一、Reciprocal expression of TRAIL and CD95L in Th1 and Th2 cells: role of apoptosis in T helper subset differentiation（论文文献综述）
张程斐[1]（2021）在《基于转录组测序研究甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠的机制影响》文中认为目的:通过观察甲炎康泰复方颗粒对自身免疫性甲状腺炎（AIT）大鼠的保护作用,并基于转录组对大鼠甲状腺组织测序,探讨甲炎康泰对甲状腺组织起保护作用的相关靶点及通路,为临床应用提供实验依据。方法:高碘饮水诱导和猪甲状腺球蛋白佐剂注射Lewis大鼠建立AIT模型大鼠40只,造模成功后,按血清TPOAb浓度随机分为模型组、甲炎康泰低（0.708g/kg）、中（1.417g/kg）、高（2.834g/kg）剂量组,每组10只。正常组与模型组大鼠给予1ml/100g的双蒸水,甲炎康泰三剂量组给予中药复方颗粒剂连续灌胃给药8周。药物干预结束后取材,检测大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb及TRAb的浓度;超低温取单侧甲状腺组织放入4%多聚甲醛中固定,用于HE染色与免疫组化检测,另一侧甲状腺组织迅速放入液氮中,待提取RNA,行转录组测序与RT-PCR检测;LC/MS检测甲炎康泰组分;RT-PCR检测甲状腺组织内Jak2、STAT3和HIF-1α mRNA的表达水平;免疫组化检测甲状腺组织中p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α IOD/Area值的变化。细胞实验采用雌性lewis大鼠20只,按体重随机分为:正常组（给予双蒸水）和甲炎康泰组（高剂量颗粒剂2.834g/kg）,每组10只。连续给药7天后麻醉取血获得含药血清。IFN-γ干预Nthy-ori 3-1细胞24h建立自身免疫性甲状腺炎细胞损伤模型,含药血清干预后,CCK-8法检测细胞活性;免疫荧光与Western blot法分别检测p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α的荧光强度以及蛋白表达情况,验证动物实验结果。结果:1.LC/MS检测:甲炎康泰组分结果得到代谢产物10122个,其中负离子数1870个,正离子数8252个。Score评分得到了最高的10个代谢物。2.甲功检测:与正常组相比,模型组T3,T4,FT3,FT4均显着性升高（P<0.01）,TSH降低（P<0.01）。经甲炎康泰干预后,与模型组相比:低剂量组T3,T4,FT3,FT4下降及TSH上升但无明显差异;中剂量组T3（P<0.0 5）,FT3（P<0.01）,FT4（P<0.01）下调明显但TSH上升无统计学差异;高剂量组T3,T4,FT3,FT4下降以及TSH上升均具有显着性差异（P<0.01）。3.抗体检测:与正常组相比,模型组TGAb、TPOAb及TRAb均显着性升高（P<0.01）。经甲炎康泰干预后,与模型组相比:低、中剂量组TGAb、TPOAb均明显降低（P<0.01）;高剂量组TGAb、TPOAb及TRAb均降低,且具有统计学差异（P<0.01）。4.形态学检测:正常组可见大量完整甲状腺滤泡,大小适中,腔内红色胶质充盈均匀,滤泡上皮细胞完整;模型组甲状腺滤泡间质呈弥漫性淋巴细胞浸润,大量滤泡腔被破坏或变小,腔内胶质分布不均或减少,滤泡壁变薄、破坏;3个治疗组甲状腺滤泡间质内淋巴细胞浸润较模型组明显减少,滤泡上皮细胞较为完整,胶质含量略减少,但较模型组轻微,滤泡结构完整。高剂量组略好于低、中剂量组。5.转录组检测:通过测序得出甲炎康泰可对自身免疫性甲状腺炎大鼠产生49个差异表达基因,其中16个下调基因,33个上调基因。GO富集分析中得到两个免疫相关差异表达基因:Dnase113和JAK3,甲炎康泰可能通过上调Dnase113和下调JAK3在甲状腺组织中的表达,以缓解了甲状腺组织内的炎症反应以及相关免疫反应。KEGG富集分析中,缺氧诱导因子HIF-1信号通路在甲炎康泰组下调趋势中富集得分最高且具有明显差异。除此之外,Jak-STAT信号通路,表皮生长因子受体信号通路,原发性免疫缺陷以及坏死性凋亡都与自身免疫性甲状腺炎具有一定的相关性。6.PT-PCR检测:与正常组比较,模型组Jak2、STAT3和HIF-1αmRNA相对表达量皆显着性上调（P<0.01）;与模型组比较,甲炎康泰高剂量组Jak2（P<0.05）、STAT3（P<0.01）和 HIF-1α（P<0.05）均下调。7.免疫组化检测:比较各组平均光密度值IOD/Area,与正常组比较,模型组大鼠甲状腺组织内有较多p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α蛋白表达（P<0.01）。与模型组比较,p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α蛋白于甲炎康泰高剂量组表达降低（P<0.05）。8.甲状腺细胞免疫荧光和Western blot检测结果:甲炎康泰组甲状腺细胞活性较模型组显着升高;免疫荧光和Western blot显示,与正常组比较,模型组p-Jak2/Jak2,p-STAT3/STAT3以及HIF-1 α/β-actin表达值均显着性上调（P<0.01）以及其对应的荧光强度也有增加（P<0.01）;与模型组比较,甲炎康泰组p-Jak2/Jak2,p-STAT3/STAT3以及HIF-1α/β-actin表达值均有下调（P<0.05或P<0.01）以及其对应的荧光强度也有下降（P<0.05 或P<0.01）。结论:1.甲炎康泰可一定程度上纠正甲状腺功能和缓解甲状腺结构损伤,可能与其降低循环TGAb、TPOAb及TRAb浓度有关。2.甲炎康泰可能通过上调Dnase113和下调JAK3 mRNA在甲状腺组织中的表达,以缓解了甲状腺组织内的炎症反应以及相关免疫反应;同时,甲炎康泰可能下调HIF-1α信号通路、Jak-STAT信号通路、原发性免疫缺陷信号通路以及坏死性凋亡信号等通路在甲状腺中的表达,以缓解AIT的发展。3.甲炎康泰可能抑制了甲状腺组织中Jak2/STAT3/HIF-1α通路进而缓解了 AIT的发展。4.甲炎康泰对甲状腺细胞具有一定保护作用,可能通过下调p-Jak2/Jak2,p-STAT3/STAT3以及HIF-1α/β-actin的表达及其对应的荧光强度有关,提示甲炎康泰对Jak2/STAT3/HIF-1 α通路有确切的抑制作用。
李会敏[2]（2021）在《髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展》文中研究说明研究背景和目的:原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy,PMN）是一种 Th2 免疫反应导致的以肾小球病变为主要病理改变的自身免疫性疾病,是引起成人肾病综合征的常见病因。大多数PMN病例（约85%）是由磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor,PLA2R）抗体介导的,而其余的与包含7A的血栓蛋白1型结构域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A,THSD7A）或不明机制相关。Th17细胞通过介导基本炎症级联作用在肾脏自身免疫中发挥关键作用,能促进自身抗体的形成,这是大多数肾脏自身免疫性疾病的关键,增强组织炎症,并对肾实质细胞有直接影响,然而Th17细胞是否参与PMN的发生发展目前尚不清楚。髓系抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）是一群免疫抑制细胞,研究发现狼疮肾炎患者中MDSC可促进Th17分化和疾病进展,但在PMN中MDSC的变化及与Th2和Th17细胞的相互作用至今尚无研究。本研究旨在揭示PMN中MDSC与Th2和Th17免疫反应的关系,为PMN的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:（1）PMN患者肾脏组织石蜡和冰冻切片染色,光镜下观察肾组织病理改变;IF检测肾小球基底膜免疫复合物沉积情况;多色免疫组化（multiplex immunohistochemistry,IHC）检测IL-4、CD3和CD11b抗体在肾组织定位和表达强度;应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测PMN患者和HC血浆中抗PLA2R抗体的含量及对疾病诊断的灵敏度和特异性。（2）应用FCM和ELISA方法分别检测了 HC和PMN患者中CD4+IL-4+（Th2）和 CD4+IFN-γ+（Th1）细胞比例及相关细胞因子 IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和IFN-γ的水平,并分析Th2细胞比例与疾病活动度的相关性及Th1/Th2比例变化;同时检测了 HC和PMN患者中调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的比例变化。（3）采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）测定健康对照组（healthy control,HC）和PMN患者外周血中MDSC及其亚群的比例与数目;并分析了 PMN患者的MDSC 比例和数量与疾病活动度和外周血Th2细胞比例的相关性。（4）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,加入CFSE标记;同时流式分选纯化各自相应的MDSC细胞,将MDSC和初始CD4+T应用CD3和CD28抗体共刺激培养3天,流式检测比较HC和PMN患者的MDSC的抑制功能。（5）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,体外建立诱导分化为Th2细胞的极化体系,分别加入MDSC和（或）Arg-1和iNOS抑制剂及IL-6和IL-10因子,通过FCM方法比较CD4+IL-4+（Th2）细胞的变化。（6）免疫荧光染色法（immunofluorescence,IF）检测PMN患者肾组织中IL-17+细胞和CD11b+细胞的共定位;FCM和ELISA分别检测HC和PMN患者中Th17细胞比例及相关细胞因子IL-17A水平,并分别分析了两者与疾病活动度的相关性;（7）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,体外建立诱导分化为Th17细胞的极化体系,加入MDSC和（或）Arg-1抑制剂,通过FCM和ELISA方法比较CD4+IL-17A+（Th17）细胞和培养上清中IL-17A的变化;（8）ELISA检测HC和PMN患者血浆中Arg-1的含量变化,分析PMN患者中Arg-1含量与疾病活动度和MDSC数量的相关性;流式分选PMN患者的MDSC并加入IL-6或IL-10因子共同培养,利用实时荧光定量核酸扩增技术（real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测 IL-6 和 IL-10 对 MDSC 中 Arg-1 mRNA表达的影响。（9）应用重组人Ⅳ型胶原蛋白α3链的非胶原（NC）结构域（Non-collagenous（NC）domains of the α3 chain of recombinant human type Ⅳ collagen,rh-α3（IV）NC1）蛋白免疫DBA/1小鼠,构建PMN小鼠模型,并给予吉西他滨（gemcitabine,GEM）去除MDSC,检测小鼠外周血、脾脏和淋巴结中MDSC、Th2、Th17、Th1和Treg细胞的变化;ELISA法检测小鼠尿白蛋白、尿肌酐及血清尿素氮的水平;qRT-PCR检测小鼠脾脏、淋巴结和肾脏组织Th2和Th17相应细胞因子IL-13和IL-17A及相关转录因子GATA3、RORγt和RORα的mRNA表达情况;IF染色检测肾组织内IgG沉积;光镜下观察模型小鼠肾脏病理改变;电镜下观察模型小鼠肾脏的超微结构变化。研究结果:（1）PMN患者外周血Th2细胞及相关因子增加并与疾病活动度正相关;（2）PMN患者外周血中MDSC及其亚群数量显着增加,抑制功能增强,但与疾病活动度正相关;（3）体外实验证实MDSC抑制Th2细胞分化,IL-6和IL-10增强MDSC抑制能力。（4）PMN患者外周血Th17细胞及其相关因子增加并与疾病活动度正相关;（5）PMN患者外周血中MDSC、Arg-1、IL-17三者存在相关性;（6）体外实验证实人MDSC通过产生Arg-1促进Th17细胞分化,并且PMN来源的MDSC有更强的促Th17分化作用且可被Arg-1抑制剂（nor-NOHA）终止;（7）PMN患者血浆中Arg-1含量增加,IL-6和IL-10可以促进MDSC分泌 Arg-1。（8）应用rh-α3NC1成功构建小鼠PMN模型;PMN小鼠外周血中MDSC、Th17和Th2细胞比例随着免疫时间延长增加;而Th1和Treg细胞比例随着免疫时间延长呈下降趋势;（9）去除MDSC减轻PMN模型小鼠的肾组织损伤;（10）去除MDSC降低Th17和Th2细胞比例及相关转录因子的表达;但增加Th1和Treg细胞比例。结论:MDSC在PMN中显着增加,MDSC可能主要通过增强Th17反应促进PMN疾病进展。Th17的分化依赖于MDSC分泌的Arg-1。PMN小鼠模型证实去除MDSC可能主要通过减弱Th17免疫反应减轻小鼠肾脏损伤。
韩盼盼[3]（2021）在《低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究》文中研究说明第一部分:低剂量地西他滨通过调节Treg细胞恢复ITP的免疫耐受的机制研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary Immune Thrombocytopenia,ITP）是一种病因未明的获得性自身免疫性出血性疾病,约占所有出血性疾病的1/3。由于长期接受激素等药物治疗并伴随高出血风险等原因,慢性ITP患者身体乏力,情绪焦虑,兴趣丧失,其生活质量甚至不如癌症患者。ITP发病机制尚未完全阐明,主要原因是患者对自身血小板抗原免疫失耐受,体液免疫和细胞免疫紊乱介导血小板破坏过多和/或血小板生成不足。免疫耐受是机体对自身抗原不产生反应,而对其他抗原发挥免疫应答能力,重建并维持免疫耐受是自身免疫性疾病的重要治疗策略。近年来,虽有血小板生成素受体激动剂、利妥昔单抗等新药出现,但仍有约1/3的患者对各种治疗反应不佳。因此,深入研究ITP免疫失耐受的机制、探寻重建免疫耐受的策略对于ITP的诊治、改善患者生活质量和预后具有重要意义。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）在介导免疫耐受,维持免疫稳态,控制自身免疫疾病及抑制过度免疫反应中发挥关键作用。大量研究结果表明,ITP患者体内Treg细胞的数量和功能较正常人显着下降,导致自身反应性效应性T（Teff）细胞过度增殖和激活。通过恢复Treg细胞的功能,抑制Th1和Th17细胞的增殖,恢复ITP患者的免疫耐受,是目前ITP特异性治疗方案的重要机制。地西他滨是DNA甲基化转移酶抑制剂,主要用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）。地西他滨去甲基化可促进巨核细胞成熟和血小板释放,因此在升高血小板方面具有显着疗效。课题组前期实验室研究证实低剂量地西他滨能够有效改善ITP患者血浆诱导的巨核细胞成熟、凋亡障碍及血小板生成不足。在此基础上,课题组牵头组织的多中心前瞻性临床研究证实,低剂量地西他滨治疗难治性ITP患者耐受性良好,总有效率约50%,部分患者获得超过1年的长期疗效。然而,低剂量地西他滨促进巨核细胞成熟和血小板生成的作用无法完全解释ITP患者获得长期疗效的原因和机制。近年来,有研究报道地西他滨在诱导和维持自身免疫耐受中发挥重要作用。同种异体小鼠骨髓单个核细胞多次输注诱导免疫耐受的基础上,联合地西他滨可显着增加Treg细胞数量、抑制CD4+T细胞增殖、提高小鼠皮肤移植成功嵌合率。我们猜想地西他滨在ITP中能够通过诱导Treg细胞生成,增强Treg细胞抑制功能,恢复Treg细胞和Teff细胞的平衡,从而对ITP起到治疗作用。研究目的:（1）探究低剂量地西他滨在体内和体外对ITP中Treg细胞生成和功能的影响,探明地西他滨是否通过Treg细胞重新平衡CD4+T细胞亚群。（2）阐明干预STAT3等关键分子对地西他滨诱导Treg细胞生成和功能的影响,进一步验证地西他滨的作用靶点和通路。（3）揭示地西他滨在ITP治疗中获得长期疗效的原因,为地西他滨用于ITP患者的治疗提供准确详实的数据,为ITP患者的诊治提供新靶点和新策略。研究方法:（1）ITP患者及对照:分别收集符合诊断标准的ITP患者及年龄、性别匹配的健康对照者的外周血样本。同时收集地西他滨治疗前、后ITP患者的外周血样本。（2）构建主动ITP小鼠模型:用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61KO）小鼠,再将CD61敲除小鼠的脾脏细胞输注给辐照后的联合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficient,SCID）。（3）体外细胞培养:分离ITP患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）并分选CD4+T细胞。加入rh-IL-2,anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养。加入不同浓度地西他滨（0,1 nM,10nM,100nM,1μM,10μM）孵育72小时。（4）流式细胞术检测:地西他滨处理后Annexin-V和PI染色检测PBMCs的凋亡水平,并检测 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞,CD4+IFN-γ+Th1 细胞,CD4+IL4+Th2细胞,CD4+IFN-γ-IL17+Th17 细胞和 CD4+IFN-γ-IL22+Th22 细胞的数量。（5）Treg细胞抑制功能实验:磁珠分选CD4+CD25-Teffs细胞,加入CFSE染色后,与分选的CD4+CD25+CD127-Treg细胞按照比例为4:1的比例共培养。6天后,流式细胞术检测CD4+T细胞增殖。（6）靶向去除Treg细胞:免疫磁珠从CD61敲除小鼠的脾细胞中删除CD4+CD25+Treg细胞后输注给SCID小鼠、或给SCID小鼠腹腔注射单克隆抗小鼠CD25（IL-2Rα）抗体来耗尽Treg细胞。（7）细胞因子检测:使用V-PLEX人促炎Panel 1试剂盒与V-PLEX人IL17A试剂盒检测ITP患者治疗前后的血清样品中的11种细胞因子,使用ELISA检测TGF-β水平。（8）转录组测序:提取地西他滨治疗前和治疗后的ITP患者PBMCs样本中的RNA,并在Illumina Hiseq平台上测序。（9）蛋白免疫印记（Western blot）:收集ITP患者治疗前后的PBMCs样本,检测AKT和STAT3蛋白水平的改变。（10）STAT3和AKT抑制实验:在体外细胞培养实验及ITP主动模型中应用STAT3和AKT抑制剂,检测其STAT3和AKT抑制剂对地西他滨治疗的影响。研究结果:（1）低剂量地西他滨促进Treg细胞的体外分化并增强其免疫抑制功能在体外研究中,低剂量地西他滨（10 nM和100 nM）显着提高了 ITP患者PBMCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例,而未改变CD4+T细胞的百分比。通过分选CD4+T细胞排除其他细胞干扰,低剂量地西他滨（100 nM）仍显着增加了 ITP中Treg细胞的数量。我们分选ITP患者和健康对照组的CD4+CD25+CD127-Treg细胞与自身Teff细胞共孵育,100nM地西他滨可以显着提高Treg细胞对Teff细胞增殖的抑制功能。地西他滨本身对Teff细胞增殖无明显影响。这些结果表明,低剂量地西他滨在ITP中显着增强了 Treg细胞的免疫抑制功能。（2）低剂量地西他滨改善主动模型ITP小鼠血小板减少并促进脾脏Treg细胞扩增我们通过建立ITP主动模型来研究地西他滨的体内作用。照射和脾细胞输注7天后,小鼠血小板计数明显下降。与对照组相比,0.03 mg/kg的地西他滨组在第21天和28天血小板显着增加。给药3周后,流式细胞术分析显示,地西他滨处理组小鼠脾脏CD4+T细胞中Treg细胞的数量显着增加。同时,与对照相比,地西他滨组CD4+T细胞中Th1、Th17细胞明显减少,而Th22细胞无明显差异。（3）靶向去除Treg细胞能够部分抵消低剂量地西他滨的治疗作用通过脾细胞输注前磁珠分选删除的Treg细胞或注射抗-CD25抗体耗尽主动模型ITP小鼠中的Treg细胞来靶向去除Treg细胞,我们发现低剂量地西他滨在ITP小鼠中提高血小板计数的作用明显减弱。同时,靶向去除Treg细胞后,低剂量地西他滨对ITP模型小鼠的脾Th1、Th7细胞也无明显影响（4）低剂量地西他滨恢复ITP患者CD4+T细胞亚群的平衡通过分析纳入低剂量地西他滨临床实验ITP患者的外周血样本,我们发现地西他滨治疗后,患者体内CD4+T细胞中Treg细胞数量显着增加。同时,地西他滨显着降低了 ITP患者CD4+T细胞群中Th1和Th17细胞的比例。我们还观察到地西他滨治疗后,ITP患者的Treg细胞的抑制功能明显增强。（5）低剂量地西他滨对ITP患者T细胞分化相关细胞因子的影响通过对ITP患者在地西他滨治疗前后的外周血清分析,我们发现低剂量地西他滨显着降低了 ITP患者血清中TNF-α、IFN-y、IL-17a、IL-6、IL-8和IL-12的水平,而TGF-β与IL-2水平在地西他滨治疗后显着升高。血清IL-1β、IL-4、IL-10和IL-13水平在治疗前后无显着差异。（6）转录组测序分析ITP患者地西他滨治疗后基因表达变化为了评估低剂量地西他滨对ITP患者基因表达的影响,我们对4例治疗有效和3例治疗无效ITP患者进行了转录组测序分析。结果显示,有效患者在地西他滨治疗后共有301个基因有显着表达差异。治疗无效患者在地西他滨治疗后有43个基因表达水平发生明显变化。根据KEGG分析,治疗有效患者的表达差异基因与IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、Th17细胞分化通路、Jak-STAT信号通路等相关。（7）低剂量地西他滨通过抑制STAT3调节Treg细胞Western blot分析ITP患者地西他滨治疗后PBMCs的蛋白水平变化发现,与治疗前相比,STAT3磷酸化水平明显降低。在体外培养中,ITP患者和健康对照组CD4+T细胞中Treg细胞比例在STAT3抑制剂+地西他滨组与STAT3抑制剂组无明显差异。在ITP小鼠研究中,STAT3抑制剂+地西他滨组的小鼠的血小板计数与STAT3抑制剂组的没有显着差异。研究结论:（1）低剂量地西他滨可以增加ITP患者PBMCs中Treg细胞的数量并增强Treg细胞的免疫抑制功能。（2）低剂量地西他滨通过调节脾脏Treg细胞从而显着提高ITP主动模型小鼠的血小板数目,恢复CD4+Th细胞亚群比例。（3）低剂量地西他滨恢复ITP患者的CD4+T细胞比例和Treg细胞抑制功能,并通过抑制STAT3调节ITP患者Treg数量和功能,从而恢复ITP患者的免疫耐受。第二部分:低剂量地西他滨在ITP中通过调节PD-1甲基化降低CTLs诱导的血小板凋亡研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种以血小板计数持续减低和出血为特征的获得性自身免疫性疾病。目前,ITP的发病机制尚未完全阐明,其中心学说为“免疫失耐受”,免疫异常介导机体对自身血小板表面抗原失耐受从而加速血小板的破坏,并导致巨核细胞的发育和成熟障碍,血小板生成减少,从而形成机体血小板持续减低的状态。在血小板自身抗体基础上,异常的T细胞免疫,特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTLs）在ITP的发病机制中发挥重要作用。研究发现,CTLs可以通过直接杀伤自身血小板和诱导血小板凋亡参与ITP的发病。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）是CD28/CTLA-4家族成员之一,主要表达在外周血活化的T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞和树突状细胞上。PD-1与其配体PD-L1结合,可以启动T细胞程序性死亡,在减少自身反应性T细胞增殖和降低CTLs对靶细胞的细胞毒性方面具有至关重要的作用。前期研究发现,ITP患者外周血单个核细胞（PBMCs）和CD4+T细胞中PD-1和PD-L1的表达减低,PD-L1-Fc重组融合蛋白通过激活PD-1/PD-L1通路增加了 ITP中T细胞的凋亡,抑制了 T细胞的激活和增殖。这些结果表明PD-1通路在ITP的发病机制中发挥重要作用,但是PD-1/PD-L1通路是否参与了 CTLs对血小板的杀伤尚无明确的研究。地西他滨是特异的DNA去甲基化药物（hypomethylating agent,HMA）,广泛应用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）。研究发现,低剂量地西他滨可以通过去甲基化作用促进巨核细胞成熟和血小板释放。此外,在治疗MDS的过程中,去甲基化药物可以导致PD-1 CpG岛去甲基化和PD-1表达增加。我们猜测低剂量地西他滨通过调节ITP病人的PD-1抑制CTLs细胞毒性,从而对ITP起到治疗作用。研究目的:（1）探究PD-1在ITP中的表达及甲基化水平及其在ITP发病中的作用机制。（2）探究PD-1/PD-L1通路在抑制CTLs毒性及恢复ITP免疫耐受中的作用。（3）探究低剂量地西他滨对PD-1甲基化和表达的调控作用,阐明地西他滨对CTLs杀伤血小板的影响以及对ITP的治疗价值。研究方法:（1）ITP患者及对照:分别收集符合诊断标准的ITP患者65例及年龄、性别匹配的健康对照者43例的外周血。（2）构建主动ITP小鼠模型;用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61KO）小鼠,再将后者的脾脏细胞输给辐照后的联合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficient,SCID）。（3）体外细胞培养:分离ITP患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）并分选CD8+T细胞。加入rh-IL-2、anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养。加入地西他滨、PD-L1-Fc或抗人PD-1抗体孵育72小时。（4）流式细胞术检测:通过流式细胞术检测CD4+T、CD8+T细胞和血小板表面PD-1和PD-L1的表达。（5）荧光定量PCR（q-PCR）:检测ITP患者和健康对照PD-1的mRNA表达水平。（6）CTL诱导的血小板凋亡检测:健康对照血小板与CD8+T细胞按照106/mL:105/mL的比例混合,加入rh-IL-2,anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养,体外共培养4小时。应用线粒体膜电位检测试剂盒（Mitochondria Staining Kit）检测血小板调亡。（7）DNA甲基化测序:检测PD-1基因启动子区甲基化水平。（8）蛋白免疫印记（Western blot）:检测ITP患者地西他滨处理后的CD8+T细胞PI3k/AKT通路的的变化。研究结果:（1）PD-1和PD-L1在ITP患者CD8+T细胞中表达降低ITP患者PBMCs中PD-1的mRNA表达水平与健康对照组无显着差异。流式分析发现ITP患者外周血中CD8+T细胞和CD4+T细胞上的PD-1及PD-L1的表达明显低于健康对照组。ITP患者血小板上PD-L1表达水平与健康对照组无差异。此外,通过相关性分析发现ITP患者CD8+T细胞上的PD-1和PD-L1表达与血小板计数无关。（2）PD-L1-Fc抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤在CD8+T细胞培养体系中加入PD-L1-Fc融合蛋白后,我们发现PD-L1-Fc融合蛋白可显着降低ITP患者CTLs介导的血小板凋亡。而PD-L1-FC自身对血小板的凋亡无明显作用。这些结果提示PD-L-Fc融合蛋白能显着抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤。（3）ITP患者CD8+T细胞中PD-1甲基化水平增高通过DNA甲基化测序,我们发现ITP患者的PD-1启动子CpG甲基化比例显着高于健康对照组。因此,ITP患者CD8+T细胞的低PD-1水平有可能由于CD8+T细胞中PD-1的基因启动子区的甲基化水平升高导致的。（4）低剂量地西他滨显着增加CD8+T细胞PD-1表达在CD8+T细胞培养体系中加入100nM地西他滨孵育72小时后,我们发现地西他滨显着提高了 ITP患者CD8+T细胞的PD-1表达。为了评估我们的体外结果在体内可重复性,我们建立了 ITP主动模型。在第21天和28天,地西他滨治疗组小鼠的血小板计数显着升高。与对照组相比,地西他滨处理ITP小鼠脾脏CD8+T细胞的PD-1表达水平升高。此外,ITP患者在接受地西他滨治疗后血小板计数显着增加,同时CD8+T细胞PD-1表达显着增加。（5）低剂量地西他滨显着降低ITP中PD-1启动子甲基化ITP患者的CD8+T细胞用100 nM地西他滨培养。DNA甲基化测序检测PD-1基因甲基化。与对照组相比,处理后的细胞甲基化CpG残基显着降低。（6）低剂量地西他滨有效抑制ITP中CTLs介导的血小板凋亡低剂量地西他滨处理的CTLs和血小板共培养体系中,CTLs介导的血小板凋亡显着减少。我们进一步检测了接受地西他滨治疗的ITP患者CTLs细胞毒性,发现在地西他滨给药12周后,CTLs介导的血小板凋亡明显降低。（7）低剂量地西他滨抑制PI3K和AKT的磷酸化Western blot检测100nM地西他滨培养的CD8+T细胞裂解液中总PI3K和AKT的表达水平,发现并无明显变化。然而,低剂量地西他滨显着下调了 PI3K和AKT的磷酸化水平。（8）阻断PD-1可部分抵消地西他滨对CTLs介导的血小板凋亡的抑制作用为了确定地西他滨的作用机制是否依赖于PD-1通路,我们进行了体外和体内的PD-1阻断试验。体外实验发现,CTLs介导的血小板凋亡在地西他滨+抗人PD-1组和对照组之间没有显着差异。在ITP小鼠中,地西他滨+抗鼠PD-1组的血小板计数与对照组小鼠没有明显差异。这些结果表明地西他滨对CTLs杀伤功能的抑制作用可部分被阻断PD-1所抵消。研究结论:（1）PD-1在CD8+T细胞的甲基化水平升高及表达降低在ITP的发病机制中起作用。通过激活PD-1/PD-L1通路可抑制CTLs介导的血小板的凋亡。（2）低剂量地西他滨能够恢复ITP患者CD8+T细胞PD-1的表达并降低CD8+T细胞PD-1启动子区甲基化水平。（3）低剂量地西他滨通过上调PD-1通路抑制CTLs介导的血小板的凋亡,恢复ITP患者免疫耐受。
叶壮[4]（2021）在《调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究》文中指出背景:调节性B细胞（Regulatory B cells,Bregs）是以负性调节功能为特征的B细胞亚群,具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用,参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式,亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。目的:（1）明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点,比较SLE患者中Bregs的功能变化,分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。（2）明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。（3）探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响,探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。方法:（1）选取新发初治的SLE患者（n=72）,同时选取年龄、性别匹配的健康对照,统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。（2）通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析,利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平,CBA技术测定Th细胞功能分子水平。（3）分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。（4）随访规范治疗的SLE患者,研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。（5）通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境,建立transwell共培养体系,研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。结果:（1）流式细胞术分析发现,SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低,TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3-CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现,SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关,IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。（2）SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低,IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。（3）体外细胞培养试验表明,SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hi Bregs。（4）SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高,血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高,IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关,BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。（5）SLE患者CD27+CD38-/lo MB、CD27+CD38hi PB和CD27-CD38hi TB的频率增高,CD27-CD38-/lonaive B细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38-/loMB、CD27-CD38-/lonaive B细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27-CD38-/lonaive B细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27-CD38hi TB细胞比例负相关。（6）临床指标相关性分析发现,SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关,IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。（7）与轻中度活动的SLE患者相比,重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。（8）与不伴有肾脏受累的患者相比,伴有狼疮性肾炎SLE患者的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例以及IL-35水平明显降低。（9）经激素及免疫抑制治疗后,IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD38hi Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞频率,IL-10、IL-35水平较基线升高。（10）Transwell共培养CD19+B细胞与CD4+T细胞实验发现,健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平,这种功能的发挥不完全依赖于细胞间的接触,但细胞间的接触可以强化这种抑制作用。健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞功能。IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs对Th细胞及其功能的抑制作用。SLE患者Bregs对健康人Th细胞的抑制作用受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复对Th1、Th17细胞水平及功能的抑制作用。Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。结论:（1）SLE患者外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38hi Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞比例减低,产生IL-35、TGF-β1功能减弱。Bregs分泌功能的发挥主要以CD19+CD24hiCD27+Bregs为主。（2）外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例、IL-35水平的降低可能与SLE患者合并LN有关。（3）SLE患者经有效治疗后,其外周血Bregs和IL-10、IL-35水平可部分恢复。（4）健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平及细胞功能,IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs的抑制作用。（5）SLE患者Bregs抑制功能受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复功能。（6）Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。
田苗苗[5]（2021）在《ATP-柠檬酸裂解酶在iTreg分化过程中的作用及机制研究》文中指出诱导型调节性T细胞（Inducible regulatory T cells,iTreg）是由激活的CD4+T细胞（Th0）在细胞因子TGFβ1的作用下分化而来,通过发挥独特的免疫抑制作用在维持机体的免疫平衡中至关重要。iTreg数量减少或功能缺陷可引起多种炎症性疾病,如炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases,IBD）。虽然iTreg是由Th0分化而来,但二者的代谢表型却有着显着的差异。其中,Th0偏好脂肪酸合成（Fatty acid synthesis,FAS）;而iTreg偏好脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation,FAO）。因FAS和FAO是两个相反的代谢途径,在同一时刻通常只能以其中一种为主,所以上述的代谢偏好就意味着在Th0分化为iTreg的过程中发生了脂肪酸代谢的重编程,即由FAS转变为FAO。目前已有研究表明,使用FAS途径中关键酶抑制剂的处理,可显着提高iTreg分化。这表明,降低FAS途径对iTreg分化非常重要,然而其发生机制并不清楚。考虑到代谢途径的旺盛程度主要取决于代谢酶的活性变化,本研究拟首先分析Th0向iTreg分化过程中FAS途径关键酶的活性,筛选出活性发生下降的代谢酶;其次,分析该代谢酶的活性变化对iTreg分化及对代谢表型的影响。在此基础上,深入解析在iTreg分化过程中该代谢酶活性下降的调节机制。最后,利用小鼠炎症模型,系统评估基于对该代谢酶活性进行调节的干预对个体炎症的缓解功效。本研究首先分析了Th0向iTreg分化过程中FAS途径关键酶的活性变化。关键酶包括ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase,ACLY）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Co A carboxylase,ACC）和脂肪酸合酶（Fatty acid synthetase,FASN）。结果显示,与Th0相比,iTreg中只有ACLY的活性呈显着下降。当过表达ACLY使细胞维持ACLY活性不发生下降时发现,iTreg分化受到了显着抑制;而通过干涉或使用抑制剂处理进一步抑制ACLY活性时发现,iTreg分化得到进一步增加。以上结果表明,iTreg分化依赖于ACLY的活性下降。其次,探究了ACLY活性下降促进iTreg分化的分子机制。[U-13C]葡萄糖示踪代谢流分析结果显示,ACLY活性下降显着减弱了FAS。当回补FAS途径关键中间产物丙二酰Co A时,因ACLY活性下降引起的iTreg分化增加被显着抑制。由于丙二酰Co A是FAO关键酶肉碱棕榈酰转移酶1（Carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1）的生理抑制剂,可显着抑制CPT1活性和FAO效率。因此,以上结果提示,ACLY活性下降很可能是通过降低丙二酰Co A水平,从而解除其对FAO的生理性抑制,促进了iTreg分化。接下来,通过分析ACLY活性下降对CPT1活性及FAO效率的影响,以及通过干涉CPT1可以显着抑制因ACLY活性下降引起的iTreg分化增加等实验,证实了上述猜测,即ACLY活性下降通过“丙二酰Co A-CPT1-FAO”轴促进iTreg分化。再次,探究了在iTreg分化过程中ACLY活性下降的调节机制。对ACLY的转录水平、蛋白水平以及翻译后修饰水平的分析结果显示,ACLY活性下降是由于其蛋白水平下降所致。对ACLY蛋白合成和降解的分析结果显示,ACLY蛋白水平的下降是由于TGFβ1介导的泛素连接酶CUL3-KLHL25与ACLY结合,进而促进ACLY的泛素化降解。后续的系列实验表明,特异性敲除T细胞CUL3,可废除ACLY的泛素化,进而降低iTreg分化;在此基础上的对ACLY的干涉处理,可消除因CUL3缺陷导致的iTreg分化下降。以上结果表明,TGFβ1是通过促进CUL3-KLHL25介导的ACLY泛素化降解,从而提高iTreg分化。接下来,对上述研究所揭示的分子机制在人的T细胞中进行了验证,发现人iTreg分化过程中存在相同的调节机制。最后,评估了以ACLY活性下降为作用靶点的干预对小鼠炎症的缓解作用。首先建立了实验性IBD小鼠模型和过敏性腹泻小鼠模型,再通过将经不同处理产生的iTreg细胞群过继到炎症小鼠体内。实验结果显示,以ACLY活性下降为作用靶点的细胞过继处理或使用ACLY的抑制剂处理,均可有效地缓解小鼠炎症的进程,且对炎症进程的缓解作用依赖于Th0向iTreg分化的程度。综上所述,本研究揭示了TGFβ1促进iTreg分化的新机制。即TGFβ1通过促进泛素连接酶CUL3-KLHL25介导的ACLY泛素化,导致ACLY降解,进而降低丙二酰Co A水平,解除了对FAO的抑制,实现了在Th0分化为iTreg的过程中发生的FAS向FAO的转变,促进了iTreg分化。本研究不仅从细胞代谢维度揭示了TGFβ1促进iTreg分化的新机制,而且为将来基于iTreg分化的免疫治疗策略提供了新的分子靶点。
王劲智[6]（2021）在《原发性肾病综合征与牛奶蛋白过敏中调节性T细胞应答异常及DOCK8缺陷致B细胞早期活化异常的机制研究》文中研究表明目的:原发性肾病综合征（Primary Nephrotic Syndrome,PNS）是儿童常见的原发肾小球疾病,也是引起我国儿童终末期肾病的重要疾病之一。由于其病因的复杂性及异质性,目前对于该病发病机制的认识仍十分有限。近年来的相关研究结果提示免疫功能紊乱及免疫炎症是PNS发病的重要机制,多种固有及适应性免疫应答异常可能参与PNS的发生发展,其中T细胞相关免疫应答失调的作用近年来越来越受到关注,被认为是介导PNS发生发展的核心环节之一。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞的亚群之一,以转录因子Foxp3表达为标志,具有强大的免疫抑制能力,在机体外周免疫耐受及免疫稳态的建立与维持中发挥核心作用。前期研究显示,PNS患儿急性期外周血中Treg水平下调,提示Treg应答异常参与PNS发生发展。同时既往的研究显示,在多种自身免疫、免疫紊乱及相关炎症条件下,存在Treg细胞谱系稳定性,可塑性及功能异常。但是,目前在肾病综合征、免疫相关肾病及相关动物模型中尚缺乏相关研究报道。故本研究目的主要为明确PNS条件下,Treg细胞是否存在谱系稳定性,可塑性及功能异常,并分析导致以上异常的潜在分子机制。以期加深对于PNS免疫发病机制的认识,同时为临床干预寻找新的靶标。方法:收集重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收治的初诊PNS患儿急性期外周血标本（PNS组）,同时在本院体检中心收集年龄性别相匹配的健康儿童外周血标本作为对照（HC组）:通过流式细胞术,分析Treg细胞相关免疫表型;通过分离纯化外周血Treg细胞、体外刺激其活化及增殖,分析Treg细胞稳定性及可塑性;通过分离纯化外周血Treg细胞及Tresponder细胞,体外共培养,分析Treg细胞的免疫抑制能力;通过分离纯化外周血Treg细胞,基因表达谱及生物信息学分析,磷酸化流式等检测,解析导致PNS条件下Treg异常的潜在信号通路及分子机制;通过分离纯化外周血Treg细胞,特异性抑制剂干预及体外功能、稳定性、可塑性实验,进一步明确相关分子机制在PNS-Treg细胞稳定性,可塑性及功能异常中的关键作用。结果:（1）PNS患儿外周血中Treg细胞谱系核心转录因子Foxp3表达稳定性显着受损,表现为PNS组中CD25+Foxp3-细胞比例显着升高,Treg细胞中Foxp3表达水平显着下降,同时体外稳定性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中存在Foxp3表达的显着丢失;（2）PNS患儿外周血中Treg细胞表现出显着的可塑性异常,表现为表达IFN-γ、T-bet、及CXCR3的Th1样Treg细胞水平显着升高,同时体外可塑性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中,伴随Foxp3表达的下调,Treg细胞显着向分泌IFN-γ的Th1样Treg细胞转化,甚至完全转分化为Th1细胞;（3）PNS患儿外周血中Treg细胞存在显着的功能失调,表现为对Tresponder细胞体外增殖的抑制能力显着减弱;（4）Treg细胞的以上异常应答,与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关,表现为与Treg及conventional T细胞活化及耗竭相关的分子标志显着上调,同时基因表达谱及生信分析也显示大量活化及耗竭相关的基因集在PNS-Treg细胞中显着富集;（5）介导T细胞活化的TCR信号,及其下游的PI3K-AKT、MAPK信号通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着富集,提示以上信号通路的异常活化,参与PNS中过度活化诱导的Treg耗竭。（6）作为PI3K-AKT、MAPK信号通路下游的共同调控靶点,m TORC1的活化水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着上调。（7）m TORC1诱导的下游转录因子,c-Myc及SREBPs的蛋白表达水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着上调,且受以上转录因子调控的靶基因集亦在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着富集,提示m TORC1-c-Myc/SREBPs可能是介导PNS条件下过度活化诱导的Treg耗竭及相关免疫应答异常的关键下游环节;（8）特异性抑制剂干预m TORC1、c-Myc、及SREBPs可显着恢复PNS-Treg细胞的体外抑制能力,下调活化诱导的耗竭标志PD-1的表达。显着改善PNS-Treg细胞体外增殖中的Foxp3稳定性异常,并抑制其IFN-γ的分泌,即减弱PNS-Treg的可塑性异常;（9）基因表达谱及生物信息学分析提示,多种生物合成以及生物能量产生相关的代谢通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着富集,提示这些异常活跃的代谢程序在活化诱导的PNS-Treg耗竭过程中可能发挥关键作用。结论:以上研究结果提示,PNS病理条件下,外周血Treg细胞表现出明显的功能、稳定性及可塑性异常。PNS-Treg细胞以上应答异常与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关。TCR介导的m TORC1信号异常激活在此过度活化诱导的耗竭过程中发挥不可或缺的作用。同时,此过程中可能伴随有多种生物合成及生物能量产生相关的代谢通路的异常活跃。目的:将牛奶蛋白诱导的过敏性直肠结肠炎（cow’milk protein induced FPIAP,CM-FPIAP）婴儿的肠道菌群移植给无菌小鼠,通过检测受体小鼠肠道内菌群结构及免疫微环境的变化,研究非IgE介导型牛奶蛋白过敏中肠道菌群失调对调节性T细胞介导的免疫耐受和免疫稳态的影响。方法:收集明确诊断为牛奶蛋白诱导的过敏性直肠结肠炎婴儿（I-FPIAP组）及健康对照婴儿（I-HC组）的粪便标本,分别移植给无菌小鼠（M-FPIAP组和M-HC组）。两周后通过16S r RNA基因测序确认供体婴儿的菌群结构在受体小鼠肠道内的保持情况;通过流式细胞术分析受体小鼠肠道Treg细胞应答相关的免疫表型及肠道免疫稳态相关指标,并通过分离纯化及体外共培养技术分析受体小鼠肠道Treg细胞的免疫抑制功能;最后通过相关性分析,寻找CM-FPIAP条件下,可能影响Treg细胞免疫应答及免疫稳态的菌属。结果:1.菌群定植2周后,供体婴儿肠道菌群的主体结构在受体小鼠肠道内较能保持;2.M-FPIAP组小鼠结肠总Treg细胞、p Treg细胞、Ro R-γt+Treg细胞水平显着下降,Treg细胞的增殖及凋亡指标无显着差异;3.M-FPIAP组小鼠结肠Treg细胞表达ICOS、CTLA4的量显着下降,Treg细胞活化水平显着下调,抑制性细胞因子IL-10的分泌水平明显减少,同时对Responder T细胞体外增殖的抑制能力显着减弱;4.M-FPIAP组小鼠结肠T细胞活化水平显着提高,且主要表现为Th2型免疫应答;5.相关性分析显示,Raoultella及Clostridium sensu stricto两个菌属的丰度都与结肠Treg水平及功能呈高度负相关。结论:1.作为非IgE介导型CMPA的主要临床类型,CM-FPIAP中的菌群失调会显着地破坏肠道Treg细胞的发育及功能,影响Treg细胞参与维持的肠道免疫耐受和免疫稳态。2.Raoultella及Clostridium sensu stricto的丰度增加对肠道Treg细胞发育及功能的异常可能产生关键影响。目的:以Dock8缺陷病人外周血单个核细胞及Dock8基因敲除小鼠为研究对象,初步探讨Dock8这一鸟苷酸交换因子缺乏对B细胞活化早期关键分子事件及记忆B细胞活化的影响,以期深化对于Dock8缺陷病人体液免疫异常发病机制的理解与认识。方法:分离及纯化Dock8缺陷病人外周血及Dock8基因敲除小鼠脾脏B细胞,通过可溶性抗原-磷酸化流式系统及膜相关抗原-TIRFm系统,分析Dock8缺陷对总B细胞或记忆性B细胞（CD19+CD27+）早期活化相关信号转导、BCR动力学、及细胞形态学的影响;通过流式细胞术分析Dock8缺陷对体外活化所诱导的初始B细胞表型转变的影响;通过流式细胞术,RT-PCR,分析Dock8缺陷对B细胞活化共受体CD19及Dock8下游效应分子WASP表达的影响。结果:相较于野生型小鼠,Dock8基因敲除小鼠B细胞中早期活化关键信号分子的磷酸化水平（p Btk,p CD19）,及BCR信号相关蛋白酪氨酸磷酸化总体水平p Y,在活化后不同时间点均显着下调,反应Dock8敲除小鼠B细胞早期活化显着受损;体外活化后,Dock8下游效应分子WASP的磷酸化水平（p WASP）在Dock8敲除小鼠B细胞中亦显着下调;Dock8缺陷小鼠B细胞中共受体CD19的转录水平显着下调;Dock8缺陷小鼠B细胞中WASP的转录及蛋白水平亦显着下调。与健康对照相比,Dock8缺陷病人外周血B细胞体外活化后,p CD19、p Btk、p Y、p WASP及肌动蛋白F-actin水平均显着下调,这与小鼠模型观察到的结果呈现一致性,提示Dock8缺陷病人外周B细胞早期活化显着受损;同时,TIRFm结果显示,膜相关抗原激活后,Dock8缺陷病人外周血记忆B细胞早期活化亦显着受损,表现为:记忆B细胞与膜相关抗原接触区域内BCR聚集簇及B细胞扩张受限,BCR信号分子的招募及活化（p Y,p Btk）受损;磷酸化流式也显示,可溶性抗原激活后,Dock8缺陷病人外周记忆B细胞中Erk及Btk的磷酸化水平显着下调,进一步证实其早期活化受损;同时,体外活化诱导的初始B细胞向记忆B细胞表型转变,在Dock8缺陷病人中亦显着受限;流式结果显示Dock8缺陷病人外周记忆B细胞中CD19表达显着下调。结论:以上结果显示Dock8缺陷将显着损害总B细胞及记忆B细胞的早期激活;且以上效应可能是通过抑制共受体CD19或Dock8下游效应分子WASP的表达及活化得以实现。
郑炜东[7]（2021）在《麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究》文中研究表明目的:本研究使用卵清蛋白（OVA）复制过敏性哮喘模型大鼠,验证麻杏石甘汤的抗过敏作用,进而探究麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠辅助T淋巴细胞Th2、Th9、Th17的调控作用和主要调控细胞;并使用体外培养外周血淋巴细胞的方式探究麻杏石甘汤干预过敏性哮喘的作用靶点;探讨麻杏石甘汤干预过敏性哮喘细胞免疫的主要机制,为阐明麻杏石甘汤抗过敏性哮喘和作用机理提供实验依据。材料与方法:1.麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠的抗过敏作用观察。观察麻杏石甘汤对过敏性模型大鼠血清Ig E,肺组织病理（HE染色）,腹腔肥大细胞脱颗粒的调控作用。采用OVA致敏、激发的方法复制过敏哮喘模型大鼠,然后给予麻杏石甘汤经口灌胃干预,采用ELISA法检测大鼠血清中Ig E,HE染色法观察肺组织病理,腹腔肥大细胞脱颗粒实验观察麻杏石甘汤对肥大细胞膜的稳定作用。2.麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠Th2、Th9、Th17的调控作用观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠血清IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17含量的影响。观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9表达的影响。观察麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠外周血淋巴细胞Th2、Th9、Th17比例的影响。采用OVA致敏、激发的方法复制过敏性哮喘模型大鼠,然后给予麻杏石甘汤经口灌胃干预,采用ELISA法检测大鼠血清IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17的含量。采用Western-Blot及免疫组化法检测大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9的表达。采用流式细胞法检测大鼠外周血淋巴细胞Th2、Th9、Th17的比例。3.麻杏石甘汤调控CD4+T细胞Th2、Th9、Th17亚型的作用采用体外培养大鼠外周血淋巴细胞,使用细胞因子和含药血清体外干预CD4+T细胞发育,采用免疫荧光法和ELISA法观察麻杏石甘汤对PBMC中Th2、Th9、Th17阳性率和细胞因子含量,阐述麻杏石甘汤调控Th2、Th9、Th17的抗过敏机制。结果:1.动物体内实验部分1.1采用腹腔注射OVA后再行雾化吸入OVA可成功诱导大鼠过敏性哮喘模型。1.2麻杏石甘汤可明显改改善造模大鼠的一般状态,麻杏石甘组大鼠肺组织HE染色气管黏膜完整,未断裂,支气管黏膜慢性炎症较轻,黏膜增生突起、杯状细胞增生较轻,肺气肿及肺间质性炎性改变较轻,周围存在少数肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润。说明麻杏石甘汤可整体改善大鼠过敏性哮喘肺组织病变程度。1.3在肥大细胞脱颗粒检测中,西药对照组、麻杏石甘组大鼠肥大细胞计数、脱颗粒的肥大细胞计数、脱颗粒率均明显降低（p<0.05）;与西药对照组比较,麻杏石甘组大鼠肥大细胞计数、脱颗粒的肥大细胞计数、脱颗粒率差异无统计学意义（p>0.05）。提示麻杏石甘组可降低肥大细胞在肺组织中的募集、减少肥大细胞脱颗粒,缓解气道炎症。且与西药效果相当。1.4 OVA造模大鼠血清中Ig E含量明显增高,空白组大鼠血清Ig E未见明显变化与文献报道结果一致。其余两组经药物干预后与模型对照组比较,麻杏石甘组和西药对照组中大鼠血清Ig E水平均明显下调（p<0.05）。虽然组间差异无统计学意义（p>0.05）,但对比数据,麻杏石甘组对Ig E的调控效果略优于西药对照组。推测示中药复方颗粒剂可能是通过抑制Ig E,增强抗过敏作用,从而减轻气道炎症反应。1.5采用流式细胞术和ELISA分别测定辅助T淋巴细胞比例和细胞因子含量。结果显示与空白对照组相比,模型对照组的大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达明显上调（p<0.05）,Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞比例均增大。说明Th2、Th9、Th17及其主要细胞因子在支气管哮喘发病过程中起重要作用,与文献报道一致。实验还发现Th2细胞因子（IL-4,IL-5）上调趋势明显同时流式检测Th2细胞阳性率最高,证实了Th2细胞在哮喘的发展过程中占主导地位。经过药物治疗后,与模型对照组比较,麻杏石甘组和西药对照组大鼠肺组织中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达均有不同程度的下调（p<0.05）,麻杏石甘组指标皆优于西药对照组且麻杏石甘组中IL-4、TGF-β、IL-9表达下调较为明显（p<0.05）,尤其在流式检测中,麻杏石甘组Th9细胞阳性率大体与空白对照组相当（p>0.05）且明显低于西药对照组（p<0.05）,证明麻杏石甘汤在调控Th2、Th9、Th17方面都有很好的效果,但麻杏石甘汤最可能是通过调控Th9细胞来干预过敏性哮喘。1.6进一步对肺组织中与Th9分化发育有关的IL-4、TGF-β和Th9分泌的特异性细胞因子IL-9进行研究。IHC结果提示在上皮细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、平滑肌细胞、杯状细胞、肥大细胞中可检测到IL-4、TGF-β、IL-9,western blot结果表明麻杏石甘汤可下调IL-4、TGF-β、IL-9表达（p<0.05）。横向观察IHC、western blot及ELISA法所测得的各组数值,显示出麻杏石甘汤可显着下调IL-9的表达（p<0.05）,同时抑制IL-4和TGF-β表达（p<0.05）,说明麻杏石甘汤可能同时抑制CD4+T细胞向Th9细胞分化和Th2细胞向Th9细胞的转化。推测麻杏石甘汤可能是通过调控细胞因子来干预Th9细胞的发育与分化以达到治疗过敏性哮喘的目的。2.动物体外实验部分2.1使用Ficoll-paque（菲科帕克）成功提取PBMC。2.2通过免疫荧光法证明Th9细胞的分化与IL-4和TGF-β协同作用密不可分,含有麻杏石甘汤成分的血清能够有效调控CD4+T细胞增殖能力。2.3麻杏石甘汤有效调控PBMC中IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17表达在检测IL-4时,细胞因子对照组和含药血清组中IL-4含量均比空白对照组明显增加（p<0.05）,其中IL-4组增加最明显（p<0.05）,含药血清组增加最少（p<0.05）。说明在IL-4高表达的情况下,原始CD4+T细胞可能向Th2细胞分化,当同时存在TGF-β表达时CD4+T细胞可能向非Th2细胞分化,麻杏石甘汤可能具有抑制Th2细胞分化的作用。在检测TGF-β时,IL-4组中TGF-β含量是细胞因子组中最低的（p<0.05）。含药血清组TGF-β含量较细胞因子组降低（p<0.05）,证明麻杏石甘汤可能具有调控TGF-β表达的作用。在检测IL-5含量时,IL-4组和IL-4+TGF-β组无统计学差异且TGF-β组含量很少（p<0.05）,证明IL-5主要由Th2细胞分泌,而含药血清组IL-5含量与TGF-β组基本相当（p>0.05）,证明麻杏石甘汤可能具有抑制IL-5表达的作用。在检测IL-10时,IL-4+TGF-β组中IL-10含量较余下细胞因子组明显增高（p<0.05）,IL-4组和TGF-β组IL-10含量无统计学差异（p>0.05）,上述结果与文献一致。含药血清组IL-10含量明显降低,证明麻杏石甘汤可能具有干预Th9细胞表达IL-10的作用。为了进一步验证麻杏石甘汤对Th9细胞的干预能力,我们检验Th9最主要细胞因子IL-9在各组中的含量,结果显示IL-4+TGF-β组的IL-9含量为细胞因子组中最高（p<0.05）,含药血清组IL-9含量明显下降（p<0.05）,进一步证明麻杏石甘汤可通过干预细胞因子IL-9调控Th9细胞。最后在检测IL-17时,TGF-β组和IL-4+TGF-β组中IL-17高表达（p<0.05）,证明TGF-β是Th17细胞分化的必要细胞因子,含药血清组IL-17表达降低（p<0.05）,说明麻杏石甘汤可能具有抑制IL-17表达的作用。结论:1.通过动物体内实验,揭示麻杏石甘汤可降低哮喘大鼠肥大细胞脱颗粒率,使大鼠血清中Ig E的含量降低,发挥治疗气道炎症的作用;麻杏石甘汤还可通过干预IL-4、TGF-β、IL-9、IL-5、IL-10、IL-17等表达来调控Th2、Th9、Th17细胞以达到控制哮喘的目的。同时麻杏石甘汤可以显着下调IL-9、IL-4和TGF-β的表达,推测麻杏石甘汤可能主要通过干预Th9细胞的分化与IL-9的分泌来达到抗哮喘的作用。2.通过动物体外实验,进一步验证了IL-4和TGF-β对于Th9细胞分化起决定性作用;麻杏石甘汤能够有效抑制CD4+T细胞中Th2、Th9、Th17增殖能力,其中抑制Th9细胞增殖能力最强;进一步证明麻杏石甘汤能够有效干预Th9细胞的分化和相应细胞因子的表达来发挥抗哮喘作用。
王亚苹[8]（2021）在《树突状细胞表面GITRL在哮喘气道炎症和气道高反应性中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分哮喘小鼠肺组织和树突状细胞表面GITRL的表达变化目的:观察哮喘小鼠肺组织和树突状细胞表面GITRL的表达变化,了解GITRL和哮喘发病的相关性。方法:将C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组和屋尘螨（HDM）激发组,用HDM滴鼻致敏和激发建立小鼠哮喘模型。在最后一次激发24小时后,用有创肺功能仪检测各组小鼠的气道高反应性,并收取血清、肺组织及支气管肺泡灌洗液（BALF）,ELISA检测血清总Ig E含量,HE染色观察肺部炎症情况,细胞计数仪计数BALF细胞总数,瑞氏染色计数嗜酸性粒细胞比例。Q-PCR、Western blot和免疫组化检测小鼠肺组织中GITRL m RNA和蛋白表达情况。流式细胞术检测小鼠肺组织中树突状细胞表面GITRL的表达。结果:（1）有创肺功能及肺组织HE染色结果显示,HDM激发组小鼠气道高反应性和肺部炎症均较生理盐水组明显增加。ELISA和BALF细胞计数结果显示,HDM激发组血清Ig E含量、BALF细胞总数和嗜酸性粒细胞的绝对计数均较生理盐水组明显增加。以上说明HDM哮喘模型建立成功;（2）Q-PCR、Western blot和免疫组化结果均显示,HDM激发组小鼠肺组织中GITRL m RNA和蛋白表达水平均较生理盐水组明显升高;（3）流式结果显示,HDM激发组小鼠肺中树突状细胞表面的GITRL分子比例增加。结论:哮喘中GITRL mRNA和蛋白水平较对照组均明显升高,且树突状细胞表面GITRL高表达,提示树突状细胞表面的GITRL可能在哮喘发病中发挥作用。第二部分敲低GITRL对小鼠哮喘表型及CD4+T细胞分化的影响目的:观察GITRL在哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性中的作用,以及对肺部CD4+T细胞分化的影响。方法:构建腺相关病毒AAV-GFP和AAV-shGITRL,经鼻途径给予小鼠。转染2周后,免疫荧光和Western blot观察肺部GITRL敲低效率,流式细胞术检测树突状细胞表面GITRL敲低效果,并用转染后的小鼠建立HDM哮喘模型。最后一次HDM激发24小时后,有创肺功能仪检测小鼠的气道高反应性,ELISA检测血清总Ig E含量,HE染色观察肺部炎症情况并进行炎症评分,细胞计数仪计数BALF细胞总数,瑞氏染色计数嗜酸性粒细胞比例。流式细胞术检测小鼠肺部Th1、Th2、Treg和Th17细胞比例。结果:（1）免疫荧光及Western blot结果显示,AAV-shGITRL组小鼠肺部GITRL蛋白水平较AAV-GFP组明显降低。流式结果显示,HDM激发的AAV-shGITRL组小鼠肺部树突状细胞表面GITRL水平较HDM激发的AAV-GFP组明显降低;（2）HDM激发的AAV-shGITRL组小鼠气道高反应性及肺部炎症均较HDM激发的AAV-GFP组明显减轻,且血清Ig E含量、BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞绝对计数较HDM激发的AAV-GFP组明显减少;（3）流式结果显示,与生理盐水组小鼠相比,HDM激发组小鼠肺中Treg细胞的比例显着降低,Th2和Th17细胞比例增加。然而,与HDM激发的AAV-GFP组小鼠相比,HDM激发的AAV-shGITRL组小鼠肺部Treg细胞的比例增加,Th2和Th17细胞的比例显着减少。各组Th1细胞比例无明显差异。结论:哮喘中小鼠肺部Th1/Th2和Th17/Treg细胞处于失衡状态,敲低肺部和树突状细胞表面的GITRL后,可显着改善哮喘小鼠气道高反应性和肺部炎症,可能与调节CD4+T细胞分化并恢复Th1/Th2和Th17/Treg细胞平衡有关。第三部分BMDCs表面GITRL对CD4+T细胞分化的影响目的:体外观察小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs）表面GITRL对CD4+T细胞分化的影响。方法:（1）体外分离培养小鼠BMDCs,用流式细胞术检测细胞的纯度。分别用PBS或HDM刺激BMDCs 24h,Western blot、免疫荧光和流式细胞术检测BMDCs表面GITRL蛋白水平变化;（2）用慢病毒LV-GFP和LV-shGITRL转染BMDCs,用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,并用Western blot、Q-PCR和免疫荧光验证GITRL敲低效果;（3）在PBS或HDM刺激下,将BMDCs与脾细胞进行共培养,流式细胞术检测Th1、Th2、Treg和Th17细胞比例,并用Q-PCR检测Foxp3、GATA3、RORγt和T-bet m RNA水平;（4）分别用anti-CD3或anti-CD3和GITRL直接刺激脾细胞48h,流式细胞术检测Th1、Th2、Treg和Th17细胞比例,并用Q-PCR检测Foxp3、GATA3、RORγt和T-bet m RNA水平。结果:（1）体外培养的BMDCs纯度大于80%。Western blot、免疫荧光和流式结果显示,HDM刺激后BMDCs表面GITRL蛋白表达较PBS组明显增加;（2）荧光显微镜及流式结果显示,慢病毒转染后GFP阳性细胞的比例约为50%。Western blot、Q-PCR和免疫荧光显示,与LV-GFP组相比,LV-shGITRL组GITRL蛋白和m RNA水平下降约50%;（3）流式结果显示,与PBS处理组相比,HDM处理组中Treg细胞比例显着降低,Th2和Th17细胞的比例明显增加。然而,在HDM刺激下,与LV-GFP组相比,LV-GITRL组Treg细胞比例明显增加,Th2和Th17细胞比例明显下降。各组Th1细胞比例无明显差异。Q-PCR结果显示,与PBS处理组相比,HDM处理组中Foxp3 m RNA显着降低,而GATA3和RORγt m RNA明显增加。敲低GITRL后,Foxp3 m RNA显着增加,GATA3和RORγt m RNA明显降低。各组T-bet m RNA无显着性差异;（4）流式结果显示,与单独用anti-CD3处理的细胞相比,anti-CD3和GITRL联合刺激的细胞中Treg细胞比例显着降低,Th2和Th17细胞的比例升高,Th1细胞比例无显着差异。Q-PCR结果显示,在GITRL刺激下,Foxp3 m RNA表达显着降低,而GATA3和RORγt的m RNA表达增加,T-bet m RNA无明显变化。结论:HDM刺激可增加BMDCs表面GITRL的表达;BMDCs表面的GITRL可能具有调节CD4+T细胞分化的作用,并在一定程度上促成了Th1/Th2和Th17/Treg细胞的失衡;敲低BMDCs表面的GITRL后,可以部分恢复Th1/Th2和Th17/Treg细胞的平衡;体外GITRL刺激可抑制Treg细胞的分化,促进Th2和Th17细胞的分化。
杨萍萍[9]（2021）在《基于RNA-seq技术的高同型半胱氨酸血症和野生型小鼠的Ly6C单核细胞亚群的免疫学特性与转录调控机制研究》文中研究指明研究背景:单核细胞是骨髓起源的单核吞噬细胞,在先天免疫应答中起重要作用,是组织慢性炎症的主要免疫细胞群。根据细胞表面标记物CD14和CD16的表达,可将人单核细胞分为三个亚群:CD14++CD16-经典型单核细胞、CD14++CD16+中间型单核细胞和CD14+CD16++非经典型单核细胞。基于表面标记物Ly6C的表达水平可将鼠单核细胞分为三个亚群:Ly6Chigh、Ly6Cmiddle和Ly6Clow单核细胞亚群。鼠Ly6Chigh和Ly6Cmiddle单核细胞亚群具有促炎功能,与人类CD14++CD16+中间型单核细胞相对应。鼠Ly6Clow单核细胞具有巡逻和抗炎功能,类似于人CD14+CD16++非经典和CD14++CD16-经典单核细胞。目前单核细胞亚群分化和转录调控的分子机制仍不清晰,有待进一步阐明。Ly6Chigh单核细胞具有较强的可塑性,可根据需要募集到组织中以补充巨噬细胞和树突状细胞。而单核细胞可塑性和亚群分化的分子机制尚不清楚。高同型半胱氨酸血症（HHcy）是心血管、糖尿病和阿尔茨海默氏病的独立危险因素。HHcy可诱导Ly6Chigh炎性单核细胞亚群分化,从而导致组织炎性反应,加速动脉硬化和慢性肾脏疾病的进展。HHcy对患者单核细胞亚群分化的影响将是未来临床研究的热点话题。进一步研究HHcy诱导的单核细胞亚群分化的调节机制可为临床治疗提供新的治疗靶标。研究目的:这项研究旨在通过RNA测序技术以及综合的生物信息学分析系统研究HHcy小鼠和野生型小鼠中Ly6Chigh和Ly6Clow单核细胞亚群中重要的免疫学相关基因的m RNA表达谱,并建立单核细胞亚群分化的分子途径和转录调控信号传导模型。研究方法:通过流式细胞荧光分选仪从野生型小鼠和HHcy(Tg-h CBS+Cbs-/-)小鼠的外周血中分离Ly6Chigh和Ly6Clow单核细胞并提取RNA进行RNA测序（RNA-seq）。通过使用系统全面的生物信息学方法分析4对比较组:野生型小鼠中Ly6Chigh单核细胞比Ly6Clow单核细胞,HHcy小鼠中Ly6Chigh单核细胞比Ly6Clow单核细胞,HHcy小鼠Ly6Chigh单核细胞比野生型小鼠Ly6Chigh单核细胞,HHcy小鼠Ly6Clow单核细胞比野生型小鼠Ly6Clow单核细胞的转录组学数据。我们分析了转录因子和4组免疫学相关基因集（分泌蛋白组、细胞因子、表面标志物和免疫检查点）和3组免疫细胞谱系特异性基因（单细胞RNA-seq筛选出的免疫细胞签名基因、细胞谱系转录因子和细胞表面标记分子）的表达谱,并进一步探索单核细胞亚群的免疫学特征和转录调控机制。研究结果:第一部分:（1）野生型小鼠Ly6Chigh单核细胞较野生型Ly6Clow单核细胞共筛选出3064个显着差异表达基因;（2）在野生型小鼠中,Ly6Chigh单核细胞炎症信号通路活化,而Ly6Clow单核细胞显示出淋巴细胞相关的免疫信号通路活化;（3）野生型小鼠Ly6Chigh单核细胞亚群中鉴定出9个上调的转录因子（Cebpa、Cebpd、Cebpe、Spi1、Ifi16、Irf5/7和Stat1/2）和4个下调的转录因子（Tbx21、Pax5、Ikzf3和Sp110）调控靶向免疫学相关基因;（4）建立了单核细胞亚群分子信号传导模型,阐述了Ly6Chigh与Ly6Clow单核细胞亚群分化的转录调控机制。第二部分:（1）HHcy小鼠Ly6Chigh单核细胞比HHcy小鼠Ly6Clow单核细胞共存在3605个显着差异表达基因;（2）在HHcy小鼠中Ly6Chigh单核细胞中炎症信号通路活化,而Ly6Clow单核细胞中淋巴细胞相关免疫信号通路活化。（3）HHcy小鼠Ly6Chigh单核细胞亚群鉴定出4个上调（Cebpa、Cebpe、Irf7和Trps1）和6个下调（Egr2、Foxm1、Myb、Pax5、Spib和Tbx21）的显着差异表达的转录因子调控靶向免疫学相关基因;（4）在野生型小鼠和HHcy小鼠中,Ly6Chigh单核细胞下调共刺激免疫检查点受体（CD2、GITR和TIM1）诱导的免疫细胞增殖和上调共刺激免疫检查点配体（LIGHT和SEMA4A）诱导的抗原启动和免疫细胞分化;（5）在野生型小鼠和HHcy小鼠中,Ly6Chigh单核细胞均高表达巨噬细胞谱系转录因子和细胞表面标记物,而Ly6Clow单核细胞高表达淋巴细胞谱系转录因子和细胞表面标记物。第三部分:（1）HHcy小鼠Ly6Chigh单核细胞比野生型小鼠Ly6Chigh单核细胞共筛选出691个显着差异表达基因,而HHcy小鼠Ly6Clow单核细胞较野生型小鼠Ly6Clow单核细胞共存在567个显着差异表达基因;（2）HHcy在Ly6Clow单核细胞中抑制代谢相关信号通路,而在Ly6Chigh中激活自然杀伤细胞信号通路;（3）HHcy在Ly6Chigh单核细胞中显着上调转录因子Ets1和Tbx21,在Ly6Clow单核细胞中上调转录因子Irf7和Fos;（4）HHcy下调Ly6Chigh单核细胞共抑制免疫检查点配体PD-L1/2,上调Ly6Clow单核细胞中共刺激免疫检查点受体DR3和ICOS;（5）HHcy小鼠中的HHcy通过增加CD3、DR3和ICOS的表达来增强Ly6Clow单核细胞中的淋巴细胞功能适应性。结论:Ly6Chigh单核细胞显示出丰富的炎症信号通路活化,和调控免疫检查点分子以抑制增殖和增加抗原启动免疫反应,并证明了分化为巨噬细胞和破骨细胞的潜力。Ly6Clow单核细胞表现出T细胞相关信号通路活化,并可能适应淋巴细胞的部分功能。Tg-h CBS+Cbs-/-小鼠中的HHcy强化Ly6Chigh单核细胞的炎性特性,并增强Ly6Clow单核细胞中的淋巴细胞功能适应性。
张雪琰[10]（2020）在《ICOS及ICOS-L在嗜酸粒细胞性鼻息肉组织中的表达及临床意义》文中研究说明目的:研究可诱导共刺激分子（Inducible costimulator,ICOS）及可诱导共刺激分子配体（inducible costimulitor-ligand,ICOS-L）在不同分型鼻息肉组织中的分布特点,探讨其在嗜酸性粒细胞性鼻息肉发病中的作用。方法:1.收集就诊于青岛大学附属医院、诊断为慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polys,CRSw NP）并接受功能性鼻内镜手术的29例患者的鼻息肉组织,收集8例视神经减压、眼眶内异物、脑脊液鼻漏患者的筛窦黏膜组织（鼻窦黏膜正常）,并对实验组和对照组的所有患者使用Lund-Mackay方法评估患者病情严重程度。2.苏木精-伊红染色鼻息肉组织,按照嗜酸性粒细胞计数多少将息肉分为嗜酸性粒细胞性鼻息肉组（eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps group,ECRS group）和非嗜酸性粒细胞性鼻息肉组（non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps group,non-ECRS group）。3.对29例鼻息肉组织和8例对照组筛窦黏膜组织进行免疫组化染色、WesternBlot检测ICOS、ICOS-L在鼻息肉组织及正常筛窦黏膜组织中的分布及表达。4.用RT-PCR检测三组组织中ICOS m RNA、ICOS-L mRNA的表达量,用△Ct法进行相对定量分析,△Ct与mRNA的表达量成反比,分析嗜酸性粒细胞性鼻息肉组织ICOS、ICOS-L mRNA相对量及每高倍镜视野嗜酸性粒细胞计数之间的相关性。5.本研究采用SPSS 24.0软件对数据进行分析。结果:1.ECRS组、non-ECRS组每高倍镜视野中平均嗜酸粒细胞数分别为:59.93±23.79个/10HPF,3.93±2.60个/10HPF。2.免疫组织化学染色结果显示ICOS、ICOS-L在ECRS组、non-ECRS组、对照组筛窦黏膜组织中均有表达,ICOS、ICOS-L表达阳性的细胞表面可见棕黄色、棕褐色或淡黄色颗粒。对照组和non-ECRS组组织中,ICOS、ICOS-L虽有表达,但表达水平较低,而在ECRS组中,ICOS、ICOS-L的染色强度和表达数目增加。ECRS组中,ICOS、ICOS-L H-score的平均分分别为113.26±25.92、122.84±17.18,non-ECRS组中,ICOS、ICOS-L的H-score的平均分分别为分别为52.09±26.01、73.77±26.82,对照组中,ICOS、ICOS-LL的H-score的平均分分别为分别为43.80±8.49、63.78±26.01。ICOS、ICOS-L在ECRS组中较其它两组表达升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,ICOS、ICOS-L在non-ECRS组中的表达较对照组表达无显着性差异（P>0.05）。3.经Western Blot方法,检测显示:ICOS在ECRS组、non-ECRS组、对照组的蛋白灰度比值分别为1.48±0.22、1.02±0.08和0.96±0.10。ECRS组中ICOS-L蛋白灰度比值为1.54±0.25、non-ECRS组中ICOS-L蛋白灰度比值为1.19±0.23,对照组中ICOS-L蛋白灰度比值为1.05±0.21,ECRS组中的ICOS、ICOS-L表达与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）;non-ECRS组中ICOS、ICOS-L的表达与对照组之间无统计学差异（P>0.05）4.对三组组织进行RT-qPCR方法检测,其中,ICOS mRNA在ECRS组、nonECRS组、对照组中的△Ct值依次为1.99±0.85、1.12±0.62、1±0.56。ICOS-LmRNA在三组的的△Ct值依次为2.25±1.11、1.09±0.58、1±0.51。ECRS组ICOSmRNA、ICOS-LmRNA的表达高于non-ECRS组、对照组;两者的表达均升高,与non-ECRS组和对照组之间差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:ECRS组的共刺激信号ICOS和ICOS-L表达相对于non-ECRS组升高,同正常对照组相比具有显着统计学意义,提示ICOS和ICOS-L可能在ECRS的免疫反应中发挥潜在的作用。
二、Reciprocal expression of TRAIL and CD95L in Th1 and Th2 cells: role of apoptosis in T helper subset differentiation（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Reciprocal expression of TRAIL and CD95L in Th1 and Th2 cells: role of apoptosis in T helper subset differentiation（论文提纲范文）
（1）基于转录组测序研究甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠的机制影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一: 自身免疫性甲状腺炎的中医药研究进展 |
| 1 自身免疫性甲状腺炎的中医概念 |
| 2 自身免疫性甲状腺炎的中医病因病机 |
| 3 自身免疫性甲状腺炎的辨证分型及分期分型 |
| 4 自身免疫性甲状腺炎的中医治疗 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 自身免疫性甲状腺炎的研究进展 |
| 1 发病诱因 |
| 2 发病机制 |
| 3 诊断与治疗 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三: STAT3/HIF1α通路在自身免疫性甲状腺炎中的研究进展 |
| 1 STAT3在免疫细胞中的作用 |
| 2 HIF1α在免疫细胞中的作用 |
| 3 STAT3/HIF1α通路在AIT中的作用 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一: LC/MS分析甲炎康泰成分并对其药效进行观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二: 转录组分析甲炎康泰对AIT大鼠甲状腺组织的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三: 甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠STAT3/HIF1α信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四: 甲炎康泰对Nthy-ori-3-1细胞STAT3/HIF1α信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
（2）髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 原发性膜性肾病 |
| 1.1.1 原发性膜性肾病的发病机制 |
| 1.1.2 原发性膜性肾病的研究进展 |
| 1.1.3 治疗上的新进展 |
| 1.2 原发性膜性肾病与免疫细胞间的关系 |
| 1.2.1 原发性膜性肾病与Th2细胞 |
| 1.2.2 原发性膜性肾病与B淋巴细胞 |
| 1.2.3 原发性膜性肾病与Th17细胞 |
| 1.2.4 原发性膜性肾病与自然杀伤细胞(natural killer, NK) |
| 1.2.5 原发性膜性肾病与Treg |
| 1.3 MDSC |
| 1.3.1 MDSC的生物分类和功能特征 |
| 1.3.2 MDSC在自身免疫性疾病中的作用 |
| 1.3.3 MDSC在肿瘤中的作用 |
| 1.3.4 MDSC在免疫相关性肾病中的研究进展 |
| 1.3.5 MDSC与其他免疫细胞相互作用 |
| 1.4 Th17与自身免疫性疾病 |
| 1.4.1 Th17细胞的分化和表达调控 |
| 1.4.2 Th17细胞功能 |
| 1.4.3 Th17细胞在自身免疫性疾病中的促炎作用 |
| 1.4.4 Th17细胞在肾脏炎症和肾脏自身免疫性疾病中的作用 |
| 第2章 原发性膜性肾病患者中MDSC通过促进Th17细胞极化促进疾病进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 2.3.2 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) |
| 2.3.3 磁珠分选初始CD4~+ T细胞 |
| 2.3.4 流式分选MDSC |
| 2.3.5 MDSC抑制功能实验 |
| 2.3.6 Th17极化实验 |
| 2.3.7 Th2极化实验 |
| 2.3.8 培养MDSC |
| 2.3.9 细胞外染色 |
| 2.3.10 细胞内IFN-γ/IL-4/IL-17A染色 |
| 2.3.11 Treg染色 |
| 2.3.12 酶联免疫吸附法检测血浆中抗磷脂酶A2受体抗体(PLA2R)IgG |
| 2.3.13 人Th1/Th2/Th17 细胞因子检测 |
| 2.3.14 血浆Arg-1 和IL- 13 检测 |
| 2.3.15 荧光定量PCR |
| 2.3.16 组织染色 |
| 2.3.17 多色免疫组化(Multiplex immunohistochemistry,IHC) |
| 2.3.18 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PMN患者病变肾组织的特征性病理改变 |
| 2.4.2 PMN患者血浆中抗PLA2R抗体含量与尿蛋白定量正相关 |
| 2.4.3 CD3~+ T细胞与CD11b~+ 细胞在PMN患者病变肾组织中沉积 |
| 2.4.4 PMN患者Th2反应增强并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.5 PMN患者外周血Th1细胞比例下调 |
| 2.4.6 PMN患者外周血Treg细胞比例下调 |
| 2.4.7 PMN患者外周血MDSC及亚群数量显着增加并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.8 PMN患者的MDSC具有更强的抑制自体初始CD4+ T细胞增殖的功能 |
| 2.4.9 PMN患者Th2比例增加与MDSC增加正相关 |
| 2.4.10 体外IL -6 和IL-10 增强MDSC抑制Th2分化的能力 |
| 2.4.11 IL-17~+ 细胞和CD11b~+ 细胞在PMN患者病变肾组织中沉积 |
| 2.4.12 PMN患者Th17反应增强并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.13 PMN患者Th17反应与MDSC正相关 |
| 2.4.14 MDSC以Arg-1 依赖的方式促进Th17细胞分化 |
| 2.4.15 PMN 患者血浆 Arg-1 含量增加并与疾病活动度相关 |
| 2.4.16 IL-6 和IL-10 促进MDSC分泌Arg-1 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 去除MDSC缓解PMN模型小鼠的肾脏损伤 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 膜性肾病小鼠模型的构建及GEM治疗 |
| 3.3.2 PBMC的分离 |
| 3.3.3 背部和腋窝淋巴结细胞分离 |
| 3.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 3.3.5 流式检测MDSC |
| 3.3.6 Treg细胞内染色 |
| 3.3.7 Th1/2/17 细胞内染色 |
| 3.3.8 荧光定量PCR |
| 3.3.9 小鼠尿白蛋白/尿肌酐比率的测定 |
| 3.3.10 小鼠血清尿素氮测定 |
| 3.3.11 肾组织病理染色 |
| 3.3.12 肾脏透射电镜制备 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 应用rh-α3NC1成功构建小鼠PMN模型 |
| 3.4.2 PMN小鼠MDSC及其亚群比例增加 |
| 3.4.3 GEM可有效去除小鼠外周血中MDSC |
| 3.4.4 去除MDSC减轻PMN模型小鼠的肾组织损伤 |
| 3.4.5 去除MDSC减弱PMN小鼠Th17免疫反应 |
| 3.4.6 去除MDSC减弱PMN小鼠Th2免疫反应 |
| 3.4.7 去除MDSC增强PMN小鼠Th1免疫反应 |
| 3.4.8 去除MDSC增加PMN小鼠Treg比例 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 低剂量地西他滨通过调节Treg细胞恢复ITP的免疫耐受的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 一、附图 |
| 二、附表 |
| 三、附加图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低剂量地西他滨在ITP中通过调节PD-1甲基化降低CTLs诱导的血小板凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 英文论着Ⅰ |
| 英文论着Ⅱ |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文及参与学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 SLE与自身免疫反应 |
| 1.2.1 固有免疫系统在SLE中的作用 |
| 1.2.2 适应性免疫系统在SLE中的作用 |
| 1.3 Bregs研究进展 |
| 1.3.1 Bregs的定义及表型 |
| 1.3.2 Bregs的来源及发育 |
| 1.3.3 Bregs的生成调节 |
| 1.3.4 Bregs的功能 |
| 1.3.5 Bregs与自身免疫性疾病 |
| 1.3.6 Bregs与感染及肿瘤性疾病 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象、仪器和试剂 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血液样本采集 |
| 2.2.2 PBMC分离及培养 |
| 2.2.3 流式细胞仪检测B细胞、Th细胞亚群 |
| 2.2.4 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的细胞分子水平 |
| 2.2.5 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的BAFF浓度 |
| 2.2.6 CBA试剂盒检测Th细胞功能分子水平 |
| 2.2.7 Bregs亚群分选及培养 |
| 2.2.8 共培养系统的建立 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 研究对象的基本情况 |
| 3.2 SLE患者Bregs的表达情况 |
| 3.2.1 SLE患者外周血IL-10+/IL-35+/TGF-β1+Bregs亚群变化 |
| 3.2.2 SLE患者外周血不同表型Bregs的变化 |
| 3.2.3 SLE患者外周血IL-10、IL-35 以及TGF-β1水平 |
| 3.2.4 SLE患者外周血中Bregs功能变化的探索 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 SLE患者外周血Th细胞及B细胞亚群的表达情况 |
| 3.3.1 SLE患者外周血Th细胞亚群及其功能分子的变化 |
| 3.3.2 SLE患者外周血B细胞亚群的变化 |
| 3.3.3 SLE患者外周血BAFF水平的变化 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE临床指标的关系 |
| 3.5 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE器官受累的关系 |
| 3.6 免疫治疗后SLE患者外周血Bregs及及IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化 |
| 3.7 体外研究Bregs对SLE患者Th细胞亚群的影响 |
| 3.7.1 Transwell体系内Bregs对Th细胞的影响 |
| 3.7.2 小结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）ATP-柠檬酸裂解酶在iTreg分化过程中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词及中文对照 |
| 一、引言 |
| (一)调节性T细胞的生物学特性 |
| 1.调节性T细胞的分化标志 |
| 2.调节性T细胞的分类 |
| 3.调节性T细胞的功能发挥途径 |
| 4.调节性T细胞与炎症性疾病 |
| (二)TGFβ1信号与调节性T细胞分化 |
| 1.TGFβ信号的分类 |
| 2.TGFβ1与调节性T细胞分化 |
| (三)代谢重编程与调节性T细胞的分化 |
| 1.调节性T细胞分化过程中的代谢变化 |
| 2.细胞代谢变化影响调节性T细胞分化 |
| (四)脂肪酸合成途径代谢酶的功能和活性调节 |
| 1.ACLY的功能和活性调节 |
| 2.ACC的功能和活性调节 |
| 3.FASN的功能和活性调节 |
| (五)泛素化的功能和调节 |
| 1.泛素化的分类 |
| 2.泛素化的调节 |
| 3.泛素化的功能 |
| (六)本研究的立题依据、研究内容和意义 |
| 1.立题依据 |
| 2.研究内容和意义 |
| 二、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.人外周血 |
| 3.细胞系 |
| 4.菌株及质粒 |
| 5.抗体 |
| 6.试剂及试剂盒 |
| 7.主要试剂配制 |
| 8.引物及干涉片段 |
| 9.主要仪器 |
| (二)实验方法 |
| 1.iTreg体外诱导 |
| 2.流式细胞术检测iTreg分化 |
| 3.总RNA的提取及反转录 |
| 4.实时荧光定量PCR |
| 5.siRNA转染 |
| 6.慢病毒的包装和侵染 |
| 7.线粒体氧消耗率检测 |
| 8.代谢物水平检测 |
| 9.脂质合成和磷脂吸收检测 |
| 10.代谢酶活性分析 |
| 11.免疫沉淀 |
| 12.蛋白印迹 |
| 13.体外T细胞抑制实验 |
| 14.T细胞过继法建立小鼠IBD模型 |
| 15.DSS饮水法建立小鼠IBD模型 |
| 16.OVA诱导建立小鼠过敏性腹泻模型 |
| 17.结肠固有层细胞的分离 |
| 18.结肠组织病理学分析 |
| 19.数据处理与分析 |
| 三、实验结果 |
| (一)iTreg分化依赖于ACLY的活性下降 |
| (二)ACLY活性下降通过降低丙二酰CoA水平促进iTreg分化 |
| (三)丙二酰CoA水平下降通过增强FAO促进iTreg分化 |
| (四)ACLY活性下降是由于TGFβ1介导的泛素化降解所致 |
| (五)TGFβ1介导的ACLY泛素化依赖于CUL3-KLHL25 |
| (六)在人iTreg分化过程中存在相同的ACLY泛素化调节机制 |
| (七)ACLY泛素化促进iTreg分化缓解小鼠IBD |
| (八)ACLY泛素化促进iTreg分化缓解小鼠过敏性腹泻 |
| 四、讨论 |
| (一)ACLY是TGFβ1调节代谢诱导iTreg分化的一个重要感应者 |
| (二)丙二酰CoA-CPT1-FAO是调节iTreg分化的关键 |
| (三)iTreg分化需要多条脂代谢途径协调配合 |
| (四)CUL3-KLHL25在炎症应答中的可能机制 |
| (五)ACLY抑制剂可能成为治疗小鼠肠道炎症的潜在药物靶点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（6）原发性肾病综合征与牛奶蛋白过敏中调节性T细胞应答异常及DOCK8缺陷致B细胞早期活化异常的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 儿童原发性肾病综合征中调节性T细胞稳定性、可塑性、功能异常及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 研究非IgE介导型牛奶蛋白过敏中肠道菌群失调对调节性T细胞介导的肠道免疫耐受和免疫稳态的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 Dock8 缺陷对B 细胞早期激活及记忆性B 细胞活化的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控T细胞免疫应答的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（7）麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 麻杏石甘汤对过敏性哮喘模型大鼠的抗过敏作用观察 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠Th2、Th9、Th17的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 麻杏石甘汤对体外培养PBMC中Th2、Th9、Th17的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 辅助T细胞亚群对过敏性哮喘的调控作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 麻杏石甘汤治疗支气管哮喘研究进展综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（8）树突状细胞表面GITRL在哮喘气道炎症和气道高反应性中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 哮喘小鼠肺组织和树突状细胞表面GITRL的表达变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 敲低GITRL对小鼠哮喘表型及CD4~+T细胞分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 BMDCs表面GITRL对CD4~+T细胞分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 GITR/GITRL共刺激分子在免疫调节中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论着 |
（9）基于RNA-seq技术的高同型半胱氨酸血症和野生型小鼠的Ly6C单核细胞亚群的免疫学特性与转录调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 单核细胞分类 |
| 2 单核细胞分化 |
| 3 免疫学基因集 |
| 4 高同型半胱氨酸血症 |
| 5 RNA测序 |
| 第一部分 野生型小鼠单核细胞亚群分化机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验所需设备及仪器 |
| 1.3 主要试剂及其配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 器材的准备 |
| 2.2 血浆样品的制备 |
| 2.3 流式细胞荧光分选技术 |
| 2.4 RNA提取 |
| 2.5 RNA测序 |
| 2.6 生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 识别3064 个显着差异表达的基因 |
| 3.2 Ly6C~(high)单核细胞炎性信号通路激活,而淋巴细胞免疫相关信号抑制 |
| 3.3 Ly6C单核细胞转录因子调控免疫学相关基因 |
| 3.4 调控Ly6C单核细胞亚群生成的转录信号机制 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 高同型半胱氨酸血症小鼠单核细胞亚群分化机制与免疫学特性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备及仪器 |
| 1.3 主要试剂及其配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠基因型测定 |
| 2.2 血浆Hcy水平的测定 |
| 2.3 流式细胞荧光分选技术 |
| 2.4 RNA测序与分析 |
| 2.5 PCA分析 |
| 2.6 SDE基因的识别 |
| 2.7 火山图和热图 |
| 2.8 IPA信号通路分析 |
| 2.9 转录信号的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 HHcy小鼠单核细胞亚群中识别出3605个SDE基因 |
| 3.2 Ly6C~(high)单核细胞炎性信号通路活化,而Ly6C~(low)单核细胞呈现T细胞活化 |
| 3.3 Ly6C~(high)向Ly6C~(low)单核细胞亚群分化的转录调控模型的建立 |
| 3.4 Ly6C~(high)单核细胞下调的共刺激因子受体以促进增殖,并上调共刺激因子配体以促进抗原引发和分化 |
| 3.5 Ly6C~(high)单核细胞向巨噬细胞分化和Ly6C~(low)单核细胞显示淋巴细胞相似功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 高同型半胱氨酸血症调控Ly6C单核细胞亚群分化与免疫学特性的转录机制 |
| 1 研究设计和路线图 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 RNA-seq数据来源 |
| 2.2 RNA-seq数据处理 |
| 2.3 基因差异表达分析 |
| 2.4 IPA信号通路富集分析 |
| 2.5 转录因子与免疫学相关基因集的识别 |
| 2.6 显着差异表达基因及信号通路的重叠分析 |
| 2.7 免疫检查点基因的识别与功能 |
| 2.8 HHcy调控单核细胞亚群的分化 |
| 3 结果 |
| 3.1 HHcy诱导单核细胞亚群显着差异表达基因筛选与识别 |
| 3.2 HHcy诱导Ly6C单核细胞亚群信号通路的改变 |
| 3.3 HHcy对单核细胞转录调控机制与免疫学相关基因集的识别 |
| 3.4 HHcy下调Ly6C~(high)单核细胞共抑制因子配体(PD-L1/2),上调Ly6C~(low)单核细胞中共刺激因子受体(DR3和ICOS) |
| 3.5 HHcy调控Ly6C~(high)单核细胞向巨噬细胞分化,促进Ly6C~(low)单核细胞获取淋巴细胞功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 免疫检查点在高同型半胱氨酸血症促动脉粥样硬化中的调控作用 |
| 参考文献 |
（10）ICOS及ICOS-L在嗜酸粒细胞性鼻息肉组织中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 慢性鼻窦炎伴鼻息肉的诊断标准 |
| 1.2 入选病例的剔除标准 |
| 1.3 标本采集与处理 |
| 2 仪器和试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE) |
| 3.2 免疫组化染色 |
| 3.3 Western Blot |
| 3.4 荧光定量逆转录聚合链反应 |
| 4 数据分析和图片处理 |
| 结果 |
| 1 临床资料 |
| 2 实验组标本HE染色结果 |
| 3 免疫组化检测三组组织标本中ICOS、ICOS-L的阳性表达情况 |
| 4 Western Blot方法检测各组组织中ICOS及 ICOS-L的表达 |
| 5 RT-q PCR方法检测各组组织ICOS、ICOS-L m RNA的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
四、Reciprocal expression of TRAIL and CD95L in Th1 and Th2 cells: role of apoptosis in T helper subset differentiation（论文参考文献）
- [1]基于转录组测序研究甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠的机制影响[D]. 张程斐. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展[D]. 李会敏. 吉林大学, 2021(01)
- [3]低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究[D]. 韩盼盼. 山东大学, 2021(11)
- [4]调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究[D]. 叶壮. 吉林大学, 2021(01)
- [5]ATP-柠檬酸裂解酶在iTreg分化过程中的作用及机制研究[D]. 田苗苗. 东北师范大学, 2021(09)
- [6]原发性肾病综合征与牛奶蛋白过敏中调节性T细胞应答异常及DOCK8缺陷致B细胞早期活化异常的机制研究[D]. 王劲智. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]麻杏石甘汤对过敏性哮喘大鼠辅助T淋巴细胞调控作用机制研究[D]. 郑炜东. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [8]树突状细胞表面GITRL在哮喘气道炎症和气道高反应性中的作用及机制研究[D]. 王亚苹. 重庆医科大学, 2021(01)
- [9]基于RNA-seq技术的高同型半胱氨酸血症和野生型小鼠的Ly6C单核细胞亚群的免疫学特性与转录调控机制研究[D]. 杨萍萍. 南昌大学, 2021(01)
- [10]ICOS及ICOS-L在嗜酸粒细胞性鼻息肉组织中的表达及临床意义[D]. 张雪琰. 青岛大学, 2020(01)