一、小鼠轮状病毒EW株VP7基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达（论文文献综述）
常新见[1]（2020）在《华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究》文中研究指明猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,Po RV）引起的一种以厌食、腹泻、呕吐、脱水为特征的急性传染病。该病多发于寒冷季节,呈地方性流行,各生长阶段的猪均可感染,感染率最高可达90%～100%,给养猪业带来巨大经济损失。目前,Po RV出现了新的基因型,导致现有疫苗对其保护效果不理想。因此,开展Po RV的分子流行病学调查,明确其流行的病毒基因型,研制安全有效的新型疫苗,对防控该病具有重要的意义。鉴于此,本论文开展了以下三方面的研究内容:1.华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查:采用本实验室已建立的Po RV RT-PCR检测方法对2017～2019年间华东地区35个规模猪场的594份样品进行检测。结果显示,2017～2019年间华东地区Po RV的平均检出率为16.8%（100/594）;在不同类型的样品中,肠道样品的Po RV检出率最高为19.5%（68/349）;在不同生长阶段猪中,仔猪的Po RV检出率最高为18.5%（70/379）。同时,扩增阳性样品的VP7和VP4基因并测序,进行序列比对、同源性比较及遗传进化分析。结果显示,5个Po RV基因型均为A群G9P7型,与参考毒株NMTL相比,VP7蛋白第100、122、180、309位有氨基酸突变;与参考毒株OSU相比,VP4蛋白在30、137、686、774位有氨基酸突变,且两者均无氨基酸位点插入和缺失。遗传进化分析结果显示,不同地区流行毒株基因型相同,表明G9P7型Po RV可能是主要的流行基因型。2.猪轮状病毒VP4蛋白间接ELSA抗体检测方法的建立:针对VP4蛋白的保守区设计并合成引物,通过PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*。将该质粒转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS PAGE和Western blot鉴定了该蛋白的表达,利用Ni柱纯化蛋白。以纯化的重组480-VP4*蛋白为抗原建立间接ELISA方法,确定了该方法的最佳包被浓度为2.56μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳稀释度为1:10 000。建立的方法与病毒中和试验的总符合率达80.0%;用该方法初步检测了华东地区的临床血清,结果显示华东地区Po RV抗体阳性检出率为87.8%。通过该试验建立的间接ELISA检测方法为Po RV的血清学调查和后续疫苗免疫后的抗体评价提供了一种新的技术手段。3.猪轮状病毒不同截短VP4蛋白免疫原性研究:VP4蛋白具有较好免疫原性,是疫苗研究的主要靶蛋白,本研究分别构建3种截断的VP4蛋白的原核表达载体,同时将破伤风毒素的通用T细胞表位（P2）作为分子佐剂与三个截断VP4蛋白融合表达,成功构建了6个重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*、p ET28a-618-VP4*、p ET28a-1428-VP4*、p ET28a-P2-480-VP4*、p ET28a-P2-618-VP4*及p ET28a-P2-1428-VP4*,将它们分别转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS-PAGE和Western blot确定了蛋白表达,利用Ni柱纯化6个重组蛋白。将6个纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂以1:1体积混合后制备成亚单位疫苗,通过肌肉注射免疫6周龄小鼠,间隔2周免疫一次,共免疫3次,第3次免疫后2周,扑杀小鼠,并采集免疫前后小鼠血清,利用ELISA检测免疫前后抗体水平的变化,中和试验检测中和抗体水平。结果显示,6个蛋白免疫原性较好,小鼠血清中能产生特异性的抗体,3个截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为618-VP4*、1428-VP4*、480-VP4*,3个融合P2的截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为P2-1428-VP4*、P2-618-VP4*、P2-480-VP4*,但是6个蛋白诱导的中和抗体水平均偏低。将P2导入VP4蛋白后,1428-VP4*的蛋白免疫原性得到增强。通过该试验对不同截断VP4蛋白的免疫原性的研究,为后期研发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了良好的基础。
宁晨[2]（2020）在《三种致猪腹泻病毒主要保护性蛋白串联表达载体的构建及其免疫效力研究》文中指出由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒（Porcinerotavirus,PoRV）引起的猪腹泻是严重危害养猪业的急性、高度传染性的肠道疾病。三种病毒常呈混合感染,其发病特点是严重的肠炎、呕吐和水性腹泻,哺乳仔猪死亡率高。能够造成重大经济损失,成为养猪行业的一个重要问题。尽管近年来针对其研制了相应疫苗,但效果并不是十分理想,而且随着病毒毒株的变异,疫苗保护效力愈发不稳定,所以很长一段时间内,猪腹泻类病毒感染仍然是中国养猪业的一个不容忽视的问题。另一方面,由于猪腹泻病毒难分离,传代培养困难,传代病毒含量低等因素的存在,使得传统疫苗的研发仍然面临诸多挑战,因此研究出安全有效且使用便捷的新型疫苗是解决目前问题的方式之一。1.PEDV、TGEV和PoRV三种中和抗原表位基因的克隆及生物信息学分析以本实验室保存的 PEDV-HN13 毒株、TGEV-TZ-10-2016 毒株、PoRV-GD-01-2015毒株为基础,结合近年来对PEDV、TGEV、PoRV三种病毒中和抗原表位的研究进展,其中参照PEDV CV777经典株S基因（登录号:AF353511）,TGEV Purdue分离株S基因（登录号:DQ811789.2）,PoRVOSU株VP7基因（登录号:KJ450849.1）设计3对引物,通过RT-PCR得到PEDV-COE、TGEV-SA和PoRV-VP7目的基因片段,并克隆至pGEM-TEasy载体,并成功构建重组质粒pGEM-T-COE、pGEM-T-SA、pGEM-T-VP7,并经酶切鉴定和测序比对,结果符合预期。而后利用SnapGene软件对重组杆状病毒表达载体的构建过程进行模拟,并得到串联基因COE-SA-VP7的拼接序列,并对其进行相关生物信息学分析,结果显示其蛋白相对分子量为56.77kDa,并具有良好的免疫原性。2.重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7的构建及鉴定通过酶切将目的基因PEDV-COE、TGEV-SA和PoRV-VP7分别从重组质粒pGEM-T-COE、pGEM-T-SA和pGEM-T-VP7中分离并纯化,按照一定顺序依次连接到杆状病毒载体pFastBacHTA中,最终构建得到重组杆状病毒载体pFastBacHT-VP7,pFastBacHT-SA-VP7和pFastBacHT-COE-SA-VP7,经酶切鉴定和测序比对,结果均符合预期。而后借助Bac-to-Bac系统将重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7转座到DH10Bac感受态细胞中进行胞外重组,经脂质体介导转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7。提取感染重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7细胞的总RNA并进行 RT-PCR 反应,可分别扩增出 PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7 和 COE-SA-VP7 目的基因,表明串联基因成功在细胞内进行转录。经间接免疫荧光试验表明,重组杆状病毒可以被猪源PEDV、TGEV、PoRV单阳性多抗血清所识别,具有一定的反应原性。Western-blot结果表明,目的蛋白能够被His标签抗体所识别,分子量大小约为56.77kDa,结果符合预期。将重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7按照一定的免疫剂量免疫小鼠,在血清中能够检测到相应抗体产生。3.重组杆状病毒载体的优化与鉴定以重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7为基础,通过设计引物借助PCR技术将TAT蛋白转导肽引入串联基因以及将Linker柔性肽引入串联基因两端。将PCR得到的COE-SA-VP7-TAT和L-COE-SA-VP7-L 目的基因片段引入杆状病毒载体pFastBacHTA中,构建得到重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7-TAT和pFastBacHT-L-COE-SA-VP7-L,而后将两者通过Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统转染至Sf9细胞中,获得重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7-TAT和rBac-L-COE-SA-VP7-L,提取感染重组杆状病毒细胞的总RNA并进行RT-PCR反应,均可分别扩增出符合预期大小的目的基因片段,表明串联基因成功在细胞内进行转录。经间接免疫荧光试验表明,重组杆状病毒可以被猪源PEDV、TGEV、PoRV单阳性多抗血清所识别,具有一定的反应原性。
文继锋[3]（2019）在《大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7与壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性研究》文中指出轮状病毒（Rotavirus,RV）能够引起人和多种幼龄动物的传染性及顽固性腹泻,导致幼龄动物出现较高的死亡率。目前,对于大熊猫轮状病毒性腹泻的预防主要依靠加强饲养管理,但是效果并不理想。因此,免疫预防是预防该病最为有效的措施。壳寡糖（Chitosan oligosaccharides,COS）具有良好的生物相容性和较好的可溶性,能够起到免疫调节作用且具有免疫增强活性。传统疫苗主要是将疫苗中的抗原与佐剂简单的物理混合,但是将抗原与佐剂通过化学结合的方法连接成一个整体可以更大程度的增强疫苗的免疫原性。本研究将大熊猫源轮状病毒（Giant Panda Rotavirus,GPRV）的重组蛋白VP6-VP7与壳寡糖结合在一起,通过动物实验来评价该疫苗对体液免疫和细胞免疫的影响。本论文的主要研究内容如下:1.利用同源重组的方法构建表达载体pET21b-MPB/GST/EDA-VP6-VP7、pET21b-EDA-VP6、pET21b-EDA-VP7根据GeneBank中大熊猫源轮状病毒CH-1株VP6和VP7的基因序列,分别设计含有相应同源臂的引物,经过RT-PCR扩增分别得到VP6、VP7、VP6-1、VP7-1基因序列,将双酶切后的表达载体与相应的片段进行同源重组反应,转化至DH5α后,测序鉴定得到正确的表达载体pET21b-MPB/GST/EDA-VP6-VP7、pET21b-EDA-VP6、pET21b-EDA-VP7。2.大熊猫源轮状病毒相关重组蛋白的诱导表达、纯化以及蛋白活性分析将构建完成且测序正确的三个表达载体转化至Rosetta（DE3）中,将表达效果最好的Rosetta（DE3）-pET21b-EDA-VP6-VP7、pET21b-EDA-VP6、pET21b-EDA-VP7进行大批量的诱导表达,然后利用Nie-Agrose来纯化重组蛋白VP6-VP7、VP6和VP7,并用TEV蛋白酶来切除促融标签;另外,将纯化得到的重组蛋白VP6-VP7、VP6和VP7进行Western blot分析得到其都具有生物学活性。3.大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7与壳寡糖化学结合疫苗的构建GPRV VP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗制备完成后,通过分析型凝胶层析、多糖蛋白比率和核磁共振氢谱的测定来验证结合疫苗的偶联效率,结果表明VP6-VP7-壳寡糖成功偶联;利用圆二色光谱来鉴定化学结合物中重组蛋白的结构特征,结果表明化学结合物中重组蛋白VP6-VP7的二级结构没有发生改变。4.大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性将GPRV VP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗免疫小鼠,在免疫实验完成后测定小鼠血清相关抗体,同时测定相关细胞因子;用MTT法检测脾脏淋巴细胞的增殖。结果表明,VP6-VP7-壳寡糖化学结合组免疫小鼠血清中IgG抗体水平显着高于对照组（p<0.05）,但是该组所产生的IgG抗体水平的稳定性要比氢氧化铝胶佐剂组好,而且该组IgG抗体含量与氢氧化铝胶佐剂组相比差异不显着（p>0.05）。VP6-VP7-壳寡糖化学结合组中IgA抗体水平显着高于其他免疫组（p<0.05）。MTT法检测脾脏淋巴细胞的增殖结果为VP6-VP7-壳寡糖化学结合组和佐剂组所测结果与其他组相比差异显着（p<0.05）。测定免疫小鼠血清中IL-2、IFN-γ含量后得出,VP6-VP7-壳寡糖化学结合组血清中IL-2、IFN-γ含量均显着高于对照组（p<0.05）,并且该组所产生的IL-2、IFN-γ的稳定性要好于氢氧化铝胶佐剂组;同时测定免疫小鼠血清中IL-4、IL-5含量后得出,VP6-VP7-壳寡糖化学结合组血清中IL-4、IL-5含量均显着高于对照组（p<0.05）,并且该组所产生的IL-4稳定性要好于氢氧化铝胶佐剂组。综合以上说明VP6-VP7-壳寡糖化学结合具有良好的免疫原性;VP6-VP7-壳寡糖化学结合组小鼠注射部位没有产生肉芽肿、溃疡,组织病理形态分析显示注射部位没有出现任何病理变化。综上所述可以得出GPRV VP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,该研究为GPRV亚单位疫苗的研究提供了参考。
黄晓星[4]（2019）在《猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用》文中进行了进一步梳理猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）是引起仔猪腹泻的重要病原之一,主要引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水。猪轮状病毒一般不引起成年猪发病,可以使成年猪呈现隐性感染,持续排毒,从而导致病毒水平传播。若与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）以及致病性大肠杆菌混合感染会使病情加重,导致高死亡率,从而给养猪业造成严重的经济损失。A群轮状病毒（RVA）属于一种无囊膜包被的病毒,它由11个分节段的双股正链RNA组成,分别编码6个结构蛋白（VP1-VP4,VP6-7）和5/6个非结构蛋白（NSP1-5/6）。VP7和VP4蛋白能够诱导产生血清型特异性中和抗体,在免疫保护和疫苗开发方面起重要作用,至今已在人类和动物中确立了 27个G血清型和37个P血清型。猪轮状病毒最常见的基因型组合为G3、G4、G5、G11和P[6]、P[7]的基因型组合。先前鉴定的在猪中主要的G血清型是G3,G4,G5和G11,与之相关的P血清型是P[6]和P[7]。本研究通过构建PoRV-VP7基因在杆状病毒表达系统中表达的rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白,制备了针对rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白的单克隆抗体;构建了以rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白为包被抗原,具有高特异性、灵敏度的PoRV抗体检测方法。1.猪轮状病毒VP7蛋白重组杆状病毒表达载体的构建为了获得PoRV-VP7蛋白在杆状病毒表达系统中表达的融合蛋白。本研究以实验室分离并全基因测序分析后保存的一株猪轮状病毒GD-01-2015株为模板,用PCR方法扩增出vp7基因,克隆到pFast-Bac-HTA真核表达供体质粒中,然后将含有目的基因的重组供体质粒转座DH10BacTM感受态细胞,获得重组杆状质粒rBacmid-PoRV-VP7;最后在脂质体LipofectamineTM 3000的介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7。间接免疫荧光（IFA）试验结果表明,重组杆状病毒表达的融合蛋白可以被抗猪轮状病毒抗体所识别且表达为胞浆蛋白。Western-Blot结果表明,重组杆状病毒表达的分子量大小为37kDa融合蛋白可以被His标签抗体特异性识别。2.抗猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备为了获得可以用于建立PoRV快速检测方法的单克隆抗体,本研究以第一章中制备的重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7为免疫原,免疫6～8周龄的Balb/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,利用间接免疫荧光（IFA）方法筛选出3株能够稳定分泌抗PoRV-VP7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Mab-PoRV-1G3、Mab-PoRV-2B10和Mab-PoRV-2D2;分别对筛选获得的单克隆抗体特异性及亚类特性进行鉴定。Western-Blot结果表明,这三株单克隆抗体都是PoRV-VP7蛋白特异性抗体,只与PoRV发生特异性反应;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,Mab-PoRV-2B10为IgG,其余2株均为IgM。3.猪轮状病毒免疫猪血清抗体ELISA检测方法的建立为了建立有较好的特异性强和灵敏度的抗PoRV抗体快速检测方法,本研究以第一章中制备的重组杆状病毒表达蛋白作为包被抗原,HRP-羊抗猪IgG作为酶标抗体,建立了检测抗PoRV-VP7抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,所建立的ELISA检测方法只与所检测的已知PoRV阳性猪血清反应,而与已知PEDV阳性猪血清和已知TGEV阳性猪血清均无交叉反应。灵敏度试验结果显示,该ELISA检测方法最低能够检测出经过1:6400稀释的本研究方法所使用的的已知PoRV 阳性猪血清。分别用三种方法对92份临床猪血清样品进行检测并比对检测结果,结果显示商品化试剂盒检测和间接免疫荧光检测结果与本研究所建立的检测方法的总符合率分别为76%和91.3%。因此,本研究所建立的方法能够有效用于检测免疫猪血清所含抗PoRV抗体,该ELISA检测方法将具有一定的应用前景。
谢力,闫姗姗,欧霞,郭莉莉,吴晋元,周艳,李鸿钧,孙茂盛[5]（2015）在《腺病毒载体表达轮状病毒G1型外壳蛋白VP7及其诱导的免疫应答研究》文中研究表明构建表达地方流行株轮状病毒G1型外壳蛋白VP7的复制缺陷型重组腺病毒,免疫小鼠评价其体液及细胞免疫反应效果,探讨基因工程轮状病毒疫苗的实验基础及可行性。RT-PCR扩增轮状病毒VP7基因并克隆至pshuttle-CMV穿梭质粒,pshuttle-VP7与腺病毒骨架质粒同源重组后转染293细胞包装重组腺病毒rAd-VP7。RT-PCR、western blot检测rAdVP7在体外细胞中的转录及表达。rAd-VP7经肌注或滴鼻免疫小鼠后检测其血清IgG、肠道IgA及中和抗体效价;流式、ELISPOT检测淋巴细胞亚群变化及IFN-γ分泌情况。结果显示ELISA可检测到免疫小鼠血清IgG和滴鼻组肠道IgA抗体的产生;肌注和滴鼻免疫组中和抗体平均滴度分别为228和322.5;免疫小鼠脾细胞IFN-γ的分泌增加。表达轮状病毒VP7的重组腺病毒不但能够激发体液及细胞免疫反应,滴鼻免疫途径还可诱导粘膜免疫应答。
谢力[6]（2014）在《表达轮状病毒NSP4、VP7基因双顺反子腺病毒载体疫苗的构建及免疫效果研究》文中进行了进一步梳理轮状病毒（Rotavirus, RV）是世界范围内引起5岁以下婴幼儿病毒性肠胃炎的最主要病原体。RV根据VP6特异性可分为7个组（A-G）,造成人类婴幼儿腹泻的主要是A组轮状病毒。全球每年有超过1亿患儿因感染RV导致腹泻,200万需要住院治疗,其中约50万因严重腹泻而死亡。至今还没有治疗轮状病毒感染的特效药物,疫苗仍然是预防和控制轮状病毒感染,减少重症死亡病例的最有效途径。目前已有多个国家和地区使用疫苗预防RV感染,获批上市的疫苗Rotateq, Rotarix及罗特威均属于减毒活疫苗,这三种疫苗的使用为减少轮状病毒腹泻的患病和死亡发挥了重要作用。由于选用的毒株不同,加之不同地区自然条件、经济状况的差异以及母乳中可能存在的抗体等因素使活疫苗的有效性受到一定程度影响。另外,活疫苗制备中的外源因子污染、可能引起的不良反应（如肠套叠）和潜在的毒力返祖风险也是活疫苗在安全性上存在的问题。因此,在尚未获得完全安全有效的疫苗前选择合适的毒株研制不同形式的疫苗还是非常必要的。以往研究RV基因工程疫苗主要选择编码结构蛋白VP7和VP4的基因作为目的基因。VP7和VP4蛋白具有很好的免疫原性和特异性,但VP7、VP4在不同型RV中存在较大差异,且随着病毒在自然界或人体的循环也易产生基因的漂移和变异,从而可能影响到免疫原的特异性和免疫的有效性。本课题利用RV基因组中变异性小,高度保守的一个多功能非结构蛋白NSP4,与具有良好特异性和免疫原性的外壳蛋白VP7结合,构建可同时表达NSP4和VP7的双顺反子重组腺病毒疫苗,并在小鼠上对其免疫原性和保护效果进行评价。重组腺病毒疫苗的构建及体外表达产物检测。以源于流行区的G1P[8]型轮状病毒ZTR-68株基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增NSP4和VP7基因,并顺序将获得的VP7和NSP4基因克隆至含有2个多克隆位点的真核载体pcDNA3.0BA。随后以得到的pcDNA3.0BA-NSP4-VP7质粒为模板,PCR扩增含有NSP4和VP7基因以及2基因间的BGHpolyA和CMV启动子序列的基因片段（NSP4-polyA-CMV-VP7）,将NSP4-polyA-CMV-VP7亚克隆至腺病毒穿梭载体pshuttle-CMV中,构建含有2个基因表达盒的双顺反子穿梭质粒pshuttle-NSP4-VP7。再通过穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183中发生同源重组获得pAd-NSP4-VP7重组质粒。线性化的pAd-NSP4-VP7转染Ad293细胞后包装生成具有感染性的重组腺病毒rAd-NSP4-VP7。同时构建表达单基因的重组腺病毒rAd-VP7和rAd-NSP4。在电镜下可观察到3种重组腺病毒颗粒的典型形态,通过间接免疫荧光、Western blot等方法可检测到NSP4和VP7基因在Vero细胞中的转录和表达。实验动物免疫及疫苗免疫原性评价。将3种重组腺病毒rAd-NSP4-VP7、 rAd-NSP4、rAd-VP7传代后以肌注和滴鼻的方式免疫ICR小鼠。3种重组腺病毒均不同程度地诱导产生了血清IgG、IgA抗体和肠道SIgA抗体,且血清抗体均具有对ZTR-68株RV的中和活性,rAd-NSP4-VP7和rAd-VP7免疫组的中和保护效果相对更为显着。通过流式细胞术分析免疫小鼠脾淋巴细胞中CD4+、CD8+及CD69+亚群的构成比情况,结合ELISPOT检测]IFN-γ、IL-4细胞因子的分泌,证明3种重组腺病毒也诱导产生了有效的细胞免疫应答,以rAd-NSP4-VP7和rAd-NSP4免疫组的效果更为显着。乳鼠的攻毒及保护性效果评价。通过将不同株RV口服接种BALB/c和ICR乳鼠后观察检测乳鼠腹泻和排毒的情况,建立了Wa（G1P[8]型）和ZTR-68株RV感染乳鼠的动物模型。通过对ICR孕鼠进行rAd-NSP4-VP7重组腺病毒疫苗免疫,再对新生乳鼠进行攻毒,攻毒后新生乳鼠的粪便病毒检出率明显降低,证实了rAd-NSP4-VP7疫苗的免疫保护作用。本研究阐述了可同时表达NSP4和VP7的双顺反子重组腺病毒rAd-NSP4-VP7的构建过程,并证实重组疫苗rAd-NSP4-VP7具有良好的免疫原性,可以同时诱导机体产生包括体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫几个方面较为全面的免疫应答反应,且对乳鼠在攻毒后的排毒有显着的保护效果。研究同时还通过比较rAd-NSP4-VP7双顺反子疫苗与rAd-NSP4、rAd-VP7单基因重组腺病毒的免疫效果差异,为NSP4、 VP7蛋白协同表达作为新型轮状病毒疫苗的开发研究提供了实验依据和有益探索。
曾婷,郝丽,谢逸欣,马丽,舒文杰[7]（2012）在《表达轮状病毒VP7基因重组腺病毒载体的构建及免疫活性研究》文中进行了进一步梳理目的包装表达轮状病毒VP7基因的重组腺病毒,并检测其免疫活性。方法 RT-PCR扩增病毒结构蛋白VP7基因,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,并用RT-PCR和Western blot检测。将包装好的腺病毒免疫小鼠,应用间接ELISA检测小鼠血清中特异性轮状病毒IgG抗体。结果酶切和测序鉴定证实成功构建携带VP7基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中成功包装病毒;RT-PCR和Western blot均能特异检测VP7基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后可诱导针对轮状病毒的特异性免疫。结论重组腺病毒的成功包装,为新型轮状病毒基因疫苗的研制提供了一种可行的途径。
郜岩,孙茂盛[8]（2012）在《腺病毒载体的研究进展及其在轮状病毒疫苗研究中的应用》文中研究指明腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、高滴度、低致病性及不整合入宿主细胞染色体等优点,是目前非常具有应用前景的转基因载体。本文就重组腺病毒载体的研究进展、研究中的问题和解决方法及其在轮状病毒疫苗研究中的应用作一综述。
张冠群[9]（2009）在《表达牛轮状病毒VP7蛋白重组干酪乳杆菌的构建及其免疫学初步分析》文中研究指明牛轮状病毒（Bovine rotavirus）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）。是引起犊牛非细菌性腹泻的主要病原,牛轮状病毒主要感染1540日龄的犊牛,以厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征性症状。如继发牛冠状病毒和细菌感染,则死亡率则高达80%,给养牛业造成很大经济损失。由于本病属于粪口途径传播的肠道传染性疾病。因此,设计疫苗以刺激肠道黏膜免疫,阻断病原入侵的第一道防线,对科学防治本病具有重要意义。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393作为递呈抗原的活菌载体,利用牛轮状病毒主要免疫保护性抗原基因VP7主要中和位点为靶基因,定向插入到干酪乳杆菌表面表达和分泌型表达载体pPG-1、pPG-2,构建了pPG-1-VP7/L.casei393和pPG-2-VP7/L.casei393重组乳酸杆菌系统。以此作为口服制剂,通过乳酸杆菌表达和传递外源抗原以及乳酸杆菌本身黏附定植作用,有效刺激机体肠道黏膜免疫系统,达到预防牛轮状病毒病目的。实验从犊牛腹泻粪便中扩增获得了牛轮状病毒VP7全基因,序列测定结果显示,该病毒属G6血清型,属于牛轮状病毒感染的广泛流行株。实验首先使用大肠杆菌表达系统摸索并验证VP7基因在原核系统中表达的可能性及免疫效果。结果表明VP7蛋白第51254位包含VP7蛋白主要抗原位点的基因片段得到了较好的表达。所制得的抗VP7蛋白小鼠抗血清具有较高的ELISA效价（1:6400）及中和抗体（1:316）效价。在此基础上,构建了表达牛轮状病毒VP7重组干酪乳杆菌表面表达系统了pPG-1-VP7/L.casei393和分泌型表达系统pPG-2-VP7/L.casei393。经乳糖诱导后,对菌体裂解物和培养上清进行的western blot检测表明,pPG-1-VP7/L.casei393在菌体裂解物中检测到了目的蛋白,而pPG-2-VP7/L.casei393表达系统在菌体裂解物和上清液中均检测到了目的蛋白的存在;间接免疫荧光试验证明,表达的牛轮状病毒VP7蛋白存在于菌体的表面。为进一步鉴定重组菌是否可诱导机体的系统和黏膜免疫应答,本实验将小鼠共分为3组,每组10只。口服免疫每只鼠2×109CFU活菌量,每隔14d免疫一次,免疫三次,每次连续免疫3d。免疫后于不同时间分别采集血清、粪便、外生殖道冲洗液样品,通过间接ELISA测定粪便、外生殖道冲洗液样品中特异性的sIgA和血清IgG水平,并通过细胞水平测定抗血清对病毒的中和效价,以评价其免疫保护作用。间接ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、外生殖道冲洗液均检测到了特异性sIgA,在小鼠血清中检测到了特异性的IgG。免疫重组菌后,小鼠外生殖道中sIgA于免疫后14d和37d、44d抗体水平达到峰值,和对照组相比,差异显着（P<0.05）;小鼠粪便中sIgA在23d和44d抗体水平达到峰值,和对照组相比,差异显着（P<0.05）;小鼠血清IgG水平在初次和再次免疫后未见抗体效价明显升高,三免后开始出现明显的上升趋势,免疫后的44d达到峰值（p<0.05）,之后稍有回落。中和试验结果表明,pPG-1-VP7/L.casei393组与pPG-2-VP7/L.casei393组在免疫后48d血清的抗体中和效价分别为1:62.9和1:50.6。以上结果说明本研究所构建的重组干酪乳杆菌表达系统能够诱导机体产生局部黏膜免疫和系统免疫应答,并能诱导集体产生免疫保护作用。
王敏[10]（2008）在《基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究》文中提出A组轮状病毒（Group A Rotavirus,ARV）是引起全世界婴幼儿严重腹泻的最重要病原,在发展中国家,每年至少约600,000儿童死于轮状病毒感染。鉴于轮状病毒危害严重且缺乏有效治疗手段,世界卫生组织一直将发展轮状病毒疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。由于腺病毒能感染呼吸道和肠道,在诱导全身免疫的同时产生局部粘膜免疫,安全可靠,可以通过口服或滴鼻给药,适于婴幼儿使用,因此,腺病毒载体轮状病毒基因工程疫苗具有良好的前景。我们实验室前期利用腺病毒载体表达轮状病毒保护性抗原,对轮状病毒基因工程疫苗进行了系统研究。我们课题组前期研究表明:用Ad5表达的轮状病毒的VP6和VP7基因,采用滴鼻或灌胃的给药方式,可以在小鼠实验模型上取得良好的细胞免疫和体液免疫效果,并对轮状病毒攻击鼠有一定的保护作用。但是,由于腺病毒对轮状病毒的野生型基因表达量比较低,因此,增强轮状病毒抗原的表达,优化免疫效果,降低重组腺病毒的用量,提高疫苗的安全性等诸多问题就成了发展该疫苗的重要课题。本文通过密码子优化,人工合成了轮状病毒的VP6,VP7基因,通过对蛋白表达量及免疫效果的比较,鉴定了密码优化确实提高了VP6,VP7蛋白的表达量,从而减少了病毒的用量。本研究还检测了口服腺病毒免疫后,不同时间点病毒在小鼠体内的分布,为该疫苗的进一步研究提供了实验资料。1.利用密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒基因的表达量ARV基因的密码子使用与人类密码子相差很远,其AT含量很高。大量研究证明,通过基因密码改造可以有效提高基因的表达量。我们对RV VP6、G1VP7、G2VP7和G3VP7 4个基因依据人的偏爱密码子进行了密码优化,人工合成了优化基因,利用腺病毒Ad5载体（AdEasy系统）在人胚肾细胞293中进行了表达。结果显示,经过密码子优化后,与野生型病毒基因相比,4个基因的蛋白表达量均有显着提高。同时,我们对这4种重组腺病毒进行了连续20代的传代培养,在连续传代过程中,插入的轮状病毒基因一直稳定存在和表达。重组腺病毒rvAdG2VP7（o）在连续传代15代后,重组腺病毒rvAdG1VP7（o）和rvAdG2VP7（o）在连续传代20代后检测到复制型腺病毒（Replication-Competent AdenovirusRCA）的存在。说明重组腺病毒在293细胞中连续传代具有良好的遗传稳定性,传代10代以内一般检测不到RCA,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要。2.密码子优化增强了轮状病毒VP6基因重组腺病毒的免疫效果在证实了通过密码子优化可以提高蛋白表达量后,我们以VP6基因为例,以表达野生型RVVP6基因的重组病毒rvAdVP6为对照,在小鼠模型上通过等量病毒（108TCID50/只/次）3次滴鼻免疫,观察了基因优化重组腺病毒rvAdVP6（o）的免疫效果。结果显示:（1）三次免疫rvAdVP6（o）产生的抗VP6血清IgG抗体水平均明显高于rvAdVP6,说明优化后的重组病毒产生了更强的体液免疫反应;（2）两种重组腺病毒均可诱导粘膜免疫,在肺灌洗液、肺匀浆液、肠匀浆液和粪便中均能检测出较高水平的特异性IgG和IgA,其中,rvAdVP6（o）肺灌洗液、肺匀浆液和粪便中的IgG和IgA水平均显着高于rvAdVP6;rvAdVP6（o）肠匀浆液IgG水平显着高于rvAdVP6,说明优化后的病毒产生了更强的粘膜免疫效果;（3）用ELISpot检测脾细胞培养上清中的γ干扰素（IFN-γ）,结果显示,rvAdVP6（o）产生的斑点数多于rvAdVP6产生的斑点数,说明优化后的病毒产生了更强的细胞免疫效果;（4）RV攻击后检测小鼠的排毒量,发现rvAdVP6（o）免疫组的RV排毒减少率明显高于rvAdVP6,说明优化后的病毒对小鼠的保护性也增强了。综上所述,在等量重组腺病毒免疫的情况下,优化后的VP6重组病毒在体液免疫、粘膜免疫、细胞免疫和攻毒保护方面,均优于优化前,可望在以后的疫苗应用中,达到减少病毒用量的目的。3.重组腺病毒口服免疫后在小鼠体内的生物分布为了探讨重组腺病毒作为口服疫苗的可行性,研究了经灌胃免疫后重组腺病毒在各组织器官中的分布以及抗原表达情况。将小鼠分为两组:rvAdVP6（o）免疫组和PBS对照组,每组70只小鼠,免疫后在7个时间点（4h、12h、1d、4d、7d、14d和28d）分别取5只小鼠,采集14种组织标本,用免疫组织化学方法检测腺病毒载体和轮状病毒VP6抗原,用荧光定量PCR检测腺病毒载体和轮状病毒VP6基因的存在。结果显示:用重组腺病毒灌胃免疫小鼠后,在4h～28d内,在肝、肾、脾、心脏、肺、大肠、小肠、胃、食管、舌、脑、气管、派氏结和卵巢14种组织标本中,均无明显的病理变化;免疫组织化学检测结果显示,只在4h时在大肠和小肠中检测到腺病毒和轮状病毒VP6抗原;荧光定量PCR在4h时在大肠、小肠、胃、食管和派氏结中检测到腺病毒载体和轮状病毒VP6基因;12h时后在大肠、小肠、胃和食管中仍能检测到腺病毒载体和轮状病毒VP6基因,但其拷贝数明显降低;1d后只在大肠和食管中检测到少量的腺病毒载体和轮状病毒VP6基因;在4d、7d后,食管、胃和大肠仍能检测到腺病毒载体基因的存在,其他组织中均检测不到;至14d时,只有在食管中仍能检测到腺病毒载体基因的存在,在其他组织中均检测不到。说明灌胃免疫后,腺病毒载体和VP6基因在小鼠体内可以表达,并在多种组织器官中存在。综上所述,本研究构建了4株表达轮状病毒密码子优化基因的VP6和VP7的重组腺病毒,与野生型基因相比,其在蛋白表达水平和免疫效果上均明显得到提高,在此基础上检测了灌胃免疫后,其在小鼠体内的分布情况,这些研究均未见报道。这些结果的获得,为研制我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗进一步奠定了基础。
二、小鼠轮状病毒EW株VP7基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠轮状病毒EW株VP7基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达（论文提纲范文）
（1）华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒形态及分子生物学特征研究 |
| 1.1 轮状病毒形态 |
| 1.2 轮状病毒分子生物学特征 |
| 2 猪轮状病毒的诊断方法研究进展 |
| 2.1 猪轮状病毒的临床诊断方法 |
| 2.2 猪轮状病毒实验室诊断方法 |
| 3 猪轮状病毒病流行现状 |
| 4 猪轮状病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 猪轮状病毒灭活苗 |
| 4.2 猪轮状病毒弱毒活疫苗 |
| 4.3 猪轮状病毒新型疫苗 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 RT-PCR检测 |
| 1.4 数据处理与分析 |
| 1.5 VP7 和VP4 基因克隆与序列鉴定 |
| 1.6 VP7 基因和VP4 基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 华东地区猪轮状病毒病流行病学调查 |
| 2.2 VP7 和VP4 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 PoRV480-VP4*基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.4 重组480-VP4*蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 1.5 重组480-VP4*蛋白浓度测定 |
| 1.6 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.7 间接ELISA的临界值 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 与中和抗体检测的比对试验 |
| 1.12 间接ELISA检测临床猪血清样品 |
| 2 结果 |
| 2.1 Po RV480-VP4*基因原核表达载体的构建 |
| 2.2 重组Po RV480-VP4*蛋白SDS PAGE和 Western Blot试验 |
| 2.3 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 2.4 间接ELISA的临界值 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 与中和抗体检测的比对试验结果 |
| 2.9 间接ELISA检测临床猪血清样品结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪轮状病毒不同截短VP4 蛋白免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计及目的基因扩增 |
| 1.4 不同的重组基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.5 重组蛋白诱导表达、纯化及鉴定 |
| 1.6 纯化的重组蛋白浓度测定 |
| 1.7 疫苗制备 |
| 1.8 试验动物及免疫接种 |
| 1.9 血清ELISA抗体检测 |
| 1.10 血清中和抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒RT-PCR产物及双酶切产物电泳结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.3 重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.4 纯化的重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.5 纯化的重组蛋白浓度测定结果 |
| 2.6 血清ELISA抗体检测结果 |
| 2.7 血清中和抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）三种致猪腹泻病毒主要保护性蛋白串联表达载体的构建及其免疫效力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻病毒的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 病原学 |
| 1.4 分子生物学 |
| 2 猪传染性胃肠炎病毒的研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 病原学 |
| 2.4 分子生物学 |
| 3 猪轮状病毒的研究进展 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 流行病学 |
| 3.3 病原学 |
| 3.4 分子生物学 |
| 4 猪腹泻相关疫苗研究进展 |
| 4.1 传统疫苗 |
| 4.2 基因工程疫苗 |
| 5 杆状病毒表达载体系统的研究进展 |
| 5.1 杆状病毒基本特性 |
| 5.2 杆状病毒表达载体系统的发展 |
| 5.3 杆状病毒表达载体系统特点 |
| 6 研究目的与意义 |
| 实验研究 |
| 第一章 PEDV、TGEV和PoRV三种中和抗原表位基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的基因的克隆 |
| 2.2 COE-SA-VP7目的基因的拼接与生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒增殖 |
| 3.2 目的基因的扩增结果 |
| 3.3 阳性重组质粒的筛选及酶切鉴定结果 |
| 3.4 目的基因的测序结果 |
| 3.5 COE-SA-VP7目的基因的拼接和生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7的构建与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组杆状病毒载体pFastBacHT-VP7的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒载体pFastBacHT-SA-VP7的构建 |
| 2.3 重组杆状病毒表达载体pFastBacHT-COE-SA-VP7的构建 |
| 2.4 重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-COE-SA-VP7的构建和鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7的制备与鉴定 |
| 2.6 重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7免疫效力的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组杆状病毒载体pFastBacHT-VP7的构建与鉴定 |
| 3.2 重组杆状病毒载体pFastBacHT-SA-VP7的构建与鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7的构建与鉴定 |
| 3.4 重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-COE-SA-VP7的PCR鉴定 |
| 3.5 重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7的鉴定 |
| 3.6 小鼠血清样品的特异性抗体的检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 重组杆状病毒表达载体的优化与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7-TAT的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒载体pFastBacHT-L-COE-SA-VP7-L的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组杆状病毒载体pFastBacHT-COE-SA-VP7-TAT的构建与鉴定 |
| 3.2 重组杆状病毒载体pFastBacHT-L-COE-SA-VP7-L的构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7与壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒概述 |
| 1.1 轮状病毒的分类及形态结构 |
| 1.2 轮状病毒的理化特性 |
| 1.3 轮状病毒的基因组结构 |
| 1.4 轮状病毒的致病机理 |
| 1.5 轮状病毒的流行病学 |
| 1.5.1 血清型分布 |
| 1.5.2 季节性分布 |
| 1.5.3 轮状病毒的年龄分布特点 |
| 1.6 轮状病毒的培养特征 |
| 2 轮状病毒结构蛋白的研究 |
| 2.1 VP1蛋白 |
| 2.2 VP2蛋白 |
| 2.3 VP3蛋白 |
| 2.4 VP4蛋白 |
| 2.5 VP6蛋白 |
| 2.6 VP7蛋白 |
| 3 轮状病毒疫苗的研究 |
| 3.1 轮状病毒减毒活疫苗 |
| 3.1.1 单价疫苗 |
| 3.1.2 多价疫苗 |
| 3.2 轮状病毒灭活疫苗 |
| 3.3 轮状病毒基因工程亚单位疫苗 |
| 3.4 轮状病毒DNA疫苗 |
| 3.5 轮状病毒转基因植物口服疫苗 |
| 4 壳寡糖的研究现状 |
| 4.1 壳寡糖的制备方法 |
| 4.1.1 酸水解法 |
| 4.1.2 酶降解法 |
| 4.1.3 壳寡糖的分离纯化 |
| 4.2 壳寡糖作为免疫佐剂的活性 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 大熊猫源轮状病毒VP6与VP7 基因的扩增及其表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株和试剂 |
| 1.2 主要试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 GPRV VP6、VP7基因的扩增 |
| 2.2.1 GPRV总 RNA的提取 |
| 2.2.2 利用反转录PCR扩增GPRV VP6、VP7片段 |
| 2.3 重组表达载体的构建 |
| 2.3.1 表达载体的双酶切 |
| 2.3.2 双酶切质粒的纯化回收 |
| 2.3.3 双酶切后表达载体与目的片段的全克隆反应 |
| 2.3.4 无缝克隆产物的转化 |
| 2.3.5 克隆质粒重组菌的培养刷选 |
| 2.4 重组表达载体的相关鉴定 |
| 2.4.1 重组表达载体的PCR鉴定 |
| 2.4.2 重组表达载体的双酶切鉴定 |
| 2.4.3 重组表达载体的测序鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPRV目的基因的扩增以及表达载体的双酶切 |
| 3.2 相关表达载体的双酶切鉴定 |
| 3.3 重组表达载体PCR鉴定和测序鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 大熊猫源轮状病毒重组蛋白的表达、纯化及蛋白活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组质粒的原核表达 |
| 2.1.1 重组表达质粒的转化 |
| 2.1.2 重组表达质粒的诱导表达及可溶性分析 |
| 2.2 重组质粒的SDS-PAGE胶鉴定 |
| 2.2.1 SDS-PAGE电泳所需溶液及制备方法 |
| 2.2.2 SDS-PAGE电泳运行及染色 |
| 2.3 重组质粒的可溶性分析 |
| 2.4 表达蛋白tag-VP6-VP7、tag-VP6、tag-VP7的纯化 |
| 2.5 表达蛋白tag-VP6-VP7、tag-VP6、tag-VP7的Western blot分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白的诱导表达以及可溶性分析 |
| 3.1.1 重组表达载体pET21b-MBP/GST/EDA-VP6-VP7的表达 |
| 3.1.2 重组表达载体pET21b-EDA-VP6和重组表达载体pET21b-EDA-VP7的表达 |
| 3.1.3 重组表达载体的可溶性分析 |
| 3.2 重组蛋白的纯化 |
| 3.3 重组蛋白的Western blot分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 大熊猫源轮状病毒VP6-VP7蛋白与壳寡糖化学结合疫苗的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 壳寡糖的氧化 |
| 2.2 壳寡糖的衍化 |
| 2.3 重组蛋白的巯基化反应 |
| 2.4 氧化后的壳寡糖与疏基化蛋白的结合 |
| 2.5 重组蛋白与壳寡糖化学结合疫苗的鉴定 |
| 2.5.1 核磁光谱法鉴定 |
| 2.5.2 分析型凝胶过滤层析法鉴定 |
| 2.5.3 测定结合物残糖比率以及多糖蛋白比率 |
| 2.5.4 圆二色光谱鉴定结合物中蛋白质的分子构象 |
| 3 结果 |
| 3.1 壳寡糖与重组蛋白比率测定 |
| 3.1.1 壳寡糖含量的测定 |
| 3.1.2 重组蛋白含量的测定 |
| 3.1.3 多糖蛋白比率的计算 |
| 3.2 分析型凝胶过滤层析鉴定 |
| 3.3 核磁光谱鉴定重组蛋白与壳寡糖化学结合疫苗 |
| 3.4 圆二色光谱测定 |
| 4 讨论 |
| 第五章 大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性评估 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂及试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 相关疫苗的制备 |
| 2.1.1 GPRV重组蛋白VP6-VP7、VP6以及VP7与壳寡糖物理混合疫苗的制备 |
| 2.1.2 GPRV重组蛋白VP6-VP7、VP6以及VP7与氢氧化铝胶佐剂混合疫苗的制备 |
| 2.2 动物实验以及免疫程序 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 免疫程序 |
| 2.3 小鼠血清抗体IgG的检测 |
| 2.4 小鼠血清抗体IgA的检测 |
| 2.5 MTT法检测脾淋巴细胞的增殖情况 |
| 2.6 外周血相关细胞因子检测 |
| 2.7 小鼠免疫后攻毒保护试验 |
| 2.8 免疫小鼠上皮组织病理组织学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠血清抗体IgG检测 |
| 3.1.1 重组蛋白VP6-VP7各组免疫小鼠血清抗体IgG检测 |
| 3.1.2 重组蛋白VP6-VP7、VP6、VP7化学结合组的小鼠血清抗体IgG检测 |
| 3.2 小鼠血清IgA抗体水平检测 |
| 3.2.1 重组蛋白VP6-VP7各组免疫小鼠血清抗体IgA检测 |
| 3.2.2 重组蛋白VP6-VP7、VP6、VP7化学结合组的小鼠血清抗体IgA检测 |
| 3.3 MTT法检测脾淋巴细胞增殖 |
| 3.3.1 重组蛋白VP6-VP7各组免疫小鼠脾淋巴细胞增殖检测 |
| 3.3.2 重组蛋白VP6-VP7、VP6、VP7化学结合组的免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测 |
| 3.4 相关细胞因子的测定 |
| 3.4.1 免疫小鼠血清中IL-2测定 |
| 3.4.2 免疫小鼠血清中IL-4测定 |
| 3.4.3 免疫小鼠血清中IL-5测定 |
| 3.4.4 免疫小鼠血清中IFN-γ测定 |
| 3.5 免疫小鼠攻毒后保护试验 |
| 3.6 免疫小鼠上皮组织病理组织学分析 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 轮状病毒概况 |
| 1. 病原学 |
| 1.1 轮状病毒的形态结构 |
| 1.2 轮状病毒的外衣壳蛋白及功能 |
| 1.3 轮状病毒分型 |
| 1.4 理化性质 |
| 2. 流行病学 |
| 3. 发病机制和病理变化 |
| 4. 猪轮状病毒感染的诊断与预防 |
| 4.1 临床诊断 |
| 4.2 实验室诊断 |
| 4.3 预防和治疗 |
| 5. 研究目的与意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 猪轮状病毒VP7蛋白重组杆状病毒表达载体的构建 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 PCR引物设计 |
| 2.2 PCR扩增PoRV-vp7基因序列 |
| 2.3 重组质粒pGEM-T-PoRV-VP7的构建和鉴定 |
| 2.4 重组供体质粒pFastBacHTA-PoRV-VP7的构建和鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒穿梭载体的构建和鉴定 |
| 2.6 重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7的制备 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Vero细胞增殖PoRV病毒 |
| 3.2 杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 抗猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 杂交瘤细胞的制备 |
| 2.3 阳性克隆筛选(间接免疫荧光法(IFA))方法的建立 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞的间接免疫荧光(IFA)筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆及建株 |
| 2.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 2.7 单克隆抗体生物学特性鉴定 |
| 2.8 腹水的制备以及纯化 |
| 3. 结果 |
| 3.1 阳性克隆筛选(间接免疫荧光法(IFA))方法的建立 |
| 3.2 IFA方法筛选阳性克隆并建株 |
| 3.3 单克隆抗体生物学特性鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 猪血清中抗猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 包被抗原的制备 |
| 2.2 间接ELISA方法的建立 |
| 2.3 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 2.4 间接ELISA方法特异性试验 |
| 2.5 间接ELISA方法灵敏度试验 |
| 2.6 间接ELISA方法重复性试验 |
| 2.7 临床检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 包被抗原的制备 |
| 3.2 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 3.4 间接ELISA方法特异性试验 |
| 3.5 间接ELISA方法灵敏度试验 |
| 3.6 间接ELISA方法重复性试验 |
| 3.7 临床检测 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）腺病毒载体表达轮状病毒G1型外壳蛋白VP7及其诱导的免疫应答研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（6）表达轮状病毒NSP4、VP7基因双顺反子腺病毒载体疫苗的构建及免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 重组腺病毒pAd-NSP4-VP7的构建及体外表达检测 |
| 一、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 细胞、质粒和病毒 |
| 2. 主要抗体、试剂 |
| 3. 主要仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 人源轮状病毒ZTR-68的分离与鉴定 |
| 2. 目的基因NSP4、VP7的扩增 |
| 3. 重组质粒pcDNA3.0BA-NSP4-VP7的构建 |
| 4. 穿梭质粒pshuttle-NSP4-VP7及pshuttle-NSP4、pshuttle-VP7的构建 |
| 5. 重组腺病毒的构建 |
| 6. 重组腺病毒的包装 |
| 7. 电镜观察重组腺病毒感染Ad293细胞及的病毒颗粒形态观察 |
| 8. 目的基因NSP4、VP7体外表达的检测 |
| 二、实验结果与分析 |
| (一) 重组质粒pcDNA3.0BA-NSP4-VP7的构建与鉴定 |
| 1. RT-PCR扩增NSP4和VP7基因 |
| 2. 重组质粒pcDNA3.0A-VP7的构建及鉴定 |
| 3.重组质粒pcDNA3.0BA-NSP4-VP7的构建及鉴定 |
| (二) 重组腺病毒rAd-NSP4-VP7的构建与鉴定 |
| 1. PCR扩增NSP4-polyA-CMV-VP7基因片段 |
| 2. 重组穿梭质粒pshuttle -NSP4-VP7、pshuttle-NSP4和pshuttle-VP7的鉴定 |
| 3. 重组质粒pAd-NSP4-VP7和pAd-NSP4、pAd-VP7同源重组的筛选 |
| 4. 重组腺病毒包装致Ad293细胞病变的观察 |
| 5. 电镜观察重组腺病毒的形态学及在Ad293细胞中的感染情况 |
| (三) 重组腺病毒rAd-NSP4-VP7和rAd-NSP4、rAd-VP7的体外转录表达检测 |
| 1. RT-PCR检测NSP4和VP7基因在Vero细胞中的转录 |
| 2. 间接免疫荧光检测NSP4和VP7基因在Vero细胞中的表达 |
| 3. Western Blot检测NSP4和VP7基因在Vero细胞中的表达 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 重组腺病毒pAd-NSP4-VP7免疫小鼠的免疫原性评价 |
| 一、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 病毒和细胞 |
| 2. 实验动物 |
| 3. 主要抗体、试剂 |
| 4. 主要仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 重组腺病毒的传代扩增 |
| 2. 重组腺病毒rAd-NSP4、rAd-VP7和rAd-NSP4-VP7滴度的测定 |
| 3. ICR小鼠免疫方案 |
| 4. 免疫小鼠的血清学检测 |
| 5. 免疫小鼠的细胞学检测 |
| 6. 对数据进行统计分析 |
| 二、实验结果与分析 |
| (一) 重组腺病毒各代次的滴度测定 |
| 1. 重组腺病毒的传代及致Ad293细胞病变的观察 |
| 2. CCID50法测定重组腺病毒的滴度 |
| 3. 蚀斑法测定重组腺病毒的滴度 |
| (二) 重组腺病毒诱导小鼠产生的体液免疫反应 |
| 1. 不同时段免疫小鼠抗轮状病毒特异性血清IgG效价 |
| 2. 二次免疫后小鼠抗轮状病毒特异性血清IgA效价 |
| 3. 免疫小鼠血清中和抗体滴度 |
| 4. 免疫小鼠肠道分泌性IgA抗体滴度 |
| (二) 重组腺病毒诱导小鼠产生的细胞免疫反应 |
| 1. 流式细胞术检测免疫小鼠脾淋巴细胞亚群构成比情况 |
| 2. ELISPOT检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-4的情况 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 轮状病毒乳鼠感染模型的建立及rAd-NSP4-VP7疫苗对其免疫保护效果评价 |
| 一、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 病毒和细胞 |
| 2. 实验动物 |
| 3. 主要抗体、试剂 |
| 4. 主要仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 轮状病毒的培养传代及收获 |
| 2. 轮状病毒感染乳鼠动物模型建立 |
| 3. rAd-NSP4-VP7疫苗对BALB/c乳鼠免疫保护效果评价 |
| 二、实验结果与分析 |
| (一) ZTR-68株轮状病毒感染性滴度的测定 |
| (二) 乳鼠口服接种RV后的症状观察和排毒检测 |
| 1. 腹泻评分与腹泻百分数 |
| 2. 乳鼠粪便排毒阳性率检测 |
| 3. 乳鼠空肠病理切片观察 |
| (三) rAd-NSP4-VP7接种ICR孕鼠后对乳鼠抗RV被动免疫保护效果评价 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
（8）腺病毒载体的研究进展及其在轮状病毒疫苗研究中的应用（论文提纲范文）
| 1. 腺病毒载体的研究进展 |
| 1.1 腺病毒载体的特点: |
| 1.2 重组腺病毒载体的构建: |
| 1.3 腺病毒载体引起的自身免疫反应: |
| 1.4 重组腺病毒载体的应用: |
| 2. 腺病毒载体在应用中的问题以及解决方法 |
| 3. 腺病毒载体在轮状病毒疫苗研究中的应用 |
| 3.1 VP4抗原的重组表达: |
| 3.2 VP7抗原的重组表达: |
| 3.3 VP6和NSP4抗原的表达: |
| 4. 展望 |
（9）表达牛轮状病毒VP7蛋白重组干酪乳杆菌的构建及其免疫学初步分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 牛轮状病毒感染流行及其主要血清型 |
| 1.2 牛轮状病毒主要结构蛋白及其功能特性 |
| 1.3 轮状病毒感染及发病机理 |
| 1.4 轮状病毒疫苗的发展研究进展 |
| 1.4.1 人轮状病毒疫苗研究进展 |
| 1.4.2 动物轮状病毒疫苗研究进展 |
| 1.5 刺激黏膜免疫反应的活菌载体疫苗研究进展 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒、菌种 |
| 2.1.3 抗体制剂 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 主要分子生物学试剂 |
| 2.1.7 培养基 |
| 2.1.8 主要溶液配制 |
| 2.1.9 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 牛轮状病VP7 基因扩增 |
| 2.2.2 牛轮状病毒VP7 基因在大肠杆菌中的构建 |
| 2.2.3 VP7 基因在大肠杆菌中的诱导表达和免疫原性分析 |
| 2.2.4 重组干酪乳杆菌表达系统构建 |
| 2.2.5 VP7 基因在重组干酪乳杆菌中的表达 |
| 2.2.6 口服重组乳酸菌免疫学评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛轮状病VP7 基因克隆与序列测定 |
| 3.1.1 RT-PCR 扩增结果 |
| 3.1.2 重组质粒pMD18-T-VP7 的鉴定结果 |
| 3.1.3 序列测定结果 |
| 3.2 表达VP7 基因重组大肠杆菌的构建 |
| 3.2.1 VP7 的获得 |
| 3.2.2 pMD18-TS-VP7 重组质粒鉴定 |
| 3.2.3 pET-32a-VP7 重组质粒鉴定 |
| 3.3 重组大蛋白表达分析及免疫活性分析 |
| 3.3.1 表达产物的SDS-PAGE 鉴定 |
| 3.3.2 表达产物的可溶性分析及纯化鉴定 |
| 3.3.3 重组VP7 蛋白免疫活性的分析 |
| 3.4 重组干酪乳杆菌乳酸菌表达系统的构建 |
| 3.4.1 表达基因的克隆 |
| 3.4.2 pMD18-TS-VP7 重组质粒鉴定 |
| 3.4.3 表面表达重组载体pPG-1-VP7 的鉴定 |
| 3.4.4 分泌表达重组载体pPG-2-VP7 的鉴定 |
| 3.5 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定 |
| 3.5.1 表达产物Western blot 鉴定 |
| 3.5.2 pPG-1-VP7/L.casei393 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.5.3 重组菌pPG-2-VP7/L.casei393 上清浓缩物Western blot 鉴定 |
| 3.6 重组干酪乳杆菌免疫效果评价 |
| 3.6.1 血清IgG 的测定 |
| 3.6.2 小鼠外生殖道黏液sIgA 的测定 |
| 3.6.3 小鼠粪便 sIgA 的测定 |
| 3.6.4 小鼠血清中和抗体的测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 牛轮状病毒VP7 蛋白的免疫保护作用 |
| 4.2 构建的重组干酪乳杆菌外源蛋白表达情况 |
| 4.3 小鼠口服重组乳菌诱导的局部粘膜免疫应答和系统免疫应答 |
| 4.4 表达 VP7 蛋白重组干酪乳杆菌黏膜作为口服疫苗的潜在应用 价值 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 利用密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒基因的表达量 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 密码子优化可增强轮状病毒VP6基因重组腺病毒的免疫效果 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 重组腺病毒口服免疫后在小鼠体内的生物分布 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 密码优化的基因序列 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
四、小鼠轮状病毒EW株VP7基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达（论文参考文献）
- [1]华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究[D]. 常新见. 西藏大学, 2020(12)
- [2]三种致猪腹泻病毒主要保护性蛋白串联表达载体的构建及其免疫效力研究[D]. 宁晨. 扬州大学, 2020
- [3]大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7与壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性研究[D]. 文继锋. 四川农业大学, 2019(01)
- [4]猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用[D]. 黄晓星. 扬州大学, 2019
- [5]腺病毒载体表达轮状病毒G1型外壳蛋白VP7及其诱导的免疫应答研究[J]. 谢力,闫姗姗,欧霞,郭莉莉,吴晋元,周艳,李鸿钧,孙茂盛. 现代免疫学, 2015(02)
- [6]表达轮状病毒NSP4、VP7基因双顺反子腺病毒载体疫苗的构建及免疫效果研究[D]. 谢力. 北京协和医学院, 2014(03)
- [7]表达轮状病毒VP7基因重组腺病毒载体的构建及免疫活性研究[J]. 曾婷,郝丽,谢逸欣,马丽,舒文杰. 国际病毒学杂志, 2012(06)
- [8]腺病毒载体的研究进展及其在轮状病毒疫苗研究中的应用[J]. 郜岩,孙茂盛. 中国生物制品学杂志, 2012(03)
- [9]表达牛轮状病毒VP7蛋白重组干酪乳杆菌的构建及其免疫学初步分析[D]. 张冠群. 东北农业大学, 2009(03)
- [10]基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究[D]. 王敏. 中国疾病预防控制中心, 2008(05)