一、Study of signal pathway of histamine H_3 receptor on AtT-20 cell（论文文献综述）
陈庆春[1]（2021）在《类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较》文中提出类胰蛋白酶δ1（tryptase delta 1,TPSD1）和尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil DNAglycosylase,UNG）是本文从 GSE10140-10141 中相对于肝炎（HBV或HCV感染）计算筛选出的肝癌高表达分子,而且TPSD1和UNG的知识与分子网络都非常丰富,是肝癌中非常活跃的分子。本文通过整合SAM、Pearson、GRNInfer和DAVID,分别构建了肝癌（HBV或HCV感染）高表达TPSD1和UNG反馈/上/下游激活和抑制知识与分子网络。横向提出并验证TPSD1有丝分裂和神经内分泌抑制、炎症反应激活机制,UNG有丝分裂激活、先天性免疫和炎症反应抑制机制,分别通过计算含其任一分子的共同知识和亚网。纵向提出并验证TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活、TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制、TPSD1炎症反应激活但UNG抑制机制,通过计算与其相互激活不同分子的知识和共同亚网。负向验证TPSD1和UNG有丝分裂、神经内分泌和先天性免疫、炎症反应,通过提出其不同游的相同知识的机制和共同亚网。1.肝癌TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活机制TPSD1反馈抑制BUB1B和CDC2的核有丝分裂,横向通过基因表达正调控|有丝分裂细胞周期G2/M转变| DNA复制,和纵向通过转录因子活性序列特异性DNA结合|细胞周期G1到S控制反应物,共同存在于 BUB1B、CDC2、E2F1、LAPTM4B、MCM4、MYBL2、NCAPH亚网。为了负向验证TPSD1反馈抑制核有丝分裂,提出TPSD1反馈激活转录因子活性序列特异性DNA结合诱导DNA损伤|正趋化性|核小体组装存在于共同DDX10、GML、HMGB2、PRSS1、SORT1、TNFRSF9、TP53I11亚网,比较 TPSD1反馈抑制转录因子活性序列特异性DNA结合诱导细胞周期通路存在于共同 BUB1B、CDC2、CDKN3、E2F1、LAPTM4B、MCM4、MYBL2、NCAPH 亚网。TPSD1上游抑制BIRC5和CCNA2的核有丝分裂,横向通过泛素蛋白转移酶活性|锌离子结合,和纵向通过细胞骨架结构组成|细胞增殖,共同存在于 ACTG2、CCNA2、ESM1、TUBG1、UBE2C亚网。为了负向验证TPSD1上游抑制核有丝分裂,提出TPSD1上游激活细胞增殖通过FcεRI信号通路|碳水化合物结合存在于共同CHRNA4、GDPD5、KCTD2、KLRC3、MAP2K6、MS4A2、NFKBIB、REG3A亚网,比较TPSD1上游抑制细胞增殖通过胚胎干细胞存在于共同 ACTG2、CCNA2、ESM1、GPSM2、TUBG1、UBE2C 亚网。UNG反馈激活CCNB1和TUBG1的M期,横向通过细胞缺氧反应| G2/M检查点|蛋白复合物装配| p53信号通路|细胞骨架结构组成,和纵向通过前列腺和小细胞肺癌|转录因子活性序列特异性DNA结合| DNA复制起始|病毒癌变|核染色质,共同存在于 ACTG2、BIRC5、CCNB1、E2F1、MCM4 亚网。为了负向验证UNG反馈激活M期,提出UNG上游激活DNA转录正调控诱导核有丝分裂|肝脏发育存在于共同UBE2C亚网,比较UNG反馈激活转录因子活性序列特异性DNA结合诱导成纤维细胞增殖正调节| DNA损伤应答内在凋亡信号转导通路存在于共同ACTG2、BIRC5、CCNB1、E2F1、LOX、MCM4 亚网。UNG上游激活NCAPH和NUSAP1的有丝分裂相关染色体凝聚,横向通过微管结合|聚（A）RNA结合,和纵向通过蛋白异源二聚化活性,细胞蛋白质代谢过程|细胞对DNA损伤刺激的反应|跨损伤合成,共同存在于GPSM2、HIST1H3H、NCAPH、RFC4亚网。为了负向验证UNG上游激活有丝分裂相关染色体凝聚,提出UNG反馈激活蛋白异源二聚化活性诱导蛋白质泛素化和sumo化|细胞凋亡负调控存在于共同BIRC5、E2F1亚网,比较UNG上游激活蛋白异源二聚化活性诱导凋亡过程正调控|细胞对DNA损伤刺激的反应|酶结合存在于共同GPSM2、RFC4亚网。2.肝癌TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制机制TPSD1反馈抑制CDKN3和SPINK1的内分泌和中枢神经系统,横向通过没有直接相关知识,和纵向通过基因表达正调控|转录因子活性序列特异性DNA结合|细胞周期G1到S控制反应物,共同存在于 CDC2、CDKN3、E2F1、LAPTM4B、MCM4 亚网。为了负向验证TPSD1反馈抑制内分泌和中枢神经系统,提出TPSD1 下游激活内分泌和中枢神经系统通过细胞-细胞信号转导存在于共同FGF9、FOLR1、NINJ2、STX1A、TBL3、TSHB亚网。UNG反馈抑制LGALS3和NFKBIB的先天性免疫反应,横向通过细胞外基质组织|甲型流感,和纵向通过认知|突触传递|神经发生|小分子代谢过程,共同存在于CHL1、CHRNA4、FOLR1、PRSS1、TPST2亚网。为了负向验证UNG反馈抑制先天性免疫反应,提出UNG上游抑制突触传递通过钾离子运输|信号转导存在于共同ARHGDIG、EIF1AX、SSTR5亚网,比较UNG反馈抑制突触传递通过膜电位调节|分泌通路存在于共同CHL1、CHRNA4、FOLR1、KIAA0513、PRSS1、RIMS3、TPST2 亚网。UNG下游抑制HMGB2和MS4A2的先天性免疫反应,横向通过内源性刺激响应|蛋白结构域特异性结合|脂多糖反应|炎症反应,和纵向通过突触传递,共同存在于HMGB2、RNF185、TNFRSF9亚网。为了负向验证UNG下游抑制先天性免疫反应,提出UNG反馈抑制突触传递通过神经活性配体受体相互作用|分泌通路存在于共同CHL1、CHRNA4、FOLR1、KIAA0513、PRSS1、RIMS3、TPST2亚网,比较UNG下游抑制突触传递通过蛋白结构域特异性结合存在于共同HMGB2、MS4A2、RNF185、TNFRSF9亚网。3.肝癌TPSD1炎症反应激活但UNG抑制机制TPSD1反馈激活CHST1和TNFRSF9的炎症反应,横向通过多细胞体发育|脂多糖反应,和纵向通过丝氨酸内肽酶活性|轴突导向|同源蛋白质结合|蛋白质自磷酸化|胰腺分泌|血液凝固,共同存在于 CHST1、EPHA4、ISG20、LGALS3、PRSS1 亚网。为了负向验证TPSD1反馈激活炎症反应,提出TPSD1下游抑制蛋白质自磷酸化诱导锌离子结合|肝脏发育|细胞周期的M期存在于共同FOXM1、HIST1H2BJ、STMN1亚网,比较TPSD1反馈激活蛋白质自磷酸化诱导轴突导向|血液凝固|钙信号转导通路存在于共同 CHL1、CHST1、EPHA4、PRSS1 亚网。TPSD1上游激活MS4A2和REG3A的炎症反应,横向通过FcεRI信号通路|碳水化合物结合,和纵向通过toll样受体信号通路|胆碱能突触,共同存在于CHRNA4、KLRC3、MAP2K6、NFKBIB、REG3A亚网。为了负向验证TPSD1上游激活炎症反应,提出TPSD1反馈激活谷氨酸能突触通过神经冲动传递|蛋白激酶活性存在于共同CHST1、PRSS1、SSTR5亚网,比较TPSD1上游激活胆碱能突触通过钾和电压门控离子通道活性存在于共同AMELY、KCNQ3、KLRC3、MAP2K6、REG3A、RNF185、SYN2、TPST2亚网。UNG下游抑制MS4A2和TNFRSF9的炎症反应,横向通过先天性免疫反应|细胞增殖负调节,和纵向通过神经递质分泌|蛋白结构域特异性结合,共同存在于HMGB2、RNF185、TNFRSF9亚网。为了负向验证UNG下游抑制炎症反应,提出UNG下游激活轴突导向通过锌离子结合存在于共同CCNB2、DLG7、ESM1、IGF2BP3、MMP9亚网,比较UNG下游抑制神经递质分泌通过蛋白结构域特异性结合存在于共同HMGB2、MS4A2、RNF185、TNFRSF9亚网。本文首次全面系统地通过大数据计算阐述了类胰酶TPSD1调控肝癌的有丝分裂和神经内分泌抑制、炎症反应激活机制,填补了当前研究领域的空白,为早期肝癌的诊断和治疗奠定基础。糖苷酶UNG调控肝癌的有丝分裂激活、先天性免疫和炎症反应抑制机制,为肝癌理论和应用研究增加了新的内容,对晚期肝癌的诊断和治疗具有重大意义。TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活、TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制、TPSD1炎症反应激活但UNG抑制的新系统比较研究为肝癌的诊断和治疗提供了重要的理论基础和应用价值。
王阳[2]（2020）在《FGFR-2基因多态性以及作为microRNA-494的靶基因与乳腺癌的相关性研究》文中研究指明研究背景乳腺癌（breast cancer,BC）是世界范围内女性最常见的癌症。BC是一种复杂的异质性疾病,根据组织学特征可分为激素受体阳性、人表皮生长因子受体2 阳性（human epidermal growth factor receptor-2 overexpressing,HER2+）和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）。诱发BC的因素具有多样性,如人工流产、用枸橼酸氯米芬和促性腺激素等诱导排卵、电离辐射以及酗酒和吸烟等。由于女性对乳房的自我检查和临床检查的疏忽,乳腺癌很难在早期被发现,从而耽误患者的及时治疗。因此,通过早期检查改善BC的预后和提高生存率仍然是BC治疗的重中之重。深入探究BC的风险因子以及其内在发病机制,对于BC的预防及治疗具有深远的意义。研究目的本研究旨在探究miR-494通过介导成纤维细胞生长因子受体-2（fibroblast growth factor receptor-2,FGFR-2）对BC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭方面的影响。实验首先探讨 FGFR-2和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PI3KCA）基因变异在BC中的意义及其与预后之间的关系。随后通过对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的研究,检测miR-494过表达或沉默对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响。以miR-494和FGFR-2之间的调控关系为切入点,深入探究miR-494对BC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,对细胞凋亡的促进作用,以及对 RAS/RAF/裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase,MEK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）信号通路和磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,AKT）信号通路的抑制作用。试图阐释miR-494通过介导FGFR-2对BC产生调控作用的分子机制,以期为BC的治疗提供有力的理论支持和方案策略。研究方法第一部分中国人群中FGFR-2和PI3KCA基因变异与乳腺癌风险的关系本部分实验中,首先通过对328名BC患者和389名健康对照组进行了基因分型。随后,我们评估FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624与BC易感性和临床病理特征的相关性,包括年龄、肿瘤大小、临床分期、分级、淋巴结浸润状态、雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）以及HER2基因状态。采用log-rank检验Kaplan-Meier曲线评估FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624与预后指标之间的相关性,以此阐述这些基因与中国女性BC患者风险和患者生存率之间的关系。在本部分实验中,采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA,进行基因分型。第二部分过表达或沉默miR-494对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响本部分实验中,首先对 MCF-10A、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT-549以及MCF-7等BC细胞系及BC组织中的miR-494的表达水平进行检测,根据表达水平选择MDA-MB-453和MCF-7细胞用于后续实验。随后,我们在所选的细胞中过表达或沉默miR-494,利用细胞活力以及细胞周期相关因子CyclinD1、细胞周期素依赖激酶（Cyclin Dependent Kinase,CDK）4 和 CDK6的表达,检测细胞增殖;利用细胞凋亡率以及凋亡相关因子pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3和Bax的蛋白表达量,检测细胞凋亡;利用细胞迁移率、侵袭率以及相关因子基质金属蛋白酶9（Matrix Metallopeptidase 9,MMP-9）和Vimentin的蛋白表达量,检测细胞迁移和侵袭。本部分的研究中,使用qRT-PCR检测BC细胞系中miR-494表达情况;使用CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞活力;使用lipofectamine 3000试剂进行细胞转染;使用碘化丙酯（propidium iodide,PI）和荧光素异硫氰酸酯（fluorescein isothiocynate,FITC）偶联Annexin V染色检测细胞凋亡率;使用双室迁移法检测细胞迁移和侵袭;使用蛋白免疫印迹分析检测CyclinDI、CDK4、CDK6、pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bax、MMP-9、Vimentin 和 β-actin 的蛋白表达。第三部分miR-494靶向FGFR-2基因抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞行为本部分实验中,首先将miR-494 mimic或其阴性对照（negative control,NC）mimic转染至MDA-MB-453和MCF-7细胞,转染48h后检测细胞中FGFR-2的表达变化。利用双荧光素酶报告实验,检测miR-494对FGFR-2的靶向调控关系。分别用 NC mimic 和 pEX-2、miR-494 mimic 和 pEX-2 以及 miR-494 mimic 和pEX-FGFR-2共转染至MDA-MB-453和MCF-7细胞,测定细胞活力、细胞凋亡率、细胞迁移率、细胞侵袭率、细胞周期相关因子CyclinDl、CDK4和CDK6的表达变化、细胞凋亡相关因子pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3和Bax的表达变化、细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的表达变化,以探究miR-494通过调控FGFR-2表达影响BC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用。最后检测RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路核心因子（RAS、RAF、p/t-MEK 以及 p/t-ERK）以及PI3K/AKT信号通路核心因子（p/t-PI3K和p/t-AKT）的蛋白表达情况,以探究miR-494通过调控FGFR-2表达,影响BC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的分子机制。本部分的研究中,利用双荧光素酶报告实验,检测FGFR-2是否为miR-494的靶基因;使用CCK-8法检测细胞活力;使用lipofectamine 3000试剂进行细胞转染;使用FITC-膜联蛋白V/PI检测试剂盒检测细胞凋亡率;使用双室迁移法检测细胞迁移和侵袭:使用蛋白免疫印迹分析检测FGFR-2、CyclinD1、CDK4、CDK6、pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bax、MMP-9、Vimentin、和β-actin的蛋白表达。结果第一部分中国人群中FGFR-2和PI3KCA基因变异与乳腺癌风险的关系本部分实验发现,FGFR-2 rs1219648,AG等位基因与BC患者临床分期和分级均表现出显着的相关性,GG等位基因与BC患者分级显着相关。同时发现FGFR-2 rs1219648优势模型也显示与BC患者临床分级显着相关。对于PI3KCA rs6443624,其AC等位基因与临床分期显着相关,并且AA等位基因与分级显着相关。此外,PI3KCA rs6443624优势模型与临床分期显着相关。FGFR-2 rs1219648或PI3KCA rs6443624在BC患者中的预后影响检测显示,相对于FGFR-2 rs 1219648 AA等位基因的患者,AG和GG等位基因的患者生存时间更短。然而,患者PI3KCA rs6443624中显示每个等位基因之间都没有差异。除此之外,我们采用逐步Cox回归模型进行多变量分析,发现临床分期、ER和PR状态可能是重要的预后指标。第二部分过表达或沉默miR-494对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响本部分实验发现,miR-494 在 MCF-10A、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT-549以及MCF-7等BC细胞系及BC组织中,呈现低表达。由于实验中MDA-MB-453和MCF-7细胞中miR-494的表达量较其它细胞更低,因此选择MDA-MB-453和MCF-7细胞用于后续实验。随后我们在所选的细胞中过表达miR-494,发现miR-494过表达能够降低MDA-MB-453和MCF-7细胞的活力、增殖,并且降低细胞周期相关因子CyclinD1、CDK4和CDK6的表达;提高细胞凋亡率进而促进细胞凋亡,并且提高凋亡相关因子Cleaved-Caspase 3和Bax的蛋白表达量;降低细胞迁移率、侵袭率,并降低细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的蛋白表达。此外,实验结果显示:miR-494沉默能够提高MDA-MB-453和MCF-7细胞活力、增殖,并且促进细胞周期相关因子CyclinD 1、CDK4和CDK6的表达;对细胞凋亡影响不是很明显;促进细胞迁移率、侵袭率并促进细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的蛋白表达。第三部分miR-494靶向FGFR-2基因抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞行为实验结果显示,miR-494过表达可以抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞中FGFR-2的表达;双荧光素酶报告实验结果证实,FGFR-2是miR-494的一个靶基因;FGFR-2过表达能够促进MDA-MB-453和MCF-7细胞活力、细胞迁移率以及侵袭率,上调细胞周期相关因子（CyclinD1、CDK4和CDK6）、细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的蛋白表达;降低细胞凋亡率以及下调细胞凋亡相关因子（c/p-Caspase 3和Bax）的表达。此外,miR-494过表达能够下调MDA-MB-453和MCF-7细胞中RAS/RAF/MEK/ERK信号通路核心因子（RAS、RAF、p/t-MEK以及p/t-ERK）以及PI3K/AKT信号通路核心因子（p/t-P13K和p/t-AKT）的蛋白表达情况,而FGFR-2过表达能够逆转该趋势。结论本课题对miR-494通过调控FGFR-2表达抑制BC细胞的增殖、迁移、侵袭以及促进细胞凋亡的作用及分子机制进行系统的研究,得出以下结论:（1）在中国人群中,FGFR-2 rs1219648 和 PI3KCA rs6443624 均与 BC 风险性相关;FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624的单核苷酸多态性可能有助于BC高危患者的鉴别,并可能是中国人群BC的潜在预后因素。（2）miR-494过表达能够抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡;miR-494沉默能够提高MDA-MB-453和MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭,对细胞凋亡影响不明显。（3）miR-494能够抑制FGFR-2表达,FGFR-2是miR-494的一个靶基因。（4）miR-494过表达通过调控FGFR-2抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。（5）miR-494能够通过调控FGFR-2的表达抑制RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路。
韩雨[3]（2020）在《地塞米松对前庭中枢代偿中小脑绒球BDNF、TrkB和KCC2的影响及意义》文中认为目的:探讨前庭外周急性损伤后中枢代偿过程中,地塞米松（Dexamethasone,DXM）对大鼠绒球中BDNF、TrkB和KCC2表达的影响及意义。方法:SD大鼠随机分为五组:生理盐水（Normal saline,NS）组（阴性对照组）、对氨基苯胂酸（Arsanilic acid,AA）组（阳性对照组）、低剂量DXM组、高剂量DXM组和DXM拮抗组。每日给予每只大鼠同侧中耳、腹腔及颈背部皮下注射干预药物各一次,连续三日。于实验第四日,观察大鼠的姿势和运动,记录各组大鼠空中翻正反射阳性率、接触翻正反射时间和头部固定后的前15秒内眼震次数,使用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）、免疫蛋白印迹（Western-blot）和逆转录定量聚合酶链式反应（Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测大鼠绒球中BDNF、TrkB和KCC2的表达水平,使用Prism8统计软件进行单因素方差分析（One-way analysis of variance,One-way ANOVA）,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:行为学表现上,AA组大鼠与NS组相比产生了严重的前庭功能障碍表现,其翻正反射阳性率降低、接触翻正反射时间延长、自发性眼震次数增加。低剂量和高剂量DXM组的上述表现均较AA组好转,其中高剂量组好转更加明显,而DXM拮抗组大鼠的前庭功能障碍表现较高剂量DXM组更为严重,组间差异具有统计学意义（P<0.05）。在分子表达上,与NS组给药侧绒球相比,AA组同侧BDNF、TrkB和KCC2的蛋白表达和mRNA表达均下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,且与对侧相比差异具有统计学意义（P<0.05）。与AA组相比,低剂量DXM组和高剂量DXM组给药侧绒球中BDNF、TrkB和KCC2的蛋白表达和mRNA表达依次提高,其中高剂量DXM组提高更明显,三个组组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。而DXM拮抗组给药侧绒球中BDNF、TrkB和KCC2的蛋白表达和mRNA表达较高剂量DXM组降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:鼓室注射AA可以造成大鼠外周前庭功能损伤;绒球BDNF-TrkB信号的表达下调参与了 AA所致的前庭功能障碍;DXM作用于糖皮质激素受体,激活绒球BDNF-TrkB信号,上调KCC2可能是其促进前庭中枢代偿的途径之一。
黄佳钦[4]（2020）在《理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的疗效与机制研究》文中提出目的慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）是临床常见的消化系统疾病,而在慢性萎缩性胃炎基础上伴发的肠上皮化生或（和）异型增生称为胃癌癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer,PLGC）。由于胃癌具有发病率高、生存率低、发现晚等特点,故胃癌癌前病变作为肠型胃癌发展过程中的重要中间环节,早期在此阶段进行及时、有效的干预对阻断胃癌的发生、发展具有至关重要的意义。西医对于此病的治疗主要集中在对症治疗及对因治疗,其中包括根除幽门螺杆菌、抗胆汁反流、抗氧化、叶酸及COX-2抑制剂等治疗方式,尚缺乏特异性干预措施。而中医药在整体观及辨证论治理论指导下展现出光明的前景,国内外研究发现,中医药在延缓、阻断甚至逆转PLGC方面发挥了独特的作用,且逐渐成为了研究的热点。本课题组结合PLGC病机特点及长期的临床经验,总结出使用理气活血解毒法干预PLGC,并在前期的临床研究中得出该法在PLGC的治疗上确有疗效,然其具体的分子机制仍不明确。故本课题拟从临床疗效和分子机制两部分展开研究:临床疗效部分,通过证候量表、胃镜及病理组织学等评价方式以明确理气活血解毒法治疗PLGC的临床疗效;分子机制部分,采用网络药理学技术及多色免疫荧光技术探讨理气活血解毒法干预慢性萎缩性胃炎癌前病变的作用机制。方法本研究由文献综述、临床疗效研究及分子机制研究三部分组成。文献综述部分分为以下2部分:“慢性萎缩性胃炎癌前病变中医研究进展”部分,对本病的病名、病因、病机特点、分型论治、现代医家治疗特点等方面展开论述;“慢性萎缩性胃炎癌前病变西医研究进展”部分,主要围绕本病的流行病学、病因、治疗方法及发病机制等方面进行探讨。临床疗效研究部分,收集就诊于东直门医院门诊的肝胃郁热、气虚血瘀型慢性萎缩性胃炎癌前病变患者30例,使用理气活血解毒法方药对其进行干预,对比患者治疗前后临床症状和胃镜病理学表现情况,试图探索理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的临床疗效。分子机制部分,首先采用网络药理学技术初步探索理气活血解毒法方药干预慢性萎缩性胃炎癌前病变的作用机制,进而运用理气活血解毒法干预30例肝胃郁热、气虚血瘀型慢性萎缩性胃炎癌前病变患者,运用多色免疫荧光技术检测患者治疗前后胃组织PI3K/AKT通路关键分子PI3K、AKT、Bcl-2、P53、ERBB4、PTEN的水平,尝试探讨理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的分子机制。结果（1）一般情况对比,本研究共纳入30例研究对象,其中年龄最大者68岁,最小者35岁,平均年龄为53.93±7.87,其中男性19例,女性11例,且不同性别年龄分布无统计学差异（P>0.05）;教育程度在大学以下者较多,其中高中21例,占70.00%;就诊季节以冬季（46.67%）、秋季（40.00%）居多;本病诱发情绪因素以焦虑忧虑（63.33%）、急躁易怒（60.00%）、精神紧张（43.33%）多见;患者饮食习惯以嗜食油腻（70.00%）、甜食（60.00%）、辛辣（40.00%）居多;生活作息方面,作息规律（46.67%）者多于熬夜（40.00%）与劳倦（30.00%）的患者;烟酒史方面,吸烟（43.33%）及饮酒（36.67%）患者较多。（2）临床疗效主要从临床症状积分及病理组织学积分两方面评估运用尼莫地平法计算临床症状积分得出,痊愈2例（6.67%）,显效5例（16.67%）,有效19例（63.33%）,无效4例（13.33%）,总有效率86.67%,且治疗前后患者症状总积分、主要症状积分及次要症状积分差异均具有显着统计学意义（P<0.01）。此外,对各症状治疗前后积分进行统计,得出胃脘痞塞、心烦易怒、反酸、烧心、口苦、口干、暖气、身重倦怠、精神疲乏、纳差、气短、大便溏薄症状治疗前后积分差异具有显着统计学意义（P<0.01）,胃脘疼痛、懒言症状治疗前后积分差异具有统计学意义（P<0.05）,胃中嘈杂、大便干结症状治疗前后积分差异无统计学意义（P>0.05）。对患者治疗前后病理组织学积分进行统计发现,治疗前后患者病理总积分差异具有显着统计学意义（P<0.01）,且萎缩、肠化、异型增生及慢性炎症4项病理表现治疗前后积分差异具有统计学意义（P<0.05）,而活动性病理表现治疗前后积分差异无统计学意义（P>0.05）。（3）分子机制研究结果包括网络药理学结果与PI3K/AKT通路关键分子多色免疫荧光检测结果网络药理学结果共搜集了 858个化合物,以OB≥30%,DL≥0.18为筛选条件,共得到83个口服利用度和类药性较好的候选化合物;化合物-靶点网路共有41个hub节点,其中靶点≥35个的化合物有11个,13个靶点能与≥20个化合物发生相互作用;靶点-疾病网络有54个节点,其中包含31个靶点与23个疾病;对参白颗粒中6种草药对应的靶点进行GO富集分析,确定了 324个GO条目;并对上调的部分差异基因进行KEGG通路富集分析,根据FDR≤0.01筛选得到24条KEGG通路信息。对30例患者治疗前后的胃组织PI3K/AKT通路关键分子进行多色免疫荧光检测得出,PI3K治疗前后光密度差异具有显着统计学意义（P<0.01）,AKT、Bcl-2治疗前后光密度差异具有统计学意义（P<0.05）,ERBB4、P53、PTEN治疗前后光密度差异无统计学意义（P>0.05）。结论（1）一般情况中,从性别年龄分析,该病好发于45-65岁的中老年,男性发病率较高。且患者发病与季节、饮食、情绪有关,其中就诊季节以冬、秋季节较多,情绪中焦虑忧虑、急躁易怒、精神紧张三方面因素影响较大,饮食以嗜食油腻、甜食、辛辣、生冷食物者居多,同时烟酒史也是本病发病的重要影响因素之一。（2）采用自身前后对照临床试验发现,患者治疗前后临床症状及病理组织学表现均得到了明显改善,故可以发现理气活血解毒法方药对慢性萎缩性胃炎癌前病变具有明确的临床疗效。（3）网络药理学结果发现细胞凋亡、P53、ERBB4、癌症通路等17条通路均与PI3K/AKT通路相关,由此猜测,参白颗粒干预慢性萎缩性胃炎癌前病变可能通过PI3K/AKT通路实现。进一步观察理气活血解毒法对慢性萎缩性胃炎癌前病变PI3K/AKT通路关键分子PI3K、AKT、Bcl-2、ERBB4、P53、PTEN分子的干预作用,发现理气活血解毒法可下调PI3K、AKT、Bcl-2分子的表达水平,故该法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变可能通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖发挥作用,从而影响癌变的发展。
宋丽军[5]（2020）在《新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究》文中指出新疆南疆地区具有适宜红枣生长的地理和气候条件,红枣种植面积和产量常年稳居世界首位。新疆红枣富含三萜烯酸类、黄酮类、碱基、核苷和环核苷酸类等多种功能因子,具有抗氧化应激、抗癌、抗炎症、免疫调节,以及胃肠道保护等多种生理功能。苯并芘（Ba P）广泛存在于空气、水、土壤、食品及其包装材料中,具有强烈的致癌性、致突变性和间接致畸性。Ba P通过食物、饮水、呼吸系统等途径进入人体,刺激机体产生大量的自由基而导致细胞氧化应激。氧化应激会诱发基因突变、蛋白质变性、线粒体功能障碍及脂质过氧化等损伤,是人体衰老、肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病和糖尿病的主要风险因子。因此,挖掘对抗Ba P危害的红枣功能因子,并深入探明其调控Ba P诱导的细胞氧化损伤的分子机制,对以红枣为原料的新型功能性食品的创制具有重要的科学意义。本文主要研究内容及结果如下:（1）新疆红枣功能因子鉴定及多元统计分析以新疆99个品种红枣为研究对象,采用高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）对红枣中主要功能因子（黄酮类、三萜烯酸类、碱基、核苷和环核苷酸类化合物等）进行定性定量研究。结果表明:新疆不同品种红枣中总三萜烯酸含量范围为1082.775±63.431–7915.451±510.824μg/g DW,其中京39枣（C41）含量最高;白桦脂酸、麦珠子酸、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酮酸和2α-羟基熊果酸是新疆红枣中主要的三萜烯酸;总核酸类含量范围为408.329±8.611–1030.450±24.634μg/g DW,其中骏枣变种2号（C45）含量最高;尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和腺嘌呤是新疆红枣中主要的核酸类物质;黄酮类含量范围为102.886±3.581–571.678±18.653μg/g DW,其中观音枣（C23）含量最高;儿茶素、表儿茶素、对香豆酸、芦丁、牡荆素、异牧荆素、阿魏酸、槲皮素3-O-葡萄糖苷、二氢槲皮素、柚皮苷、槲皮甙、二氢山萘酚、杨梅黄酮、圣草酚和白杨素是新疆红枣中的主要黄酮类物质。（2）基于细胞氧化损伤模型的红枣功能因子筛选首先建立了Ba P诱导的人肺部细胞氧化损伤模型;进一步基于该模型筛选红枣中对细胞氧化损伤具有最佳调控作用的功能因子及其干预方式。结果表明,以Ba P为诱导试剂,诱导浓度为400μmol/L,诱导时间为48 h条件下建立的细胞氧化损伤模型,可用于后续实验。与其他处理组相比,熊果酸（UA）干预可显着提高损伤模型细胞增殖活性和抗氧化酶活性（SOD、CAT、GSH）,同时降低细胞内丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量（P<0.05）。以选择对细胞正常生长影响较小,且相对较高的浓度水平为原则下,筛选得到UA为最佳功能因子,最佳干预浓度为10μg/m L,最佳干预时间为48 h。（3）熊果酸对苯并芘诱导的细胞氧化损伤的调控机制研究在上述功能因子筛选的基础上,以UA为最佳干预试剂,通过研究UA干预对细胞氧化损伤模型周期与凋亡、DNA损伤、自噬相关蛋白表达量的影响,以及激光扫描共焦显微镜和透射电镜检测,探讨UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的调控机制。结果表明,与氧化损伤组相比,UA干预组G0/G1期细胞增加12.770%,S期减少13.162%,G2/M期减少49.864%（P<0.01）,细胞凋亡率减少58.170%,8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）含量减少46.39%,说明UA能显着改善Ba P对细胞周期的阻滞作用和减少细胞凋亡比率,修复细胞DNA损伤。同时,损伤模型细胞经UA干预后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、ATG5、P62蛋白表达量与损伤模型组相比差异显着（P<0.05）,说明UA干预能显着降低细胞过度自噬,从而有效保护细胞免受Ba P损伤。激光扫描共焦显微镜和透射电镜检测进一步证实UA能显着降低Ba P诱导的细胞氧化损伤,其机制与抑制细胞过度自噬有关。（4）熊果酸调控苯并芘诱导的细胞氧化损伤的转录组学分析采用转录组测序技术结合生物信息学分析,研究UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的调控作用及其分子机制。结果表明,UA干预组与氧化损伤组相比,表达显着上调和下调基因分别为296和688个;差异表达基因富集到的GO条目的生物学过程主要是:细胞连接、细胞内受体信号通路、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号的调节;细胞组分主要是:核质、细胞核、细胞膜、细胞质;分子功能主要是:胰岛素样生长因子激活受体活性、蛋白酪氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、转录因子结合。差异表达基因KEGG pathway分析主要富集到NF-kappa B、Wnt、MAPK和m TOR信号通路。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）对主要差异表达基因atg2a,nfkb1,eif4ebp1,pik3ip1和nr4a1进行验证,结果表明UA调控Ba P诱导的细胞氧化损伤的机制主要通过PI3k-AKT/m TOR信号通路上的eif4ebp1、nfkb1与nr4a1基因调控其上下游基因（mapkapk2、zfp36l1、il1a）的表达,从而缓解细胞过度自噬和细胞衰老进程,进而调控Ba P诱导的细胞氧化损伤。综上所述,本研究在新疆不同品种红枣中主要功能因子系统分析的基础上,通过Ba P诱导的细胞氧化损伤模型筛选出UA为最佳功能因子,并初步阐明了UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的保护作用及其分子机制。研究结果为新疆南疆红枣精深加工和利用提供了理论依据,对南疆红枣产业的持续健康发展和农民脱贫致富具有重要意义。
张胜婷[6]（2019）在《基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究》文中研究表明G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）是细胞表面最重要的受体之一,它涉及到一系列细胞的代谢和信号传导过程,与许多重大疾病相关,同时也是许多环境激素的靶点,也是药物开发的重要靶点。目前利用GPCRs也开发了一些的检测和药物筛选技术和方法,但它们都存在敏感性不高、自动化程度低等缺点,因此如何利用不同受体的特点开发特异性强、灵敏性高和稳定性好的检测和筛选技术是我们亟待解决的问题。本论文为更好地避免N末端标记可能会对受体配件结合的影响,通过基因工程技术构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）标记受体C末端的重组细胞系的策略,以期最大限度地降低融合蛋白对受体与配体结合的影响;又利用高内涵筛选（High Content Screening,HCS）技术,建立起可对样品进行可视化和自动化的检测和筛选系统。首先,论文选择将绿色荧光蛋白（tGFP）直接标记在雌激素受体α（Estrogen Receptorα,ERα）受体的C末端的重组细胞系构建策略。首先构建了ERα/pCMV6穿梭质粒,其中含CMV真核启动,而SV40 ori是真核复制起始子。成功构建的质粒经转染导入人骨肉瘤细胞U2OS中获得了稳定的转染细胞株ERα/U2OS,其个体大、形态完整,非常有利于后期开展高内涵检测体系的建立。研究证明新构建的细胞系能与雌二醇（Estrogen 2,E2）产生特异性的反应产生荧光聚集现象,通过与高内涵技术相结合还定量分析了细胞模型对E2反应的参数,研究表明其EC50为0.1 nM,也能被抑制剂他莫西酚（TAM）所抑制,IC50为1.5 nM,该方法对E2检测的下限接近1x10-33 nM,初步满足了环境中部分污染物中E2类样品的生物学效应检测要求;同时对人工混合样品的检测表明其只能专一性地检测E2或其类似物,表明该系统可以用于将来对环境样品中E2或其类似的检测。其次,为了筛选天然产物中的活性成分,避免受体N端修饰后对活性的潜在干扰,我们构建了C末端用tGFP标记的hGLP-1R-tGFP/U2OS重组细胞系,经Exendin 4激活GLP-1受体后,观察到荧光斑点出现在细胞膜上,并随后内化形成细胞内的荧光聚集体（囊泡）,结合高含量筛选（HCS）技术定量分析重组细胞中在激动剂刺激下标记的荧光受体从聚集、内化、脱敏和复敏的过程。证实了hGLP-1R-tGFP/U2OS对GLP-1及其类似物的高活性、敏感性和特异性,这一活性可被GLP-1R的特异性拮抗剂Exendin9-39所阻断。同时研究也表明,在重组细胞系中GLP-1通路的下游,腺苷酸环化酶的激活和细胞cAMP水平的升高并没有受到C末端修饰的影响,表明该方法也可以进一步用于其它GPCR信号通路的研究。结合HCS技术的自动图像采集和数据处理系统,我们建立一种全新的GLP-1活性成分筛选检测的方法,利用该方法对云南省药物研究所提供的约100份中药粗提物进行了筛选,结果表明,黄芪、三七提取物均具有GLP-1R激动剂活性,部分粗提物中具有调节剂和抑制剂的成分,为从中药中寻找新糖尿病药物提供了重要参考。最后,为解析P2Y1R的信号传导通路,我们构建了直接受体标记和间接标记b-arrestin的两个细胞系hP2Y1R-tGFP/U2OS和hP2Y1R-?-AR2-tGFP/U2OS。研究表明:虽然两个细胞系都可被100?M的ADP激活形成荧光囊泡,并可通过高内涵技术进行自动的记录和分析,但二者表现又有所不同,其形成最大荧光值的时间分别为15和20 min,EC50值分别为35.72和71.8 nM。所有的反应都可以被特异性拮抗剂MRS2179所阻断。证明了P2Y1R途径是通过耦合Gq蛋白质而激活PKC途径进而激活磷脂酰胆碱具体的PLC,最后由磷脂酶D启动?-arrestin2介导的信号通路。这两个细胞系实现受体的再敏化时间显然不同,分别为30和45 min。这些研究首次证明了P2Y1R不仅可通过异源三聚体Gq途径,也可以通过β-arrestin2途径激活和引发下游的信号传导。本论文通过构建荧光标记不同受体的细胞模型并结合高内涵技术建立了一个对天然样品进行检测或筛选的平台。这个平台能够与靶标高亲和力特异性的结合,与传统检测/筛选方法相比,具有靶标范围广、可视化、特异强、自动化、稳定性高等特点,因而可望在将来广泛被用于环境雌激素的检测以及糖尿病和心血管疾病的天然药物筛选及受体信号通路的研究等领域。
张凯丽[7]（2019）在《靶向EZH2-EED相互作用抑制剂的发现及抗肿瘤机制研究》文中指出表观遗传（Epigenetics）是指基因的DNA序列没有改变的情况下,基因功能却发生可遗传的变化,最终导基因表型的变化。表观遗传调控方式形式多样,过程可逆,控制细胞命运,调控个体正常生长发育有序进行,并与肿瘤,糖尿病,心脏病,肠道疾病等多种疾病的发生发展也密切相关。因此表观遗传和基于表观遗传的药物开发近年来一直是研究的热点。表观遗传主要的研究内容包括:DNA的甲基化,组蛋白的各种修饰,非编码RNAs等。目前已上市的表观类抑制剂有8个,分属三个靶点,分别为2个DNA甲基化酶抑制剂,5个组蛋白去乙酰化酶抑制剂和1个异柠檬酸脱氢酶抑制剂（Isocitrate Dehydrogenase,IDH）。多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2,PRC2）是表观遗传中一颇受关注的组蛋白甲基转移酶（Histone Methyltransferases）。它是由EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）,EED（Embryonic Ectoderm Development）,SUZ12（suppressor of zeste 12）和RbAp46/48等亚基构成的复合物,主要催化H3K27甲基化,导致靶基因启动子区H3K27的高度甲基化,继而使该基因转录沉默,影响细胞的多种生物学效应,如多个调控细胞分化过程的基因皆受该甲基转移酶的调控。越来越多的研究表明EZH2与多种肿瘤的发生发展密切相关。如在淋巴瘤,胰腺癌,黑色素瘤,乳腺癌,膀胱癌,胃癌等肿瘤中,都发现EZH2的异常表达和/或突变。因此抑制PRC2复合物的活性被认为可能成为治疗肿瘤的新兴手段,很多科学家为此投入大量精力。目前靶向PRC2的抑制剂多为针对EZH2的酶活抑制剂,数个正进行临床试验,但暂时没有药物上市。EZH2既可以作为PRC2酶活催化亚基,通过H3K27me3依赖的形式抑制靶基因的表达,也可以直接激活一些非组蛋白,如直接甲基化Actin,激活GATA4（GATA binding protein 4）,AR（androgen receptor）和ER（estrogen receptor）)等。因此单独抑制EZH2的酶活,可能并不能非常好地抑制EZH2高表达和/或突变的肿瘤细胞的生长。EED对H3K27me3的识别对于PRC2活性激活,以及在抑制性染色质中通过使H3K27甲基化的扩增来使基因沉默,都至关重要。并且H3K27me3与EED的结合会导致EZH2蛋白中刺激响应性基序的构象变化,提高催化效率,这可以通过PRC2复合物的晶体结构来解释。本研究拟发现干扰EZH2和EED蛋白之间相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）的抑制剂,从而抑制PRC2整个复合物活性,发挥抗肿瘤作用。为此我们首先利用新型生物发光能量共振转移（Nano-Bioluminescence resonance energy transfer,NanoBRET）的方法在活细胞水平建立高通量的该类抑制剂筛选平台。此外,我们还在分子水平建立了基于荧光偏振（Fluorescence Polarization,FP）的该类抑制剂的评价方法。其次,通过对我们课题组建立的涵盖1000余个上市药物的小化合物库的筛选发现了一个活性化合物,并对其抗肿瘤作用和机制进行了进一步的评价。1.建立基于荧光偏振（FP）和新型的生物发光能量共振转移（NanoBRET）方法的EZH2-EED蛋白相互作用抑制剂高通量筛选平台基于荧光偏振这一物理现象而发展的化合物筛选方法已成为目前最重要的PPI抑制剂筛选手段,可以在分子水平实现化合物对靶点选择性的筛选。但分子水平筛选得到的活性化合物,往往在细胞水平的评价中表现一般。因此,在我们的筛选中,我们希望能建立细胞水平的高通量筛选模型,直接进行细胞水平的筛选评价。NanoBRET是基于生物发光能量共振转移原理新发展的一种技术,可以在活细胞水平对化合物和靶标蛋白之间的结合进行筛选,是本课题研究采用的主要筛选方法。通过将EZH2和EED两个蛋白分别和荧光供体和荧光受体构建融合蛋白表达质粒,将表达质粒同时导入工具细胞中进行表达。当EZH2和EED相互结合,使得荧光供体和荧光受体足够接近,此时加入反应底物,荧光供体催化底物产生的荧光就会转移并激活荧光供体发射荧光。将工具细胞和化合物共同孵育处理后通过检测两个荧光信号强度值及比值,就可以判断化合物是否能干扰EZH2-EED蛋白之间的相互作用。通过实验条件优化,我们找到了最佳表达质粒组合EZH2 FN31N+EED FC14H,即在EZH2蛋白的N段标记荧光供体NanoLuc,在EED蛋白的C段标记荧光受体HaloTag,并且二者按照1:1的比例导入HEK293T工具细胞中,取得较好的窗口信号值和灵敏度,且Z’因子在1左右,具有较好的稳定性和可靠性,可用于EZH2-EED PPI抑制剂活细胞水平的筛选。2.活性化合物AZD9291的发现及其抗肿瘤作用评价基于我们建立的抑制剂筛选平台,我们对课题组1000种化合物进行了筛选,其中AZD9291引起我们的关注。该化合物是三代EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）抑制剂,在2015年被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准上市用于治疗具有T790M位点突变EGFR的非小细胞肺癌。而我们的研究结果表明,AZD9291能直接和EZH2蛋白结合,干扰EZH2-EED之间的相互作用,抑制肿瘤细胞增殖,该作用的发挥与其对EGFR信号通路的抑制无关。此外,我们还发现该化合物在破坏EZH2-EED结合,从而影响PRC2稳定性的同时,还能抑制EZH2 mRNA表达,进而影响EZH2调控的基因表达,抑制肿瘤细胞运动。micRNA Array分析结果提示AZD9219可能通过上调miR-34a的表达,降低EZH2 mRNA,抑制EZH2蛋白表达。3.microRNA（miRNA）作用于mRNA的经典方式是通过其5’端的种子序列和mRNA的3’UTR（3’-Untranslated Region）区直接结合,最终被整合进RNA沉默复合物中,基于与mRNA碱基互补配对程度以及位置来调节基因表达。但也有研究表明存在一些miRNA可通过靶向mRNA的5’UTR和CDS区来调节基因的表达,甚至有些miRNA并不需要通过其种子序列和mRNA结合,而是通过其他碱基和mRNA结合,实现对mRNA的调节作用。我们通过利用NCBI数据库将miR-34a和EZH2的3’UTR区序列进行Blast,发现miR-34a和miR-3157可能以一种非经典的种子序列和EZH2的3’UTR结合,直接靶向EZH2的mRNA,促进其降解,进而抑制EZH2蛋白的表达。这种新的调节方式可能是对现有的miRNA调节mRNA机制的一种补充,还需要进一步确证。综上所述,我们建立了EZH2-EED PPI抑制剂的筛选平台,并利用该平台发现了有该活性的先导化合物AZD9291,并对其作用和机制进行了评价确证。该活性化合物的发现为该类抑制剂的研发提供了新的结构类型。
芦斌[8]（2016）在《组胺受体H4R介导ERK信号通路分子机制与受体内吞定量分析方法的研究》文中进行了进一步梳理组胺受体隶属于G蛋白偶联受体超家族,在生物体的各个组织器官中都存在分布,参与调控机体各项生理功能。其中H4R为最新发现的一种亚型,它参与调节机体包括免疫与过敏反应在内的多种生理功能,有着巨大的研究潜力。本论文针对H4R调控胞内ERK1/2磷酸化所涉及的分子机制展开研究。利用多种特异性的抑制剂抑制相关蛋白的功能,然后检测胞内ERK1/2磷酸化水平的变化情况。最终确定了参与调控H4R介导的ERK1/2过程的蛋白。Ga蛋白以及Gβγ蛋白都能够影响H4R介导的ERK1/2磷酸化的过程。钙离子非依赖型的PKC,P13K相关蛋白也涉及其中。另外,H4R还能通过转激活途径激活ERK1/2。这为进一步研究H4R对生理功能影响的分子机制,打下了一定的基础。同时,本论文还改进了以DnaE为基础的受体内吞定量分析技术。基于GPCR与Rab5在内吞过程中的相互作用,设计出新的内吞定量检测方法。该方法适用面更广,灵敏度、可靠性高,能够更好的被应用于GPCR的相关研究。
何述栋[9]（2015）在《黑芸豆凝集素的纯化和生物信息学及结构与功能特性研究》文中研究表明凝集素是一类具有重要生物活性的糖蛋白,可用于血型鉴定、细胞信号传导、恶性肿瘤细胞抑制、免疫应答和药物靶向定位的研究中,同时,凝集素也是食品中的抗营养因子。凝聚素主要存在于豆类中,黑芸豆是种植量较大的芸豆品种之一,研究发现黑芸豆中凝聚素的含量较高,但对黑芸豆凝集素的结构及生物学性质的认识非常有限。本文对黑芸豆凝集素的分离纯化、凝集素的结构、凝集素的理化性质及生物学特性与凝集素结构之间的关系进行了系统性研究,可为豆类凝集素功能性开发提供理论基础。本研究采用反胶束萃取方法对芸豆水溶性蛋白粗提取物中的凝集素进行了分离纯化,并研究了反胶束萃取方法对凝集素活性和结构的影响。确定反胶束萃取凝集素的工艺参数为:前萃取水相Na Cl浓度为77.6 mmol/L,p H值为5.7,AOT（二（2-乙基已基）丁二酸酯磺酸钠）浓度为127.4 mmol/L;后萃取水相KCl浓度为593.0 mmol/L,p H值为8.0;在最佳工艺条件下,凝集素的得率为63.2±2.4 mg蛋白/g豆,纯化倍数为8.8±0.2倍。反胶束萃取法对凝集素的活性没有影响;经傅立叶变换红外光谱和圆二色光谱分析可知,反胶束萃取对凝集素蛋白二级结构没有显着的影响。反胶束法萃取的凝集素样品经色谱纯化后纯度可达到94%以上,比传统的离子交换和分子筛纯化方法的蛋白得率提高了70%。基于LC-MS/MS方法,确定反胶束萃取分离纯化的蛋白为凝集素,与PHA-E蛋白具有高度同源性。以黑芸豆基因组DNA为模板,依据PHA-E蛋白c DNA序列合成的特异引物进行同源克隆,获得黑芸豆凝集素蛋白的编码基因序列。根据同源分析和进化分析可知,黑芸豆凝集素高度保守,可能与PHA-E蛋白共同分化自Arc7变种。根据对黑芸豆凝集素的生物信息学分析,黑芸豆凝集素为亲水蛋白,具有较高的稳定性,含有疏水内核区;在生理p H值下黑芸豆凝集素可能以四聚体形式存在,含有高度保守的Lectinleg B功能结构域;蛋白分子中含有Ca2+和Mn2+结合位点及可能与N端糖基特异性结合的位点;研究表明黑芸豆凝集素含有B淋巴细胞抗原表位和T淋巴细胞抗原表位,具有潜在的抗癌细胞活性。黑芸豆凝集素单体分子量为31 k Da,四聚体分子量约为116.97 k Da;黑芸豆凝集素单体的等电点在5.27左右,二聚体等电点在6.03左右,四聚体等电点在6.91左右。利用荧光光谱法证明黑芸豆凝集素蛋白可与N-乙酰-D-葡萄糖胺发生特异性结合,亲和常数约为0.45 mmol/L,为中等强度的亲和作用。基于凝集素活性恢复的方法,证明黑豆凝集素为金属离子依赖性蛋白,Mn2+和Ca2+是黑芸豆凝集素蛋白的必需金属离子。对黑芸豆凝集素热失活与蛋白构象之间的关系进行研究,发现加热导致凝集素蛋白折叠结构的打开,使凝集素发生变性,凝集素的热变性程度与加热温度和时间呈函数关系,其热稳定性符合一级动力学模型。采用紫外、荧光光谱和DSC法对黑芸豆凝集素的酸碱稳定性进行研究,结果表明在p H 2.010.0范围内凝集素具有相对稳定的蛋白构象。采用指数数学模型分析电泳条带光密度变化,建立了较为准确的体外模拟胃肠道消化评价体系,研究结果表明:黑芸豆凝集素在模拟胃液和胰蛋白酶消化环境下稳定性较好,半衰期分别为23 min和大于90 min;加热和去离子化处理改变了凝集素的蛋白构象,使得凝集素在模拟胃肠道环境下的消化性提高。MTT实验研究证明,在2 h内黑芸豆凝集素对肠道模拟上皮细胞无明显毒性作用。致敏实验证明低剂量黑芸豆凝集素（6 mg/120 g大鼠）未诱发动物模型的致敏症状,黑芸豆凝集素可同时促进IL-4和INF-γ细胞因子的分泌,两者的拮抗作用可能导致Ig E抗体的表达未达到阳性症状水平,研究结果证明低剂量黑芸豆凝集素蛋白不具有致敏性。初步研究了黑芸豆凝集素对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用,黑芸豆凝集素的IC50值为9.85μg/m L,凝集素对Hela细胞的抑制能力与作用剂量和时间呈正相关,高剂量的凝集素可使Hela细胞凋亡或坏死;当凝集素浓度低于IC50值时,Hela细胞以凋亡为主,当凝集素浓度高于IC50值时,Hela细胞以晚期凋亡和死亡为主;此外,黑芸豆凝集素能显着地影响Hela细胞周期分布,阻止Hela细胞从G1期进入S期,并对G2/M期也有一定的阻滞作用。
赵圣强[10]（2015）在《核孤儿受体TR3在消化道肿瘤血管生成中的分子机制研究》文中研究指明研究背景与目的血管生成在胃肠道肿瘤发生和转移过程中起到至关重要的作用,包括结肠癌、胃癌、肝癌、胆管癌等的发生和转移。在已知存在众多血管生成因子中,血管内皮生长因子（VEGF-A）和组胺（Histamine）被广泛认为是两种最重要的成员,前者其不但活性强,而且对血管内皮上表达的VEGFR-1、VEGFR-2以及神经毡蛋白受体具有一定选择性,并且几乎在所有的病理性血管生成中都高度表达,并且能影响血管生产中的多个环节。尽管人源的VEGF-A抗体阿瓦斯汀已经广泛用于临床的抗肿瘤治疗,且效果不错,但也存在明显的副作用。因此,迫切需要寻找一类能作用在VEGF-A下游靶位点的药物,以减少其副作用。组胺是一种在体内外实验中都具有重要作用的生物胺,参与急性炎症反应,也是中枢神经系统的一种重要递质。组胺在哺乳动物组织的神经元、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、胃壁细胞以及许多癌细胞中都有广泛的表达。组胺的活性由4种G蛋白偶联的受体（H1-H4）介导,且这些受体在不同组织中有不同的分布。H1受体的分布最为广泛,除了能介导中枢神经系统的功能调节外,还参与超敏反应,在这些反应中,组胺从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中被释放出来,对血管平滑肌细胞具有强烈的收缩作用,进而引起细胞的收缩和分裂,而在内皮细胞则会诱导微血管的通透性的增加,甚至内皮细胞的分裂。H2受体也参与了神经递质的传递,此外还参与胃酸的分泌和T淋巴细胞的功能,而H3则主要介导神经递质的传递。最近又有研究发现,H4还在造血系细胞上有表达并介导炎性细胞的趋化,细胞因子释放和T淋巴细胞活化等功能。TR3/Nur77属于转录因子家族的核受体IV亚家族,该家族受体有三个成员（包招Nur77, NOT1/Nurr1和NOR1）,都包含3个功能区：反式激活区、DNA结合区以及配体结合区。他们的DNA结合区高度同源,但反式激活区差异较大。由于其序列与其他受体如T细胞受体之间的高度同源性,因此在T细胞介导的凋亡和棕色脂肪产热过程中也发挥重要作用。但在胚胎的发育中,这三种受体的作用却大不相同。最近研究显示,TR3/Nur77还是血管生成过程中的一个重要介质,与微血管通透性有关。体内和体外实验均显示,TR3/Nur77在VEGF-A,组胺和五羟色胺等能导致微血管通透性增加的促血管生成因子刺激下,可以发生一过性高表达,并导致微血管通透性增加,但是其他不能引起微血管通透性增加的血管因子则没有该作用。TR3/Nur77还参与后天的血管生成。还有研究显示,TR3/Nur77对VEGF-A,组胺和五羟色胺诱导的内皮细胞的增殖,迁移,存活以及微管形成都是不可缺少的。在Nur77基因敲除的小鼠中,VEGF-A,组胺和五羟色胺对肿瘤生长,血管生成和微血管通透性的诱导作用都明显下降。但Nur77敲除小鼠不但可以存活,繁殖,并且其成年鼠的血管结构也基本正常。这些研究显示,TR3/Nur77对病理性血管生成是不可或缺的,但对于生理性血管生成以及生长发育却没有明显影响。然而,VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导作用和信号通路尚不明确,本研究对此作用及其分子机制进行了初步探讨。研究通过实时定量PCR、RNA干扰以及免疫印迹等实验方法,检测了VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导和信号通路,并借助免疫印迹以及免疫共沉淀方法,检测与TR3/Nur77表达密切相关通路中蛋白质表达水平的变化,进一步探讨了VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达诱导可能的分子机制。第一部分VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导作用研究目的1、明确TR3三种转录变异体在不同细胞系中的存在及其结构差别；2、检测VEGF-A和组胺对TR3三种转录变异体表达的影响；3、检测其他炎性因子如TNF-a, PMA, LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体表达的影响。研究方法1、在Genebank数据库进行检索查找TR3基因编码的3种转录变异体信息,比对其内含子外显子区别,并设计特异性的实时定量PCR引物序列；2、用实时定量PCR和免疫印迹技术确认TR3三种转录变异体的存在和差异性的表达；3、应用实时定量PCR明确其他炎性因子如TNF-a, PMA, LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体在不同细胞系中表达的影响；4、实验根据情况采用非对称t检验,和Mann - Whitney检验来进行统计学显着性的检查。p<0.05为差异有统计学意义。结果1、TR3三种转录变异体的Genebank数据库信息及结构和实时定量PCR引物序列TR3基因位于第12对染色体上（NC000012.12）,Genebank数据库收录的mRNA转录变异体有3个,分别为TR3转录变异体1（TR3-TV1）、TR3转录变异体2（TR3-TV2）和TR3转录变异体3（TR3-TV3）。TR3-TV1由外显子3-10构成,缺失外显子1和外显子2,；TR3-TV2则由外显子3和外显子5-10构成,缺失外显子1,2和4；而TR3-TV3则由外显子1,2以及外显子5-10构成,缺失外显子3和4。TR3-TV1和TR3-TV2均编码相同的59.8KDa大小的TR3-异构体1（TR3-iso1）蛋白；而TR3-TV3的产物为61.2KDa大小的TR3-异构体2（TR3-iso2）蛋白,该蛋白比TR3-异构体1蛋白多了13个氨基酸。我们设计了能够特异性地对TR3的3种转录变异体进行扩增的实时定量PCR引物。所得到的PCR产物用DNA电泳胶进行分析,均通过DNA测序验证序列正确无误。2、TR3三种转录变异体在不同细胞系中的存在和差异性的表达这三种TR3转录变异体在细胞内的表达水平不同,在HUVEC和HDMVEC中都是TR3-TV1表达最低,而TR3-TV3的表达最高。我们进一步对VEGF-A刺激下三种TR3转录变异体的表达情况进行了研究。在HUVEC细胞中TR3-TV1, TV2和TV3的表达分别被诱导升高了约2倍,100倍和5倍,而在HDMVEC田胞中,VEGF-A对这3中变异体的诱导作用明显更高,分别达到100倍,400倍和20倍。而且VEGF-A对TR3-TV1和TR3-TV2诱导作用峰值出现在1小时时,而对TR3-TV3诱导作用的峰值出现在2小时时（图1D）。VEGF的另一个家族成员VEGF-Al21以及另一血管生成因子Histamine对HUVEC细胞TR3转录变异体的影响与VEGF-A类似,都已刺激TR3-TV2表达上调为主,而组胺的刺激作用更强。我们还特制了针对TR3-iso2上N末端前13个氨基酸序列的抗体,并用其对HUVEC和HDMVEC细胞裂解液进行免疫印迹检测。发现,经VEGF-A刺激的HUVEC和HDMVEC中TR3-iso2蛋白水平明显升高。TR3-iso1和TR3-iso2的共同抗体（TR3-iso1&2）也有类似结果。但是,在HDMVEC的细胞裂解液中存在多条TR3条带,暗示其中的TR3发生高度磷酸化。我们的数据显示,在内皮细胞中存在TR3转录变异体,且这些TR3转录变异体在VEGF-A/Histamine的刺激下表达上调程度有所差异。3、其他炎性因子如TNF-a, PMA, LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体表达的影响我们对HUVEC细胞,人结肠肿瘤细胞HCT116、人前列腺癌肿瘤细胞PC3和LnCap用生长因子EGF或炎性因子TNF-a, PMA, LPS和CHX进行刺激,发现,在接受生长因子EGF刺激下这些细胞的TR3的这三种转录变异体均有一定程度升高,以TR3-TV2表达上调最为明显,且峰值出现在1小时。其他炎性因子也可刺激这些细胞内TR3转录变异体的上调,其中PMA可刺激HUVEC细胞的TR3-TV2在一小时的时间点上上调400多倍,而炎性因子CHX则主要诱导HUVEC的TR3-TV3表达上调,且增高可达30余倍。这表明,TR3的这三种转录变异体广泛存在于这些细胞内,并且在受到不同的炎性因子和生长因子刺激时,表达可以有不同程度的上调。结论1、TR3存在三种转录变异体,且这三种转录变异体的表达存在差异性；2、VEGF-A和组胺对TR3转录变异体的表达有很强的刺激作用,且均以TR3-TV2表达上调最为明显；3、TR3三种转录变异体也存在于其他肿瘤细胞系中,且不同的炎性因子和生长因子对其表达的影响不同；VEGF-A和组胺对TR3/Nur77表达诱导作用的分子机制研究目的1、检测参与介导VEGF-A和组胺对TR3转录变异体转录影响的可能信号通路。2、检测VEGF家族不同成员对TR3转录变异体转录的影响,并确定参与VEGF-A诱导TR3转录上调的VEGF受体类型。3、检测IGF-1R在VEGF-A诱导的TR3转录上调过程中的作用。4、检测介导组胺诱导的TR3转录上调的受体类型以及IGF-1R对组胺诱导的TR3转录上调的影响。研究方法1、实时定量PCR方法检测多条常见信号通路抑制剂和shRNA对VEGF-A和组胺诱导TR3转录变异体转录的影响。2、实时定量PCR方法检测VEGF家族不同成员对TR3转录变异体转录的影响,并用免疫印迹方法检测VEGF下游MAPK表达情况。3、用VEGF和EGF受体嵌合体系统对参与VEGF诱导TR3转录上调的VEGF受体类型继续确认,并检测其下游MAPK的表达。4、加入IGF-1R特异性抑制剂和shRNA后,观察IGF-1R在VEGF-A诱导的TR3转录上调过程中的作用。5、用免疫印迹方法检测VEGF对IGF-1R磷酸化的影响,并用免疫共沉淀方法检测KDR与IGF-1R的相互作用。6、用特异性组胺受体抑制剂研究介导组胺诱导TR3转录避变异体的受体类型,并探讨IGF-1R对该通路的影响。结果1、参与调节VEGF-A诱导TR3转录变异体表达的信号通路我们用三种转录变异体特异性的引物对VEGF-A刺激下的TR3-TV2和TR3-TV3调节通路予以了研究。发现：BAPTA/AM（一种能抑制细胞内Ca2+释放的抑制剂）和环孢菌素-A（一种钙调磷酸酶抑制剂）几乎能完全阻断VEGF-A对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用。而钙调素拮抗剂W-7以及CaM激酶Ⅱ抑制剂KN62则对VEGF-A的该作用几乎没有影响。而且,PLC抑制剂U-73122, PLC显性失活对照（PLC-DN）, PKC抑制剂GF109203X,经PMA处理的PKC表达下调,PKCδ显性失活突变体（PKCδ-DN）, PKD抑制剂（CID2011756）,PKD异构体1shRNA （shPKD）,和MEK抑制剂（PD98059）,IκB shRNA （shIκB）,p38抑制剂SB203580以及JNK抑制剂Ⅱ都几乎能完全抑制VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调。而PI-3激酶抑制剂以及P13K和Akt的显性失活突变体则对VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达几乎没有影响。这些数据表明,Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路,NF-κB通路以及MAP激酶（ERK, p38和JNK）通路在VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达发挥关键性作用,而PI3K-Akt通路则没有参与该过程的调节用。2、参与调节组胺诱导TR3转录变异体表达的信号通路对组胺诱导TR3转录变异体表达调节的信号通路研究发现：BAPTA/AM和环孢菌素-A几乎能完全阻断组胺对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用。而钙调素拮抗剂W-7以及CaM激酶Ⅱ抑制剂KN62则对该作用几乎没有影响。而且,PLC抑制剂U-73122,PLC显性失活对照（PLC-DN）, PKC抑制剂GF109203X,经PMA处理的PKC表达下调,PKCδ显性失活突变体（PKCδ-DN）, PKD抑制剂（CID2011756）, PKD异构体shRNA （shPKD）,和MEK抑制剂（PD98059）,都几乎能完全抑制组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调。而PI-3激酶抑制剂,PI3K和Akt的显性失活突变体,IκB shRNA（shIκB）,p38抑制剂SB203580以及JNK抑制剂Ⅱ则对组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达几乎没有影响。我们的数据表明,Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路,以及MAP激酶（ERK）通路在组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达发挥关键性作用,而PI3K-Akt通路和NF-κB通路则没有参与该过程的调节用。3. VEGF家族其他成员对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用我们还对VEGF-A诱导TR3转录变异体表达时起作用的4种VEGF受体类型进行了进一步的验证。VEGF-A与VEGFR1/Flt-1, VEGFR2/KDR,申经毡蛋白1（NP-1）以及神经毡蛋白2（NP-2）都能结合,VEGF-B和P1GF仅能与VEGFR1/Flt-1, NP-1和NP-2发生相互作用,而VEGF-E则仅能够与VEGFR2/KDR发生相互作用。我们还发现,VEGF-A和VEGF-E可以同时上调TR3-TV2和TR3-TV3的表达,而VEGF-B和P1GF则对两者都没有作用。这些数据显示,VEGFR2/KDR介导了VEGF-A刺激下TR3-TV2和TR3-TV3上调,而VEGFRl/Flt-1, NP-1或者NP-2都不起作用。我们还对HUVEC细胞予以VEGF-A+VEGF-B, VEGF-A+P1GF, VEGF-E+VEGF-B和VEGF-E+P1GF进行刺激,结果显示,尽管VEGF-B或者P1GF都可以导致MAPK的磷酸化,但对于VEGF-A或者VEGF-E所诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调没有影响。这些数据表明,VEGFR2/KDR,而非VEGFR1/Flt-1或者神经毡蛋白介导了VEGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达。4、VEGF嵌合受体无法导致TR3-TV2的高表达我们将HUVEC细胞分别单独或联合转染蛋白嵌合受体,并以EGF取代VEGF-A对细胞进行刺激,这样,每个受体的传导通路都被分别开来。所得的数据显示：与对照组相比相比,经转染EGDR的HUVEC细胞中,EGF仅能诱导TR3-TV2mRNA表达上调15倍作用,比VEGF-A或者VEGF-E诱导的非转染细胞低75%,而EGF诱导的TR3-TV3为5倍左右,与VEGF-A或者VEGF-E诱导的非转染HUVEC细胞类似。而且与EGDR一起联合转染EGLT或EGNP-1对EGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3几乎没有影响。随之,我们对实验中所使用的该EGF-EGDR系统通过特异性的MAPK磷酸化抗体的免疫印迹分析进行了有效性验证。这些数据显示,除了VEGFR2/KDR外,应该还有其他受体参与了VEGF-A诱导的TR3-TV2高表达。5、IGF-1R对VEGF-A刺激下的TR3-TV2表达的影响我们对HUVEC细胞予以VEGFR2/KDR激酶抑制剂SU1498, IGF-1R激酶抑制剂AG1024处理后,或者进行转染shKDR或者shIGF-1R2后,予以VEGF-A刺激,实时定量PCR数据显示,AG1024和shIGF-1R2能显着性抑制TR3-TV2的表达上调,但对TR3-TV3的表达没有影响,而shKDR几乎能同时完全抑制VEGF-A所诱导的TR3-TV2和TR3-TV3两种变异体的表达。虽然SU1498能增加TR3-TV2的表达,但对TR3-TV3的表达却没有影响。综合所有这些数据,我们发现VEGFR2/KDR介导了VEGF-A所诱导的TR3-TV3表达,而VEGFR2/KDR或者EGDR仅能介导VEGF-A所诱导的低水平的TR3-TV2表达,高水平的TR3-TV2表达则需要另一种受体-IGF-1R的共同参与。我们还发现,IGF-1R不参与VEGF-A诱导的MAPK磷酸化过程。6、VEGF-A所诱导的IGF-1R磷酸化以及其与VEGFR2/KDR的交联作用我们进一步对IGF-1R调节VEGF-A诱导TR3变异体表达的信号通路进行了研究。HUVEC细胞经血清饥饿后予以VEGF-A, VEGF-B, VEGF-E和P1GF刺激,之后提取细胞裂解液用特异性的IGF-1Rβ抗体进行免疫印迹研究。研究发现,VEGF-A和VEGF-E能诱导IGF-1R磷酸化,但VEGF-B或者P1GF却没有该作用,而且VEGF-A导致的IGF-1R磷酸化可以完全被KDR的沉默RNA-shKDR所抑制,但KDR的另一种化学抑制剂SU1498或IGF-1R的化学抑制剂AG1024则没有该作用,并且EGF也不能在EGDR转染HUVEC中诱导该效应。我们随之用特异性的VEGFR2/KDR或者IGF-1Rα抗体进行免疫共沉淀发现,VEGF-A刺激后,在VEGFR2/KDR抗体的免疫共沉淀物中检测到磷酸化的IGF-1Rβ和IGF-1Rα,而在IGF-1R抗体的免疫共沉淀物中则检测到了VEGFR2/KDR.这些数据表明,VEGF-A能够诱导VEGFR2/KDR和IGF-1Rα/IGF-1Rβ的物理学相互作用。7、参与组胺诱导的TR3转录变异体表达的受体类型及IGF-1R对该过程的影响我们对经血清饥饿处理的HUVEC细胞分别用H1,H2和H4特异性的阻断剂处理后,发现TR3-TV2的转录刺激主要由H1受体介导,而TR3-TV3的转录上调则由H1和H4共同介导。此外,我们还发现IGF1-R的特异性化学阻断剂AG1024和shRNA均可以下调组胺对TR3转录的刺激,表明IGF1-R在组胺刺激的TR3转录上调过程中有一定作用。但在免疫印迹研究中,我们发现,组胺并不诱导IGF1-R的磷酸化,但AG1024可以一定程度上抑制组胺导致的ERK磷酸化。这些结果表明,组胺通过其受体H1和H4介导对TR3转录的诱导,并且受体IGF1-R似乎也对这一通路有一定影响,但具体机制尚不明确。结论1、钙PLC-PKC-PKD1通路和NF-κB通路和MAP激酶（ERK, p38和JNK）通路在VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表达中都起到重要作用；而组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表达则主要由钙PLC-PKC-PKD1通路介导。2、VEGFR2/KDR,而非VEGFR1/Flt-1或者神经毡蛋白介导了VEGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达。3、VEGF-A和VEGF-E可以诱导胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）的磷酸化,并促成其与VEGF受体2（KDR）发生交联,进而导致TR3-TV2的高表达。4、组胺通过其受体H1和H4介导对TR3转录的诱导,并且受体IGF-1R对这一通路的传导有一定影响。
二、Study of signal pathway of histamine H_3 receptor on AtT-20 cell（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Study of signal pathway of histamine H_3 receptor on AtT-20 cell（论文提纲范文）
（1）类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究现状 |
| 1.1.1 TPSD1研究现状 |
| 1.1.2 UNG研究现状 |
| 1.2 研究方法和原始结果 |
| 1.2.1 数据来源和方法 |
| 1.2.2 TPSD1网络构建 |
| 1.2.3 UNG网络构建 |
| 1.3 问题提出和解决方案 |
| 1.3.1 TPSD1和UNG有丝分裂差异 |
| 1.3.2 TPSD1和UNG神经内分泌和先天性免疫反应差异 |
| 1.3.3 TPSD1和UNG炎症反应差异 |
| 1.4 论文的课题来源和创新点 |
| 1.5 论文的主要内容和结构安排 |
| 第二章 TPSD1知识和分子网络 |
| 2.1 TPSD1反馈激活网络 |
| 2.2 TPSD1上游激活网络 |
| 2.3 TPSD1下游激活网络 |
| 2.4 TPSD1反馈抑制网络 |
| 2.5 TPSD1上游抑制网络 |
| 2.6 TPSD1下游抑制网络 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 UNG知识和分子网络 |
| 3.1 UNG反馈激活网络 |
| 3.2 UNG上游激活网络 |
| 3.3 UNG下游激活网络 |
| 3.4 UNG反馈抑制网络 |
| 3.5 UNG上游抑制网络 |
| 3.6 UNG下游抑制网络 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 TPSD1与UNG网络比较 |
| 4.1 有丝分裂 |
| 4.1.1 TPSD1与有丝分裂抑制 |
| 4.1.2 UNG与有丝分裂激活 |
| 4.2 神经内分泌和先天性免疫反应 |
| 4.2.1 TPSD1与神经内分泌抑制 |
| 4.2.2 UNG与先天性免疫反应抑制 |
| 4.3 炎症反应 |
| 4.3.1 TPSD1与炎症反应激活 |
| 4.3.2 UNG与炎症反应抑制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）FGFR-2基因多态性以及作为microRNA-494的靶基因与乳腺癌的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 参考文献 |
| 第二章 中国人群中FGFR-2和PI3KCA基因变异与乳腺癌风险的关系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂耗材 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 研究人群 |
| 2.2.4 基因组DNA的提取和基因分型 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624与BC风险的关系 |
| 2.3.2 FGFR-2 rs1219648或PI3KCA rs6443624与BC临床病理特征的关系 |
| 2.3.3 FGFR-2 rs1219648对BC患者预后的影响 |
| 2.4 实验讨论 |
| 2.5 实验结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-494过表达或沉默对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂耗材 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 病人组织样本 |
| 3.2.4 细胞培养 |
| 3.2.5 qRT-PCR |
| 3.2.6 细胞转染 |
| 3.2.7 细胞活力检测 |
| 3.2.8 细胞凋亡率的检测 |
| 3.2.9 Western blot检测 |
| 3.2.10 细胞迁移率检测 |
| 3.2.11 细胞侵袭率检测 |
| 3.2.12 统计方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 miR-494在BC细胞系及BC组织中的表达 |
| 3.3.2 在MDA-MB-453和MCF-7细胞中过表达和沉默miR-494 |
| 3.3.3 过表达或沉默miR-494对MDA-MB-453和MCF-7细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 过表达或沉默miR-494对MDA-MB-453和MCF-7细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 过表达或沉默miR-494对MDA-MB-453和MCF-7细胞迁移的影响 |
| 3.3.6 过表达或沉默miR-494对MDA-MB-453和MCF-7细胞侵袭的影响 |
| 3.4 实验讨论 |
| 3.5 实验结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 miR-494靶向FGFR-2基因抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞行为 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂耗材 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 细胞转染 |
| 4.2.5 报告载体构建和荧光素酶报告基因测定 |
| 4.2.6 Western blot检测 |
| 4.2.7 细胞活力检测 |
| 4.2.8 细胞凋亡率检测 |
| 4.2.9 细胞迁移率检测 |
| 4.2.10 细胞侵袭率检测 |
| 4.2.11 统计方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 miR-494过表达对MDA-MB-453和MCF-7细胞中FGFR-2的表达的影响 |
| 4.3.2 FGFR-2是miR-494的一个靶基因 |
| 4.3.3 在MDA-MB-453和MCF-7细胞中过表达FGFR-2 |
| 4.3.4 miR-494通过调控FGFR-2影响MDA-MB-453和MCF-7细胞增殖 |
| 4.3.5 miR-494通过调控FGFR-2影响MDA-MB-453和MCF-7细胞凋亡 |
| 4.3.6 miR-494通过调控FGFR-2影响MDA-MB-453和MCF-7细胞迁移 |
| 4.3.7 miR-494通过调控FGFR-2影响MDA-MB-453和MCF-7细胞侵袭 |
| 4.3.8 miR-494通过调控FGFR-2影响MDA-MB-453和MCF-7细胞中的RAS/RAF/MEK/ERK信号通路 |
| 4.3.9 miR-494通过调控FGFR-2影响MDA-MB-453和MCF-7细胞中的PI3K/AKT信号通路 |
| 4.4 实验讨论 |
| 4.5 实验结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 综述:乳腺癌疾病研究进展 |
| 5.1 乳腺癌概况 |
| 5.2 发病机制 |
| 5.2.1 遗传因素 |
| 5.2.2 基因突变 |
| 5.2.3 机体免疫功能下降 |
| 5.2.4 神经功能异常 |
| 5.3 预防与治疗 |
| 5.3.1 化疗 |
| 5.3.2 内分泌治疗 |
| 5.3.3 靶向治疗 |
| 5.3.4 免疫治疗 |
| 5.4 小结 |
| 附录附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）地塞米松对前庭中枢代偿中小脑绒球BDNF、TrkB和KCC2的影响及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 国内外研究概况 |
| 1.3 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法与流程 |
| 2.3 IHC步骤 |
| 2.4 Western-blot步骤 |
| 2.5 RT-qPCR步骤 |
| 2.6 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 行为学结果 |
| 3.2 IHC结果 |
| 3.3 Western-blot结果 |
| 3.4 RT-qPCR结果 |
| 第四章 补充实验 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 动物分组及给药 |
| 4.3 实验方法和步骤 |
| 4.4 IHC、Western-blot、RT-qPCR步骤 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.6 实验结论 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 大鼠鼓室注射AA建立前庭功能障碍模型具有可行性和稳定性 |
| 5.2 小脑绒球通过浦肯野细胞调节双侧MVN兴奋性平衡而促进前庭代偿 |
| 5.3 DXM可剂量依赖性地缓解绒球BDNF和TrkB表达的抑制,从而上调KCC2改变抑制性递质的表达 |
| 5.4 DXM可能通过GR激活来改变BDNF-TrkB信号 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 小脑在前庭代偿中的作用和研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读硕士期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（4）理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的疗效与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性萎缩性胃炎癌前病变中医研究进展 |
| 1 中医病名认识 |
| 2 中医病因病机认识 |
| 3 现代医家辨证论治特点 |
| 4 辨病专方治疗 |
| 5 中成药治疗 |
| 6 外治法 |
| 7 中医药治疗慢性萎缩性胃炎的机制研究 |
| 8 理气活血解毒法 |
| 9 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 慢性萎缩性胃炎癌前病变西医研究进展 |
| 1 病因 |
| 2 治疗 |
| 3 PI3K/AKT通路研究现状 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床疗效研究 慢性萎缩性胃炎癌前病变临床疗效研究 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究内容与方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 分子机制研究 |
| 一、理气活血解毒法方药治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的网络药理学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 二、理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的机制研究 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究内容 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 1 研究结论 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 红枣的起源与分布 |
| 1.1.2 红枣的分类 |
| 1.2 红枣的功能性 |
| 1.2.1 抗氧化和神经保护特性 |
| 1.2.2 抗癌作用 |
| 1.2.3 抗炎症与免疫调节作用 |
| 1.2.4 心脏、肝脏与胃肠道保护作用 |
| 1.2.5 其他生理活性 |
| 1.3 红枣的功能因子及其生物活性 |
| 1.3.1 多酚类化合物 |
| 1.3.2 多糖类化合物 |
| 1.3.3 碱基、核苷和核苷酸类化合物 |
| 1.3.4 三萜烯酸类化合物 |
| 1.4 熊果酸及其功能性研究进展 |
| 1.4.1 熊果酸概述 |
| 1.4.2 熊果酸功能性研究进展 |
| 1.5 本课题研究的意义、主要内容及技术路线 |
| 1.5.1 本课题研究的意义 |
| 1.5.2 本课题研究的主要内容 |
| 1.5.3 本课题研究的技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 新疆红枣功能因子鉴定及多元统计分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 主要材料和试剂 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 红枣功能因子提取 |
| 2.3.2 红枣功能性成分定性与定量分析 |
| 2.3.3 抗氧化活性测定 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 不同品种红枣中三萜烯酸含量 |
| 2.5.2 不同品种红枣中碱基、核苷和环核苷酸含量 |
| 2.5.3 不同品种红枣中黄酮类含量 |
| 2.5.4 不同品种红枣中功能因子多元统计分析 |
| 2.5.5 不同品种红枣叶子多酚类分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于细胞氧化损伤模型的红枣功能因子筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 材料和仪器 |
| 3.2.2 耗材和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 苯并芘诱导细胞损伤模型的构建 |
| 3.3.3 不同功能因子对细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.4 功能因子对损伤模型细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.5 功能因子提前干预对损伤模型细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.6 单一功能因子对损伤模型细胞抗氧化酶活性的影响 |
| 3.3.7 功能因子对损伤模型细胞活性氧和丙二醛含量的影响 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 苯并芘诱导细胞损伤模型的构建 |
| 3.5.2 不同功能因子对细胞增殖活性的影响 |
| 3.5.3 不同功能因子组合对细胞增殖活性的影响 |
| 3.5.4 不同功能因子对损伤模型细胞生长的影响 |
| 3.5.5 不同功能因子组合对损伤模型细胞生长的影响 |
| 3.5.6 不同功能因子对ROS及 MDA含量的影响 |
| 3.5.7 不同功能因子对细胞抗氧化酶活性的影响 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 熊果酸对苯并芘诱导的细胞氧化损伤的调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.2.1 材料和仪器 |
| 4.2.2 主要耗材和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 实验分组 |
| 4.3.3 试验方法 |
| 4.4 统计分析 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 熊果酸对细胞周期与凋亡的影响 |
| 4.5.2 熊果酸对细胞8-OHdG含量的影响 |
| 4.5.3 熊果酸对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.4 LC3自噬的激光扫描共聚焦观察 |
| 4.5.5 自噬小体的透射电镜观察 |
| 4.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 熊果酸调控苯并芘致细胞氧化损伤的转录组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 .实验仪器和材料 |
| 5.2.1 仪器设备 |
| 5.2.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 试剂配制 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 实验分组 |
| 5.3.4 细胞总RNA的提取及质检 |
| 5.3.5 RNA样本的处理及测序 |
| 5.3.6 测序数据预处理及质量控制 |
| 5.3.7 基因表达水平分析 |
| 5.3.8 差异基因表达分析 |
| 5.3.9 差异表达基因的GO功能注释和KEGG pathway分析 |
| 5.3.10 差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 测序序列质量评估(Fast QC) |
| 5.4.2 基因表达水平分析 |
| 5.4.3 差异表达基因分析 |
| 5.4.4 差异表达基因功能分析 |
| 5.4.5 差异表达基因q RT-PCR验证 |
| 5.4.6 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.论文创新点 |
| 3.展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 G蛋白偶联受体 |
| 1.1.1 G蛋白偶联受体(GPCRS)的分类 |
| 1.1.2 重要的生物效应靶标 |
| 1.1.3 G蛋白偶联受体(GPCR)的信号传导 |
| 1.1.4 G蛋白偶联受体(GPCR)研究热点 |
| 1.2 高内涵筛选技术及其应用 |
| 1.2.1 高内涵筛选技术在检测中的应用 |
| 1.2.2 高内涵技术在分子机制研究中的应用 |
| 1.2.3 高内涵靶向药物筛选技术 |
| 1.3 环境激素及其检测 |
| 1.3.1 环境及环境污染的定义及种类 |
| 1.3.2 化学污染物及其分类 |
| 1.3.3 环境荷尔蒙 |
| 1.3.4 环境雌激素及其危害 |
| 1.4 天然产物(中药)活性成分的筛选技术 |
| 1.4.1 天然产物的高通量筛选技术 |
| 1.4.2 基于GPCRs的新药筛选 |
| 1.4.3 药物HCS分析用于中药和天然药物现代化的优势 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究路线 |
| 1.6 论文的意义 |
| 第二章 ERα荧光标记细胞系的建立及雌激素的检测 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.2 稳定转染ERα的 U2OS细胞系建立 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.3 ERα受体激动剂的高通量筛选模型建立 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.4 本章总结与讨论 |
| 第三章 荧光标记GLP-1R高内涵细胞筛选平台的建立及天然活性成分的筛选 |
| 3.1 重组pCMV6-GFP-GLP-1R质粒的构建 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 稳定转染pCMV6-GFP-GLP-1R的 U2OS细胞系的建立 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 重组细胞hGLP-1R-tGFP高内涵药物筛选体系的建立 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.3.3 结果 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 基于高内涵系统GLP-1R/U2OS对天然产物活性成分的初筛 |
| 3.4.1 材料 |
| 3.4.2 方法 |
| 3.4.3 结果 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 本章总结与讨论 |
| 第四章 基于荧光标记P2Y1R高内涵系统对P2Y1 信号通路的解析 |
| 4.1 重组质粒p CMV6-t GFP-P2Y1、p CMV6-t GFP-barresin2 和p S100024-P2Y1R的构建 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 p CMV6-t GFP- P2Y1R、barresin2 和p S100024-P2Y1R细胞系的构建 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.2.4 小结 |
| 4.3 P2Y1R受体、配体相互作用机制及信号通路的解析 |
| 4.3.1 材料 |
| 4.3.2 方法 |
| 4.3.3 结果 |
| 4.3.4 小结 |
| 4.4 本章总结与讨论 |
| 第五章 总结及展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
（7）靶向EZH2-EED相互作用抑制剂的发现及抗肿瘤机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 表观遗传和肿瘤 |
| 1.1.1 表观修饰酶 |
| 1.1.2 非编码 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs |
| 1.2 靶向肿瘤表观修饰酶的研究现状 |
| 1.3 PRC2/EZH2 和肿瘤的发生发展 |
| 1.3.1 PRC2 和 EZH2 生物学功能 |
| 1.3.2 靶向PRC2抑制剂的研究现状 |
| 1.3.3 目前靶向PRC2抑制剂的开发和研究方法 |
| 1.4 表观遗传领域抑制剂研发存在的问题 |
| 1.5 课题研究内容和方案 |
| 第二章 EZH2-EED 蛋白相互作用抑制剂高通量筛选平台的建立 |
| 2.1 基于 NanoBRET 方法,建立活细胞水平、高通量 EZH2-EED 蛋白蛋白相互作用抑制剂筛选平台 |
| 2.1.1 材料和方法 |
| 2.1.1.1 细胞和大肠杆菌的培养 |
| 2.1.1.2 试剂和耗材 |
| 2.1.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.1.4 表达质粒构建与验证 |
| 2.1.1.5 最佳质粒组合选择 |
| 2.1.1.6 质粒导入细胞最佳比例选择 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.2.1 EZH2 FN31N+EED FC14H 为最佳质粒组合 |
| 2.1.2.2 EZH2 FN31N+EED FC14H 最佳质粒转染比例为 1:1 |
| 2.2 建立基于FP的分子水平高通量抑制剂筛选平台 |
| 2.2.1 材料和方法 |
| 2.2.1.1 主要试剂,耗材和实验仪器 |
| 2.2.1.2 EED蛋白表达质粒和蛋白表达纯化 |
| 2.2.1.3 多肽的合成 |
| 2.2.1.4 FP实验条件 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 EZH2-EED 相互作用小分子抑制剂的发现及作用机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞株和细胞培养 |
| 3.1.2 实验试剂,耗材和主要实验仪器 |
| 3.1.3 NanoBRET 检测 |
| 3.1.4 蛋白质免疫印迹实验(Western Blotting) |
| 3.1.5 蛋白热迁移实验 |
| 3.1.6 全细胞热迁移实验 |
| 3.1.7 FP实验 |
| 3.1.8 磺酰罗丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)检测贴壁细胞增殖实验 |
| 3.1.9 CCK8检测悬浮细胞的增殖实验 |
| 3.1.10 RNA 提取和实时定量(real-time PCR)实验 |
| 3.1.11 细胞周期和凋亡检测 |
| 3.1.12 平板克隆形成实验 |
| 3.1.13 免疫荧光 |
| 3.1.14 迁移(Transwell)实验 |
| 3.1.15 细胞划痕实验 |
| 3.1.16 逆转录和 qRT-PCR 检测基因 miRNAs 表达水平 |
| 3.1.17 双荧光素酶报告基因系统检测 |
| 3.1.18免疫共沉淀实验 |
| 3.1.19 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 AZD9291 干扰 EZH2-EED 蛋白之间的相互作用 |
| 3.2.2 AZD9291特异性抑制H3K27甲基化 |
| 3.2.3 AZD9291 影响 EZH2-EED 的蛋白相互作用不依赖于 EGFR |
| 3.2.4 AZD9291的抗肿瘤作用 |
| 3.2.4.1 AZD9291抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3.2.4.2 AZD9291抑制肿瘤细胞体外运动 |
| 3.2.4.3 AZD9291诱导细胞自噬 |
| 3.2.5 AZD9291 直接促进 EZH2 蛋白的泛素化降解 |
| 3.2.6 AZD9291 促进 EZH2 蛋白降解,不依赖 EGFR 下游信号通路 |
| 3.2.7 AZD9291 通过上调 micRNAs,抑制 EZH2 mRNA 的表达 |
| 3.2.7.1 AZD9291 下调 EZH2 mRNA |
| 3.2.7.2 AZD9291 通过影响 miR-34a,抑制 EZH2 mRNA |
| 3.2.8 miR-34a 可模拟 AZD9291 对肿瘤细胞的多种生物学效应 |
| 3.2.9 miR-34a 可能通过非经典的方式靶向 EZH2 的 3’UTR,调节 EZH2 mRNA的表达 |
| 3.2.10 AZD9291 通过上调 miR-3157,下调 EZH2 的 mRNA |
| 3.2.10.1 miR-3157 靶向 EZH2 |
| 3.2.10.2 AZD9291 上调 miR-3157 发挥抗肿瘤作用 |
| 3.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附录 就读期间参加的学术会议 |
| 附表 1:检测 MDA-MB-453 细胞中miRNAs表达的变化 |
（8）组胺受体H4R介导ERK信号通路分子机制与受体内吞定量分析方法的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 1 综述 |
| 1.1 组胺受体的研究发展 |
| 1.1.1 H1R的发现与研究 |
| 1.1.2 H2R的发现与研究 |
| 1.1.3 H3R的发现与研究 |
| 1.1.4 总结 |
| 1.2 H4R的研究发展 |
| 1.2.1 H4R的发现 |
| 1.2.2 H4R的激动剂 |
| 1.2.3 H4R的拮抗剂 |
| 1.2.4 总结 |
| 1.3 定量分析GPCR内吞的实验技术 |
| 1.3.1 GPCR的内吞 |
| 1.3.2 以DnaE为基础的定量内吞检测方法 |
| 1.3.3 总结 |
| 参考文献 |
| 2 组胺H4R介导的ERK1/2信号通路分子机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒扩增与提取 |
| 2.2.2 细胞培养、冻存与复苏 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 胞内Ca~(2+)的测定 |
| 2.2.5 基于CRE报告基因的胞内cAMP的检测 |
| 2.2.6 蛋白免疫印迹检测反洗磷酸化ERK1/2 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 H4R介导的浓度依赖性与时间梯度的ERK1/2的激活 |
| 2.3.2 PTX对H4R介导的ERK1/2激活的影响 |
| 2.3.3 Gβγ亚基在H4R介导的ERK1/2磷酸化过程中的作用 |
| 2.3.4 PKC对H4R介导的ERK1/2磷酸化过程的影响 |
| 2.3.5 PI3K、PDK1、Src对H4R介导的ERK1/2磷酸化过程的影响 |
| 2.3.6 H4R通过转激活途径激活ERK1/2 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 3 以DnaE与Rab5为基础的GPCR内吞定量分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的基因载体的构建 |
| 3.2.2 细胞培养、冻存与复苏 |
| 3.2.3 细胞转染 |
| 3.2.4 胞内荧光素酶活性的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 G蛋白偶联受体内吞的定量检测 |
| 3.3.2 功能缺失型G蛋白偶联受体内吞的定量检测 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（9）黑芸豆凝集素的纯化和生物信息学及结构与功能特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 凝集素学的研究进展 |
| 1.2.1 凝集素的定义和分类 |
| 1.2.2 凝集素的分布 |
| 1.2.3 凝集素的结构及理化性质 |
| 1.2.4 凝集素的生物功能特性 |
| 1.2.5 凝集素的应用 |
| 1.3 芸豆凝集素的研究进展 |
| 1.3.1 芸豆凝集素的分离纯化 |
| 1.3.2 芸豆凝集素的蛋白结构研究 |
| 1.3.3 芸豆凝集素的理化性质研究 |
| 1.3.4 芸豆凝集素的生物安全性和活性研究 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料和设备 |
| 2.1.1 主要原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 测定方法 |
| 2.2.1 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.2 凝血活性测定 |
| 2.2.3 反胶束水分含量的测定 |
| 2.2.4 凝胶电泳分析 |
| 2.2.5 反向高效液相色谱分析 |
| 2.2.6 傅立叶变换红外光谱分析 |
| 2.2.7 圆二色光谱分析 |
| 2.2.8 串联质谱分析 |
| 2.2.9 高效凝胶排阻色谱分析 |
| 2.2.10 全柱成像等电聚焦毛细管电泳仪分析 |
| 2.2.11 荧光光谱分析 |
| 2.2.12 紫外光谱分析 |
| 2.2.13 差示扫描量热分析 |
| 2.2.14 主动全身过敏实验 |
| 2.2.15 被动皮肤过敏实验 |
| 2.2.16 大鼠免疫血清中Ig E抗体的测定 |
| 2.2.17 大鼠免疫血浆中组胺的测定 |
| 2.2.18 大鼠免疫血清中细胞因子的测定 |
| 2.2.19 MTT细胞增殖及细胞毒性测定 |
| 2.2.20 细胞形态学观察 |
| 2.2.21 细胞的凋亡与坏死测定 |
| 2.2.22 细胞周期的测定 |
| 2.3 论文前期研究进展及研究对象选择 |
| 2.4 反胶束分离纯化黑芸豆凝集素的实验 |
| 2.4.1 芸豆水溶性蛋白的提取工艺实验 |
| 2.4.2 黑芸豆凝集素的反胶束萃取实验 |
| 2.4.3 反胶束萃取对黑芸豆凝集素蛋白结构影响的实验 |
| 2.5 黑芸豆凝集素的蛋白鉴定及生物信息学分析实验 |
| 2.5.1 黑芸豆凝集素蛋白的鉴定及基因克隆 |
| 2.5.2 黑芸豆凝集素的蛋白序列分析 |
| 2.5.3 黑芸豆凝集素蛋白的生物信息学分析 |
| 2.6 黑芸豆凝集素的性质与结构关系研究实验 |
| 2.6.1 黑芸豆凝集素的基本物理特性 |
| 2.6.2 黑芸豆凝集素的亲和特性研究实验 |
| 2.6.3 黑芸豆凝集素的热失活与蛋白构象之间的关系实验 |
| 2.6.4 黑芸豆凝集素酸碱稳定性与蛋白构象之间的关系实验 |
| 2.7 黑芸豆凝集素的生物安全性和抑制Hela细胞增殖作用实验 |
| 2.7.1 黑芸豆凝集素的体外消化实验 |
| 2.7.2 黑芸豆凝集素的免疫致敏性研究实验 |
| 2.7.3 黑芸豆凝集素抗人宫颈癌细胞活性的初步研究实验 |
| 2.8 数据处理 |
| 第3章 反胶束分离纯化黑芸豆凝集素的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 芸豆水溶性蛋白的提取工艺研究 |
| 3.2.1 芸豆粉碎方式的确定 |
| 3.2.2 浸提溶剂的选择 |
| 3.2.3 料液比的确定 |
| 3.2.4 浸提时间的确定 |
| 3.3 黑芸豆凝集素的前萃取工艺参数研究 |
| 3.3.1 前萃取水分含量的确定 |
| 3.3.2 前萃取离子强度的确定 |
| 3.3.3 前萃取p H值的确定 |
| 3.3.4 前萃取表面活性剂浓度的确定 |
| 3.3.5 前萃取时间的确定 |
| 3.4 黑芸豆凝集素的后萃取工艺参数研究 |
| 3.4.1 后萃取p H值的确定 |
| 3.4.2 后萃取离子强度的确定 |
| 3.4.3 反胶束萃取黑芸豆凝集素的得率和纯度 |
| 3.5 反胶束萃取黑芸豆凝集素的优化设计 |
| 3.5.1 反胶束萃取的响应面实验设计及模型拟合 |
| 3.5.2 反胶束萃取各因素的交互作用影响 |
| 3.5.3 反胶束萃取的最佳参数及验证 |
| 3.6 反胶束萃取对黑芸豆凝集素蛋白结构的影响 |
| 3.6.1 黑芸豆凝集素蛋白的进一步纯化 |
| 3.6.2 黑芸豆凝集素蛋白的二级结构分析 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 黑芸豆凝集素的蛋白鉴定及生物信息学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 黑芸豆凝集素蛋白的鉴定及基因克隆 |
| 4.2.1 电喷雾四极杆飞行时间串联质谱法鉴定凝集素蛋白 |
| 4.2.2 黑芸豆凝集素的基因克隆 |
| 4.3 黑芸豆凝集素的蛋白序列分析 |
| 4.3.1 黑芸豆凝集素蛋白序列的同源性分析 |
| 4.3.2 黑芸豆凝集素蛋白序列的进化分析 |
| 4.4 黑芸豆凝集素蛋白的生物信息学分析 |
| 4.4.1 黑芸豆凝集素蛋白的基本性质分析 |
| 4.4.2 黑芸豆凝集素蛋白的结构域分析 |
| 4.4.3 黑芸豆凝集素蛋白的空间结构预测 |
| 4.4.4 黑芸豆凝集素蛋白的抗原表位预测 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 黑芸豆凝集素蛋白的构效关系研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 黑芸豆凝集素的基本物理特性 |
| 5.2.1 黑芸豆凝集素的蛋白分子量 |
| 5.2.2 黑芸豆凝集素的蛋白等电点 |
| 5.3 黑芸豆凝集素的亲和特性研究 |
| 5.3.1 黑芸豆凝集素的糖专一性及糖蛋白功能性分析 |
| 5.3.2 黑芸豆凝集素的金属离子依赖性及蛋白构象分析 |
| 5.4 黑芸豆凝集素的热失活与蛋白构象之间的关系 |
| 5.4.1 热处理对黑芸豆凝集素活性及结构的影响 |
| 5.4.2 黑芸豆凝集素热失活动力学分析 |
| 5.5 黑芸豆凝集素酸碱稳定性与蛋白构象之间的关系 |
| 5.5.1 紫外光谱分析 |
| 5.5.2 荧光光谱分析 |
| 5.5.3 DSC分析 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 黑芸豆凝集素的生物安全性和抑制Hela细胞增殖作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 黑芸豆凝集素的体外消化性 |
| 6.2.1 黑芸豆凝集素的体外消化稳定性 |
| 6.2.2 热处理黑芸豆凝集素的体外消化稳定性 |
| 6.2.3 去离子化黑芸豆凝集素的体外消化稳定性 |
| 6.3 黑芸豆凝集素的致敏性 |
| 6.3.1 黑芸豆凝集素对模拟肠道上皮细胞的毒性 |
| 6.3.2 过敏模型建立及主动全身过敏症状 |
| 6.3.3 被动皮肤过敏实验 |
| 6.3.4 大鼠血清中的Ig E抗体水平 |
| 6.3.5 大鼠血浆中的组胺水平 |
| 6.3.6 黑芸豆凝集素对细胞因子水平的影响 |
| 6.4 黑芸豆凝集素抗人宫颈癌细胞活性的初步研究 |
| 6.4.1 黑芸豆凝集素对Hela细胞的体外增殖抑制作用 |
| 6.4.2 黑芸豆凝集素对Hela细胞形态学的影响 |
| 6.4.3 黑芸豆凝集素诱导Hela细胞的凋亡/坏死作用 |
| 6.4.4 黑芸豆凝集素对Hela细胞周期的影响 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）核孤儿受体TR3在消化道肿瘤血管生成中的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分：VEGF-A和组胺对TR3/Nur77表达的诱导作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 第二部分：VEGF-A和组胺对TR3/Nur77表达诱导作用的分子机制 |
| 前言 |
| 实验一：参与调节VEGF-A和组胺诱导TR3转录变异体表达的信号通路 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验二：VEGF家族其他成员对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用以及参与介导的VEGF受体类型 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验三：IGF-1R对VEGF-A刺激下的TR3-TV2表达的影响及其与VEGFR2/KDR的相互作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验四：参与组胺诱导的TR3转录变异体表达的受体类型及IGF-1R对该过程的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、Study of signal pathway of histamine H_3 receptor on AtT-20 cell（论文参考文献）
- [1]类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较[D]. 陈庆春. 北京邮电大学, 2021
- [2]FGFR-2基因多态性以及作为microRNA-494的靶基因与乳腺癌的相关性研究[D]. 王阳. 山东大学, 2020(04)
- [3]地塞米松对前庭中枢代偿中小脑绒球BDNF、TrkB和KCC2的影响及意义[D]. 韩雨. 苏州大学, 2020(02)
- [4]理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的疗效与机制研究[D]. 黄佳钦. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究[D]. 宋丽军. 华南理工大学, 2020(01)
- [6]基于荧光标记G蛋白偶联受体细胞模型的环境雌激素检测及新药筛选研究[D]. 张胜婷. 昆明理工大学, 2019(06)
- [7]靶向EZH2-EED相互作用抑制剂的发现及抗肿瘤机制研究[D]. 张凯丽. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2019(07)
- [8]组胺受体H4R介导ERK信号通路分子机制与受体内吞定量分析方法的研究[D]. 芦斌. 浙江大学, 2016(02)
- [9]黑芸豆凝集素的纯化和生物信息学及结构与功能特性研究[D]. 何述栋. 哈尔滨工业大学, 2015(02)
- [10]核孤儿受体TR3在消化道肿瘤血管生成中的分子机制研究[D]. 赵圣强. 山东大学, 2015(01)