支气管哮喘发病过程中起重要作用,与文献报道一致。实验还发现Th2细胞因子（IL-4,IL-5）上调趋势明显同时流式检测Th2细胞阳性率最高,证实了Th2细胞在哮喘的发展过程中占主导地位。经过药物治疗后,与模型对照组比较,麻杏石甘组和西药对照组大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达均有不同程度的下调（p<0.05）,麻杏石甘组指标皆优于西药对照组且麻杏石甘组中IL-4、TGF-β、IL-9表达下调较为明显（p<0.05）,尤其在流式检测中,麻杏石甘组Th9细胞阳性率大体与空白对照组相当（p>0.05）且明显低于西药对照组（p<0.05）,证明麻杏石甘汤在调控Th2、Th9、Th17方面都有很好的效果,但麻杏石甘汤最可能是通过调控Th9细胞来干预过敏性哮喘。1.6进一步对肺组织中与Th9分化发育有关的IL-4、TGF-β和Th9分泌的特异性细胞因子IL-9进行研究。IHC结果提示在上皮细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、平滑肌细胞、杯状细胞、肥大细胞中可检测到IL-4、TGF-β、IL-9,western blot结果表明麻杏石甘汤可下调IL-4、TGF-β、IL-9表达（p<0.05）。横向观察IHC、western blot及ELISA法所测得的各组数值,显示出麻杏石甘汤可显着下调IL-9的表达（p<0.05）,同时抑制IL-4和TGF-β表达（p<0.05）,说明麻杏石甘汤可能同时抑制CD4+T细胞向Th9细胞分化和Th2细胞向Th9细胞的转化。推测麻杏石甘汤可能是通过调控细胞因子来干预Th9细胞的发育与分化以达到治疗过敏性哮喘的目的。2.动物体外实验部分2.1使用Ficoll-paque（菲科帕克）成功提取PBMC。2.2通过免疫荧光法证明Th9细胞的分化与IL-4和TGF-β协同作用密不可分,含有麻杏石甘汤成分的血清能够有效调控CD4+T细胞增殖能力。2.3麻杏石甘汤有效调控PBMC中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达在检测IL-4时,细胞因子对照组和含药血清组中IL-4含量均比空白对照组明显增加（p<0.05）,其中IL-4组增加最明显（p<0.05）,含药血清组增加最少（p<0.05）。说明在IL-4高表达的情况下,原始CD4+T细胞可能向Th2细胞分化,当同时存在TGF-β表达时CD4+T细胞可能向非Th2细胞分化,麻杏石甘汤可能具有抑制Th2细胞分化的作用。在检测TGF-β时,IL-4组中TGF-β含量是细胞因子组中最低的（p<0.05）。含药血清组TGF-β含量较细胞因子组降低（p<0.05）,证明麻杏石甘汤可能具有调控TGF-β表达的作用。在检测IL-5含量时,IL-4组和IL-4+TGF-β组无统计学差异且TGF-β组含量很少（p<0.05）,证明IL-5主要由Th2细胞分泌,而含药血清组IL-5含量与TGF-β组基本相当（p>0.05）,证明麻杏石甘汤可能具有抑制IL-5表达的作用。在检测IL-10时,IL-4+TGF-β组中IL-10含量较余下细胞因子组明显增高（p<0.05）,IL-4组和TGF-β组IL-10含量无统计学差异（p>0.05）,上述结果与文献一致。含药血清组IL-10含量明显降低,证明麻杏石甘汤可能具有干预Th9细胞表达IL-10的作用。为了进一步验证麻杏石甘汤对Th9细胞的干预能力,我们检验Th9最主要细胞因子IL-9在各组中的含量,结果显示IL-4+TGF-β组的IL-9含量为细胞因子组中最高（p<0.05）,含药血清组IL-9含量明显下降（p<0.05）,进一步证明麻杏石甘汤可通过干预细胞因子IL-9调控Th9细胞。最后在检测IL-17时,TGF-β组和IL-4+TGF-β组中IL-17高表达（p<0.05）,证明TGF-β是Th17细胞分化的必要细胞因子,含药血清组IL-17表达降低（p<0.05）,说明麻杏石甘汤可能具有抑制IL-17表达的作用。结论:1.通过动物体内实验,揭示麻杏石甘汤可降低哮喘大鼠肥大细胞脱颗粒率,使大鼠血清中Ig E的含量降低,发挥治疗气道炎症的作用;麻杏石甘汤还可通过干预IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17等表达来调控Th2、Th9、Th17细胞以达到控制哮喘的目的。同时麻杏石甘汤可以显着下调IL-9、IL-4和TGF-β的表达,推测麻杏石甘汤可能主要通过干预Th9细胞的分化与IL-9的分泌来达到抗哮喘的作用。2.通过动物体外实验,进一步验证了IL-4和TGF-β对于Th9细胞分化起决定性作用;麻杏石甘汤能够有效抑制CD4+T细胞中Th2、Th9、Th17增殖能力,其中抑制Th9细胞增殖能力最强;进一步证明麻杏石甘汤能够有效干预Th9细胞的分化和相应细胞因子的表达来发挥抗哮喘作用。
司东旭[2]（2021）在《肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究》文中研究说明目的基于前期支气管哮喘慢性持续期（Chronic duration of bronchial asthma,CDBA）中医干预方案研究成果,温润方组（Wenrunformulagroup,WRFG）良好控制率75.44%,明显优于常规辨证组（Routine syndrome differentiation group,RSDG）良好控制率 48.33%。本研究进一步通过分子生物学研究,证明“肺脾为核心脏腑整体辨证”的中医干预思路充分反映了中医治疗CDBA的优势与特色。构建基于“肺脾为核心脏腑整体辨证”CDBA免疫调控的生物学依据。方法本研究工作主要依托课题——支气管哮喘慢性持续期中医干预方案,分别在山东中医药大学附属医院、安徽中医药大学第一附属医院、北京中医药大学东直门医院、中国中医科学院西苑医院等四个研究中心,开展同时期、多中心、随机、对照、三盲的临床实用性随机对照优效设计研究。应用“肺脾为核心脏腑整体辨证”观指导思想下形成的“温润辛金培本”原理系列方药（简称温润方）为中医干预方案。共纳入符合研究要求病例128例,将入组病例随机分为WRFG和RSDG。为进一步观察两组治疗前血清免疫球蛋白、白介素谱系分布特点,以及治疗后血清免疫球蛋白、白介素谱系变化趋势,对符合要求的入组患者进行了二次筛选。同时,招募健康人群作为健康对照组（Healthy group,HG）,并收集受试者血清标本。采用ELISA竞争检测方法进行血清标本检测,开展“肺脾为核心脏腑整体辨证”治疗CDBA调节血清免疫球蛋白及血清白介素水平的免疫调控研究。结果1病例信息分析本研究根据现有各组血清病例数,结合纳入排除标准,确定纳入WRFG24例,RSDG 14例、HG 14例。WRFG与RSDG两组患者治疗前中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,只有腰膝酸软1（1,2）（WRFG）、0（0,1）（RSDG）,具有统计学差异。其他单项中医症状体征及中医症状体征总积分均无统计学差异;WRFG与RSDG两组患者治疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,均无统计学差异;WRFG组患者疗前疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,喘息、乏力、口干、心悸、头晕、畏寒肢冷、腰膝酸软、咳嗽、咳嗽性质、咳痰不爽、总分具有统计学差异。其他单项中医症状体征均有下降趋势,但无统计学差异;RSDG组患者疗前疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,气短、乏力、口干、畏寒肢冷、咳嗽、咳嗽性质、总分具有统计学差异。其他单项中医症状体征多有下降趋势,但无统计学差异;WRFG与RSDG中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分差值比较中,WRFG在喘息、口苦、口干、心悸、纳呆、腹胀、口渴喜饮、大便不调、夜尿频、头晕、腰膝酸软、总分等方面较RSDG症状积分降低,但均无统计学差异;WRFG与RSDG疗前疗后肺功能比较,两组患者在FEV1%FVC、PEF%等方面无统计学差异。2血清免疫球蛋白2.1治疗前组间比较WRFG血清IgA、IgG水平较RSDG和HG低,具有统计学差异。WRFG血清IgE水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG血清IgA、IgG、IgE水平较HG无统计学差异。2.2治疗后组间比较WRFG血清IgA、IgG水平较RSDG和HG无统计学差异。WRFG血清IgE水平较RSDG高,具有统计学差异,较HG无统计学差异。RSDG血清IgA、IgG、IgE水平较HG无统计学差异。3血清促炎白介素3.1治疗前组间比较WRFG 血清 IL-1β、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-13、IL-20、IL-25、IL-36y 水平较RSDG、HG 低,具有统计学差异。WRFG 血清 IL-3、IL-4、IL-6、IL-9、IL-33 水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG 血清 IL-1β、IL-7、IL-8、IL-9、IL-13、IL-20、IL-25、IL-33、IL-36γ 水平较HG无统计学差异。RSDG血清IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6水平较HG低,具有统计学差异。3.2治疗后组间比较WRFG 血清 IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-33、IL-36γ 水平较 RSDG 无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。WRFG血清IL-2、IL-3、IL-8、IL-13、IL-20、IL-25水平较RSDG、HG无统计学差异。RSDG 血清 IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-13、IL-20、IL-33 水平较 HG 无统计学差异。RSDG 血清 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-25、IL-36γ 水平较 HG 低,具有统计学差异。4血清抗炎白介素4.1治疗前组间比较WRFG 血清 IL-10、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-35 水平较 RSDG、HG 低,具有统计学差异;WRFG血清IL-29水平较RSDG低,具有统计学差异,较HG无统计学差异;血清IL-12、IL-37水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG 血清 IL-10、IL-12、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-29、IL-35、IL-37 水平较 HG无统计学差异。4.2治疗后组间比较WRFG血清IL-10、IL-12、IL-21水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异;WRFG血清IL-27、IL-29、IL-35、IL-37水平较RSDG、HG无统计学差异;WRFG血清IL-28A水平较RSDG低,具有统计学差异,较HG无统计学差异。RSDG 血清 IL-10、IL-12、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-29、IL-35、IL-37 水平较 HG无统计学差异。结论1 WRFG组在改善哮喘患者喘息、咳嗽、咳嗽性质、咳痰不爽、乏力、口干、心悸、头晕、畏寒肢冷、腰膝酸软、总分等全身症状体征方面具有明显的优势。体现了WRFG“肺脾为核心脏腑整体辨证”,整体诊治CDBA的优势与特色。2 WRFG治疗后血清免疫球蛋白、血清促炎和抗炎白介素水平升高并接近健康人水平,可能与温润方减轻了哮喘患者气道慢性炎症这一基础病理损害,使哮喘患者气道炎症局部对较高的血清促炎白介素水平耐受性增强,提高了气道对损伤因子的免疫防御及修复能力有关。3 CDBA具有多种免疫细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症病理变化基础,炎症、免疫参与了疾病宏观表现的微观病理变化。反之,不同的微观炎症免疫调控失衡状态影响着宏观中医哮喘的病机演变。CDBA存在着“肺脾为核心多脏虚”的关键病机共性规律。“肺脾为核心脏腑整体辨证”是在全面客观认识CDBA脏腑关系与病机演变规律基础上对中医整体观念、脏腑辨证的继承、发展、应用,强调以“肺脾为核心”的整体观揭示哮喘发病机制。
于晓峰[3]（2021）在《变应性鼻炎患者CD4+T细胞研究》文中指出变应性鼻炎（Allergic Rhinitis,AR）是由Th2细胞介导的一种常见的免疫性疾病,是一个影响全世界人口健康的重大问题,大概20%左右的人群被变应性鼻炎所困扰,并且全世界的发病率一直在不断上升[1-3]。近年来,变应性鼻炎的症状由于治疗方案的发展得到一些改善,但仍然居高不下,且有较高比例的AR患者发展成鼻-鼻窦炎、鼻息肉、眼结膜炎及哮喘等诸多疾病,很大程度的影响患者的生活质量[4-6]。变应性鼻炎的的主要临床症状包括流鼻涕、打喷嚏、鼻痒及鼻塞[7]。变应性鼻炎如果长期得不到控制和治疗,很容易发展成支气管哮喘[8]。所以,对变应性鼻炎进行干涉和治疗能够对哮喘的发生起到一定的防治作用,也正因为如此,变应性鼻炎越来越成为耳鼻喉界基础和临床研究的热点疾病。近年来对变应性鼻炎的机制研究颇多,但具体的发生机制仍然不是很清楚[9-11],目前认为T细胞是引起变应性鼻炎发生发展的主要淋巴细胞[12],Th1/Th2的免疫失衡是主要因素[11-13],并深入研究相关的细胞因子,例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等。我们在进行变应性鼻炎患者外周血的细胞学实验中发现细胞表面趋化因子受体的变化对该病的发生机制也存在一定决定作用,遂进行进一步的深入研究。目的:本研究旨在研究变应性鼻炎患者外周血淋巴细胞亚群的数量和比例,变应性鼻炎患者T细胞亚群及功能,以及变应性鼻炎患者T细胞趋化因子受体的变化,从中找出影响变应性鼻炎的关键因素,为疾病的治疗提供分子学依据。方法:1、研究对象25例AR患者和31例健康对照者（HCs,从20例健康对照者收集的外周血单个核细胞）从中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科门诊于2019年10月至2020年2月招募,其中25例AR患者为本院初诊患者,对其筛选和分类依据以下标准:（1）年龄:≥18岁。（2）临床症状:鼻塞、鼻痒、流清水涕、打喷嚏（≥2项）,持续时间≥1小时/天。（3）体征:鼻粘膜苍白、水肿,鼻腔水样分泌物。（4）治疗:初次就诊,均未进行免疫治疗,并排除其他系统的免疫性疾病。（5）化验:血清过敏源抗体检测（+）、血清总Ig E（+）。（6）分类:使用2016变应性鼻炎及其对哮喘的影响（ARIA）指南:所有AR患者根据病情严重程度分为轻度组（1分）和中重度组（2分和3分）。伦理批准获得了中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准,并获得了所有研究参与者参与本研究的书面知情同意书。2、外周血样本处理使用含有乙二胺四乙酸（EDTA;Becton Dickinson,Plymouth,UK）的真空采集管从每位研究参与者收集5毫升外周血。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMCs）,冷冻保存于添加10%二甲基亚砜的胎牛血清中,收集后48h内液氮保存。用免疫帽100（Phadia,Uppsala,Sweden）测定AR患者血浆总Ig E水平。3、外周血淋巴细胞亚群与绝对值检测淋巴细胞亚群计数（T,B,NK,CD4和CD8）百分比和绝对数用BD-FACSCanto TM II（Becton-Dickinson,USA）流量测定仪测定,使用六色直接免疫荧光试剂盒（BD-Multitest-IMK kit和BD-Multitest six-color TBNK。Becton Dickinson,USA）和绝对计数管（Becton Dickinson,USA）。4、外周血CD4+T细胞亚群及趋化因子受体检测调节性T细胞（Treg）定义为CD4+CD25+CD127Low/-细胞。其他CD4T亚群通过先前报道[35,36]的CCR4、CXCR3和CCR6的差异表达鉴定:CXCR3+CCR4-CCR6-（Th1）、CXCR3-CCR4+CCR6-（Th2）、CXCR3-CCR4+CCR6+（Th17）和CXCR3+CCR4-CCR6+（Th1Th17）。此外,Th17细胞被定义为CXCR3-CCR4+CCR6+（Th17）和CXCR3+CCR4-CCR6+（Th1Th17）的总和。用于多色流式细胞术分析的荧光色素结合抗体是CD3-BV510（Biolegend,USA,catalog no.317332）,CD4-APC-Cy7（Biolegend,USA,catalog no.317418）,CCR4-APC（Biolegend,USA,catalog no.359404）,CXCR3-PE（Biolegend,USA,catalog no.353706）,CCR6-PE-Cy7（Biolegend,USA,catalog no.353418）,CD25-BV421（Biolegend,USA,catalog no.302630）,D127-FITC（Biolegend,USA,catalog no.351312）,PE-Cy7-CCR7（Biolegend,USA,catalog no.353226）and CD62L-FITC（Biolegend,USA,catalog no.304804）.一种活性染料7-AAD（Becton Dickinson,USA,catalog no.559925）用于排除死细胞。同种型抗体也被用作阴性对照,为受体的表达设置合适的门控。细胞分析采用荧光活化细胞分选（FACS）,使用BD-LSRII细胞仪和Flow Jo软件。5、AR患者血清细胞因子及趋化因子水平检测收集AR患者和HCs血清,离心分离（2000×g,10min）。在-80℃下储存在500微升的等分液中待分析。使用LEGENDplex人类基本免疫应答面板（Biolegend,USA,catalog no.740929）按照制造商的说明测量血清IL-4、IL-2、IP-10、IL-6、TNF-a、MCP-1、IL-17、IL-10、IFN-y、IL-12和IL-8的浓度。简言之,50微升血清与抗体包被的捕获珠在室温下孵育2小时。洗涤珠粒后,添加25微升检测抗体,并与珠粒在室温下孵育1小时。接下来,将25微升SA-PE直接添加到每个孔中,并在室温下培养30分钟。在冲洗掉未结合的SA-PE后,将珠子重新悬浮在鞘液中5分钟。最后,在BD FACSCanto II（Becton Dickinson,USA）上评估样品,并使用LEGENDplex 8.0（Biolegend,USA）进行分析。6、统计学分析使用spss17.0软件进行统计计算。分类数据用频数和卡方检验进行描述和分析。对于参数比较,采用双侧Mann-Whitney U检验或配对Wilcoxon检验来评估各组间的差异。Spearman秩相关检验用于测量变量之间的相关性。除非另有说明,否则p值<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、变应性鼻炎患者和正常对照组的B和NK细胞大计数无明显差异,但是变应性鼻炎患者的T细胞有轻度的上升。2、变应性鼻炎中-重症患者外周血淋巴细胞数量及比例与轻症患者无显着性差异。3、变应性鼻炎患者外周血CD4+T细胞数量显着高于健康对照。4、变应性鼻炎中-重症患者外周血CD4+T细胞亚群数量与轻度患者无显着性差异。5、变应性鼻炎患者外周血Th1及Th17亚群细胞数量及比例显着降低。6、变应性鼻炎中重症患者外周血Th1及Th17亚群细胞数量及比例显着低于轻症患者。7、AR患者的IFN-g、IL-10、IL-6水平升高,提示Th1、Th17细胞因子均上调。8、变应性鼻炎患者外周血CD4+T细胞CCR4、CCR6、CXCR3及CD62L表达显着低于健康对照。9、变应性鼻炎中重症患者外周血CXCR3+CD4+T细胞比例显着低于轻症患者。结论:虽然T细胞被认为在Ig E介导的特应性疾病中起主要作用,但对变应性鼻炎（AR）患者T细胞亚群的系统性变化知之甚少。为了确定外周T细胞的特征,我们分析了自然杀伤细胞、B细胞和T细胞群,进行了T细胞亚群结构的分析,评估了25例变应性鼻炎和31例健康对照者的趋化因子受体和相关血清细胞因子的表达。我们的结果显示CD4+T细胞、血清IL-10、IL-6和IFN-γ水平升高,Th1和Th17降低系通过变应性鼻炎患者其趋化因子受体的低表达。这些结果提示变应性鼻炎患者中T细胞反应的活跃性。我们进一步证明变应性鼻炎患者表现出明显的CD4+T细胞中CXCR3趋化因子的表达降低,特别是在中重度变应性鼻炎患者中,表明CXCR3是阻碍变应性鼻炎患者中Th1/Th2平衡的潜在关键因素。总之,变应性鼻炎患者发生全身T细胞活化,CD4+T细胞中的CXCR3显着降低,最终可能被用于潜在的疾病治疗靶点。
董方[4]（2019）在《基于自噬基因ATG5探讨针刺调控内质网应激诱导气道高反应T淋巴细胞亚群稳态机制研究》文中指出气道高反应性（Airway Hyperrecation,AHR）是指气管、支气管对特异性抗原刺激和非特异性刺激呈现的过度反应,是支气管哮喘病人区别于正常人的重要特征之一。以气道高反应为主要特征的支气管哮喘是危害人类健康的最常见慢性病之一,全球范围有超过3.58亿的哮喘患者。哮喘常有家族倾向,受遗传因素影响,伴随着生活方式的改变,其发病率和死亡率呈上升趋势。针刺作为作为传统中医疗法之一,对气道高反应的治疗效果临床疗效得到了中西医呼吸学专家的广泛认可,但针刺治疗气道高反应的具体机制研究甚少,制约了针刺治疗气道高反应在更广泛范围的认可和应用。目前普遍认为,炎症反应是AHR发生的重要机制之一。当气道受到过敏原或其他外界刺激后,淋巴细胞比例和自噬失衡、炎症细胞因子水平升高、炎症细胞浸润、气道上皮细胞损害等因素导致了AHR。内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）和自噬是细胞抗损伤的重要机制,两者可通过多种途径参与T淋巴细胞的增殖/分化和炎症性反应,包括气道高反应。自噬基因ATG5在气道高反应中起着重要作用。本课题组先前的研究中证实了针刺可通过调节CD4+T淋巴细胞亚群平衡改善小鼠气道高反应的症状。因此,本研究拟建立卵清蛋白ovalbumin（OVA）致敏气道高反应C57小鼠及条件性ATG5基因敲除小鼠模型,观察针刺大椎、肺俞、足三里对OVA致敏小鼠气道反应性的影响,并以此为基础探讨针刺通过自噬基因ATG5介导内质网应激-自噬在CD4+T淋巴细胞稳态中的作用机制,为针刺在气道高反应治疗的临床应用提供理论和实验室依据。第一章文献研究一、哮喘的研究进展二、针灸在哮喘治疗中的应用三、内质网应激与哮喘的关系四、细胞自噬与哮喘的关系五、自噬基因ATG5与哮喘的关系第二章实验研究第一节针刺对气道高反应模型气道高反应性及气道炎症的影响目的:观察针刺大椎、肺俞、足三里对OVA致敏小鼠气道反应性和气道炎症的作用方法:一、气道高反应模型的构建及分组干预18只C57小鼠随机分成3组,Sham组、AHR组（气道高反应模型组）,AAHR组（针刺治疗组）,每组6只。Sham组:实验的第0天、第7天和第14天共3次在腹腔注射生理盐水0.2ml。于第15日起开始以1%戊巴比妥钠0.1ml腹腔注射麻醉,隔日一次,至第27天结束。于第28、29、30天,每天以生理盐水雾化,20min/天,连续3天。AHR组:于实验的第0天、第7天和第14天共3次在腹腔注射含10μg OVA及1mg Al（OH）3的生理盐水0.2ml,于第15日起开始腹腔注射1%戊巴比妥钠0.1ml麻醉,隔日一次,至第27天结束。于第28、29、30天,以含1%OVA的生理盐水（70mg OVA加入7ml无菌生理盐水中）给致敏小鼠雾化。AAHR组:气道高反应模型构建同AHR组,于第15日起选择大椎、肺俞（双）、足三里（双）进行针刺,隔日针刺1次,共针7次,至第27天结束针刺。于第28、29、30给致敏小鼠雾化,方法同AHR组。二、指标检测1.无创肺功能检测清醒动物的特殊气道阻力记录乙酰甲胆碱刺激后s Raw值。2.HE染色观察各组小鼠肺组织病理切片中气道与肺组织的形态结构变化。3.瑞氏染色观察并统计BALF中白细胞百分比变化。结果:一、无创肺功能检测结果显示,与Sham组相比,AHR组小鼠在乙酰甲胆碱浓度为3.125 mg/ml至50mg/ml激发剂量时s Raw改变百分比升高,差异有统计学意义;经针刺治疗后,AAHR组小鼠在各浓度Mch激发后,s Raw改变百分比均低于AHR组,差异均有统计学意义。二、肺组织病理HE染色结果显示,正常组小鼠肺组织支气管粘膜上皮细胞排列规则,未见炎性细胞浸润,支气管内无明显分泌物;AHR组支气管粘膜出现充血性水肿,上皮细胞可见局灶性脱落,皱折增多,支气管管腔内及肺间质可见明显的分泌物;AAHR组支气管粘膜上皮细胞排列趋于整齐,粘膜下充血性水肿程度减弱,支气管管腔内及肺间质中分泌物明显减少。三、对BALF中细胞瑞氏染色结果计数分析发现气道高反应模型组的BALF中白细胞总数明显增加,而针刺组白细胞总数明显减少。同时,AHR组的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比明显高于Sham组,巨噬细胞明显低于Sham组（均P<0.05）。经针刺干预后,嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比明显降低,巨噬细胞百分比明显升高。结论:本研究成功制备了C57小鼠气道高反应模型,针刺大椎、肺俞、足三里穴可以改善其气道高反应,减轻气道炎症,是一种有效的治疗方案。第二节针刺对气道高反应模型T淋巴细胞亚群的影响目的:观察针刺大椎、肺俞、足三里对气道高反应小鼠的Th1/Th2和Treg/Th17淋巴亚群平衡的作用方法:一、气道高反应模型的构建及分组干预二、指标检测1.ELISA法分别检测血清和肺泡灌洗液（BALF）中TGF-β,IL-17,IFN-γ,IL-4的含量变化。2.流式细胞术检测脾脏调节性T细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞,观察T淋巴细胞亚群变化。结果:一、在血清和BALF中,AHR组TGF-β,IL-17,和IL-4含量均高于Sham组,而AHR组IFN-γ含量低于Sham组（P<0.05）。与AHR组比较,针刺AAHR组TGF-β,IL-17,和IL-4显着降低,IFN-γ含量显着升高。二、流式细胞术检测结果显示,与Sham组比较,AHR组小鼠调节性T细胞和Th1细胞比例显着降低,Th17细胞和Th2细胞比例显着升高。经针刺干预后,与模型组（AHR组）比较,AAHR组调节性T细胞和Th1细胞比例显着升高,Th17细胞和Th2细胞比例显着降低（均P<0.05）。结论:气道高反应模型表现出Th1/Th2和Treg/Th17细胞比例失衡的状态,并伴随相应的细胞因子分泌的紊乱,针刺大椎、肺俞、足三里穴可以调节T淋巴细胞比例及其炎症因子的分泌,从而减轻气道炎症。第三节针刺对气道高反应模型内质网应激和自噬的影响目的:观察针刺大椎、肺俞、足三里对气道高反应小鼠内质网应激-自噬的作用方法:一、气道高反应模型的构建及分组干预二、指标检测1.RT-PCR和Western blot检测各组小鼠肺组织自噬相关基因、蛋白ATG5、LC3II及内质网应激相关基因、蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的表达变化。2.透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构,观察自噬体的形成。结果:一、气道高反应模型组小鼠的自噬基因及蛋白ATG5、LC3II,内质网应激相关基因及蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的m RNA和蛋白表达水平,与Sham组比较,均明显升高（均P<0.05）。经针刺干预后,上述基因和蛋白的表达水平表现出不同程度的下调,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。二、透射电镜观察,气道高反应模型组小鼠肺组织细胞超微结构可见较多典型的自噬小体,多数呈现封闭的、圆球形的双层膜结构。针刺组自噬小体数量明显减少。结论:气道高反应模型肺组织内质网应激和自噬相应的基因和蛋白表达水平升高,针刺通过调节内质网应激-自噬相关基因和蛋白的表达改善模型气道高反应性和气道炎症。第四节自噬基因ATG5在针刺调控气道高反应小鼠内质网应激-自噬诱导T淋巴细胞稳态中的作用目的:观察ATG5在针刺调控气道高反应小鼠内质网应激-自噬-T淋巴细胞稳态中的作用。方法:一、制备ATG5基因CD4+条件性基因敲除小鼠二、气道高反应模型的构建及分组干预18只ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠随机分成3组,Sham（+）组、AHR（+）组（气道高反应模型组）,AAHR（+）组（针刺治疗组）,每组6只。18只ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠随机分成3组,Sham（-）组、AHR（-）组（气道高反应模型组）,AAHR（-）组（针刺治疗组）,每组6只。模型建立方法同第一节。三、指标检测1.ATG5基因敲除小鼠的基因型鉴定。2.有创肺功能检测法记录乙酰甲胆碱刺激后气道阻力改变百分比值。3.HE染色观察各组小鼠肺组织病理切片中气道与肺组织的形态结构变化。4.瑞氏染色观察并统计BALF中白细胞百分比变化。5.流式细胞术检测脾脏调节性T细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞,观察T淋巴细胞亚群变化。6.ELISA法分别检测血清和肺泡灌洗液（BALF）中TGF-β,IL-17,IFN-γ,IL-4的含量变化。7.RT-PCR和Western blot检测各组小鼠自噬相关ATG5、LC3II蛋白及内质网应激相关蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的表达变化。8.透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构。结果:一、经实验室繁育,获得F3代小鼠82只,其中flox纯合且Cre阳性的小鼠ATG5flox/floxCD4+Cre+19只,flox纯合且Cre阴性的小鼠ATG5flox/floxCD4+Cre-20只。各选择18只进行后续实验。二、肺功能检测结果:ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠在Mch激发不同浓度时,AHR组RI增加百分比均明显高于Sham组（P<0.05）;经针刺治疗后,AAHR组在Mch各浓度激发时的RI值变化百分比均小于AHR组,差异均具有显着性（P<0.05）;同时,在AHR组和AAHR组,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,RI增加百分比降低,差异有统计学意义（P<0.05）。说明模型小鼠气道高反应增强,而针刺和ATG5条件性基因敲除可减弱气道高反应;针刺后的ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠气道阻力更接近与正常对照组。三、肺组织病理HE检测结果:ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠Sham组肺组织形态学与ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠Sham组肺组织形态学类似。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠针刺组比ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠针刺组炎症细胞浸润明显减弱。四、肺泡灌洗液瑞氏染色结果:对于ATG5flox/floxCD4+Cre-和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠,BALF中细胞瑞氏染色结果计数分析发现,AHR组BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞明显高于Sham组,而巨噬细胞明显低于Sham组。在AHR组中,与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠白细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比显着降低,淋巴细胞百分比显着升高;在AAHR组中,与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比显着降低;巨噬细胞和淋巴细胞百分比显着升高。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AAHR组更接近于Sham组。五、脾脏细胞流式细胞分析结果:在ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,与Sham组比较,AHR组小鼠调节性T细胞和Th1细胞比例显着降低,Th17细胞和Th2细胞比例显着升高。经针刺干预后,与AHR组比较,AAHR组调节性T细胞和Th1细胞比例显着升高,Th17细胞和Th2细胞比例显着降低（均P<0.05）。在AHR组中,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠比ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠,调节性T细胞和Th1细胞比例显着升高,Th17细胞和Th2细胞比例显着降低（均P<0.05）;在AAHR组中,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠比ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠调节性T细胞和Th1比例显着升高,Th17细胞比例显着降低（均P<0.05）;ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠针刺治疗组脾脏T淋巴细胞比例更接近正常对照组。六、ELISA结果:在ATG5flox/floxCD4+Cre-和Cre+小鼠血清和BALF中,AHR组TGF-β,IL-17,和IL-4含量均高于Sham组,而AHR组IFN-γ含量低于Sham组（P<0.05）。与AHR组比较,针刺AAHR组TGF-β,IL-17,和IL-4显着降低,IFN-γ含量显着升高（P<0.05）。与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AHR组血清中IL-4含量有所降低,IFN-γ含量有所升高;BALF中TGF-β,IL-17,和IL-4显着降低,IFN-γ含量显着升高;AAHR组中,ATG5flox/floxCD4+Cre+比ATG5flox/floxCD4+Cre-血清中TGF-β和IL-4含量降低,IFN-γ含量升高（P<0.05）;BALF中TGF-β,IL-17和IL-4显着降低,IFN-γ含量显着升高。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AAHR组炎症程度更低,更接近Sham组。七、RT-PCR基因和Western blot蛋白检测结果:在ATG5flox/floxCD4+Cre-和ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,气道高反应模型组自噬基因ATG5、LC3II、内质网应激相关基因PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78的m RNA和蛋白表达水平,均明显高于Sham组。经针刺干预后,上述基因和蛋白的表达水平表现出不同程度的下调,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AHR组ATG5和LC3的m RNA表达水平和自噬蛋白ATG5含量和内质网应激蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78均低于ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠。AAHR组中,与ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠自噬基因ATG5、LC3和内质网应激基因PERK1含量降低;自噬蛋白ATG5、LC3和内质网应激蛋白PERK1、IRE-1、ATF6、Grp78含量降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠AAHR组小鼠自噬和内质网应激程度更低,更接近sham组。八、肺组织电镜结果:在ATG5flox/floxCD4+Cre-小鼠中,AHR组小鼠肺组织细胞超微结构可见较多典型的自噬小体,AAHR组肺组织细胞中自噬小体数量明显减少。在ATG5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,AHR组小鼠肺组织细胞超微结构可见极少数量的自噬小体,而针刺组未发现典型的自噬小体结构。结论:自噬基因ATG5可介导内质网应激-自噬过程,调节T淋巴细胞亚群,调控气道高反应和气道炎症。针刺大椎、肺俞、足三里可调控ATG5基因表达,进而通过调控ER stress-自噬过程促进恢复T淋巴细胞稳态。
闫兴柱[5]（2018）在《基于全基因表达谱揭示天灸药物白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建的分子机制研究》文中指出目的本实验在前期动物实验已确定古方天灸药物白芥子散穴位贴敷治疗哮喘最佳配比的基础上,确定应用古方天灸药物白芥子散进行穴位贴敷治疗对哮喘大鼠的气道炎症有显着地抑制作用和免疫调节作用,促使免疫功能恢复正常,即古方天灸药物白芥子散在免疫稳态重建中有重要作用。拟从基因角度对白芥子散在小儿哮喘的发病机制、免疫稳态重建机制、治疗机制等方面进行研究,提高哮喘的诊断准确性和治疗靶向性,为临床应用提供实验依据与理论支撑。方法将雄性清洁SD大鼠90只,46周龄,体重（150±20）g,按均衡随机法（按体重分层）分为3组,分别为给药组、模型组A组和B组（各15只）、正常组,每组实验动物30只。第1天,给药组、模型组分别于用新鲜配制的OVA,100mg辅以氢氧化铝凝胶200mg及生理盐水1ml的混悬液在大鼠两腹股沟、后足跖,共4点做皮下注射,每点0.2ml,同时腹腔注射0.2ml,正常组不做任何处理。第15天中处死模型组A组,正常组5只大鼠,收集并保存需检测部位的标本,以便于确认造模成功后动物的体内基因表达状态,模型组B组留用作为治疗对照。第1524天给药组开始进行天灸贴敷治疗,穴位贴敷前用8%硫化钠在穴位处脱毛,将药丸放在医用脱敏胶贴上,分别贴于大鼠肺俞（双）、定喘、膻中、膏肓（双）处,每天1次,每次贴敷24h,贴敷治疗后,将实验组致敏的大鼠置于密闭容器内用超声雾化器雾化吸入2%OVA生理盐水悬液,每天30min,进行激发诱喘1次,连续10天。模型组B组予空白贴敷,处理方法同给药组。正常组自由进食常规饲料和水。第25天处死大鼠,采集肺组织标本。进行RNA的提取及鉴定、基因芯片的检测、生物信息学分析、采用Western blot、Northern bLot、荧光定量RT-PCR检测和基因敲除技术对基因芯片检测结果进行验证。结果（1）造模成功判定:与正常组对比,模型组大鼠在行为学、病理学及基因学上有显着变化,造模成功。（2）送检9只大鼠的肺组织中提取的基因,将所得基因结果根据基因库等数据进行剔除,按照p<0.05,以基因表达倍数值的绝对值≥2.0为阈值来确定差异表达基因。结果有统计学意义,这些基因与哮喘的发生发展均有直接或者间接的关系。正常组与模型组A组比较,正常组中下调的17个基因,上调的6个基因,模型组A组呈现相反的变化,有统计学意义,哮喘模型建立成功。正常组和模型组B组、给药组比较,差异表达基因相同,上调基因有4个,下调基因有2个,给药组基因上下调倍数明显高于模型组B组,上调基因和下调基因减少。模型组A组和模型组B组、给药组比较,上调基因有两个,下调基因有6个,给药组基因上下调倍数明显高于模型组B组,模型组A组中上调的基因在模型组B组、给药组中下调,下调的基因不表达或者低表达,模型组B组、给药组出现了两个上调基因,其均有抗炎作用。模型组B组和给药组比较中,无表达下调基因,表达上调基因有8个。结果提示模型组B组自身免疫恢复,给药组用药后免疫恢复,且治疗效果优于模型组B组,尚未恢复到正常状态。（3）将正常组、模型组和给药组的差异表达基因进行比较,通过热图可以发现,正常大鼠的基因表达中通过不同基因的上调和下调或者不表达来维持免疫稳态,模型组和给药组的基因也出现了上调与下调来应对哮喘的发生,差异有统计学意义,发现与哮喘有关的上调基因有18个,下调基因有7个。通过各个基因作用对比分析,实验结果与已经发表的一些相关文献报道一致,也与基因的功能相一致。结论1.差异表达基因与哮喘发生机制的关系:与EOS有关,参与气道炎症形成、气道高反应性、气道重塑过程的基因有:EOS趋化性细胞因子CCR3、Ccl11、Ccl2、Ccl22;有抗炎作用的基因:ADM、Pla2g4c、Fcgr3a、Nr1d1、Acox1;参与气道炎症的基因有:C3、SelP、Sele、Serpina3n、CX3CR1;参与气道炎症和气道重塑的基因有:MMP-9、TLR1;抗气道炎症和气道重塑的基因有:Timp1;与哮喘密切相关,但是尚不清楚发生机制的基因有:prim1、Serpinb10、FMO3、Scd1、per3、DBP、ANKRD1、CD177、DES。2.正常组和模型组A组比较,基因上下调明显,基因与哮喘形成的三种机制均有关系,哮喘模型建立成功,差异有统计学意义。正常组、模型组A组分别和模型组B组、给药组相比,差异表达基因相同,给药组基因上下调倍数高于模型组B组,两组组间比较,差异表达基因全部是上调,无下调基因,说明天灸药物白芥子散治疗哮喘大鼠后,较之模型组A组、B组哮喘情况有所好转,较之正常组仍有哮喘炎症的存在,结果有统计学意义。3.正常情况下,免疫稳态维持大鼠生命的基本状态,哮喘大鼠伴随着免疫稳态的打破,与哮喘相关的基因也发生变化,在热图中可以明显看出基因上下调变化,原本应该上调的基因,转变为下调,原本下调的基因转变为上调,原本不表达或者低表达的基因开始表达,将正常组、模型组和给药组的差异表达基因进行比较,发现与哮喘有关的上调基因有18个,下调基因有7个,通过各个基因作用对比分析,实验结果与已经发表的一些相关文献报道一致,也与基因的功能相一致,在基因上,哮喘大鼠的基因发生了改变,其中部分基因或者基因多态性在在哮喘中明确发挥着重要的作用,能够为治疗哮喘的免疫稳态的重建过程提供一个方向。
翟春涛[6]（2018）在《隔药饼灸对免疫抑制兔机体免疫和细胞免疫功能量—效及时—效影响的研究》文中提出目的:1.观察不同灸量隔药饼灸对环磷酰胺所致免疫抑制模型兔机体免疫功能和细胞免疫作用的影响,分析不同灸量所产生效果的差异性,探究不同灸量的疗效差异及机制所在。2.观察在最佳灸量下,隔药饼灸对环磷酰胺所致免疫抑制模型兔机体免疫功能和细胞免疫作用不同时间位点的影响,分析隔药饼灸效应发生、发展过程中潜伏期、效应期和后效应期的时间位点,阐明效应随时间的变化规律,为今后临床研究提供思路与方法。方法:1.50只大耳白兔按照随机数字表分为空白组、模型组、隔药饼灸3壮组（3壮组）、隔药饼灸5壮组（5壮组）、隔药饼灸7壮组（7壮组）,每组10只。除空白组外,其余各组按照预实验改良后的造模方法进行造模,即每天上午按照60 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺,每日1次,连续注射7天。造模结束后第2天,除空白组和模型组外,其余各组均进行隔药饼灸治疗,药饼按照用六味地黄汤原方比例制备,穴位选取“脾俞（双）”“肾俞（双）”“关元”“神阙”“足三里（双）”。3壮组、5壮组和7壮组分别每穴连灸3壮、5壮、7壮,隔日1次,共灸10次。空白组和模型组只绑缚固定于兔台,不做任何处理。实验结束后次日,实验动物称重后麻醉,进行腹腔静脉取血和摘取脾脏。（1）静脉血离心后取血清,酶联免疫法测定免疫细胞CD3+、CD4+、CD8+、NK、Bc含量;（2）称取脾脏质量,计算脾脏指数;（3）取脾脏组织制备脾脏匀浆液,离心机离心后采用酶联免疫法测定细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ含量;（4）取脾脏组织置于10%福尔马林中固定,经石蜡包埋切片,HE染色,显微镜观察脾脏一般形态学变化。2.90只大耳白兔采用随机数字表法分为空白组,模型14组,隔药饼灸治疗结束后即刻组、5天组、10天组和15天组,简称灸后即刻组、灸后5天组、灸后10天组和灸后15天组,每组10只。模型1组对应于灸治结束后即刻组（模型即刻组）,模型2组对应于灸治结束后5天组（模型5天组）,模型3组对应于灸治结束后10天组（模型10天组）,模型4组对应于灸治结束后15天组（模型15天组）。除空白组外,其余各组按照预实验改良后的造模方法进行造模,即每天上午按照60 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺,每日1次,连续注射7天。造模结束后第2天,除空白组、模型组外,其余各组均进行隔药饼灸治疗,药饼按照用六味地黄汤原方比例制备,穴位选取“脾俞（双）”“肾俞（双）”“关元”“神阙”“足三里（双）”。每穴连灸5壮,隔日1次,共灸10次。空白组和模型组只绑缚固定于兔台,不做任何处理。空白组、模型即刻组、灸后即刻组实验结束后次日,模型5天组和灸后5天组、模型10天组和灸后10天组、模型15天组和灸后15天组隔药饼灸后正常饲养5、10、15天后次日,实验动物称重后麻醉,进行腹腔静脉取血和摘取脾脏。（1）腹腔静脉取血后,采用血细胞检测仪检测外周血细胞系列的变化（WBC、NEU%、LYM%、MONO%、EOS%、BASO%、RBC、HGB、HCT、PLT）;（2）静脉血离心后取血清,采用免疫检测仪检测Ig M、Ig G含量,补体C3、C4含量;酶联免疫法测定免疫细胞CD3+、CD4+、CD8+、NK、Bc含量;（3）称取脾脏质量,计算脾脏指数;（4）取脾脏组织制备脾脏匀浆液,离心机离心后采用酶联免疫法测定细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ含量;（5）取脾脏组织置于10%福尔马林中固定,经石蜡包埋切片,HE染色,显微镜观察脾脏一般形态学变化。结果:1.与空白组比较,模型组实验前后体质量差值明显降低（P﹤0.01）;血清CD3+含量明显降低（P﹤0.01）,CD8+含量明显升高（P﹤0.01）;组织IFN-γ、IL-4含量明显降低（P﹤0.01）;脾脏指数明显升高（P﹤0.01）;脾脏形态学计量指标白髓平均面积、脾小体半径明显缩小（P﹤0.01）,动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数明显降低（P﹤0.01）,差异有统计学意义。不同灸量隔药饼灸治疗后,与模型组比较,3壮组、5壮组、7壮组实验前后体质量差值明显升高（P﹤0.01）;血清CD3+含量明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）,血清CD8+含量明显降低（P﹤0.01）;组织IL-4含量明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）;脾脏指数明显降低（P﹤0.01,P﹤0.05）;白髓平均面积和脾小体半径明显扩大（P﹤0.01）,动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数明显增加（P﹤0.01）,差异有统计学意义。5壮组、7壮组组织IFN-γ含量与模型组比较明显升高（P﹤0.01）。不同灸量隔药饼灸对免疫抑制兔免疫功能的影响不同,与3壮组比较,5壮组、7壮组实验前后体质量差值明显升高（P﹤0.01）;5壮组血清CD8+含量明显降低（P﹤0.01）,7壮组血清CD3+含量明显升高（P﹤0.05）,CD8+含量明显降低（P﹤0.01）;5壮组、7壮组组织IL-4、IFN-γ含量明显升高（P﹤0.05）;5壮组和7壮组白髓平均面积和脾小体半径明显扩大（P﹤0.01,P﹤0.05）,动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数明显增加（P﹤0.01,P﹤0.05）,差异有统计学意义。与5壮组比较,隔药饼灸7壮组可以明显升高血清CD3+含量（P﹤0.05）,其余指标实验前后体质量差值、血清CD8+含量,组织IFN-γ、IL-4含量,白髓平均面积、脾小体半径及动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数隔药饼灸5壮组与7壮组比较差异无统计学意义;3壮组、5壮组和7壮组脾脏指数比较差异无统计学意义。2.与空白组比较,模型即刻组、模型5天组、模型10天组和模型15天组血细胞WBC、RBC、HGB、HCT、PLT、NEU%,Ig G、Ig M含量、补体C3含量及实验前后体质量差值明显降低（P﹤0.01）,LYM%和脾脏指数显着升高（P﹤0.01）;模型即刻组、模型5天组补体C4显着升高（P﹤0.05）,差异有统计学意义。与空白组比较,模型组血清CD3+含量明显降低（P﹤0.01）,CD8+含量明显升高（P﹤0.01）,组织IFN-γ、IL-4含量明显降低（P﹤0.01）,白髓平均面积和脾小体半径明显缩小（P﹤0.01）,动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数明显降低（P﹤0.01）,差异有统计学意义。模型即刻组、模型5天组、模型10天组及模型15天组血细胞WBC、RBC、HGB、HCT、PLT、NEU%、LYM%、MONO%、EOS%及BASO%,Ig G、Ig M含量,补体C3、C4含量,实验前后体质量差值及脾脏指数组间比较差异均无统计学意义。隔药饼灸治疗后,与模型组各相应时间点比较,灸后即刻组、灸后5天组、灸后10天组和灸后15天组血细胞WBC、RBC、HGB、HCT明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）,LYM%明显降低（P﹤0.01）;灸后即刻组、灸后5天组和灸后10天组PLT明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）;灸后即刻组和灸后5天组NEU%明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）;灸后即刻组、灸后5天组和灸后10天组Ig G、Ig M均明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）,灸后15天组Ig M明显升高（P﹤0.05）;灸后即刻组和灸后5天组补体C3明显升高（P﹤0.01）,灸后5天组C4明显降低（P﹤0.01）;灸后即刻组、灸后5天组、灸后10天组和灸后15天组实验前后体质量差值明显升高（P﹤0.01）,脾脏指数明显降低（P﹤0.01,P﹤0.05）。与模型组比较,灸后即刻组、灸后5天组、灸后10天组、灸后15天组血清CD3+含量明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）,CD8+含量明显降低（P﹤0.01）;组织IFN-γ、IL-4含量明显升高（P﹤0.01）;白髓平均面积和脾小体半径明显扩大（P﹤0.01）,动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数明显增加（P﹤0.01）,差异有统计学意义。与灸后即刻组、灸后5天组比较,灸后10天组WBC、RBC、HGB、HCT明显升高（P﹤0.01,P﹤0.05）,LYM%明显降低（P﹤0.01）;Ig G、Ig M明显升高;实验前后体质量差值明显增加（P﹤0.01）;脾脏指数明显降低（P﹤0.05）;血清CD3+含量明显升高（P﹤0.05）,CD8+含量明显降低（P﹤0.05）;组织IFN-γ、IL-4含量明显升高（P﹤0.05）;白髓平均面积和脾小体半径明显扩大（P﹤0.01）,差异有统计学意义。与灸后即刻组比较,灸后5天组和灸后15天组血细胞WBC明显升高（P﹤0.01）,NEU%明显降低（P﹤0.01）;灸后5天组补体C3含量明显升高,灸后10天组和灸后15天组补体C3含量明显降低（P﹤0.01,P﹤0.05）;灸后15天组动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数明显增加（P﹤0.05）;灸后15天组实验前后体质量差值明显增加（P﹤0.01）差异有统计学意义。与灸后5天组比较,灸后10天组、15天组补体C3含量明显降低（P﹤0.05）,灸后15天组脾小体半径明显缩小（P﹤0.05）,差异有统计学意义。与灸后10天组比较,灸后15天组WBC、RBC、HGB、HCT、PLT明显降低,LYM%显着升高（P﹤0.05）;Ig G、Ig M均显着降低（P﹤0.01,P﹤0.05）,脾脏指数明显升高（P﹤0.05）;血清CD3+含量明显降低（P﹤0.05）,CD8+含量明显升高（P﹤0.01）;组织IFN-γ、IL-4含量明显降低（P﹤0.01,P﹤0.05）;白髓平均面积及脾小体半径明显缩小（P﹤0.01）,差异有统计学意义。结论:1.不同灸量（3壮、5壮、7壮）隔药饼灸对环磷酰胺所致免疫抑制兔免疫细胞、免疫分子及免疫器官均有明显的调节作用。2.不同灸量隔药饼灸对环磷酰胺所致免疫抑制兔免疫细胞、免疫分子及免疫器官的影响存在明显的量-效关系。5壮和7壮灸量较3壮灸量在提高免疫抑制兔的免疫功能方面作用更为明显。本项目研究显示的最佳灸量为5壮。3.隔药饼灸5壮灸量对免疫抑制兔免疫细胞、免疫分子和免疫器官的影响存在一定的时-效关系,从多项指标的变化趋势分析,灸治结束后即刻开始起效,灸治结束后10天达到最佳效应期,随后灸疗效应开始出现衰减。4.从隔药饼灸对免疫抑制兔免疫功能调节的总体疗效来看,隔药饼灸对免疫抑制兔免疫细胞、免疫分子和免疫器官的影响存在一定的量-效及时-效关系,本项目研究的最佳灸量为5壮,最佳效应期为灸后10天。
赵春兰[7]（2017）在《Th1/Th2与Treg/Th17平衡对儿童哮喘的调节作用研究》文中提出研究目的支气管哮喘（bronchial asthma,简称哮喘）是一种常见的儿童气道慢性炎症性疾病,目前正严重威胁着儿童的身体和心理健康,但哮喘发病的免疫学机制目前仍未完全阐明。目前认为Th1/Th2、Treg/Th17两大细胞平衡失调是哮喘发病的重要机制。本研究通过检测外周血中T淋巴细胞亚群和Th17/Treg细胞百分率,检测哮喘患儿血清中Th1、Th2、Th17和Treg类细胞因子的表达情况,以及Tim-3在哮喘发病机制中对Th1/Th2、Treg/Th17失衡的影响,以此探讨在儿童哮喘发病过程中Th1/Th2、Treg/Th17平衡失调的情况。研究方法1、以2013.10-2014.12于山东大学齐鲁儿童医院初次确诊哮喘或停止规范激素吸入超过3个月后哮喘复发的患儿（哮喘组,n=81）和同期择期手术儿童（对照组,n=38）为研究对象;2、收集两组患儿外周血,流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群水平、Th17/Treg细胞百分率;3、CBA法检测血清中Th1、Th2、Th17和Treg细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A以及IL-12/IL-23p40的表达情况;4、实时PCR法测定外周血中Tim-3 mRNA的相对表达量。研究结果1、一般资料统计分析,两组在年龄和性别构成上无显着性差别;2、与对照组比较,各年龄组CD3T、CD4T细胞百分率及2岁以内CD4/CD8T细胞比例均明显降低（P<0.01或P<0.05）,各年龄组的CD8T细胞百分率及大于2岁的CD4/CD8T细胞比例在两组无明显差别（P>0.05）;3、与对照组比较,哮喘组患儿外周血CD4+IL17+Th17细胞百分率显着增高,具统计学意义（P<0.05）;哮喘组患儿CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分率低于对照组,但两组间没有明显差异（P>0.05）;4、与对照组比较,哮喘组患儿血清中Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ含量显着增高,具统计学意义（P<0.05）,而两组患儿血清中TNF含量没有明显差异（P>0.05）;5、哮喘组患儿血清Th2类细胞因子IL-4、IL-6比对照组低,有统计学意义（P<0.01或P<0.05）,而IL-10浓度则明显高于对照组（P<0.05）;6、哮喘组患儿血清Treg细胞因子IL-12/IL-23p40显着低于对照组（P<0.01）,而Th17细胞因子IL-17A的表达在两组之间的差异无统计学意义;7、哮喘组患儿外周血细胞中Tim-3 mRNA的相对表达量明显高于对照组,有统计学意义（P<0.05）。研究结论儿童哮喘发生过程中可能存在T淋巴细胞免疫功能紊乱,且Th1和Th17细胞功能亢进,Th2和Treg细胞功能降低,Th1/Th2和Treg/Th17失衡可能是哮喘发病的重要机制,Tim-3可能通过调节Th1/Th2与Treg/Th17失衡影响着哮喘的发展。
何海明[8]（2016）在《艾灸法对哮喘大鼠模型外周血CD4+、CD8+T细胞及血清IL-1、IL-1Ra的影响》文中研究说明实验目的:通过观察CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及血清IgE、IL-1、IL-1ra指标,探讨艾灸法防治哮喘的免疫学机制,为临床治疗哮喘提供一定的实验依据。实验方法:选择清洁型SD大鼠30只,雄性,体重175-220g,随机分为三组:正常组、模型组、艾灸组,每组10只。模型组和治疗组以卵蛋白致敏复制大鼠哮喘模型,造模成功后,将三组大鼠置于简易灸架上,正常组和模型组不予治疗,治疗组大鼠用特制细艾条间接灸双侧“肺俞”穴,“肾俞”穴,交替进行艾灸,每次灸30min,每天治疗一次,七天为一疗程,共灸14天。治疗后,处死各组大鼠,采用腹主动脉取血法取血,用流式细胞仪检测大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平,用ELISA试剂盒检测大鼠血清IgE、IL-1、IL-1ra水平,之后取大鼠肺组织,做HE染色,行病理形态学检查。实验结果:1.与正常组比较,模型组血清IgE、CD3+、CD8+T细胞及IL-1水平显着升高（P<0.01）。2.与模型组比较,艾灸组血清IgE、CD8+T细胞及IL-1水平显着降低（P<0.05）。3.与模型组比较,艾灸组CD4+T细胞水平、血清IL-1Ra水平显着升高（P<0.05）。结论:1.应用卵蛋白加氢氧化铝腹腔注射并给予雾化激发可以成功复制大鼠哮喘模型。2.哮喘大鼠模型建立后可导致CD3+、CD8+T细胞及血清IL-1、IgE水平的升高。3.艾灸可通过降低CD8+T、升高CD4+T细胞水平;降低血清IgE、IL-1水平升高IL-1Ra干预哮喘的免疫紊乱,控制炎症反应。
姜晓红[9]（2015）在《雾化吸入母牛分枝杆菌对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的影响及机制研究》文中认为目的:研究母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的防治作用,探讨其作用机制。方法:予OVA致敏制作Balb/c哮喘模型、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）滴鼻制作RSV感染模型,分别于模型制作前后予母牛分枝杆菌（商品名:微卡）雾化或腹腔注射。哮喘预防组于哮喘模型制作前1个月分别予微卡雾化或腹腔注射,哮喘模型制作成功后处死小鼠;哮喘治疗组于哮喘模型制成后雾化吸入微卡,分别于治疗前、治疗3天、治疗5天处死小鼠;RSV感染预防组分别从量—效关系和时—效关系研究,时—效关系于RSV感染模型制作前1个月或1周分别予微卡雾化吸入或腹腔注射,用106PFU RSV感染制作病毒感染模型。量—效关系于RSV感染模型制作前1周分别用1支或3支微卡雾化吸入,分别用106PFU和105PFU RSV感染制作病毒感染模型。感染后第4天处死小鼠;RSV感染治疗组于RSV感染后第1天雾化吸入微卡,治疗第5天处死小鼠。以上各组均设正常对照组和模型对照组。所有小鼠处死前予无创肺功能仪检测气道反应性,哮喘组病理观察气道炎症,ELISA检测BALF中IL-9、OVA-IgE浓度,流式细胞术检测肺 γδTCR+CD 3+、IL-9+CD3+、IL-10+CD3+、IL-9+γδTCR+、IL-10+γ8TCR+淋巴细胞百分数,荧光定量PCR法测定肺IL-9R mRNA水平,哮喘预防组同时予免疫组化检测肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达,荧光定量PCR检测肺NGF mRNA水平;病毒组除了以上方法外予电镜、肺免疫荧光法观察肺RSV感染情况,荧光定量PCR检测肺IL9R、PU.1、PD-L2、JAK1、STAT1、STAT5A、RSV、IFN-y、TLR7、TLR8 mRNA 水平,免疫组化监测肺EGFR、NF09、Acetylcholine含量。结果:与哮喘对照组相比,哮喘预防组气道反应性均明显下降、气道炎症明显减轻;肺IL-9、OVA-IgE、IL-9R mRNA、NGF mRNA水平明显下降、IL-10水平明显增高;肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达明显下降。哮喘治疗组气道炎症明显减轻、肺IL-9水平明显下降、IL-10水平明显增高。RSV预防和治疗组较对照组比较电镜下RSV明显减少、免疫荧光示肺抗RSV明显减弱、RSV mRNA明显下降,机制研究发现微卡干预后IL-9水平明显下降、IL-10水平明显增高;IL-9-JAK1-STAT通路研究结果示JAK1、STAT1、STAT5A水平明显增高;TLR7、TLR8 mRNA水平明显增高,PU.1mRNA水平明显降低,肺免疫组化NF09、Acetylcholine、EGFR表达明显下降。以小剂量微卡短期雾化吸入效果最佳。RSV感染治疗组同时发现微卡雾化后肺γδT细胞明显增多,但IL-9+γδT细胞明显减少。结论:实验剂量微卡雾化吸入可用于小鼠哮喘的防治,与其调节Th9细胞、γδT细胞、BDNF、NF09、Acetylcholine有关;实验剂量微卡雾化吸入可用于小鼠RSV感染的防治,与其调节Th9细胞、γδT细胞、IL-9-JAK-STAT 通路、TLR7、TLR8、PU.1、神经机制、EGFR 等有关。第一部分 雾化吸入母牛分枝杆菌对小鼠支气管哮喘的影响及机制研究第一节 雾化吸入母牛分枝杆菌预防小鼠支气管哮喘及对Th9细胞功能的影响目的:观察母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠支气管哮喘的预防作用及对Th9细胞功能的影响方法:24只雌性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组,每组6只:正常对照组、哮喘对照组、雾化吸入预防组、腹腔注射预防组。雾化吸入预防组于哮喘模型制作前一个月雾化吸入母牛分枝杆菌,每天1次,连续5天;腹腔注射预防组于哮喘模型制作前一个月腹腔注射母牛分枝杆菌,每天1次,连续5天;正常对照组和哮喘对照组雾化吸入PBS液,每天1次,连续5天。卵清蛋白（OVA）致敏制作小鼠支气管哮喘模型。哮喘模型制成后4组小鼠予小动物无创肺功能仪检测气道高反应性;HE染色和PAS染色观察小鼠气道炎症变化;ELISA法检测小鼠BALF中IL-9、OVA-IgE浓度水平;流式细胞术检测肺γδTCR+CD 3+、IL-9+CD3+、IL-10+CD3+、IL-9+γδTCR+、IL-10+yδTCR+淋巴细胞百分数;荧光定量PCR法测定肺IL-9R mRNA水平。结果:与正常对照组相比,哮喘对照组气道炎症明显,气道反应性明显增高（P<0.05）,BALF 中 IL-9、OVA-IgE 浓度明显增高（P<0.01,P<0.001）,γδTCR+CD3+、IL-9+γδTCR+、IL-9+ CD3+淋巴细胞百分数明显高于正常对照组（P值均<0.001）,IL-10+CD3+淋巴细胞百分数低于正常对照组（P<0.05）,而IL-10+γδTCR+淋巴细胞百分数与正常对照组无差异（P>0.05）。雾化吸入及腹腔注射预防组气道反应性均明显低于哮喘对照组（P<0.05）;气道炎症病变较哮喘对照组减轻;BALF中IL-9、OVA-IgE浓度明显低于哮喘对照组（P 值均<0.001）;肺 γδTCR+CD3+、IL-9+CD3+、IL-9+γδTCR+淋巴细胞百分数均明显低于哮喘对照组（P值均<0.001）,而IL-10+CD3+、IL-10+γδTCR+淋巴细胞百分数明显高于哮喘对照组（P值均<0.01）;肺IL-9R mRNA水平明显低于哮喘对照组（P<0.0001,P<0.01）。结论:母牛分枝杆菌雾化吸入与腹腔注射均可用于小鼠支气管哮喘的预防,其机制可能是通过诱导γδT细胞分泌IL-10增多、抑制γδT细胞分泌IL-9减少、γδT细胞呈IL-10优势表达而发挥作用,γδT细胞可能是Th9细胞家族成员之一。第二节 雾化吸入母牛分枝杆菌预防小鼠支气管哮喘的神经机制研究目的:探讨母牛分枝杆菌雾化吸入预防小鼠支气管哮喘的神经机制方法:将24只雌性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组,每组6只:正常对照组、哮喘对照组、雾化吸入预防组、腹腔注射预防组。雾化吸入预防组于哮喘模型制作前一个月雾化吸入母牛分枝杆菌（商品名:微卡）,每天1次,连续5天;腹腔注射预防组于哮喘模型制作前一个月腹腔注射母牛分枝杆菌,每天1次,连续5天;正常对照组和哮喘对照组雾化吸入PBS液,每天1次,连续5天。卵清蛋白（OVA）致敏制作小鼠支气管哮喘模型。免疫组化检测肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达,荧光定量PCR检测肺NGF mRNA水平。结果:与正常对照组相比,哮喘对照组肺BDNF、NF09及Acetylcholine表达明显增高,荧光定量PCR示肺NGF mRNA水平明显增高;微卡雾化吸入组肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达及NGF mRNA水平较哮喘对照组明显降低;微卡腹腔注射组BDNF、Acetylcholine表达较哮喘组明显降低（P<0.05,P<0.001）,但高于微卡雾化吸入组（P值均<0.01）。结论:微卡雾化吸入可下调肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达及NGF mRNA水平,发挥着调节神经机制、抗胆碱能的作用,这可能是其预防哮喘的重要机制。第三节 雾化吸入母牛分枝杆菌治疗小鼠支气管哮喘及对Th9细胞功能的影响目的:观察母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠支气管哮喘的治疗作用及对Th9细胞功能的影响方法:36只雌性Balb/c小鼠按随机数字表法分为6组,每组6只:正常对照组（A）、哮喘治疗前（B0）、微卡雾化吸入治疗组（B3、B5）、哮喘治疗对照组（C3、C5）。予卵清蛋白（OVA）致敏制作小鼠支气管哮喘模型。母牛分枝杆菌（商品名:微卡）雾化吸入治疗组于哮喘模型制成后雾化吸入母牛分枝杆菌22.5μg+PBS液30ml,每天1次,连续5天;哮喘治疗对照组雾化吸入PBS液30ml,每天1次,连续5天。分别于雾化治疗第3天、第5天予无创肺功能仪检测气道高反应性;HE染色和PAS染色观察小鼠气道炎症变化;ELISA法检测小鼠BALF中IL-9、OVA-IgE浓度水平;流式细胞术检测肺 γδTCR+CD 3+、IL-9+CD3+、IL-10+CD3+、IL-9+yδTCR+、IL-10+γδTCR+淋巴细胞百分数;荧光定量PCR法测定肺IL-9R mRNA水平。结果:与正常对照组（A）相比,哮喘治疗前（B0）气道炎症明显;气道反应性明显增高（P<0.05）;BALF中IL-9、OVA-IgE浓度明显增高（P<0.01,P<0.001）;γδTCR+CD3+、IL-9+γδTCR+、IL-9+ CD3+淋巴细胞百分数明显高于正常对照组（P值均<0.001）,IL-10+CD3+淋巴细胞百分数低于A组（P<0.05）,而IL-10+yδTCR+淋巴细胞百分数与A组无差异（P>0.05）;肺IL-9R mRNA水平明显高于正常对照组（P<0.05）。B3组气道炎症病变较B0减轻;B3组肺IL-9+CD3+、IL-9+yδTCR+淋巴细胞百分数均明显低于B0组（P<0.0001、P<0.01）,IL-10+CD3+淋巴细胞明显高于 B0 组（P<0.0001）;B5组气道炎症较B3组加重;BALF中IL-9浓度明显低于B0组（P<0.05）,IL-9+CD3+、IL-9+yδTCR+淋巴细胞百分数均明显低于B0组（P<0.0001、P<0.05）,IL-10+CD3+淋巴细胞明显高于B0组（P<0.05）;C3、C5组上述指标与B0组比较无差异（P值均>0.05）。肺IL-9R mRNA水平B3、B5组与BO组无差异,明显低于C3、C5组（P值均<0.0001）。结论:实验剂量的微卡雾化吸入可减轻哮喘气道炎症,Th9细胞在其中发挥着重要作用,Th9细胞及γδT细胞均参与其过程,其机制可能是通过诱导γδT细胞分泌IL-10增多、抑制γδT细胞分泌IL-9减少、γδT细胞呈IL-10优势表达而发挥作用,γδT细胞可能是Th9细胞家族成员之一。但微卡反复雾化吸入可加重哮喘气道炎症,微卡可能扮演着抗原的角色。第二部分 雾化吸入母牛分枝杆菌防治小鼠肺呼吸道合胞病毒感染及对Th9细胞功能的影响第一节雾化吸入母牛分枝杆菌预防小鼠肺呼吸道合胞病毒感染及对Th9细胞功能的影响目的:观察母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠肺呼吸道合胞病毒感染的预防作用及对Th9细胞功能的影响方法:72只雌性Balb/c小鼠按随机数字表法按时-效、量-效关系研究分组。时-效关系分为6组:正常对照组（N）、RSV感染组（C6）、微卡干预组（Wneb、Wi.p、Mneb、Mip）,量-效关系分为7组:正常对照组（N）、RSV感染组（C6、C5）、微卡干预组（Wneb16、Wneb36、Wneb15、Wneb35）。时效关系研究:Wneb予微卡雾化吸入1周后感染106PFU RSV;Wi.p予微卡腹腔注射1周后感染106PFURSV;Mneb予微卡雾化吸入1月后感染106PFURSV;Mip予微卡腹腔注射1月后感染106PFU RSV,RSV感染后第4天予无创肺功能仪监测气道反应性,处死小鼠。量效关系研究:C6、Wneb16、Wneb36组感染106PFURSV;C5、Wneb15、Wneb35 组感染 105PFU RSV,每天 1 次,连续 3天,第4天Wneb16、Wneb15组予微卡1支雾化吸入,每天1次,连续5天;Wneb36、Wneb35组予微卡3支雾化吸入,每天1次,连续5天,微卡最后1次吸入后予无创肺功能仪监测气道反应性,处死小鼠。所有小鼠予电镜观察肺部RSV感染情况;HE染色观察气道炎症反应;免疫荧光观察肺抗RSV表达;ELISA 监测 BALF 中 IL-9 浓度;免疫组化监测肺 EGFR、NF09、Acetylcholine含量;荧光定量 PCR 监测 IL9R、PU.1、PD-L2、JAK1、STAT1、STAT5A、RSV、IFN-y、TLR7、TLR8 mRNA 表达;流式细胞术检测 IL-9+ CD3+、IL-10+CD3+淋巴细胞百分数。结果:①C6组小鼠气道反应性较正常对照组明显增高（P<0.05）,微卡腹腔注射1个月或1周均能降低气道反应性（P<0.05）,微卡雾化吸入对气道反应性无影响。②RSV感染可导致气道炎症,C6组炎症重于C5组;微卡雾化吸入可导致气道炎症,与剂量相关,Wneb36组气道炎症重于Wneb16组;微卡腹腔注射（Wi.p、Mi.p）均可减轻气道炎症,与时间无关。③C6、C5组BALF中IL-9浓度均明显增高（P值均<0.05）;Mneb、Mi.p较C6组明显降低（P值均<0.01）;Wneb16组较C6组明显降低（P<0.05）。④免疫荧光:IOD值C6、C5组均明显高于正常对照组（P<0.01,P<0.0001）;C6组明显高于C5 组（P<0.01）;Wneb、Wi.p、Mneb.、Mi.p组 IOD 值较C6组明显降低（P值分别<0.01,<0.01,<0.05,<0.01）;Wneb组较Mneb组、Wi.p 组明显降低（P<0.05,P<0.001）,Wi.p组明显高于Mi.p组（P<0.001）;Mi.p组较Mneb组明显降低（P<0.05）;Wneb16、Wneb36组均明显低于 C6 组（P 值均<0.01）;Wneb36 明显高于 Wneb16（P值<0.01）;Wneb15、Wneb35 组均明显低于 C5 组（P 值均<0.0001）。⑤电镜:C6组肺泡间质可见大量RSV;Wneb16组未见病毒;C5组及其它微卡干预组均可见少量RSV。⑥免疫组化:C6、C5组EGFR、NF09、Acetylcholine IOD值均明显高于正常对照组（P值均<0.0001）;肺EGFR表达IOD值Wneb、Wi.p、Wneb16组均明显低于C6组（P值均<0.0001）;Wneb15组明显低于 C6 组（P<0.0001）;肺 NF09 表达 IOD值Wneb、Wneb16、Wneb36组均明显低于C6组（P值均<0.001）;Wneb15、Wneb35组均明显低于C5组（P<0.0001）;肺Acetylcholine表达IOD值Wneb16组明显低于C6组（P值均<0.0001）;Wneb15、Wneb35组均明显低于C5组（P<0.0001）。⑦荧光定量PCR:IL-9R mRNAC6、C5组与正常对照组及各干预组间比较无差异;PU.1 mRNA水平C6、C5组均较正常对照组增高（P<0.0001,P<0.05）,Wneb、Wneb36、Wi.p组较C6组均降低（P<0.0001,P<0.001,P<0.001）;PD-L2 mRNA水平C6组较正常对照组降低（P<0.05）,Mi.p组较C6组明显降低（P<0.05）;JAK1 mRNA水平C6感染组较正常对照组明显降低（P<0.05）,Wneb.、Wi.p、Mneb.、Mi.p组较RSV感染组均无明显差异,Wneb36、Wneb15、Wneb35分别较C6、C5、C5 组明显增高（P<0.05,P<0.01,P<0.0001）;STAT1 mRNA 水平C6、C5组较正常对照组无明显差异,Wneb15、Wneb35均较C5组增高（P<0.05,P<0.01）;STAT5A mRNA水平C6、C5组均较正常对照组明显降低（P<0.0001、P<0.001）,Wneb16、Wneb36 较 C6 组明显增高（P<0.001,P<0.0001）,Wneb15、Wneb35均较 C5 组明显增高（P值均<0.01）;RSV mRNA水平C6、C5组较正常对照组明显增高（P<0.01,P<0.05）,Wneb、Wi.p、Mneb、Mi.p 均较 C6 组明显降低（P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05）,Wneb16、Wneb36均较C6明显降低（P<0.01,P<0.05）,Wneb15较C5组明显降低（P<0.01）。IFN-γmRNA水平C6、C5组较正常正常对照组、各干预组较C6、C5组间均无显着性差异（P值均>0.05）。TLR7 mRNA水平C6组较正常对照组明显增高（P<0.0001）,Wi.p、Mneb、Mi.p较C6组均明显增高（P<0.001,P<0.001,P<0.0001）,Wneb16、Wneb36 均较 C6 组明显降低（P 值均<0.0001）,C5组较正常对照组明显降低（P<0.001）,Wneb15、Wneb35较C5组无明显差异（P值均>0.01）。TLR8 mRNA水平C6感染组较正常对照组明显降低（P<0.001）,Wneb、Wi.p、Mneb、Mi.p较 C6 组均明显增高（P<0.0001,P<0.001,P<0.001,P<0.0001）,Wneb16、Wneb36均较C6组明显增高（P值均<0.0001）,C5组较正常对照组明显增高（P<0.0001）,Wneb35较C5组增高（P<0.01）。⑧流式细胞术:IL9+CD3+淋巴细胞百分数C6组明显高于正常对照组（P<0.05）,Wi.p、Mi.p组明显低于C6组（P值均<0.001）,Mneb、Wneb36明显高于C6组（P<0.05,P<0.0001）。IL10+CD3+淋巴细胞百分数C6组与正常对照组相比无差异,Wi.p、Mi.p较C6组明显增高（P<0.05,P<0.001）。IL9+D3+淋巴细胞百分数C5组与正常对照组无明显差异,Wneb15、Wneb35组均明显高于C5组（P<0.05,P<0.01）,IL10+CD3+淋巴细胞百分数C5组与正常对照组无明显差异,Wneb15较C5组明显增高（P<0.0001）。结论:微卡可用于RSV预防,Th9细胞在其中发挥着重要作用,微卡预防RSV感染的机制包括:①调控PU.1及PD-L2,调节Th9细胞功能,降低IL-9水平、增加IL-10水平发挥抗炎作用;调IL-9信号通路STAT1、STAT5A水平,调控下游基因表达,发挥抗病毒作用;②活化TLR7、TLR8发挥抗病毒作用,在其中扮演着TLR7、TLR8激动剂的作用;③下调气道NF09、Acetylcholine表达,通过调节神经机制发挥作用;④下调肺内EGFR表达,抑制RSV感染。第二节雾化吸入母牛分枝杆菌治疗小鼠肺呼吸道合胞病毒感染及对Th9细胞功能的影响目的:观察母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠肺呼吸道合胞病毒感染的治疗作用及对Th9细胞功能的影响方法:18只雌性Balb/c小鼠按随机数字表法分为3组:正常对照组（Normal group）、RSV 感染组（RSV group）、微卡治疗组（Treat group）。感染组与治疗组滴鼻感染106PFU RSV,每天1次,连续3天,第4天RSV感染组予PBS液雾化吸入、微卡治疗组雾化吸入母牛分枝杆菌,每天1次,连续5天。微卡最后1次吸入后24小时内予无创肺功能仪监测气道反应性,处死小鼠。所有小鼠予电镜观察肺部RSV感染情况;HE染色观察气道炎症反应;免疫荧光观察肺抗RSV表达;ELISA监测BALF中IL-9浓度;免疫组化监测肺EGFR、NF09、Acetylcholine含量;荧光定量PCR监测IL9R、PU.1、PD-L2、JAK1、STAT1、STAT5A、RSV、IFN-γ、TLR7、TLR8 mRNA表达;流式细胞术检测 IL-9+CD3+、IL-10+CD3+、γδTCR+CD3+、IL-9+γδTCR+、IL-1 0+γδTCR+淋巴细胞百分数。结果:①RSV感染组小鼠气道反应性较正常对照组明显增高（P<0.05）,微卡雾化吸入治疗组能显着降低气道反应性（P<0.05）②RSV感染可导致明显气道炎症,微卡雾化吸入治疗组可减轻气道炎症。③RSV感染组BALF中IL-9浓度明显高于正常对照组（P<0.05）,微卡治疗组较RSV感染组无显着性差异。④免疫荧光:IOD值RSV感染组明显高于正常对照组（P<0.01）,微卡治疗组较RSV感染组明显降低（P<0.0001）。⑥电镜:RSV感染组肺泡间质可见大量RSV,微卡治疗组未见病毒。⑦免疫组化:RSV感染组EGFR、NF09、Acetylcholine IOD值均明显高于正常对照组（P值均<0.0001）,微卡治疗组EGFR、Acetylcholine IOD值明显低于RSV感染组（P<0.01,P<0.0001）,NF09 IOD值较RSV感染组无显着性差异。⑧荧光定量PCR:IL-9R mRNARSV感染组与正常对照组无差异,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染组降低（P<0.01）;PU.1 mRNA水平RSV感染组较正常对照组增高（P<0.0001）,微卡雾化吸入组较RSV感染组明显降低（P<0.0001）;PD-L2 mRNA水平RSV感染组较正常对照组降低（P<0.05）,微卡雾化吸入治疗组与RSV感染组比较无显着性差异;JAK1 mRNA水平RSV感染组较正常对照组明显下降（P<0.05）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染组明显增高（P<0.0001）;STAT1 mRNA水平RSV感染组较正常对照组无明显差异,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染组明显增高（P<0.001）;STAT5A mRNA水平RSV感染组较正常对照组明显降低（P<0.0001）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染对照组明显增高（P<0.0001）;RSV mRNA水平RSV感染组较正常对照组明显增高（P<0.01）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染对照组明显降低（P<0.01）;IFN-y mRNA水平RSV感染组较正常正常对照组无显着性差异（P>0.05）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染对照组明显降低（P<0.05）;TLR7 mRNA水平RSV感染组较正常对照组明显增高（P<0.0001）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染组明显增高（P<0.0001）;TLR8 mRNA水平RSV感染组较正常对照组明显降低（P<0.001）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染对照组明显增高（P<0.05）。⑨流式细胞术:RSV感染组γδTCR+CD3+淋巴细胞百分数较正常对照组明显减少（P<0.05）,微卡雾化吸入治疗组较RSV感染组明显增多（P<0.01）;IL-9+CD3+、IL-9+γδTCR+淋巴细胞百分数RSV感染组较正常对照组明显增高（P<0.05,P<0.01）,IL-10+CD3+、IL-10+yδTCR+淋巴细胞百分数RSV感染组与正常对照组无显着性差异;微卡雾化吸入治疗组IL-9+CD3+较RSV感染组明显下降（P<0.01）,但IL-9+γδTCR+淋巴细胞百分数较RSV感染组无显着性差异;IL-10+CD3+、IL-1O+γδTCR+淋巴细胞百分数微卡雾化治疗组与RSV感染组无显着性差异。结论:实验剂量的微卡雾化吸入可明显降低气道反应性、减轻气道炎症、降低肺RSV感染及RSV mRNA表达,小剂量微卡雾化吸入可用于RSV的治疗,Th9细胞、γδT细胞在其中发挥着重要作用。微卡雾化吸入治疗RSV的机制包括:①调控PU.1,降低IL-9水平,调节Th9细胞功能;上调IL-9信号通路STAT1、STAT5A水平,调控下游基因表达,发挥抗病毒作用;②活化TLR7、TLR8发挥抗病毒作用,微卡在其中扮演着TLR7、TLR8激动剂的作用;③下调气道Acetylcholine表达,通过调节神经机制发挥作用;④下调肺内EGFR表达,抑制RSV感染;⑤募集γδT细胞参与抗病毒过程。第三部分 正常Balb/c小鼠肺功能测定目的:测定正常Balb/c小鼠肺功能,为广大研究人员提供参考。方法:300只Balb/c小鼠按体重和性别分为六组（AF组,雌性,体重16～20克;AM组,雄性,体重16～20克;BF组,雌性,体重20～24克;BM组,雄性,体重20～24克;CF组,雌性,体重24～28克;CM组,雄性,体重24～28克）,清醒状态下予美国BUXCO公司无创肺功能仪TBL4500 FinePointe NAM 系统测定如下指标:f、TV、MV、sRaw、sGaw、Raw、Frc、R2、PIF、PEF、Ti、Te、Dt、Rpef、EF50、Rinx。并行各参数间相关性分析。结果:组间比较参数 TV、MV、Frc、R2、PIF、PEF、Rpef、EF50 和 Rinx有显着性差异,而f、sRaw、sGaw、Raw、Ti、Te和Dt无显着性差异。相关性分析发现性别与W、Frc、R2、Rpef相关;W与TV、MV、sRaw、Frc、PIF、PEF、Rpef、EF50、Rinx 正相关;f 与 TV、MV、R2、PIF、PEF、Rpef、EF50、Rinx 正相关,但与 sRaw、sGaw、Raw、Ti、Te、Dt 负相关结论:各组小鼠肺功能各指标存在显着性差异,实验用小鼠的选择应根据实验目的参考选择,以减少实验误差。
马小娟[10]（2014）在《维吾尔药神香草对慢性哮喘的干预作用及其过程中Tfh细胞的变化研究》文中研究说明目的：本研究通过建立Balb/c小鼠慢性哮喘的模型，并用维吾尔药神香草干预后，观察神香草对慢性哮喘气道高反应性的抑制作用；比较肺组织中MMP-9、TIMP-1与T细胞亚群的关系，并探讨神香草能否通过调节MMP-9/TIMP-1的平衡而达到改善气道重塑的目的；检测不同组中Tfh细胞表型和含量的变化，以了解Tfh细胞是否参与了慢性哮喘的发病过程，同时观察维吾尔药神香草干预后对慢性哮喘时Tfh细胞表达的影响。本研究包括：①复制慢性哮喘的动物模型，并分别经地塞米松和神香草干预后，观察各组小鼠气道反应性、肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例及组织结构的改变，探讨神香草能否降低气道高反应性，减轻组织损伤；②通过比较各组MMP-9，TIMP-1与T细胞主要细胞因子的相关性，探讨慢性哮喘发病过程中MMP-9，TIMP-1的改变与T细胞亚群的关系；同时给予神香草干预，观察维吾尔药神香草是否能通过调节MMP-9，TIMP-1的平衡而对慢性哮喘气道重塑发挥改善作用；③分析哮喘组和对照组中Tfh细胞含量和表型的变化，初步探讨Tfh细胞在慢性哮喘发生过程中的作用；并观察维吾尔药神香草干预后脾脏和外周血中Tfh细胞及其相关分子的改变，进一步揭示神香草的作用机制。方法：课题第一部分：①神香草水提液的制备。神香草干草经煮沸、过滤后呈水提液，并浓缩备用；②选择健康的雌性Balb/c小鼠32只，随机分为对照组、哮喘组、地塞米松组和神香草组。除对照组外，其余三组小鼠均致敏，并连续激发8周；预处理组小鼠分别于激发前1h给予地塞米松和神香草水提液灌胃，连续8周。末次激发24h内在清醒、无创条件下测定小鼠气道反应性；抽取肺泡灌洗液并进行白细胞的分类和计数；并观察各组小鼠肺组织形态学的改变以及胶原纤维的沉积和气道粘液分泌的情况。课题第二部分：神香草水提液的制备及模型的复制同第一部分。末次激发后留取标本，测定指标。通过Real-timePCR检测各组小鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1、IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-βmRNA的变化，并且分别比较MMP-9、TIMP-1和IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β的相关性；此外，使用westernblot和免疫组化的方法检测并比较了各组肺组织中MMP-9、TIMP-1在蛋白水平的表达。课题第三部分：神香草水提液的制备及模型的复制同第一部分。末次激发后留取标本，测定指标。通过流式细胞术检测并比较各组脾脏和外周血中Tfh细胞的比例；采用RT-PCR，WesternBlot和免疫组化等方法分别检测BCL-6、CXCR5、ICOS、ICOSL和IL-21在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果：课题第一部分：与对照组比较，哮喘组小鼠在吸入各浓度Mch时Penh值均升高（P＜0.05），且此差异具有浓度依赖性；地塞米松组和神香草组小鼠在吸入各浓度Mch时Penh的变化大于对照组，但明显低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组BALF中白细胞的含量和嗜酸性粒细胞的比例均增加（P＜0.05），但经地塞米松和神香草干预后含量和比例均减少（P＜0.05）；哮喘组小鼠血清IgE的浓度增加（P＜0.05），而神香草干预后IgE的浓度有所下降；此外，Masson染色和PAS染色的结果均表明哮喘组肺组织中有大量的胶原纤维沉积和黏液分泌，而地塞米松组和神香草组中上述变化均减轻。课题第二部分：经RT-PCR法均观察到哮喘组肺组织MMP-9和TIMP-1的表达与对照组比较明显升高，尤其是TIMP-1的变化更加显着，差异有统计学意义（P＜0.05）；而经地塞米松和神香草干预后，MMP-9、TIMP-1的表达降低，与哮喘组比较有统计学差异（P＜0.05）；同时发现，经地塞米松和神香草干预后，肺组织IL-4、IL-17和TGF-β在mRNA水平的表达均较哮喘组减少（P＜0.05），而IFN-γmRNA的表达量却增加（P＜0.05）；相关性分析表明，MMP-9与IL-4和IL-17的表达呈正相关，而与IFN-γ的表达呈负相关；TIMP-1的表达量与各指标均密切相关。此外，蛋白水平的检测也表明，哮喘组MMP-9和TIMP-1的表达增加（P＜0.05），而经地塞米松和神香草干预后表达量下降（P＜0.05）。课题第三部分：经地塞米松和神香草干预后，脾脏和外周血中CD4+CXCR5+细胞数的百分率均低于哮喘组，并且神香草组中的减少更加明显（P＜0.05）；同时神香草组肺组织中BCL-6、CXCR5、ICOS、ICOSL和IL-21mRNA的表达均低于哮喘组（P＜0.05），并且经WesternBlot检测后发现神香草组BCL-6、CXCR5、ICOS、ICOSL的水平也低于哮喘组（P＜0.05）；此外，IL-21的阳性表达量也明显减少（P＜0.05）。结论：①慢性哮喘时肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比值增加，气道反应性增高，组织损伤并伴有大量黏液的分泌；而经维吾尔药神香草预处理后可减少嗜酸性粒细胞比值，降低气道反应性，减轻组织损伤和黏液的分泌；提示，维吾尔药神香草可能通过影响T细胞的表达，使炎性细胞和细胞因子减少，从而降低气道高反应性和组织损伤。②慢性哮喘发病过程中，MMP-9、TIMP-1的改变与T细胞主要细胞因子的变化具有相关性；而维吾尔药神香草可减少IL-4、IL-17和TGF-β的表达，增加IFN-γ的表达，还可纠正MMP-9/TIMP-1的失衡；考虑T细胞亚群的异常表达可能影响了MMP-9和TIMP-1的分泌，维吾尔药神香草可能通过调节T细胞亚群的表达，纠正了MMP-9/TIMP-1失衡从而达到缓解气道重塑的目的；③哮喘组小鼠脾脏和外周血中Tfh细胞的含量增加，并且肺组织中BCL-6、CXCR5、ICOS、ICOSL、IL-21mRNA水平和蛋白水平的表达明显升高，提示Tfh细胞可能参与了慢性哮喘的发病过程；而神香草组小鼠脾脏和外周血中Tfh细胞的含量低于哮喘组；并且神香草组小鼠肺组织Tfh细胞相关分子BCL-6、CXCR5、ICOS、ICOSL及IL-21在mRNA水平和蛋白水平的表达明显降低，考虑维吾尔药神香草可能抑制了慢性哮喘过程中Tfh细胞的表达。
二、天灸对哮喘患者血清可溶性IL-2受体及T淋巴细胞亚群的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、天灸对哮喘患者血清可溶性IL-2受体及T淋巴细胞亚群的影响（论文提纲范文）
（1）麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠的抗过敏作用观察 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠Th2、Th9、Th17的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 麻杏石甘汤对体外培养PBMC中Th2、Th9、Th17的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 辅助T细胞亚群对过敏性哮喘的调控作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 麻杏石甘汤治疗支气管哮喘研究进展综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（2）肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 前言 |
| 1 支气管哮喘慢性持续期的免疫调控特征 |
| 2 支气管哮喘慢性持续期炎性因子与免疫调控的相互关系 |
| 3 免疫调控对支气管哮喘慢性持续期预后转归的影响 |
| 4 支气管哮喘慢性持续期免疫调控的临床需求 |
| 5 支气管哮喘慢性持续期免疫调控的临床局限与未来展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 前言 |
| 1 支气管哮喘慢性持续期的中医观 |
| 2 支气管哮喘慢性持续期中医临床特征与免疫炎症的相关性 |
| 3 支气管哮喘慢性持续期中医病机演变与免疫调控的相互关系 |
| 4 中医干预对支气管哮喘慢性持续期炎性因子与免疫调控的作用 |
| 5 中医通过免疫调控影响支气管哮喘慢性持续期预后转归 |
| 6 支气管哮喘慢性持续期中医免疫调控的优势与特色 |
| 7 支气管哮喘慢性持续期中医免疫调控面临的问题与发展趋势 |
| 参考文献 |
| 第二部分 支气管哮喘慢性持续期“肺脾为核心脏腑整体辨证”理论研究 |
| 1 “脏腑整体辨证”观 |
| 1.1 整体观念 |
| 1.2 脏腑辨证 |
| 1.3 “脏腑整体辨证”的含义 |
| 2 “肺脾为核心脏腑整体辨证”观 |
| 2.1 支气管哮喘慢性持续期关键病机的共性规律特征 |
| 2.2 “肺脾为核心脏腑整体辨证”的含义 |
| 3 “温润辛金培本”原理方药的临床应用 |
| 3.1 “温润辛金培本”治则理论基础 |
| 3.2 “温润辛金培本”原理方药系列疗法 |
| 3.3 温润辛金培本原理内服方药 |
| 3.4 温润方 |
| 4 支气管哮喘慢性持续期“肺脾为核心脏腑整体辨证”与西医免疫调控的异同 |
| 4.1 免疫调控失衡的认识思路不同 |
| 4.2 免疫调控的方法有别 |
| 4.3 免疫调控的目的一致 |
| 5 “肺脾为核心脏腑整体辨证”继承与发展了中医解决支气管哮喘慢性持续期问题的优势与特色 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 研究一 基于RCT的肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期患者临床信息分析及血清标本收集 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节免疫球蛋白水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节促炎ILs水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节抗炎ILs水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 特色与创新 |
| 3 问题与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 附录 |
| 附件1 支气管哮喘慢性持续期实用性随机对照研究方案 |
| 附件2 试验过程的标准作业程序质量控制(即SOP管理) |
| 附件3 各中心血清采集及哮喘控制情况 |
（3）变应性鼻炎患者CD4+T细胞研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:变应性鼻炎患者外周血淋巴细胞亚群研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器及耗材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 样本制备程序 |
| 2.4 外周血样本处理 |
| 2.4.1 实验前准备 |
| 2.4.2 操作过程 |
| 2.5 外周血淋巴细胞亚群与绝对值检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AR患者临床特征 |
| 3.2 AR患者外周血淋巴细胞亚群数量及比例与HC组无显着性差异 |
| 3.3 中重度AR患者外周血淋巴细胞数量及比例与轻度AR患者无显着性差异 |
| 3.4 AR患者外周血CD4+T细胞数量显着高于HC |
| 3.5 中-重度AR患者外周血CD4+T细胞亚群数量与轻度AR患者无显着性差异 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:变应性鼻炎患者T细胞亚群及功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 PBMC提取及冻存 |
| 2.3.1 PBMC提取 |
| 2.3.2 PBMC冻存 |
| 2.4 细胞复苏 |
| 2.5 外周血CD4+T细胞亚群及趋化因子受体检测 |
| 2.6 AR患者血清细胞因子及趋化因子水平检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AR患者外周血Th1及Th17亚群细胞数量及比例与HC相比显着降低 |
| 3.2 中重度AR患者外周血Th1及Th17亚群细胞数量及比例显着低于轻度AR患者 |
| 3.3 AR患者血清T细胞相关细胞因子水平分析 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:变应性鼻炎患者CD4+T细胞趋化因子受体的表达研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 PBMC提取及冻存 |
| 2.3.1 PBMC提取 |
| 2.3.2 PBMC冻存 |
| 2.4 细胞复苏 |
| 2.5 细胞表面趋化因子受体检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AR患者外周血CD4+T细胞CCR4、CCR6、CXCR3及CD62L表达显着低于HC |
| 3.2 AR患者外周血表达CXCR3及CD62L的CD4+T细胞比例显着低于HC |
| 3.3 中重度AR患者外周血CD4+T细胞CXCR3表达水平显着低于轻度患者 |
| 3.4 中重度AR患者外周血CXCR3+CD4+T细胞比例显着低于轻度患者 |
| 4 讨论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 2型固有淋巴细胞(ILC2)在变应性鼻炎中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于自噬基因ATG5探讨针刺调控内质网应激诱导气道高反应T淋巴细胞亚群稳态机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 哮喘的研究进展 |
| 一、哮喘的定义 |
| 二、哮喘的病因 |
| 三、哮喘的治疗 |
| 第二节 针灸在哮喘治疗中的应用 |
| 一、各种针灸疗法对哮喘的治疗 |
| 二、针灸在哮喘治疗中的作用机制 |
| 第三节 内质网应激与哮喘的关系 |
| 一、内质网应激的分子机制 |
| 二、内质网应激在呼吸系统中的生物学效应 |
| 三、内质网应激与哮喘 |
| 第四节 细胞自噬与哮喘的关系 |
| 一、自噬的作用 |
| 二、自噬的调控机制研究 |
| 三、内质网应激与自噬 |
| 四、自噬与哮喘 |
| 第五节 自噬基因ATG5与哮喘的关系 |
| 一、ATG5在自噬中的作用 |
| 二、ATG5在免疫系统中的作用 |
| 三、ATG5与哮喘 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 针刺对气道高反应模型气道高反应性及气道炎症的影响 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 针刺对气道高反应模型T淋巴细胞亚群的影响 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 针刺对气道高反应模型内质网应激和自噬的影响 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第四节 自噬基因ATG5在针刺调控气道高反应小鼠内质网应激-自噬反应的作用研究 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）基于全基因表达谱揭示天灸药物白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）隔药饼灸对免疫抑制兔机体免疫和细胞免疫功能量—效及时—效影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 隔药饼灸理论及临床应用研究分析 |
| 1 复方隔药灸的临床应用分析 |
| 1.1 理论研究 |
| 1.2 临床应用 |
| 2 六味地黄汤调节机体免疫功能的作用分析 |
| 2.1 六味地黄汤免疫调节活性成分研究 |
| 2.2 免疫调节作用研究 |
| 3 中药透皮吸收及促透作用的特色分析 |
| 3.1 中药药性对透皮吸收的影响 |
| 3.2 炮制对中药透皮吸收的影响 |
| 3.3 经穴位给药对中药透皮吸收的影响 |
| 3.4 常用的促透皮吸收中药 |
| 4 针灸效应与时-效和量-效关系的研究 |
| 4.1 针灸时-效关系的特点及相关研究 |
| 4.2 针灸量-效关系的特点及研究 |
| 第二部分 隔药饼灸对免疫抑制兔机体免疫和细胞免疫量-效影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂与药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 造模方法 |
| 2.3 穴位选择 |
| 2.4 隔药饼灸 |
| 2.5 标本采集 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 不同灸量隔药饼灸对免疫抑制兔实验前后体质量差值的影响 |
| 3.2 不同灸量隔药饼灸对免疫抑制兔免疫细胞的影响 |
| 3.3 不同灸量隔药饼灸对免疫抑制兔细胞因子的影响 |
| 3.4 不同灸量隔药饼灸对免疫抑制兔脾脏指数的影响 |
| 3.5 不同灸量隔药饼灸对免疫抑制兔脾脏组织形态学的影响 |
| 4 结论 |
| 第三部分 隔药饼灸对免疫抑制兔机体免疫功能和细胞免疫作用时-效影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂与药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 造模方法 |
| 2.3 穴位选择 |
| 2.4 隔药饼灸 |
| 2.5 标本采集 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隔药饼灸对免疫抑制兔实验前后体质量变化的影响 |
| 3.2 隔药饼灸对免疫抑制兔实验前后体质量差值的影响 |
| 3.3 隔药饼灸对免疫抑制兔外周血细胞时-效关系的影响 |
| 3.4 隔药饼灸对免疫抑制兔免疫球蛋白时-效关系的影响 |
| 3.5 隔药饼灸对免疫抑制兔补体时-效关系的影响 |
| 3.6 隔药饼灸对免疫抑制兔免疫细胞时-效关系的影响 |
| 3.7 隔药饼灸对免疫抑制兔细胞因子时-效关系的影响 |
| 3.8 隔药饼灸对免疫抑制兔脾脏指数时-效关系的影响 |
| 3.9 隔药饼灸对免疫抑制兔脾脏组织形态学时-效关系的影响 |
| 4 结论 |
| 全文讨论 |
| 1 隔药饼灸对机体免疫功能的影响 |
| 1.1 对免疫分子的影响 |
| 1.2 对免疫细胞的影响 |
| 1.3 对机体免疫器官的影响 |
| 2 灸法量-效和时-效关系对机体免疫系统的影响 |
| 2.1 灸法量-效关系对免疫系统的影响 |
| 2.2 灸法时-效关系对免疫系统的影响 |
| 3 施灸穴位对机体免疫功能调节作用的影响 |
| 4 复方药饼对机体免疫功能调节作用的影响 |
| 5 中医学对免疫抑制的认识 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 针灸时效-量效关系对机体免疫调节作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文、参与科研情况 |
（7）Th1/Th2与Treg/Th17平衡对儿童哮喘的调节作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）艾灸法对哮喘大鼠模型外周血CD4+、CD8+T细胞及血清IL-1、IL-1Ra的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 艾灸法对哮喘大鼠模型外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞的影响 |
| 1.实验目的 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.指标检测 |
| 5.统计学分析 |
| 6.结果 |
| 7.小结 |
| 实验二 艾灸法对哮喘大鼠模型血清IgE、IL-1、IL-1Ra细胞因子的影响 |
| 1.实验目的 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.指标检测 |
| 5.统计学分析 |
| 6.结果 |
| 7.小结 |
| 实验三 艾灸法对哮喘大鼠肺组织病理的影响 |
| 1.实验目的 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.指标检测 |
| 5.结果 |
| 6.小结 |
| 讨论 |
| 1.现代医学对哮喘的认识 |
| 2.中医对哮喘的认识 |
| 4.艾灸对免疫系统的调节作用 |
| 5.哮喘模型的评价 |
| 6.实验指标的选择 |
| 7 选穴依据 |
| 结论 |
| 附图 |
| 课题创新之处 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）雾化吸入母牛分枝杆菌对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 雾化吸入母牛分枝杆菌对小鼠支气管哮喘的影响及机制研究 |
| 第一节 雾化吸入母牛分枝杆菌预防小鼠支气管哮喘及对Th9细胞功能的影响引言 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 雾化吸入母牛分枝杆菌预防小鼠支气管哮喘的神经机制研究引言 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 雾化吸入母牛分枝杆菌治疗小鼠支气管哮喘及对Th9细胞功能的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雾化吸入母牛分枝杆菌防治小鼠肺呼吸道合胞病毒感染及对Th9细胞功能的影响 |
| 第一节 雾化吸入母牛分枝杆菌预防小鼠肺呼吸道合胞病毒感染及对Th9细胞功能的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 雾化吸入母牛分枝杆菌治疗小鼠肺呼吸道合胞病毒感染及对Th9细胞功能的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 正常Balb/c小鼠肺功能测定 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 附录 (英文缩略词表) |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文清单 |
| 附件 |
（10）维吾尔药神香草对慢性哮喘的干预作用及其过程中Tfh细胞的变化研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 维吾尔药神香草对气道高反应性的抑制作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验动物的分组 |
| 1.2 动物模型的建立 |
| 1.3 神香草水提液的制备 |
| 1.4 指标检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 维吾尔药神香草对慢性哮喘气道重塑过程中 MMP-9，TIMP-1 平衡的调节作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验动物的分组 |
| 1.2 动物模型的建立 |
| 1.3 神香草水提液的制备 |
| 1.4 指标检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部 Tfh 细胞在慢性哮喘发病机制中的作用及其神香草的干预 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验动物分组 |
| 1.2 动物模型的建立 |
| 1.3 神香草水提液的制备 |
| 1.4 指标检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、天灸对哮喘患者血清可溶性IL-2受体及T淋巴细胞亚群的影响（论文参考文献）
- [1]麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究[D]. 郑炜东. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [2]肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究[D]. 司东旭. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]变应性鼻炎患者CD4+T细胞研究[D]. 于晓峰. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]基于自噬基因ATG5探讨针刺调控内质网应激诱导气道高反应T淋巴细胞亚群稳态机制研究[D]. 董方. 广州中医药大学, 2019(05)
- [5]基于全基因表达谱揭示天灸药物白芥子散对哮喘大鼠免疫稳态重建的分子机制研究[D]. 闫兴柱. 山西中医药大学, 2018(01)
- [6]隔药饼灸对免疫抑制兔机体免疫和细胞免疫功能量—效及时—效影响的研究[D]. 翟春涛. 湖南中医药大学, 2018(01)
- [7]Th1/Th2与Treg/Th17平衡对儿童哮喘的调节作用研究[D]. 赵春兰. 泰山医学院, 2017(06)
- [8]艾灸法对哮喘大鼠模型外周血CD4+、CD8+T细胞及血清IL-1、IL-1Ra的影响[D]. 何海明. 安徽中医药大学, 2016(03)
- [9]雾化吸入母牛分枝杆菌对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的影响及机制研究[D]. 姜晓红. 广西医科大学, 2015(08)
- [10]维吾尔药神香草对慢性哮喘的干预作用及其过程中Tfh细胞的变化研究[D]. 马小娟. 新疆医科大学, 2014(04)