一、Role of Dendritic Cells in Myocarditis Induced by Coxsackie B_3 Virus in Mouse（论文文献综述）
孙琳[1]（2021）在《IL-37通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡》文中进行了进一步梳理研究背景病毒性心肌炎（Viral Myocarditis,VMC）是由多种病毒感染引起的淋巴细胞性心肌炎,因具体的发病机制尚不十分清楚,故针对该疾病的特异性治疗手段有限。白介素37（Interleukin-37,IL-37）作为一种抗炎和免疫调节剂,在系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosu,SLE）、强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis,AS）、类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）等自身免疫性疾病中发挥强大的免疫调节作用。目前有研究证实,IL-37在心血管疾病如动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）、急性冠脉综合征（Acute Coronary Syndrome,ACS）及心力衰竭（Heart Failure,HF）的发生发展中也发挥重要的作用。IL-37可以通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogen-actived Protein Kinase,p38 MAPK）通路减轻炎性浸润,调节免疫失衡,抑制细胞凋亡。病毒性心肌炎的发病机制与心肌淋巴细胞浸润和心肌细胞凋亡密切相关。IL-37在病毒性心肌炎中是否可以通过调节p38 MAPK信号通路抑制病毒性心肌炎心肌细胞的凋亡尚未得到论证。研究目的1.柯萨奇 B 组 3 型病毒（Coxsackievirusgroup B type 3,CVB3）提取、扩增、纯化,通过腹腔注射构建VMC小鼠模型,重组IL-37干预VMC小鼠,观察CVB3及IL-37对小鼠心肌组织的病理损伤情况。2.通过对各组小鼠的体重,死亡率,一般生命体征,血清炎性细胞因子表达,心肌组织病理学检测,心脏超声心脏功能检测,凋亡相关蛋白的分子生物学及免疫病理学表达,研究IL-37对急性VMC心肌炎性细胞,心脏功能的调节作用。3.探讨p38 MAPK通路在急性VMC的表达以及IL-37对p38 MAPK通路表达的影响。研究方法1.模型构建及实验分组小鼠40只（品系:BALB/c）,雄性,周龄（4-6周）,随机分4组,每组10只,分别为对照组（正常小鼠,Control）,单纯药物组（正常小鼠+IL-37,Control+IL-37）,实验组（病毒组,Virus）,药物治疗组（病毒+IL-37,Virus+IL-37）。其中①实验组小鼠于第0天腹腔注射CVB3（CVB3原液（108TCID50）:25μl,加入PBS 75μl配成100μl）和200μl生理盐水;②对照组小鼠于第0天腹腔注射100μl磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline,PBS）和200μl生理盐水;③单纯药物组小鼠于第0天腹腔注射100μl PBS和200μl生理盐水,第5、8、11天腹腔注射200μl溶有重组IL-37（2μg）的生理盐水和100μl PBS;④药物治疗组小鼠于第0天腹腔注射CVB3（CVB3原液（108TCID50）:25μ]加入PBS 75μl配成100μl）和200μl生理盐水,于第5、8、11天腹腔注射200μl溶有重组IL-37（2μg）的生理盐水和100μl PBS。构建相应的动物模型,以14天为观察研究终点。2.小鼠一般情况、体重变化,生存曲线观察记录小鼠的活动度、毛发颜色、体重等一般情况的变化及小鼠死亡情况,构建小鼠体重变化曲线及生存曲线。3.心功能检测模型构建14天后,对所有小鼠进行心脏超声,异氟醚吸入麻醉四组小鼠,通过小动物高分辨率超声成像系统（Vevo 2100,Fuji Visual Sonics）测量四组小鼠的心脏血流动力学参数。二维超声在胸骨长轴、短轴切面采集胸骨旁长轴图像（Parasternall Long-axis View,PLAX）图像、胸骨旁短轴图像（Parasternall S hort-axis View,PSAX）、M型超声图像,观察小鼠心肌活动度。12 MHz探头测 IVS-s,IVS-d,LVID-s,LVID-d,LVPW-s,LVPW-d,LVEF,以上数据用于评价小鼠心脏功能,后麻醉处死提取心脏组织。4.心肌病理学检测模型构建14天后,戊巴比妥钠（浓度:2%,用量:70mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠,打开胸腔,留取小鼠心肌组织,拍照留取大体标本图片。心尖取血,多聚甲醛过夜浸泡固定,脱水石蜡包埋,常规制备5μm厚度的石蜡病理切片进行病理学检查。苏木素-伊红染色（Hematoxylin&Eosin,HE）观察各组小鼠心肌炎性细胞浸润,Masson染色观察心肌纤维化,拍照、留存,统计分析。5.ELISAELISA法检测各组小鼠血清TNF-α,IL-1,C-TnI表达;评估各自小鼠炎性细胞因子及心肌坏死标志物的表达。6.蛋白免疫印迹实验（Western Blot）提取小鼠心肌组织总蛋白,Western Blot法测定凋亡相关蛋白、p38 MAPK通路相关蛋白的表达;7.免疫组织化学染色（IHC）石蜡病理切片行IHC法测定特异性淋巴细胞及凋亡相关蛋白表达,正置光学微镜下观察,拍照,留存,统计分析。8.TUNEL石蜡病理切片行TUNEL法测定四组小鼠心肌细胞凋亡水平及凋亡相关蛋白表达,正置光学显微镜下观察观察各组心肌细胞凋亡水平,拍照,留存,统计分析。研究结果1.各组小鼠一般情况及体重变化我们观察到,对照组小鼠饮食良好,好动活泼,毛发浓密,触感柔顺光滑,毛发颜色鲜亮,抓取时挣扎、抵抗感明显,给予刺激,反应明显;与对照组相比,病毒组小鼠病毒性心肌炎的体征明显,包括饮食减少,活动量减少,毛发稀疏,触感粗糙,毛发颜色灰暗,抓取时挣扎、抵抗感不明显,给予外界刺激,反应不明显。而接受重组IL-37干预的小鼠则表现出明显的改善。对照组、单纯药物组小鼠体重一直上升,病毒组和药物治疗组小鼠体重明显下降。第1-4日,与对照组相比,病毒组小鼠的体重表现为明显的下降（p<0.05）,药物治疗组体重也明显减轻（p<0.05）。自第4日开始,与对照组相比,病毒组小鼠的体重下降更为显着（第6日（p<0.01）,第8日（p<0.01）,第10日（p<0.001）,第12日（p<0.001）,第14日（p<0.001））,药物治疗组明显降低了体重减轻的速率（第 6 日（p<0.05）,第 8 日（p<0.05）,第 10 日（p<0.01）,第 12 日（p<0.01）,第14日（p<0.01））。对照组和单纯药物组之间无明显差异。2.生存曲线分析对照组和单纯药物组中没有小鼠死亡,生存率为:100%,病毒组小鼠中生存率为:60%,药物治疗组生存率为:90%。与对照组相比,病毒组生存率明显降低（p=0.0208）,与病毒组相比,药物治疗组生存率也有显着统计学差异（p=0.0238）。3.IL-37减轻了病毒性心肌炎心肌损伤和心脏重塑在第14天进行动物取材,对照组和单纯药物组小鼠心脏红润,无水肿,心脏表面光滑,无坏死组织沉积,可观察到血管在心脏表面清晰走形。与对照组相比,病毒组小鼠心脏大体标本表现为明显的苍白水肿,心肌非常松弛,肉眼可观察到心脏表面有大片的白色坏死组织,心脏表面血管观察不清。与病毒组相比,药物治疗组小鼠心脏表面略有发白,心脏组织苍白肿胀明显减轻,心脏表面白色坏死组织面积明显减少。HE染色切片中,对照组及单纯药物组心肌组织心肌纤维结构清晰、规整,形态均匀,大小正常,心肌间质中未见异常细胞浸润。与对照组相比,病毒组小鼠心肌纤维结构排列紊乱,心肌细胞水肿,形态不均,大小各异,部分心肌细胞溶解坏死,心肌间质中可见大量炎性细胞浸润。药物治疗组小鼠心肌纤维排列紊乱程度明显改善,心肌细胞仍有水肿,形态,大小仍有异常,心肌间质中仍可见炎性细胞浸润,但较病毒组轻。与对照组相比,病毒组心肌炎性平均病理评分增高（p<0.001）,与病毒组相比,药物治疗组心肌炎平均病理评分明显降低（p<0.01）。Masson染色病理切片中,对照组及单纯药物组未见明显胶原纤维沉积,与对照组相比,病毒组小鼠心肌间质可见明显的胶原纤维沉积,纤维化增加（p<0.001）。与病毒组相比,药物治疗组小鼠心肌组织胶原纤维沉积明显减轻,纤维化面积明显降低（p<0.01）。我们还观察到一个值得探究的现象,单纯药物组小鼠的心脏外膜表现为炎性细胞浸润,心肌纤维坏死。药物治疗组的小鼠也表现出同样的现象。对照组心脏心外膜未见异常。4.IL-37改善了病毒性心肌炎小鼠心脏功能小鼠心脏超声检查中,与对照组相比,病毒组小鼠在胸骨旁短轴视图（PSAX）和胸骨旁长轴视图（PLAX）中观察到随心肌运动的不均一的弥漫的高回声影,同时,与对照组相比,M型超声图像显示病毒组小鼠心室明显扩大,室壁运动能力明显减弱。药物治疗组小鼠在PLAX,PSAX仍有随心肌运动的不均一的高回声影,但面积明显减少,心室仍有扩大,室壁活动仍有减弱,但较病毒组明显减轻。另外,与对照组相比,病毒组左室射血分数（LVEF）（p<0.05）明显下降,IVS-s（p<0.05）、IVS-d（p<0.05）明显变薄,LVID-s（p<0.05）、LVID-d（p<0.05）明显缩小,LVPW-s（p<0.01）,LVPW-d（p<0.01）显着降低。而与病毒组相比,药物治疗组左室射血分数（LVEF）（p<0.05）明显升高,IVS-s（p<0.05）、IVS-d（p<0.05）明显增厚,IVID-s（p<0.05）、LVID-d（p<0.05）明显扩大,LVPW-s（p<0.05）,LVPW-d（p<0.05）显着增高。5.IL-37减少了病毒性心肌炎血清炎性细胞因子及心肌损伤标志物的表达TNF-α,C-TNI,IL-1与病毒性心肌炎的发生发展密切相关,IL-1和TNF-α是重要的促炎细胞因子,C-TNI是心肌坏死的重要指标。与对照组相比,病毒组TNF-α（p<0.01）,C-TnI（p<0.05）,IL-1（p<0.001）的表达水平明显升高。与病毒组相比,药物治疗组降低了 TNF-α（p<0.05）,C-TnI（p<0.05）,IL-1（p<0.05）的产生。6.IL-37减少了病毒性心肌炎淋巴细胞、巨噬细胞的浸润采用IHC法标记CD3+T淋巴细胞,CD4+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞,CD68+巨噬细胞,评估病毒性心肌炎炎性细胞浸润情况。对照组心肌纤维致密,排列均匀,心肌细胞大小,染色正常,心肌间质未见明显淋巴血细胞浸润。与对照组相比,病毒组小鼠心肌纤维水肿增粗,大小不均,心肌间质可见大量CD3+T淋巴细胞,CD4+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞,CD68+巨噬细胞浸润,正置光学显微镜下可见阳性染色面积显着增加。药物治疗组也可见以上炎性细胞浸润,但较病毒组减轻。对四组小鼠炎性细胞染色阳性率进行统计学分析,与对照组相比,病毒组小鼠心肌CD3+T淋巴细胞（p<0.001）,CD4+T淋巴细胞（p<0.001）,CD8+T 淋巴细胞（p<0.001）,CD68+巨噬细胞（p<0.001）有明显差异。与病毒组相比,药物治疗组小鼠心肌CD3+T淋巴细胞（p<0.01）,CD4+T淋巴细胞（p<0.01）,CD8+T淋巴细胞（p<0.05）,CD68+巨噬细胞（p<0.01）有统计学差异。7.IL-37抑制了病毒性心肌炎心肌细胞凋亡采用IHC法标记细胞凋亡相关蛋白,评估病毒性心肌炎心肌凋亡情况。与对照组相比,病毒组小鼠心肌纤维变性坏死,大量染色阳性棕褐色异常细胞核。药物治疗组较病毒组心肌坏死程度较轻。统计学分析与对照组相比,凋亡相关蛋白 Cleved-Caspase3（p<0.001）,Caspase3（p<0.01）,Cleved-Caspase8（p<0.01）,Caspase8（p<0.01）,Bax（p<0.001）的蛋白IHC染色阳性率增加。与病毒组相比,药物治疗组 Cleved-Caspase3（p<0.05）,Caspase3（p<0.05）,Cleved-Caspase8（p<0.05）,Caspase8（p<0.05）和 Bax（p<0.01）蛋白 IHC 染色阳性率降低。相反,与对照组相比,病毒组中Bcl-2（p<0.01）表达下降,但在药物治疗组中Bcl-2（p<0.05）升高。Western Blot法分析来评估凋亡相关蛋白表达水平。对照组相比,病毒组Cleved-Caspase3（p<0.05）,Caspase3（p<0.01）,Cleved-Caspase8（p<0.01）,Caspase8（p<0.01）,Bax（p<0.01）蛋白相对表达水平显着升高,Cleved-Caspase3/Caspase3（p<0.05）,Cleved-caspase8/Caspase8（p<0.01）有明显统计学差异;而同病毒组相比,药物治疗组 Cleved-Caspase3（p<0.05）,Caspase3（p<0.05）,Cleved-Caspase8（p<0.05）,Caspase8（p<0.05）,Bax（p<0.05）相对表达量明显减少。此外药物治疗组的 Cleved-Caspase3/Caspase3（p<0.05）,Cleved-caspase8/Caspase8（p<0.05）的比率也低于病毒组。病毒组中Bcl-2（p<0.05）的相对表达和Bcl-2/Bax（p<0.001）比值相较与对照组下降,而药物治疗组中Bcl-2（p<0.05）相对表达量及Bcl-2/Bax（p<0.05）的表达上升。TUNEL法标记心肌凋亡细胞,与对照组相比,病毒组心肌组织中可见大量细胞核核膜破裂、分解、深染、变旧、皱缩。药物治疗组心肌细胞TUNEL染色阳性及细胞核形态变化较病毒组减轻。统计学分析结果为:与对照组相比,病毒组心肌凋亡细胞数量显着增多（p<0.001）,与病毒组相比,药物治疗组心肌凋亡细胞数量降低（p<0.01）。8.IL-37可能通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡Western Blot法检测四组小鼠心肌细胞p38 MAPK及p-p 38MAPK蛋白的相对表达,各组心脏组织中总p38 MAPK蛋白量的表达无显着差异。与对照组相比,病毒组p-p 38MAPK蛋白的表达显着增加（P<0.05）,相反,与病毒组相比,药物治疗组p-p 38MAPK蛋白的表达水平明显降低（P<0.05）。另外与对照组相比,病毒组p-p 38 MAPK/p38MAPK（P<0.01）比例升高,而与病毒组相比,药物治疗组中p-p 38 MAPK/p38 MAPK（P<0.05）比例降低。研究结论1.IL-37可减轻急性VMC小鼠心肌病理损伤;2.IL-37可减轻急性VMC小鼠的死亡率,改善心功能,减轻炎性因子的表达和炎性细胞的浸润,减少凋亡相关蛋白的表达。3.急性VMC心肌p38 MAPK信号通路表达增高,IL-37可抑制p38 MAPK信号通路的表达。
孙琳[2]（2021）在《白介素37通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡减轻病毒性心肌炎》文中研究说明背景:病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）是指由于感染各类嗜心肌性病毒所导致的心肌非特异性疾病,VMC是导致青年人发生心力衰竭和心源性猝死的重要原因。临床表现为乏力、胸痛、心力衰竭、恶性心律失常、休克,甚至发生心脏骤停。虽然大多数病毒性心肌炎患者能够自愈或经治疗后好转,但有部分患者进展为扩张型心肌病、心律失常和严重的心力衰竭,极大地影响了患者的生活质量和寿命。现阶段仍然没有特异性的针对病毒性心肌炎的有效治疗方法,目前临床上应用的抗病毒治疗及对症支持治疗,效果并不显着。一直以来,国内外学者长期致力于探究病毒性心肌炎的发病机制,目前广为接受的机制包括病毒对心肌的直接损伤、免疫反应过度激活及各种细胞因子介导的心肌损伤,然而其具体机制仍不完全清楚。焦亡（Pyroptosis）是一种新型的炎症性细胞程序性死亡,由炎症小体介导,并且伴有包括IL-1β和IL-18在内的多种炎性细胞因子释放,与凋亡不同。炎症小体是一种胞内蛋白复合体,由三部分组成:胞浆内模式识别受体、适配蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶原-1（Caspase-1）,炎症小体激活GSDMD,导致细胞膜孔形成,细胞破裂,释放IL-1β和IL-18。炎症小体与许多炎症性疾病有关,如心肌梗死和缺血再灌注损伤。最近的研究表明,在VMC患者和VMC小鼠模型中存在炎性小体。因此,心肌细胞焦亡在VMC发病进程中可能具有重要作用,而阻断这一过程有希望成为治疗VMC的新靶点。白介素-37（IL-37）属于IL-1家族,是一种新型的潜在的炎症抑制因子。在自身免疫性疾病、风湿性疾病、恶性肿瘤等疾病中发挥抗炎作用,而小鼠体内不表达IL-37。我们先前的动物实验研究表明,IL-37能够减轻小鼠病毒性心肌炎的心脏内炎症反应,降低小鼠的死亡率。然而,IL-37对病毒性心肌炎心肌细胞焦亡的作用及其机制尚不清楚。因此,本研究通过建立小鼠病毒性心肌炎模型,应用IL-37对模型小鼠进行干预,研究IL-37对病毒性心肌炎发病过程中的具体作用,并进一步探讨IL-37参与心肌细胞焦亡的影响及其机制,为病毒性心肌炎的治疗提供崭新的治疗靶点。我们的实验主要围绕以下两个部分展开:第一部分:小鼠病毒性心肌炎动物模型的构建研究背景及意义心肌炎是指心肌组织内的非特异性炎性疾病,全球每年约有150万人患心肌炎,可以表现为急性、亚急性或者慢性心肌炎。任何年龄阶段的人群均可能患心肌炎,但以青少年最为多见。病毒是其最常见的病原体,肠道病毒属的柯萨奇病毒最为多见。细菌、真菌、寄生虫、立克次体等也可以引起心肌炎,但临床上相对比较少见。病毒性心肌炎的患者症状表现差异较大,主要取决于心肌的病变所累及的范围,轻症患者可以没有任何自觉症状,部分患者发病前存在7-20天左右的前驱期,表现为发热、乏力,肌肉疼痛等感染症状。随后临床表现为胸痛、心律失常、充血性心力衰竭、心源性休克甚至心脏骤停。一般认为,造成VMC患者心肌损害的原因主要如下:病毒复制的直接损伤;免疫反应被触发后过度激活;炎症反应过程中细胞因子的作用以及各种原因诱导的心肌细胞凋亡。病毒入侵后在心肌内复制,并导致免疫系统激活,其病理生理学进展过程通常有三个阶段:急性阶段、亚急性阶段和慢性阶段。急性阶段是指病毒对心肌的直接毒性作用,亚急性阶段主要表现为T细胞及B细胞的活化及其引发的自身免疫反应,慢性阶段表现为心肌弥漫纤维化与心脏泵功能障碍,如扩张性心肌病。大量病理学证据表明,病毒性心肌炎表现为心肌炎性细胞浸润,主要包括单核细胞,包括淋巴细胞,巨噬细胞,树突状细胞（DC）和自然杀伤（NK）细胞。病毒性心肌炎患者的预后取决于发病原因、临床症状的严重程度和起始治疗是否及时。其预后不良的因素包括射血分数降低和左束支传导阻滞等。轻度心肌炎患者通常预后良好,约有50%的VMC患者可自行缓解。然而,仍有25%的VMC患者可发展为心功能不全,严重者发展为扩张性心肌病。重症心肌炎最常见的死亡原因是心源性休克,其1年内死亡率为20%,5年死亡率为50%。然而现阶段仍无特异性的治疗方法,单纯抗病毒治疗及对症支持治疗,效果并不明显。在本实验的第一部分中,为了模拟病毒性心肌炎的发病进程,我们对balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒液,观察病毒性心肌炎的病理学特征,探究其病理机制,为VMC的治疗提供新的思路。研究目的1.通过对balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒液,建立急性病毒性心肌炎模型,观察小鼠心肌损伤的病理学改变。2.通过对小鼠体重、活力、毛发、心脏超声、心肌病理学切片等进行观察与监测,评估使用CVB3 Nancy株构建小鼠病毒性心肌炎模型的效果。研究方法1.建立动物模型将12只雄性6周龄balb/c小鼠饲养于山东省医学科学院SPF类动物房,随机分为对照组和模型组,每组6只。Day 0对对照组小鼠腹腔注射100μl PBS,对模型组小鼠腹腔注射25μl 109TICD50病毒液（加入75μl PBS稀释至100μl）,饲养9天后建立急性心肌炎动物模型。2.超声心动图Day 9用3%异氟醚麻醉小鼠,使用Visual Sonics高分辨率Vevo 2100系统（Visualsonics Inc.,加拿大多伦多）采集胸骨旁长轴图像,记录每组小鼠左心室射血分数（LVEF）,缩短分数（LVFS）,收缩期室间隔厚度（IVSs）,舒张期室间隔厚度（IVSd）,收缩期左室内径（LVIDs）,舒张期左室内径（LVIDd）,收缩期左室后壁厚度（LVPWs）,舒张期左室后壁厚度（LVPWd）。3.心肌组织病理学检测于Day 9心脏超声检查后收集各组小鼠的心脏标本,石蜡包埋切片后进行苏木精和伊红（H&E）染色,Masson染色检测心肌纤维化程度。4.ELISA 检测收集各组小鼠外周血,离心收集上层血清,ELISA检测心肌损伤标志物cTnI与炎症因子IL-1β、IL-18。研究结果1.模型组小鼠一般状态较差对照组小鼠活力良好,毛色鲜亮;与对照组小鼠相比,模型组小鼠活力欠佳,不喜活动,毛发暗淡无光泽,抓取时反应不明显。与对照组相比,VMC模型组小鼠体重自第三天开始明显下降,心脏重量/体重比值升高。2.模型组小鼠左心功能下降与对照组小鼠相比,模型组小鼠心脏超声示IVSs（P<0.01）,IVSd（P<0.05）明显减小,LVEF、LVFS测量值下降,表明对小鼠腹腔注射CVB3后室间隔明显变薄,心肌收缩功能存在受损的可能性。3.模型组小鼠心肌炎症损伤明显对照组小鼠切片HE染色显示心肌细胞规律排列,未见明显炎症浸润,模型组小鼠HE染色可见部分心肌细胞坏死及炎症病灶,间质内炎症细胞浸润明显,病理学评分较对照组升高（P<0.0001）。模型组小鼠比对照组小鼠血清心肌损伤标志物 cTnI（P<0.01）、IL-1β（P<0.05）、IL-18（P<0.05）明显升高。4.模型组小鼠心肌纤维化明显Masson染色可见对照组小鼠心肌间质内无明显胶原纤维分布,模型组小鼠心肌可见灶性坏死伴胶原纤维增生,间质内可见较多胶原纤维分布。研究结论1.对balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒液能够成功构建小鼠VMC模型。2.病毒性心肌炎小鼠心肌损伤表现为炎性细胞因子表达升高,炎症浸润增加及心肌纤维化加剧。第二部分:IL-37对VMC小鼠心肌细胞焦亡的作用及机制研究研究背景及意义病毒性心肌炎是指机体感染嗜心肌病毒后,心肌组织内出现的非特异性炎症,其临床症状及体征轻重不一。尽管部分患者临床表现轻微,甚至症状表现呈自限性,病毒性心肌炎仍然能够引起一系列严重的并发症。据统计,VMC能够占到年轻人猝死原因的10%左右。VMC的发病机制尚不完全清楚。近期有研究证实,炎症小体的过度激活可能引起心肌炎、动脉粥样硬化及结肠炎等疾病。炎症小体又称焦亡小体,是一种细胞内的蛋白复合体,由胞质内的模式识别受体（PRR）、适配蛋白ASC与半胱氨酸蛋白酶原-1（Caspase1）构成,其中研究最为广泛的模式识别受体是NOD样受体家族的NLRP3。当NLRP3被细胞毒素、ATP或胆固醇等激活后,进一步募集ASC与Caspase1,炎症小体激活后切割IL-1β与IL-18。同时,NLRP3裂解Gasdermin D,释放其N末端结构域,形成细胞膜孔,释放炎性因子,引起一系列免疫反应。因此,抑制炎症小体表达或为病毒性心肌炎的治疗提供新的思路。IL-37是IL-1家族的一种潜在炎症抑制因子,对机体固有免疫和适应性免疫存在一定抑制作用。IL-37在人外周血单核细胞和树突状细胞中低表达,而小鼠体内不表达IL-37。IL-37已被证实能够改善CVB3引起的小鼠病毒性心肌炎,然而其具体机制并不清楚。因此,本部分实验通过应用重组人IL-37对病毒性心肌炎小鼠干预,观察其对心肌炎小鼠炎症浸润及NLRP3炎症小体表达的影响,探讨IL-37对病毒性心肌炎的作用及具体机制。研究目的:1.构建病毒性心肌炎模型,通过IL-37对病毒性心肌炎小鼠进行干预,观察IL-37对病毒性心肌炎小鼠一般状态、心功能和心肌病理学切片的影响。2.通过检测各组小鼠心肌细胞的炎症小体的表达,探讨IL-37减轻小鼠病毒性心肌炎的具体机制。研究方法:1.IL-37干预病毒性心肌炎小鼠将32只雄性6周龄balb/c小鼠饲养在山东省医学科学院SPF级动物房,随机分为4组:对照组（n=6）、IL-37对照组（n=6）、模型组（n=10）、实验组（n=10）。Day 0对对照组、IL-37对照组小鼠各腹腔注射100μtlPBS,同时对模型组、实验组小鼠腹腔注射25μl 109TICD50病毒液（加入75μl PBS稀释至100μl）。Day3、Day7对对照组、模型组小鼠腹腔注射200μl PBS,同时对IL-37对照组、实验组腹腔注射2μg IL-37（加入200μl PBS溶解）,饲养9天后建立急性心肌炎动物模型。2.超声心动图评估小鼠心功能Day 9用异氟醚麻醉小鼠,采集胸骨旁长轴图像,记录每组小鼠左心室射血分数（LVEF）,缩短分数（FS）,收缩期室间隔厚度（IVSs）,舒张期室间隔厚度（IVSd）,收缩期左室内径（LVIDs）,舒张期左室内径（LVIDd）,收缩期左室后壁厚度（LVPWs）,舒张期左室后壁厚度（LVPWd）。3.心肌组织病理学检测收集各组心脏标本,石蜡包埋后用苏木精和伊红（H&E）染色、Masson染色分别检测心肌组织的炎症变化及纤维化程度,免疫荧光检测各组大鼠心肌组织GSDMD蛋白表达情况。4.ELISA 检测收集各组小鼠外周血,离心收集上层血清,ELISA检测心肌损伤标志物cTnI与炎症因子IL-1β、IL-18。5.蛋白印迹实验收集各组小鼠心肌组织,提取心肌组织总蛋白后,Western blot检测NLRP3、ASC dimer、cleavaged caspase 1、NFkB P65 及 phospho-P65 在心肌组织中的表达。6.RT-PCR从液氮中取出各组小鼠心肌组织,液氮研磨组织提取总RNA,PCR检测NFκB P65的mRNA表达水平。研究结果1.IL-37改善病毒性心肌炎小鼠一般状态与模型组小鼠相比,实验组小鼠活力较好,毛色光滑,抓取时反应明显。与模型组相比,实验组小鼠体重同样呈现持续下降趋势,心脏重量/体重比值低于模型组小鼠（P<0.05）。2.IL-37改善病毒性心肌炎小鼠心功能与模型组小鼠相比,实验组小鼠LVEF（P<0.05）、LVFS（P<0.05）、IVSs（P<0.01）和IVSd（P<0.01）均有不同程度的改善,表明实验组小鼠心脏室间隔厚度高于模型组,左室收缩功能较模型组有所改善。3.IL-37降低病毒性心肌炎小鼠心肌炎症损伤小鼠心肌切片HE染色显示,与模型组相比,实验组小鼠心肌炎症病灶浸润较少,心肌细胞坏死减少,间质内炎症细胞分布较少。外周血Elisa检测显示,与模型组小鼠相比,实验组小鼠cTnI（P<0.01）与IL-18（P<0.05）表达明显下降。4.NLRP3炎症小体在模型组小鼠表达升高,在实验组中表达降低Western blot检测显示:模型组小鼠NLRP3（P<0.01）、ASC（P<0.05）与cleaved-caspase 1（P<0.05）蛋白比对照组升高,实验组小鼠NLRP3（P<0.05）、ASC dimer（P<0.001）与cleaved-caspase 1（P<0.05）蛋白比模型组表达降低。GSDMD的免疫荧光染色检测显示:模型组中GSDMD的表达水平高于对照组（P<0.01）;实验组GSDMD的表达水平低于模型组（P<0.01）。5.IL-37可能通过抑制NFκB降低心肌炎小鼠NLRP3炎症小体表达Western blot检测显示:模型组小鼠比对照组NFκB P65（P<0.05）、phospho P65（P<0.01）的表达明显升高;实验组 P65（P<0.01）、phosphoP65（P<0.01）的表达低于模型组,IL-37对照组中P65（P<0.05）、phospho P65（P<0.05）的表达水平明显低于对照组。RT-PCR检测发现模型组P65 mRNA表达高于对照组（P<0.05）,实验组P65 mRNA表达水平明显低于模型组（P<0.05）,IL-37对照组P65 mRNA比对照组表达水平明显下降（P<0.05）。研究结论1.IL-37可以减轻病毒性心肌炎小鼠的心肌损害,改善小鼠一般状态。2.NLRP3炎症小体参与CVB3诱导的病毒性心肌炎,IL-37抑制NLRP3炎症小体表达。3.IL-37可能通过抑制NFκB通路改善小鼠病毒性心肌炎。
聂抒[3]（2020）在《干扰TLR9-IRF5信号通路对柯萨奇病毒性心肌炎的保护作用》文中提出病毒性心肌炎（VMC）是由病毒感染和继发的免疫反应等多种因素共同作用引起的心肌炎性病变,也是引起青少年心源性猝死和心衰最主要的病因之一,目前尚无特异而有效的临床治疗方法。已发现Toll样受体9（TLR9）信号通路在柯萨奇病毒B3（CVB3）感染诱发VMC过程中活化并起加重心脏炎症及损伤作用,而TLR9信号途径中的关键转录因子干扰素调节因子5（IRF5）也与多种心脏炎症的发生发展密切相关。为了探讨TLR9-IRF5信号通路在柯萨奇病毒性心肌炎发生发展中的作用及干预此通路对该疾病的治疗作用,本文选择感染柯萨奇病毒性心肌炎患者为研究对象,检测患者血清中IRF5参与调控的细胞因子和心包积液中TLR9-IRF5信号通路主要因子的表达水平;应用CVB3感染Balb/c小鼠和H9C2细胞建立VMC小鼠和细胞模型,检测TLR9-IRF5信号在柯萨奇病毒性心肌炎病程中是否活化及其致病作用,以及采用免疫抑制性脱氧寡核苷酸AAAG ODN对模型小鼠的TLR9-IRF5信号进行干预。结果发现:TLR9-IRF5信号通路主要因子在柯萨奇病毒性心肌炎患者心包积液及IRF5参与调控的细胞因子在患者血清中的表达水平明显升高;TLR9-IRF5信号途径的活化对心脏炎症及损伤有加重作用;在柯萨奇病毒性心肌炎病程中适时干扰TLR9-IRF5信号,如在CVB3感染小鼠后第4天给予AAAG ODN,可明显减轻小鼠的心肌损伤。综上,TLR9-IRF5信号参与了柯萨奇病毒性心肌炎的致病过程,而在疾病病程中适时干预TLR9-IRF5信号可减轻心肌的炎症反应和损伤。本研究为治疗柯萨奇病毒性心肌炎提供了有价值的实验数据。
杨慧[4]（2019）在《芩芪口服液的毒性研究及其对EMCV致小鼠心肌炎的治疗作用》文中认为目的:探讨新兽药芩芪口服液的急性毒性与长期毒性,评价其安全性。研究芩芪口服液对脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）所致的病毒性心肌炎（viralmyocarditis,VMC）的治疗作用及其分子机制。方法:1、急性毒性试验:采用最大给药量测定芩芪口服液急性毒性,评价其安全性。2、长期毒性试验:将80只SD大鼠随机分为芩芪口服液低、中、高剂量组和空白对照组,每组20只,雌雄各半,连续给药30天。停止给药24 h和15 d后进行剖检、血液生化检查和病理组织切片观察。3、VMC模型的建立:观察小鼠106TCID50EMCV攻毒后3、7、10、14 d不同时间点心肌病理变化及心肌组织病毒载量、IL-1β、IL-6、TNF-α含量变化。4、药效学试验:180只雄性昆明小鼠随机平均分为对照组、模型组,芩芪口服液低、中、高剂量组,利巴韦林阳性对照组。模型组、各治疗组小鼠腹腔注射0.2 mL含有106TCID50EMCV的培养液,对照组注射0.2 mL的培养液。小鼠攻毒24 h后,芩芪口服液低、中、高剂量组小鼠灌胃0.1 mL分别含0.6、1.2、2.4 g·mL-1芩芪口服液6 d;阳性对照组腹腔注射0.1mL利巴韦林6 d;对照组及模型组小鼠灌服蒸馏水6d。于实验第3天每组处死8只小鼠,第7天将各组存活小鼠称重后处死,取心脏固定、冻存。心脏组织进行病理积分,qRT-PCR检测心肌EMCV载量、IL-6、IL-23A、IL-17A、TGF-βmRNA的表达,流式细胞术检测脾脏中Th17细胞与Treg细胞的比率。结果:1、急性毒性试验证明芩芪口服液安全无毒。长期毒性试验中,与空白相比,芩芪口服液各组大鼠的外观体征、行为活动、体增重、血液学和血液生化指标均无显着性差异（P>0.05）;系统剖检与脏器病理组织学检查,均未见与药物毒性相关的组织病理变化,停药后也未见药物延迟性毒性反应。2、EMCV感染小鼠可造成小鼠心肌损伤与炎症,成功建立VMC模型。3、药效学试验:（1）攻毒后第3 d、7 d芩芪口服液各剂量组均可显着降低VMC小鼠心肌病理损伤（P<0.05）;（2）攻毒第3 d,芩芪口服液各处理组IL-6、IL-23A、IL-17A mRNA均低于模型组,中剂量组最佳;第7 d芩芪口服液各组IL-6、IL-23A、IL-17A mRNA均显着低于模型组（P<0.05）。第3 d芩芪口服液高剂量与第7 d芩芪口服液中剂量TGF-βmRNA显着高于模型组（P<0.05）;EMCV感染3 d、7 d芩芪口服液各组病毒载量显着低于与模型组（P<0.05）;（3）第7 d芩芪口服液中、高剂量与模型组相比可显着降低脾淋巴细胞中Th17/Treg细胞比率（P<0.05）。结论:1、芩芪口服液对大小鼠均安全无毒,为靶动物的临床试验提供了依据。2、芩芪口服液可降低病毒及炎症带来的心肌损伤,调节机体Th17/Treg的稳态。
汪亚萍[5]（2019）在《组织蛋白酶B在病毒性心肌炎中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:病毒性心肌炎是由病毒感染导致的心肌弥漫性或局灶性炎症病变。它是年轻人心源性猝死的重要原因之一,也是继发性扩张型心肌病的最常见病因,但目前临床上仍缺乏有效的特异性治疗措施。心肌细胞的凋亡、坏死和心脏中的炎症反应是病毒性心肌炎的主要病理特点。组织蛋白酶B（CatB）是一种广泛表达且主要位于溶酶体和晚期内体的半胱氨酸蛋白水解酶,可通过参与细胞凋亡、细胞外基质降解、抗原呈递、炎症反应、细胞自噬等多种病理生理过程从而参与多种疾病的发生和发展。然而,其在病毒性心肌炎中的作用尚无研究。因此,本研究旨在探索CatB在柯萨奇病毒B组3型（CVB3）诱导的小鼠病毒性心肌炎中的作用及相关机制。研究方法:本研究采用4周龄雄性CatB基因全敲（Ctsb-/-）小鼠、其内源性抑制剂胱抑素C（cystatin C）基因全敲（Cstc-/-）小鼠和野生型C57BL/6小鼠,通过腹腔注射1000半数组织培养感染剂量（TCID50）的CVB3构建小鼠病毒性心肌炎模型,应用心脏超声检查评价小鼠心功能后,收集其血清和心脏组织标本。通过苏木素-伊红染色、组织病理学评分、心脏超声、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法,观察CatB敲除和cystatinC敲除对小鼠病毒性心肌炎生存率和疾病严重程度的影响;并进一步应用western blot蛋白印迹、酶活性测定、ELISA、原位末端转移酶标记技术（TUNEL）、病毒滴度测定等方法,探究CatB影响病毒性心肌炎的可能机制。研究结果:在感染CVB3后第7天和第28天,模型组小鼠心肌中活化型CatB的蛋白水平以及CatB的酶活性相比于对照组均明显升高。在未感染病毒的情况下,CatB及其内源性抑制剂cystatin C的缺失均不影响小鼠短期内的存活率、心脏结构和功能。但在腹腔接种等量CVB3的条件下,与野生型小鼠相比,Ctsb-/-小鼠的存活率、心肌组织炎症浸润、炎症病理评分、血清肌钙蛋白水平、心功能均明显改善,而Cstc-/-小鼠的这些指标均进一步恶化。进一步研究发现,野生型小鼠感染病毒后,心肌组织中炎症小体被激活,细胞焦亡加重,表现为含pyrin结构域的NOD样受体家族3（NLRP3）、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活和募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-1 p20片段表达增高、caspase-1酶活性增强、血清白介素-1β水平增高以及心肌组织TUNEL染色阳性细胞比例增加,而CatB的敲除抑制了心肌炎小鼠心肌中NLRP3炎症小体的激活和细胞焦亡,相反,cystatin C的敲除则进一步增强了该现象。但三种不同基因型小鼠感染CVB3后第7天和第28天,其心肌组织中的病毒滴度均无显着性差异。结论:在CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型中,心肌组织CatB被激活。CatB的激活会加重病毒性心肌炎,且这一作用不依赖于对病毒复制的影响,而调控NLRP3炎症小体的激活和促进细胞焦亡的发生可能是其作用机制之一。这为病毒性心肌炎提供了一个新的潜在治疗靶点,有望改善心肌炎的预后。
颜克鹏[6]（2018）在《固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制》文中进行了进一步梳理目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是多病因引起的血清淀粉酶、脂肪酶显着升高为特征的胰腺炎症损伤疾病。AP由胆石病、高血脂、酗酒、感染、遗传因素等诱导,发病机制和临床治疗策略均不十分清楚。可引起胰腺炎的病毒包括:流行性腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒等。柯萨奇病毒中的B3、B4型均可引起胰腺炎,B3型柯萨奇病毒（Coxsackievirus B Type 3,CVB3）感染诱导的病毒性心肌炎研究较为深入广泛,而CVB3诱导的急性胰腺炎的发病机制缺乏研究。CVB3为小核糖病毒科无衣壳正链RNA病毒。经粪口途径感染心脏、胰腺、脑、肝脏等,导致心肌炎、胰腺炎、病毒性脑炎、肝炎等。CVB3诱导急性病毒性心肌炎的机制主要由急性期（0-3天）病毒大量复制直接损伤心肌和心脏局部浸润免疫细胞炎症效应损伤所介导。病毒感染早期心脏局部,固有免疫激活介导的炎症细胞因子、趋化因子分泌及多种免疫细胞（主要为巨噬细胞和T细胞）的浸润,是急性病毒性心肌炎的主要致病细胞;心肌局部M1型巨噬细胞浸润介导的炎症损伤（TNF-α和IL-1β）和后期心脏局部过度的Th1/Th17免疫炎症损伤（IFN-γ和IL-17A）,是介导病毒性心肌炎的主要免疫效应机制:NK和γδT细胞等也发挥了重要的早期促炎和调控功能。很多研究证实CVB3感染早期心脏局部上调的IL-17A及IL-17-IL-17RA通路应答在心肌炎和心肌纤维化进程中发挥关键致病作用。胰腺是CVB3感染肠道入血后的首要器官,且胰腺CVB3的复制水平高于心脏,提示CVB3感染的致死首先来自于急性胰腺损伤,其次来自于急性心肌炎。然而迄今,CVB3感染诱导的急性胰腺炎的免疫发病机制未见详尽报道。我们的小鼠预试验发现:1)CVB3在胰腺组织的复制最高,心脏、肝脏次之;第3天的胰腺组织大量坏死主要来自于病毒复制;2)相对于病毒性心肌炎显着的免疫炎症浸润,CVB3感染后的胰腺坏死程度高于免疫浸润损伤;3)急性心肌炎和急性胰腺炎的共同特征是发现感染早期IL-17A的显着上调;IL-17A敲除小鼠感染CVB3后病毒性心肌炎显着减轻、小鼠生存率提高,提示IL-17A及其通路也可能在急性胰腺炎发病中发挥关键作用。IL-17A及IL-17A/IL-17RA通路是已知的感染性和自身免疫性组织炎症损伤的关键核心机制。IL-17A通路所介导的中性粒细胞组织浸润、Th17应答极化及其炎症效应,是其介导组织损伤的主要机制。IL-17A的来源主要有固有免疫细胞（ILC3、γδT、中性粒细胞）、T细胞（Th17）和组织细胞等。我们的预实验发现:病毒感染早期（3天）诱导了胰腺内γδT细胞上调浸润;同时该群细胞分泌较高水平的IL-17A。CVB3感染心肌细胞早期,γδT细胞是分泌IL-17A的主要细胞且促进急性心肌炎的发展。提示γδT细胞主导的IL-17A通路在CVB3诱导的胰腺炎中发挥重要作用。基于以上,我们提出了科学假设:CVB3感染胰腺早期的innate IL-17A可能在病毒性胰腺炎发病中发挥重要促炎作用,γδT是CVB3感染早期胰腺IL-17A的重要分泌细胞,并促进Th17分化及炎症损伤效应。本研究在CVB3感染C57BL/6小鼠诱导的急性胰腺炎模型中,明确胰腺早期IL-17A的分泌动力学;流式细胞术明确innate IL-17A的来源细胞及分泌IL-17A的γδT亚群;通过IL-17A-/-小鼠、TCRδ-/-小鼠、中和单抗和转输试验明确γδT17在CVB3病毒性胰腺炎中的作用;并探讨了 IL-23响应的γδT17促进胰腺Th17炎症效应的可能机制。本研究旨在创新性阐明γδT17及其IL-17A通路在CVB3急性胰腺炎发病中的作用和机制。研究方法:1.C57BL/6小鼠急性CVB3胰腺炎模型的建立:以2000 TCID50剂量CVB3腹腔注射小鼠,7天小鼠死亡率约为30%-60%,体重减轻率为25%,第三天胰腺病毒载量约106 PFU/g。第3～7天可见胰腺腺泡细胞坏死崩解及炎症细胞浸润。2.组织HE染色鉴定心肌炎、胰腺炎病理:胰腺组织经过多聚甲醛固定、脱水、包埋、制备5μm石蜡切片,H&E染色。3.组织病毒滴度测定:胰腺组织20mg,0.5ml PBS匀浆重悬,离心取上清,按1 0-1—1 0-10梯度稀释待用。Hela细胞按80%密度铺96孔板,胰腺匀浆30μl组织样本稀释液加至细胞表面,8复孔,37℃培养1小时,PBS洗三遍,加2%FBS DMEM培养,连续5天观察细胞病变情况。以细胞皱缩、折光性变差、飘起等大于50%视为病变孔。计算组织病毒TCID50/g,乘0.7换算PFU/g。4.胰腺、脾脏、外周血淋巴细胞分离与流式细胞术鉴定:小鼠胰腺组织以胶原酶IV和DNA酶Ⅰ消化,经75%-40%不连续Percoll密度梯度离心分离单个核免疫细胞:脾脏、外周血细胞经去除红细胞和过滤获得单个核细胞。T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、yδT细胞表型分别为CD45+CD3+、CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD45+CD11b+F4/80+、CD45+CD11b+Ly6C+和CD45+CD3+TCRδ+。5.IL-17A+细胞的胞内染色鉴定:单个核淋巴细胞首先经PMA和离子霉素刺激5小时,而后加入Golgi阻断剂作用1小时,收集洗涤后先经表面标志单抗CD4、CD8、TCRδ+、CD11b、Ly6G染色;经固定和穿膜后,再以荧光标记anti-IL-17A、IFNγ、IL-4染色,流式测定。6.中和单抗清除试验:在病毒感染-1和+3天,分别通过尾静脉注射120μg anti-Vγ4单抗,逐天经外周血检测清除效率。7.体外培养和激活Vγ4细胞:Vy4 mAb抗体包板4℃过夜,取单个脾细胞,以anti-CD28（1μg/ml）,rmIL-2（2ng/ml）培养基重悬,培养48h后,换rmIL-2（2ng/ml）的新鲜培养基培养;培养第3-4天始有活化γδT细胞出现,调整细胞浓度为0.7-1 ×106/ml。每1.5天更换培养基至第6天。Vγ4γδT细胞得率约2×107/脾。8.体外转输Vγ4细胞试验:WT和TCRδ KO小鼠,在CVB3感染-1和+3天分别通过尾静脉注射106新鲜培养Vγ4细胞,检测输注效率。9.外源注射重组IL-23试验:小鼠尾腹腔注射重组rIL-23（4μg）,1天后注射CVB3,观察小鼠发病情况。10.Elisa检测外周血及组织匀浆液细胞因子水平:胰腺组织30mg匀浆,1ml PBS（含有PMSF）重悬,离心取上清。依照eBioscience细胞因子检测试剂盒检测IFNy,IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-17A 等蛋白含量。11.脂肪酶活性测定:外周血血清样本、空白（双蒸水）,标准品分别与试剂混合均匀,37℃孵育100秒,570nm检测吸光度,根据公式计算样本脂肪酶活力。12.统计学分析:数据采用均数±标准差表示;两组间比较以t-检验;多组间比较以 one-way ANOVA 和 Bonferroni multiple comparison test 分析;生存曲线以Log-rank test 比较;以Graphpad Prism 5统计软件进行分析。结果:1、CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了急性病毒性胰腺炎以2000 TCID50的CVB3经腹腔感染C57BL/6雄性小鼠,感染7天体重下降率20%,死亡率为30～60%。第7天小鼠胰腺石蜡切片H&E染色显示:感染小鼠胰腺呈大量胰腺腺胞细胞坏死和炎性细胞浸润,脂肪酶水平明显升高,提示已成功建立了急性AP小鼠模型。2、CVB3急性胰腺炎小鼠胰腺IL-17A水平在感染早期显着升高且IL-17A显着促进了胰腺炎发病程度以ELISA、WB、IHC、IF法检测小鼠胰腺IL-17A水平,发现:CVB3感染后胰腺IL-17A水平显着增高,且在感染第3天达高峰。为证实IL-17A在急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染IL-17A-/-小鼠,发现:与WT小鼠相比,感染7天IL-17A-/-小鼠体重减轻显着降低,生存率明显提高;病毒滴度无明显变化;胰腺炎性细胞浸润和组织坏死明显改善;胰腺TNF-α等促炎细胞因子水平显着降低;提示IL-17A在急性病毒性胰腺炎发病中发挥关键的促炎作用。3、γδT细胞是CVB3感染早期期胰腺固有IL-17A的主要分泌细胞之一且主要为Vγ4 γδT亚群为明确感染早期胰腺增高的IL-17A的细胞来源,以流式检测CVB3感染小鼠0、3、7天小鼠胰腺浸润免疫细胞。发现:CVB3感染第3天可见胰腺γδT细胞比例显着增高,而CD4+Th细胞比例无明显变化。γδT细胞第3天浸润达高峰（2.2%,104/胰腺）,显着高于未感染组（0.8%,103/胰腺）;而CD4+Th细胞浸润于第7天达高峰（30%,106/胰腺）。胞内染色鉴定感染早期胰腺IL-17A+细胞类型,发现:感染3天,胰腺CD3+T细胞系分泌IL-17A的主要细胞。比较CD3+T中CD4+T、CD8+T、γδT、NKT 细胞发现:感染第 3 天 CD8+T（0.08%）和 NK（0.02%）几乎不分泌IL-17A,而CD4+T（0.24%）和γδT（0.31%）是分泌IL-17A的主要细胞;30%以上的γδT细胞分泌IL-17A,而仅6%的CD4+T分泌IL-17A（p<0.05）,提示CVB3感染胰腺早期增高的IL-17A主要由γδT和CD4+T分泌,γδT分泌效率显着高于CD4+Th17。检测γδT细胞亚群发现:γδT亚群Vγ1和Vγ4浸润比例和绝对数相当;而第3天胰腺分泌IL-17A的γδT主要是Vγ4细胞亚群。4、CVB3感染TCRδ-/-小鼠诱导的急性胰腺炎显着减轻为证实γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染TCRδ-/-小鼠,发现:γδT细胞缺失后,小鼠CVB3胰腺炎发病显着降低,胰腺细胞坏死和炎症浸润显着减少;胰腺IL-17A、TNF-α和IL-6水平均显着降低;病毒载量无变化。提示γδT细胞在胰腺炎发病中发挥致病作用。5、以中和抗体清除Vγ4 γδT细胞显着减轻CVB3急性胰腺炎发病为证实CVB3感染胰腺早期分泌IL-17A的Vγ4 γδT细胞亚群的作用,以Vγ4中和抗体于-1、+3天尾静脉注射小鼠清除体内Vγ4细胞,0天感染CVB3。结果显示:Vγ4中和抗体清除90%以上外周血Vγ4 γδT;清除Vγ4γδT使CVB3感染小鼠诱导的急性胰腺腺泡细胞坏死和炎症浸润显着减少;胰腺IL-17A、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平显着降低;提示Vγ4 γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中发挥促炎作用。6、过继转输Vγ4 γδT细胞显着加重CVB3病毒性胰腺炎体外诱导培养正常和IL-17A-/-小鼠来源的Vy4 γδT细胞,以106细胞/只小鼠尾静脉回输TCRδ-/-小鼠,1天后感染CVB3,发现:向发病减轻的TCRδ-/-小鼠回输Vγ4 γδT可显着加重病毒性胰腺炎发病,而回输IL-17A-/-来源Vγ4 γδT,则急性胰腺炎发病显着减轻。提示Vγ4 γδT所分泌的IL-17A确实在CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病中发挥关键促炎作用。7、IL-17A+Vγ4 γ8T细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关IL-17A-IL-17RA通路的效应之一是趋化中性粒细胞的器官浸润。流式检测发现:CVB3感染第3天诱导了胰腺中性粒细胞的大量浸润。而TCRδ-/-、IL-17A-/-小鼠及中和抗体清除了 Vγ4的感染小鼠胰腺中性粒细胞浸润比例和数目显着减少。清除Vγ4 γδT的小鼠外周血中性粒细胞被显着抑制90%,其向胰腺的浸润被显着抑制80%以上。提示胰腺早期浸润的IL-17A+Vγ4γδT细胞,显着促进中性粒细胞胰腺浸润并发挥促损伤功能。其次发现:清除Vγ4γδT小鼠脾脏及外周血的IFNγ+CD4+T（Th1）细胞比例及绝对数明显增加,而IL-17A+CD4+T（Th17）细胞的比例及绝对数明显减少;提示Vγ4 γδT细胞分泌的IL-17A通过抑制Th1应答、促进Th1 7炎症应答加剧病毒性胰腺炎。8、感染早期胰腺上调的IL-23激活浸润IL-23R+Vy4 γδT细胞向γδT17分化从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎为明确感染早期激活胰腺γδT细胞的机制,发现:CVB3感染极早期（day1）胰腺显着上调IL-23表达,而γδT细胞组成型高表达IL-23R,为证实IL-23-IL-23R通路对胰腺早期浸润Vγ4 γδT细胞的激活,对WT、TCRδ-/-小鼠外源腹腔注射IL-23,1天后感染CVB3,发现显着加剧WT小鼠急性胰腺坏死及炎症浸润,而不改变TCRδ-/-小鼠胰腺病理;同时,rIL-23显着增高注射12小时后体内胰腺诱导的IL-17A+γδT（而非Th17）比例。提示CVB3感染早期上调的胰腺局部IL-23,经由IL-23R通路激活Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A,从而促进病毒性胰腺炎病理。结论:1、CVB3感染C57BL/6小鼠第7天诱导了以胰腺腺泡细胞坏死、免疫浸润和血清胰酶增高为特征的急性病毒性胰腺炎。2、CVB3感染诱导小鼠胰腺早期（day1～3）上调表达IL-17A且其显着促进CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病。3、感染早期胰腺分泌IL-17A的主要细胞为Vγ4γδT17和CD4+Th17细胞,但γδT17先于CD4+T浸润胰腺、且其分泌IL-17A的效率显着高于Th17。4、γδT细胞敲除小鼠经CVB3诱发的急性胰腺炎发病显着减轻。中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后感染CVB3诱导的急性胰腺炎发病显着减轻。过继转输IL-17A+Vγ4 γδT显着加重CVB3诱导的急性胰腺炎;而转输IL-17A-/-来源的Vγ4 yδT细胞则使加重的胰腺炎显着减轻,提示Vγ4 γδT来源的固有IL-17A促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。5、IL-17A+Vγ4 γδT细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进γδT17分泌的IL-17A对于嗜中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关。6、感染早期胰腺上调的IL-23经IL-23R通路激活浸润Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。
杨洋[7]（2018）在《Annexin A1调控的中性粒细胞心脏浸润在病毒性心肌炎发病中的作用及机制》文中认为目的:病毒性心肌炎（Virus myocarditis,VMC）是病毒感染机体诱导的淋巴细胞心脏浸润与心肌细胞损伤所导致的心脏收缩和传导功能受损疾病,约21%的急性VMC可发展成为致死性扩张性心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）和心衰,可引起10%的青少年急性心功能衰竭死亡。肠道病毒属B3型柯萨奇病毒（coxsackievirus B type 3,CVB3）仍被认为是最常见的VMC病因,是临床DCM和心脏移植患者中最常检出的病毒。迄今,VMC的致病机理不清,临床缺乏特异性检测及治疗药物,阐明VMC的发病机制和探索繁殖新靶点具有重要意义。CVB3属单股正链小RNA病毒,经粪口途径首先在胃肠道少量复制,而后经血液循环进一步感染心脏、胰腺等诱导病毒性心肌炎、胰腺炎等。CVB3感染的急性期,病毒复制在第3天达高峰,引起心肌细胞坏死和凋亡,心肌细胞、成纤维细胞、局部巨噬细胞等经Toll样受体（TLRs）等识别病毒来源分子模式（PAMPs）和损伤心肌细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs）,上调趋化因子表达趋引外周免疫细胞浸润,并激活局部固有免疫炎症,分泌IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α及干扰素（IFNs）等多种炎症因子,发挥抗病毒效应,同时启动抗原提呈。感染的亚急性期（7-14天）,心脏病毒载量降至低点,适应性细胞被激活并渐次浸润心脏,CD8+杀伤性T细胞和过度的Th1和Th17应答促进了急性心肌炎的发展;而自身免疫性抗体加剧心肌炎。CVB3感染慢性期（14天至数月）,病毒低剂量持续存在,心肌修复重建,调节性T细胞和M2巨噬细胞分泌TGF-β等促进心肌纤维化和心肌肥大。当前,认为病毒导致的早期心肌损伤与免疫细胞浸润介导的免疫损伤是VMC的主要致病机制。CVB3感染的极早期（03天）,心脏浸润的多种固有免疫细胞（NK、巨噬细胞、γδT）及其独特的炎症因子效应发挥了直接抗病毒效应和调节后续T细胞应答的重要前驱作用。我们的预实验发现,CVB3感染1天起,即诱导激活了外周血中性粒细胞扩增和向心脏组织的快速浸润,并在第3天达高峰,其动力学曲线显着早于单核巨噬细胞,其绝对数高于其他浸润免疫细胞,且其心脏浸润绝对数与急性心肌炎损伤成正相关,提示中性粒细胞可能在急性VMC发病早期扮演重要作用。中性粒是人外周血的优势监控细胞,具有分泌抗菌肽、细胞因子及产生反应活性氧（ROS）、形成胞外诱捕网（NET）、调节T细胞应答等多种功能,是抗细菌及真菌感染的早期重要效应细胞,在心肌梗塞等无菌性炎症疾病中则发挥早期浸润和损伤组织作用;而在肿瘤则发挥抑制免疫促肿瘤生长功能。然而,中性粒细胞在病毒感染中的作用不甚明确,呼吸道单纯疱疹病毒和流感病毒感染中肺泡支气管大量浸润的中性粒细胞不发挥显着功能。在CVB3感染早期,浸润心脏的中性粒细胞是否可能发挥抗病毒作用?或发挥损伤心肌组织、促进心肌炎作用?本实验室前期研究以中性粒细胞特异单抗anti-Ly6G清除外周中性粒细胞发现不影响CVB3复制与急性心肌炎。而这一现象不能反映心脏浸润中性粒细胞的功能。为寻求一种能调节中性粒细胞心脏浸润的试剂从而探究心脏浸润中性粒细胞在VMC中的作用,我们发现膜联蛋白A1（annexin A1,Anx A1）具有调节中性粒细胞组织迁移的功能。Anx A1,是糖皮质激素通路信使,优势表达于上皮细胞、血管内皮细胞和中性粒细胞,能调节细胞内体囊泡吞噬体与肌动蛋白微丝结合而调控细胞的血管黏附与跨血管迁移。Anx A1和其N端模拟肽Ac2-26,与血管内皮细胞表面甲酰化受体2（FPR2）作用,具有调控中性粒细胞与内皮细胞黏附和迁移、调控巨噬细胞极化、调控局部炎症应答的功能。综上,我们提出科学假设:CVB3感染早期诱导外周血中性粒细胞向心脏的快速和优势浸润,可能发挥促炎促心肌损伤、促炎的有害作用,外源注射膜联蛋白Anx A1模拟肽Ac2-26,预期通过干预感染早期的中性粒细胞血管黏附与心脏迁移而改变（减轻）病毒性心肌炎发生。进一步深入探讨心脏浸润中性粒细胞通过分泌ROS、经由NET凋亡结构的促心肌细胞损伤和促心肌炎的致病机制,为病毒性心肌炎的防治提供基于中性粒细胞干预的新切入点。研究方法:1.BALB/c小鼠病毒性心肌炎模型建立:以1000 TCID50剂量CVB3腹腔注射小鼠建立急性心肌炎模型,7天小鼠死亡率约20%,体重减轻率25%,心脏第3天病毒载量约105 PFU/g心肌。第7天可见心肌细胞坏死崩解及炎性细胞浸润。2.心肌炎和心肌纤维化免疫组化染色鉴定:心脏组织经过多聚甲醛固定、脱水、包埋、制成超薄切片,H&E染色显示心脏组织炎症。3.骨髓中性粒细胞提取纯化与中性粒细胞流式细胞术鉴定:自小鼠股骨和胫骨取骨髓,经Percoll密度梯度离心获得中性粒细胞,纯度达95%。表型为CD11b+Ly6G+或CD11b+Gr1high。经流式检测,均可见独立的CD11b+Ly6G+一群,健康未感染鼠外周血中性粒细胞比例约410%（占CD45+淋巴细胞）。4.中性粒细胞合成ROS鉴定:骨髓来源中性粒细胞用PMA或CVB3刺激,中加入ROS检测探针H2DCFDA,流式细胞术检测ROS检测探针荧光强度。5.中性粒细胞形成胞外诱捕网（NET）效应的鉴定:两种方法:1)双荧光染色:以PMA诱导骨髓来源中性粒细胞形成胞外诱捕网,瓜氨酸化组蛋白（Cit-H3）为标志,anti-Cit-H3抗体联合Alexa fluor 488-抗-兔荧光二抗标记Cit-H3,DAPI染核,激光共聚焦显微镜鉴定。2)Western blot检测瓜氨酸化组蛋白（Cit-H3）。6.Anx A1模拟肽Ac2-26小鼠注射试验:6-8周BALB/c雄鼠,Ac2-26通过腹腔注射小鼠（2.5 mg/kg/d）,day-1/day1/day3注射3次。7.外周血和心脏免疫细胞组成的流式鉴定:裂解外周血中红细胞获取外周血单核细胞;以40%-75%不连续Percoll密度梯度离心获取心脏组织单个核免疫细胞,5抗体染色鉴定髓系细胞组成:CD45、CD11b、Ly6C、Ly6G、F4/80。通过4抗体染色鉴定T细胞组成:CD45、CD3、CD4、CD8,流式细胞仪检测。8.心脏超声仪检测左心室收缩舒张功能:小鼠麻醉后,用小动物超声成像系统（Vevo 2100）测量左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径,获得左心室射血分数（EF%）、左心室短轴缩短率（FS%）的计算值。9.实时定量RT-PCR技术检测外周血和心脏中性趋化因子、炎症细胞因子表达。10.骨髓中性粒细胞与原代心肌细胞共孵育试验:提取骨髓来源中性粒细胞,体外经PMA或CVB3刺激4小时,诱导ROS及NET的形成,随后与乳鼠原代心肌细胞共培养4小时,流式细胞术检测心肌细胞凋亡、坏死情况。11.统计学分析:数据采用均数±标准差表示;以Graphpad Prism 5统计软件进行统计学分析;组间比较采用方差分析;P<0.05被认为存在统计学差异。结果:1、CVB3感染第3天小鼠心脏上调表达中性粒细胞趋化因子。实时定量PCR检测心脏组织中性粒相关趋化因子表达,结果显示,CVB3感染后,显着诱导了CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、IL-8的上调表达,且第3天达高峰。2、CVB3感染小鼠诱导的外周血中性粒细胞扩增与心脏的早期快速浸润。CVB3感染第0、3、7天,流式细胞术检测外周血和心脏组织单核淋细胞结果显示:未感染小鼠外周血中性粒细胞占CD45+淋巴细胞的8%,绝对数2╳105个/ml;心脏比例约4%,绝对数1╳104个/g心脏。CVB3感染3天,外周血和心脏中性粒细胞比例显着上升至65%和45%,达到高峰,随后比例下降,而绝对数均持续上升。感染第7天心脏中性粒细胞比例回落至15-28%,而其绝对数达到13╳104个/g心脏。中性粒细胞这一先升后降的动力学曲线与CVB3心脏复制曲线一致。同时发现Ly6Chigh单核细胞发生外周扩增和心脏浸润,但其比例和绝对数（心脏浸润单核细胞在0/3/7天分别为2%-12%-15%）显着低于中性粒细胞。提示CVB3感染诱导0-3天外周血中性粒迅速扩增和向心脏的快速优势浸润。3、CVB3体内外均激活中性粒细胞上调功能性分子MPO及ROS的表达。中性粒细胞合成分泌的特征性酶和功能性分子包括:髓过氧化物酶（MPO）和活性反应氧中间物（ROS）等,为研究CVB3感染对心脏浸润中性粒细胞的激活作用,首先免疫组化及Western blot检测CVB3感染心脏组织中MPO的变化,发现随CVB3感染0-7天,心脏组织MPO表达逐渐上调;Amplex法证实心脏组织中ROS水平持续升高。体外以CVB3刺激骨髓来源中性粒细胞发现ROS水平增高。提示CVB3感染激活中性粒细胞的心脏浸润并促使其上调表达功能性酶和ROS。4、CVB3感染上调心脏组织内源性膜联蛋白表达。在使用外源性膜联蛋白干预中性粒细胞迁移之前,我们检测了CVB3感染对内源性膜联蛋白的调节。免疫组化发现,未感染小鼠心脏几乎不表达膜联蛋白;CVB3感染07天,内源性膜联蛋白随感染不断上调表达。5、外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26可减少病毒复制并治疗急性病毒性心肌炎。为干预CVB3感染后的中性粒细胞心脏迁移,采用膜联蛋白模拟肽Ac2-26注射方案:在感染-1、1、3、5天腹腔注射2.5mg/kg Ac2-26肽,0天注射CVB3,检测病毒复制与急性病毒性心肌炎的改变。结果显示:注射Ac2-26的小鼠经CVB3感染后,生存率显着提高、体重减轻率则相对下降,提示Ac2-26的治疗效果。感染7天心脏石蜡切片HE染色显示:Ac2-26组与未治疗组相比,心肌细胞坏死、炎性细胞浸润显着减少。Ac2-26显着减少心脏匀浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-6表达水平。心超检测发现:Ac2-26能显着提高CVB3感染下降的心脏左室短轴缩短率及心脏射血分数,提示心脏舒张功能改善。Ac2-26能明显降低心脏病毒的载量及复制。提示外源注射Ac2-26能显着减少病毒复制、减轻CVB3诱导的急性病毒性心肌炎并改善心脏功能。6、外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26减轻急性病毒性心肌炎的机制:与外周及心脏中性粒细胞浸润比例与绝对数显着减少密切相关。Anx A1调节免疫细胞的血管黏附与跨血管运动。为此分析了Ac2-26治疗第7天外周血和心脏中性粒细胞、单核细胞的比例与数目变化,发现:1)外周血中性粒细胞比例及绝对数显着减少:CVB3感染诱导外周血总CD11b+髓系细胞及其中的Ly6Chigh单核与Ly6G+Ly6C-中性粒细胞比例及绝对数显着上升,而Ac2-26显着降低CD11b+髓系细胞比例及绝对数。其中,外周血单核细胞比例及绝对数略有下降;而外周血中性粒细胞比例由90%降低至63%,其绝对数由1.4╳106/ml显着减少至0.4╳106/ml。2)心脏中性粒相关趋化因子表达显着降低:的表达变化。结果显示:膜联蛋白模拟肽Ac2-26注射后使CVB3上调的心脏CXCL1/2/3/5的表达显着降低。3)心脏中性粒细胞浸润比例与绝对数显着减少:Ac2-26注射后,心脏浸润总CD11b+髓系细胞比例和绝对数显着减少,其中心脏中性粒细胞比例略下降（45%至33%）,而绝对数由4╳104/g心脏显着降至1.2╳104/g心脏。免疫荧光检测心脏CD11b+Ly6G+细胞,同样证实Ac2-26能显着减少心脏内中性粒细胞浸润。同时,心脏浸润促炎单核细胞比例略下降,绝对数显着降低。提示外源注射Anx A1治疗急性心肌炎的机制与显着抑制CVB3诱导的外周中性粒心脏浸润密切相关。7、CVB3可体外激活骨髓来源中性粒细胞分泌ROS并促进原代心肌细胞凋亡。为阐明心脏浸润中性粒细胞促进心肌炎症损伤的机制,首先研究了中性粒细胞ROS分泌及其对心肌细胞效应。小鼠骨髓来源中性粒细胞在PMA和CVB3刺激后,ROS的产生显着上升;经与原代心肌细胞共孵育,可能促进心肌细胞凋亡。而Ac2-26能减少CVB3诱导中性粒ROS产生。8、PMA诱导中性粒NET效应可促心肌细胞凋亡而CVB3体外不能诱导经典NET形成。骨髓来源中性粒细胞以PMA刺激3hr,双荧光共聚焦显示PMA可诱导中性粒细胞内DNA等向胞外翻转和弥散;而Ac2-26能够显着抑制NET结构形成。将PMA诱导NET与原代心肌细胞共孵育发现促进心肌细胞凋亡,而NET抑制剂、MPO抑制剂和Ac2-26均可抑制PMA诱导中性粒NET的促心肌凋亡作用。初步试验发现CVB3体外刺激并不能诱导经典NET结构,推测诱导另一形式的不正常死亡（necroptosis）。9、NET抑制剂体内注射小鼠具有病毒性心肌炎的治疗作用。为证实CVB3感染诱导过度的中性粒死亡（NET）是其促炎致病机制。以中性粒细胞NET形成必需的PAD4抑制剂Cl-amidine,-1/1/3/5天注射小鼠,0天感染CVB3,发现可提高小鼠生存率。其余试验尚进行中。结论:1、CVB3感染BALB/c小鼠诱导了外周血中性粒细胞扩增和快速优势的心脏迁移浸润,中性粒细胞心脏浸润程度与心肌炎症损伤呈正比。2、CVB3感染诱导小鼠心脏上调表达膜联蛋白Annexin A1.3、外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26可显着降低CVB3体内复制、减轻急性病毒性心肌炎。4、Anx A1减轻CVB3性心肌炎的机制与显着下调外周血中性粒细胞扩增、减少中性粒细胞心脏浸润、抑制中性粒细胞分泌ROS相关。5、CVB3体外激活中性粒细胞分泌大量ROS,其可能促进心肌细胞凋亡。6、体外PMA诱导的中性粒NET效应促心肌细胞凋亡;体内中性粒NET效应可增加小鼠对CVB3的易感性。
黄炎兰[8]（2018）在《B细胞在小鼠病毒性心肌炎中的作用及其机制》文中研究说明病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是由嗜心肌病毒感染引起的炎症性心脏疾病,是引起40岁以下青年人猝死和心力衰竭的主要原因之一。VMC的主要发病机制与病毒直接损害心肌和病毒入侵后激活炎症因子引起的炎症免疫反应有关。尽管已有的研究表明T细胞在VMC中起重要作用,尤其是Th1和Th17,但是针对T细胞的研究仍未能完全解释VMC的发病机制。B细胞是另外一种重要的免疫细胞,主要调节体液免疫反应。B细胞的主要功能是分泌抗体、抗原呈递和分泌细胞因子。传统对B细胞的研究主要针对其分泌抗体,近年来越来越多的研究表明,B细胞分泌抗体以外的功能在自身免疫疾病中起更重要作用。我们的前期研究表明调节性B细胞（Breg,B细胞的其中一个亚群）在VMC中起调节免疫作用。然而,B细胞在VMC中作用及其作用机制如何?目前尚未见相关报道。为了进一步了解B细胞在VMC中的作用以及阐明B细胞在VMC中的作用机制,深入阐明VMC的发病机制,指导临床治疗。本课题应用C57BL/6小鼠腹腔注射柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3,CVB3）建立VMC小鼠模型,进行以下三方面研究。第一部分B细胞的免疫学特征在小鼠病毒性心肌炎中的变化研究一目的:应用C57BL/6小鼠腹腔注射CVB3方法建立VMC模型,观察VMC小鼠不同时期心肌的病理改变。方法:雄性4周龄C57BL/6小鼠72只,随机分为VMC组（n=40）和对照组（n=32）,两组小鼠均设1、2、3、4周4个时点亚组。其中VMC组每个亚组10只小鼠,对照组每个亚组8只小鼠。采用腹腔注射CVB3为VMC组,腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液（PBS）为对照组。两组小鼠在规定时点处死,留取心脏,用苏木精-伊红染色（hematoxylin&eosin,HE）染色了解心肌病理变化及计算心肌病理积分。结果:小鼠心肌在CVB3感染后第1周时炎症最重,可见心肌细胞肿胀,大量炎症细胞浸润和局灶性坏死,第2周后炎症逐渐减轻。计算心肌病理积分结果显示,VMC组小鼠心肌病理积分在第1周明显升高,并达高峰,第2周开始降低,与对照组相应时点比较有显着性差异（P<0.01）。结论:VMC模型成功,且炎症最重在CVB感染后第1周。研究二目的:观察在小鼠VMC的发病过程中B细胞分泌抗体、抗原呈递能力和分泌细胞因子的变化,探讨B细胞的免疫学特征在VMC中的变化及意义。方法:研究对象和分组同研究一。用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测血清IgA、IgM和IgG浓度,用流式细胞术检测脾脏B细胞总数、B细胞表达CD40、CD69、CD80、CD86和MHC-II变化以及B细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-4、IL-6和IL-17的变化。结果:VMC组血清IgG、IgM水平、B细胞表达CD40、CD69、CD80和MHC-II均在第1周明显升高（P<0.01）,并达高峰,第2周后逐渐降低（P<0.01）,但在第4周仍然高于对照组（P<0.05）,而VMC组血清IgA水平和B细胞总数与对照组比较均无显着差异（P>0.05）。但是VMC组B细胞表达CD86则在第1周开始下降（P<0.01）,在第2周明显降低（P<0.01）,第3周逐渐升高（P<0.01）,在第4周与对照组相当（P>0.05）。B细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-17在VMC组第1周明显升高（P<0.01）,第2周开始逐渐下降（P<0.01）,第4周降至与对照组相当（P>0.05）。而B细胞分泌的IL-4在VMC第1周和第2周则明显低于对照组（P<0.01）,在第3周和第4周与对照组比较无显着差异（P>0.05）。结论:B细胞分泌免疫球蛋白、抗原呈递能力和分泌的抗炎细胞因子均在VMC急性期明显升高并达高峰。第一部分总结论:B细胞在VMC急性期明显活化,B细胞分泌免疫球蛋白、抗原呈递能力和分泌的促炎细胞因子均在VMC急性期明显升高并达高峰。提示B细胞有可能参与VMC的发病过程。第二部分B细胞在小鼠病毒性心肌炎中的作用研究一目的:观察B细胞缺失（BKO）后对心肌损伤的影响,探讨B细胞在VMC中的作用。方法:野生型（WT）C57BL/6小鼠16只,分为对照组和WT组,每组各8只;BKO小鼠8只,为BKO组;严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠16只,分为SCID组和SCID+B细胞组,每组各8只,所有小鼠约为4-6周龄的雄性小鼠。其中SCID+B细胞组:将来源于VMC第7天C57BL/6小鼠脾脏分选出来的的B细胞在注射CVB3前3天腹腔注射进SCID小鼠体内。除对照组注射PBS外,其余各组均注射CVB3病毒建立VMC模型。用HE染色观察各组心肌病理变化并计算心肌病理积分,用ELISA测血清肌钙蛋白T水平。结果:BKO组和SCID组心肌病理积分比WT组和SCID+B细胞组均明显降低（P<0.01）,差异有统计学意义,BKO组分别与WT组和SCID+B细胞组比较差异有统计学意义（P<0.01）;SCID组分别与WT组和SCID+B细胞组比较差异也有统计学意义（P<0.01）,但是BKO组与SCID组比较、WT组与SCID+B细胞组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。血清肌钙蛋白T结果与心肌病理积分一致。结论:B细胞在VMC中的致病作用无需T细胞辅助,可单独通过B细胞分泌的细胞因子在VMC中起致病作用。研究二目的:探讨B细胞缺失后对IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22细胞因的影响。方法:WT C57BL/6小鼠和BKO小鼠各8只,分别为WT组和BKO组。均腹腔注射CVB3病毒,建立VMC模型。VMC1周时小鼠被处死,留取采血和心脏。ELISA测血清IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22的浓度,实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）测心肌细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22的mRNA表达。结果:与WT组相比,BKO组血清IFN-γ和IL-17浓度均显着下降,P<0.01;而BKO组血清IL-4的浓度则相反,比WT组显着升高,P<0.01;但是血清IL-22浓度在两组之间无统计学差异,P>0.05。心肌IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22的mRNA表达结果与血清蛋白水平结果一致。结论:在VMC中,B细胞促进IFN-γ和IL-17分泌,抑制IL-4的分泌。第二部分总结论:B细胞在VMC中起致病作用,无需T细胞辅助,且有可能通过影响辅助T（Th）细胞反应起作用。第三部分B细胞在小鼠病毒性心肌炎中对Th细胞分化的影响研究一目的:观察B细胞缺失后Th1、Th2、Th17和Th22细胞数及其相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγt以及AHR mRNA表达的变化。方法:WT C57BL/6小鼠和BKO小鼠各8只,分别为WT组和BKO组,均腹腔注射CVB3病毒,建立VMC模型。VMC1周时处死小鼠,留取心脏和脾脏。用流式细胞术测脾脏Th1、Th2、Th17和Th22细胞数,用RT-qPCR测心肌T-bet、GATA-3、RORγt以及AHR mRNA表达水平。结果:BKO组Th1和Th17细胞数比WT组均明显下降（P<0.01）,但是Th2细胞数比WT组显着升高（P<0.01）,Th22细胞数在两组之间比较无显着差异（P>0.05）。心肌T-bet和RORγt的mRNA表达在BKO组比WT组显着下降（P<0.01）,而GATA3的mRNA表达在BKO组则比WT组显着升高（P<0.01）,AHR的mRNA表达在两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:B细胞在VMC中可能促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。研究二目的:体外实验验证B细胞在小鼠VMC中对Th细胞分化的影响。方法:实验对象和动物分组同本部分研究一,VMC1周时处死小鼠,留取脾脏,用磁珠从VMC小鼠脾脏中分离B细胞,从BKO组小鼠和WT组小鼠脾脏中分离初始CD4+T细胞,体外培养诱导Th细胞分化。体外培养分为三组:（1）WT组:从WT组小鼠脾脏中分离初始CD4+T细胞;（2）BKO组:从BKO组小鼠脾脏中分离初始CD4+T细胞;（3）BKO+B细胞组:从BKO组小鼠脾脏中分离的初始CD4+T细胞与从VMC小鼠脾脏中分离的B细胞共同培养。用流式细胞术测Th1、Th2、Th17和Th22细胞数;用ELISA测细胞上清液IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22蛋白水平,用RT-qPCR测相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγt以及AHR表达水平的变化。结果:Th1和Th17细胞数、上清液IFN-γ和IL-17的浓度以及T-bet和RORγt的mRNA表达水平在BKO组均比在WT组和BKO+B细胞组明显降低（P<0.01）,Th2细胞数、上清液IL-4的浓度以及GATA-3的mRNA表达水平则在BKO组均比在WT组和BKO+B细胞组明显升高（P<0.01）,而Th22细胞数、上清液IL-22的浓度以及AHR的mRNA表达水平在三组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:体外实验表明B细胞可促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。第三部分总结论:B细胞在VMC中可促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。全文总结:（1）B细胞在VMC急性期明显活化,B细胞分泌的免疫球蛋白在VMC急性期明显升高并达高峰,B细胞的抗原呈递能力和分泌细胞因子能力均在VMC急性期明显增强。（2）B细胞在VMC中起致病作用且无需T细胞辅助,B细胞分泌的细胞因子在VMC中起促进心肌损伤作用,B细胞在VMC中可促进IFN-γ和IL-17分泌,抑制IL-4的分泌。（3）B细胞在VMC中可促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。
孟雅雯[9]（2018）在《Calpain1和Calpain2的活性对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎的作用及机制研究》文中研究说明病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是心肌局限性或弥漫性的炎性病变,可呈急性或慢性病程。绝大多数患者预后良好:约10-15%的患者由于急性期后炎症持续、病情反复,进展为扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy,DCM）。在原发性扩张型心肌病中高达60%的患者能检测到病毒感染,表明病毒直接感染是心肌炎重要的触发因素之一。已知超过20种病毒可引起病毒性心肌炎,包括柯萨奇病毒,腺病毒,流感病毒,艾滋病毒等,最常见的是嗜心性柯萨奇B3病毒（coxsackievirus group B type 3,CVB3）。因此探寻抑制CVB3的靶点,探寻病毒性心肌炎可能的干预途径,对病毒性心脏病的治疗具有重要的临床意义。自噬在心脏疾病中的作用:首先发现在正常生理下自噬对于维持心肌细胞的功能和活力至关重要;其次发现本底水平的自噬可以防止心肌肥大,当在小鼠心脏中阻断自噬导致了小鼠的心肌肥大;在链脲佐霉素（STZ）诱导的一型糖尿病小鼠中,抑制自噬将加剧心肌损伤。综上可知自噬对于维持心脏正常生理和改善心脏病理具有重要作用。越来越多的研究表明,在体外实验中细胞自噬过程促进CVB3病毒的复制,而在体内实验中也有研究表明胰腺腺泡细胞中自噬的减少能很好的改善胰腺炎。CVB3作为一个嗜心性病毒,其导致的危害最大的疾病是病毒性心肌炎,然而关于自噬在心肌炎的体内研究却未见报道。Calpain作为一个钙离子依赖激活的半胱氨酸蛋白酶,在其蛋白活性被激活后水解多种底物并发挥重要的生理功能。其中calpain1和2在心脏中的功能被广泛研究,并参与多种心血管疾病,在VMC心脏的心肌细胞中我们已经证明钙离子通道蛋白下调导致胞内钙离子负载,从而激活胞内calpain蛋白酶活性,在体外CVB3感染的细胞中calpain被激活,提示calpain在VMC病理中发挥重要作用。因此我们首先在体外抑制了calpain的蛋白活性,结果表明CVB3的复制明显受到了抑制。进一步实验结果表明,抑制calpain活性明显阻断自噬过程从而抑制了病毒复制。Calpain4作为calpain1与calpain2蛋白的小亚基,可以稳定蛋白结构和调节大亚基活性,当capn4敲除很大程度上抑制了calpain1和calpain2大亚基的活性。因此心肌特异性敲除capn4的小鼠通常作为calpain功能缺陷的小鼠。我们应用心肌细胞特异性敲除capn4的小鼠做VMC模型,探讨calpain1和2的活性对CVB3诱导的病毒性心肌炎的影响。与细胞结果不同,在小鼠体内我们的结果表明,capn4 KO组小鼠发病更严重,且心脏中病毒载量更高。ATG7心肌细胞特异性敲除的小鼠可以阻断心肌细胞上的自噬,以此小鼠及其同窝对照小鼠感染病毒,结果同capn4敲除小鼠一致:KO组小鼠明显心肌炎病情明显加重。因此我们确信在病毒性心肌炎小鼠体内抑制心肌细胞calpain的活性从而抑制自噬途径可以加重了病毒性心肌炎。本研究结果表明在细胞水平抑制calpain蛋白酶活性可以减少CVB3病毒复制,但是在体内抑制calpain活性却促进病毒性心肌炎病情的发展,也预示了calpain蛋白酶作为治疗病毒性心肌炎的靶点并不可行。
朱同刚[10]（2018）在《基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3机制研究》文中研究表明目的:应用柯萨奇病毒B3（CVB3）腹腔注射建立病毒性感染小鼠模型,予以新扶正除疫颗粒剂干预,检测小鼠一般状况、死亡率、肺组织病毒滴度及病理形态学变化、血清中IFN-γ、IL-4、IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达、凋亡因子Caspase-9及心肌组织中磷酸化AKT（p-AKT）和NF-kB的表达,探讨新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3的功效及其作用机制。方法:包括体外和体内实验两部分。1.新扶正除疫颗粒体外抗柯萨奇病毒B3作用研究:体外培养心肌细胞后,进行CVB3的培养和制备并进行CVB3病毒滴度的测定,按Reed-Muench方法计算TCID50;在培养板中观察新扶正除疫颗粒剂抗病毒吸附作用、对染毒心肌细胞的保护和抑制CVB3增殖作用实验。2.体内实验2.1柯萨奇病毒B3（CVB3）动物模型的建立、分组及给药:将144只BALB/c小鼠采用随机方法平均分为6组,每组24只,按照表面积换算给药量,按如下方法分组造模及给药:空白组;生理盐水灌胃,剂量是0.4ml/只,每日1次,连续7天;病毒模型组:生理盐水灌胃,剂量是0.4ml/只,每日1次,连续7天;新扶正除疫颗粒剂低剂量组:以新扶正除疫颗粒剂中成药量4.5g/（kg·d）灌胃,以上各组均连续7天,每日1次;新扶正除疫颗粒剂中剂量:以新扶正除疫颗粒剂中成药量9g/（kg·d）灌胃;每日1次,连续7天;新扶正除疫颗粒剂高剂量:以新扶正除疫颗粒剂中成药量18 g/（kg·d）灌胃;每日1次,连续7天;利巴韦林对照组（即阳性药物对照组）:以利巴韦林水溶液0.025g/（kg·d）灌胃,每日1次,连续7天。给药第3天,给每只小鼠腹腔注射50ul CVB3溶液(10×TCID50),常规饲养,造模后1小时后各组继续给药,存活72小时以上,且体重显着降低,证实病毒感染模型成功建立。2.2新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3感染作用及机制研究:从攻毒后感染之日（即给药第3天）起,随机选择每组中10只小鼠,连续对其观察7天,用于评价新扶正除疫颗粒剂对CVB3感染小鼠的一般状态及死亡保护作用。并且对每组另外剩余的小鼠进行心、肺等脏器病毒滴度和HE染色观察。采用流式细胞仪检测技术,观察新扶正除疫颗粒剂对CVB3染毒小鼠Th1免疫IFN-γ和Th2免疫IL-4表达的影响;采用ABC-ELISA法测定血清中IL-1β、IL-6及TNF-α表达的影响;采用流式细胞仪检测技术观察新扶正除疫颗粒剂对心肌细胞凋亡因子Caspase-9的影响;采用Western blot法观察新扶正除疫颗粒剂对心肌组织中磷酸化AKT（p-AKT）和NF-kB蛋白表达的影响。结果:1.新扶正除疫颗粒剂体外抗CVB3实验结果。新扶正除疫颗粒剂能够对染毒心肌细胞起到很好的保护作用,其中0.8 mg/ml新扶正除疫颗粒剂对心肌细胞保护作用明显,能够阻止CVB3的吸附作用。同时,该药物能够抑制CVB3的增殖的作用,抑制效果与药物浓度正相关。2.新扶正除疫颗粒剂体内抗柯萨奇病毒B3作用研究结果:新扶正除疫颗粒剂细胞毒性低,并且能够有效缓解染毒小鼠组织缺氧、缺血和坏死的症状和体征,能够降低染毒小鼠的死亡率。病毒滴度:感染病毒7天后,检测了不同组心、肺、肾脏组织中病毒滴度,发现中剂量组新扶正除疫颗粒剂组低于病毒模型组（P<0.05）,高剂量新扶正颗粒剂组显着低于病毒模型组和低剂量组（P<0.01）;心、肺组织病理变化:心肌病理变化方面,中剂量和高剂量给药组炎性细胞浸润明显减轻,其中高剂量组对心肌保护作用更加明显,同利巴韦林药物对照组相似;肺组织病理变化方面,中剂量和高剂量给药组炎症病变明显减轻,其中高剂量新扶正除疫颗粒组的结果更佳,与利巴韦林阳性药物对照组结果相似。3.在观察新扶正除疫颗粒剂抗CVB3感染机制探讨方面结果:对相关免疫学指标进行了检测,新扶正除疫颗粒剂中、高剂量组和利巴韦林组的IFN-γ和IL-4数值均明显升高,与病毒模型组比较,有显着性差异（P<0.01或P<0.05）;低剂量组与病毒模型组比较无显着性差异（P>0.05）;对血清中IL-1β、IL-6及TNF-α表达进行了检测,新扶正除疫颗粒剂中、高剂量组和利巴韦林组的IL-1β、IL-6及TNF-α表达均明显下降,与病毒模型组比较,有显着性差异（P<0.01或P<0.05）;低剂量组与病毒模型组比较无显着性差异（P>0.05）。对心肌细胞凋亡因子Caspase-9蛋白表达进行检测,新扶正除疫颗粒剂中、高剂量组和利巴韦林组的凋亡因子Caspase-9蛋白表达均明显升高,与病毒模型组比较,均有显着性差异（p<0.01）,其中高剂量组与病毒组比较差异性更加明显（P<0.001）;高剂量组与利巴韦林组比较有极显着差异（P<0.01）。对心肌细胞p-AKT和NF-κB蛋白表达结果进行检测,与病毒组比较,生理盐水组蛋白表达程度最高,其次是低剂量组、中剂量组;新扶正除疫颗粒剂高剂量组蛋白表达最低。结论:1新扶正除疫颗粒剂在抗CVB3感染体外实验中表现出良好的效果。对染毒心肌细胞观察发现,新扶正除疫颗粒剂能够明显减轻CVB3染毒细胞病变程度,抑制CVB3的增殖,对染毒心肌细胞起到很好的保护作用,作用效果与药物浓度呈正相关,而且新扶正除疫颗粒剂的细胞毒性较低。2.新扶正除疫颗粒剂在抗CVB3小鼠感染作用实验中效果明显。新扶正除疫颗粒剂能够有效缓解染毒小鼠组织缺氧、缺血和坏死的症状和体征,能够降低染毒小鼠的死亡率,抑制病毒在心、肺和肾脏等脏器中的增殖,能够有效抑制小鼠心、肺组织的过度的炎症表现,对染毒小鼠的脏器有一定的保护作用。3.新扶正除疫颗粒剂能够提高CVB3染毒小鼠的细胞免疫功能,有利于介导细胞免疫反应,提高对细胞内病毒的清除。其作用机制可能是与新扶正除疫颗粒剂能够提高IFN-γ和IL-4表达相关。4.血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β与心肌细胞病毒感染严重程度呈正相关;新扶正除疫颗粒剂能够降低柯萨奇病毒B3染毒小鼠的血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。5.新扶正除疫颗粒剂能够升高柯萨奇病毒B3染毒小鼠心肌细胞凋亡因子Caspase-9的表达。Caspase-9是细胞凋亡的启动因子,它本身无法直接达到促凋亡作用,而是需要通过对核心凋亡蛋白酶Caspase-3的激活,然后由Caspase-3激发凋亡级联反应诱发细胞凋亡。新扶正除疫颗粒剂促进细胞凋亡的机制可能是通过升高Caspase-9表达而促进染毒细胞的凋亡,从而抑制病毒在机体内的复制与增殖。6.新扶正除疫颗粒剂能够降低心肌组织中磷酸化AKT（p-AKT）和NF-kB的表达。PI3K-AKT-mTOR是哺乳动物细胞内一条重要的免疫信号通路,该通路由上游信号传导因子PI3K、下游信号因子Akt和底物因子mTOR组成。Akt对病毒复制的过程有重要的调节作用,在CVB 3感染过程中,经磷酸化激活的Akt具有明确的抗凋亡作用;活化后的Akt,能够促使下游核转录因子NF-κB转入细胞核,使NF-κB发挥其抑制细胞凋亡、促进细胞增殖与存活的功能。新扶正除疫颗粒剂抗CVB3感染的作用机制有可能与其抑制了细胞通路PI3K-AKT-mTOR相关。
二、Role of Dendritic Cells in Myocarditis Induced by Coxsackie B_3 Virus in Mouse（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Role of Dendritic Cells in Myocarditis Induced by Coxsackie B_3 Virus in Mouse（论文提纲范文）
（1）IL-37通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 IL-37在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）白介素37通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡减轻病毒性心肌炎（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分：CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎动物模型的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第二部分：IL-37在VMC小鼠心肌细胞焦亡中的作用及潜在机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）干扰TLR9-IRF5信号通路对柯萨奇病毒性心肌炎的保护作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 柯萨奇病毒 |
| 2 柯萨奇病毒性心肌炎 |
| 2.1 病毒性心肌炎 |
| 2.1.1 病毒性心肌炎的病原学 |
| 2.1.2 病毒性心肌炎的诊断标准 |
| 2.1.3 病毒性心肌炎的治疗 |
| 2.2 柯萨奇病毒感染诱发心肌炎的致病过程 |
| 2.3 柯萨奇病毒性心肌炎中介导心脏损伤的因素 |
| 2.3.1 病毒直接介导的心脏损伤 |
| 2.3.2 固有免疫反应介导的心脏损伤 |
| 2.3.3 获得性免疫反应介导的心脏损伤 |
| 3 TLR9-IRF5 信号通路与病毒性心肌炎 |
| 3.1 TLR家族简介 |
| 3.2 TLR信号通路与病毒性心肌炎 |
| 3.3 TLR9 介导的信号通路与病毒性心肌炎 |
| 3.3.1 TLR9 信号通路 |
| 3.3.2 TLR9 信号途径在病毒性心肌炎发病机制中的研究 |
| 3.4 病毒性心肌炎中TLR9 的配体 |
| 3.4.1 mtDNA |
| 3.4.2 HMGB1 |
| 3.5 TLR9 信号途径中参与病毒性心肌炎的关键分子 |
| 3.5.1 MyD88 |
| 3.5.2 NF-κB |
| 3.5.3 IRFs |
| 3.6 IRF5 在心肌炎中的作用 |
| 3.6.1 IRF5 的生理功能 |
| 3.6.2 IRF5 对炎症的调控 |
| 3.6.3 IRF5 介导的心脏损伤 |
| 3.7 TLR9/ IRF5 信号拮抗剂应用的研究现状 |
| 3.7.1 TLR9 拮抗剂应用的研究现状 |
| 3.7.2 IRF5 拮抗剂的研究现状 |
| 3.7.3 TLR9/ IRF5 信号拮抗剂的临床应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 TLR9-IRF5 信号通路相关分子在柯萨奇病毒性心肌炎患者中的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 柯萨奇病毒性心肌炎患者纳入与排除标准 |
| 2.1.2 临床指标采集 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 柯萨奇病毒性心肌炎患者血清中IRF5 相关细胞因子的表达检测 |
| 2.3.2 柯萨奇病毒性心肌炎患者心包积液中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达检测 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 柯萨奇病毒性心肌炎患者血清中IRF5 相关细胞因子的表达水平 |
| 3.2 柯萨奇病毒性心肌炎患者的心包积液细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平 |
| 3.3 柯萨奇病毒性心肌炎患者的心包积液上清中TNF-α和IL-6 的表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 TLR9-IRF5 信号通路在柯萨奇病毒性心肌炎小鼠中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.0 实验动物与细胞 |
| 2.1 ODNs |
| 2.2 病毒 |
| 2.3 实验试剂与器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 CVB3 的扩增与毒力检测 |
| 2.4.2 CVB3 感染BAlB/c小鼠建立VMC动物模型 |
| 2.4.3 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织病理变化的动态检测 |
| 2.4.4 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子m RNA表达水平的动态检测 |
| 2.4.5 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌组织中HMGB1 的检测 |
| 2.4.6 CVB3 感染H9C2 细胞建立VMC细胞模型 |
| 2.4.7 CVB3 感染后H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子m RNA表达水平的动态检测 |
| 2.4.8 HMGB1 中和抗体干预后CVB3 感染的H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的检测 |
| 2.4.9 氯喹干预后CVB3 感染的H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的检测 |
| 2.4.10 AAAG ODN干预后CVB3 感染的H9C2 细胞中HMGB1和TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的检测 |
| 2.4.11 检测Cp G1826 干预后CVB3 感染的H9C2 细胞活力 |
| 2.4.12 检测AAAG ODN干预后CVB3 感染的H9C2 细胞活力 |
| 2.4.13 检测氯喹干预后CVB3 感染的H9C2 细胞活力 |
| 2.4.14 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子与心肌损伤的关系 |
| 3.1.1 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠模型的建立 |
| 3.1.2 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织病理动态变化 |
| 3.1.3 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的动态变化 |
| 3.1.4 柯萨奇病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平与心肌损伤程度的相关性分析 |
| 3.2 CVB3 感染诱发心肌细胞中TLR9-IRF5 信号活化 |
| 3.2.1 CVB3 感染后心肌细胞中HMGB1 表达水平 |
| 3.2.3 CVB3 感染后心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.2.4 HMGB1 中和抗体对CVB3 感染的心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的影响 |
| 3.2.5 氯喹对CVB3 感染的心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的影响 |
| 3.2.6 AAAG ODN对 CVB3 感染的心肌细胞中TLR9-IRF5 信号通路主要因子表达水平的影响 |
| 3.3 干扰TLR9-IRF5 信号对CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.1 Cp G1826对CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.2 氯喹对CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.3 AAAG ODN对 CVB3 感染的心肌细胞活力的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CVB3 感染过程中HMGB1 的释放与TLR9 信号的激活 |
| 4.2 CVB3 感染后TLR9-IRF5 信号的激活与心肌损伤 |
| 5 小结 |
| 第三章 调节TLR9-IRF5 信号通路对小鼠柯萨奇病毒性心肌炎的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2 ODNs |
| 2.3 实验试剂与器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 AAAG ODN干预柯萨奇病毒性心肌炎小鼠 |
| 2.4.2 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠体重及一般状态影响的检测 |
| 2.4.3 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏炎症的检测 |
| 2.4.4 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9 信号通路主要因子的表达检测 |
| 2.4.5 AAAG ODN不同时间干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周免疫器官中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达检测 |
| 2.4.6 AAAG ODN干预后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中病毒载量检测 |
| 2.4.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AAAG ODN对柯萨奇病毒性心肌炎小鼠的影响 |
| 3.1.1 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠的一般状态 |
| 3.1.2 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠的心脏损伤程度 |
| 3.2 给予AAAG ODN后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.2.1 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子在感染后第7天的表达水平 |
| 3.2.2 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中TLR9-IRF5 信号通路主要因子在感染后第14天的表达水平 |
| 3.3 给予AAAG ODN后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周免疫器官中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.3.1 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠脾脏中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.3.2 不同时间给予AAAG ODN的柯萨奇病毒性心肌炎小鼠外周血白细胞的中TLR9-IRF5 信号通路主要因子的表达水平 |
| 3.4 给予AAAG ODN后柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏组织中病毒载量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AAAG ODN干预后对柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏中TNF-ɑ和 IL-6 表达水平的影响 |
| 4.2 不同时间应用AAAG ODN对柯萨奇病毒性心肌炎影响差异的可能机制 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）芩芪口服液的毒性研究及其对EMCV致小鼠心肌炎的治疗作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 病毒性心肌炎研究进展 |
| 1.1 病原学研究进展 |
| 1.2 发病机制研究 |
| 1.3 防治研究 |
| 1.3.1 疫苗防治 |
| 1.3.2 中药防治 |
| 2 芩芪口服液中单味中药药理研究进展 |
| 2.1 黄芩研究现状 |
| 2.2 黄芪研究现状 |
| 2.3 丹参研究现状 |
| 2.4 板蓝根研究现状 |
| 2.5 连翘研究现状 |
| 前言 |
| 试验部分 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 实验动物、细胞株、病毒 |
| 1.2 主要试剂与药物 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 芩芪口服液对小鼠急性毒性试验 |
| 2.2 芩芪口服液对大鼠长期毒性试验 |
| 2.3 BHK-21 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.4 EMCV的扩增、收获 |
| 2.5 EMCV的毒力测定 |
| 2.6 EMCV 3D基因质粒的制备 |
| 2.7 VMC动物模型制备 |
| 2.8 芩芪口服液对VMC小鼠的影响 |
| 2.9 数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 小鼠急性毒性试验结果 |
| 3.2 大鼠长期毒性试验结果 |
| 3.3 EMCV毒力测定 |
| 3.4 EMCV3D基因质粒的制备 |
| 3.5 小鼠VMC模型评价 |
| 3.6 芩芪口服液对VMC的影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 芩芪口服液安全性评价 |
| 4.2 EMCV感染小鼠模型的评价 |
| 4.3 芩芪口服液对小鼠急性病毒性心肌炎中Th17/Treg平衡的影响 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）组织蛋白酶B在病毒性心肌炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 HeLa细胞和病毒 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 CVB3病毒的扩增和滴度测定 |
| 3.2 基因敲除小鼠的鉴定 |
| 3.3 小鼠病毒性心肌炎的建立 |
| 3.4 小鼠心脏超声检查 |
| 3.5 小鼠组织标本的收集 |
| 3.6 心肌组织病理学检测 |
| 3.7 心脏组织病毒滴度测定 |
| 3.8 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.9 Western blot蛋白印迹 |
| 3.10 Caspase-1酶活性测定 |
| 3.11 CatB酶活性测定 |
| 3.12 原位末端转移酶标记(TUNEL)技术 |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型的构建 |
| 4.2 病毒性心肌炎小鼠心肌中CatB被激活 |
| 4.3 Ctsb~(-/-)小鼠和Cstc~(-/-)小鼠基因敲除的验证 |
| 4.4 CatB和cystatinC敲除不影响小鼠短期内的存活率、心脏结构和功能 |
| 4.5 CatB加重CVB3诱导的心肌细胞损伤和心功能不全 |
| 4.6 CatB在小鼠病毒性心肌炎中的作用并非通过影响病毒复制而实现 |
| 4.7 CatB促进了病毒性心肌炎小鼠心肌中NLRP3炎症小体的激活 |
| 4.8 CatB促进了病毒性心肌炎小鼠心肌组织中细胞焦亡的发生 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 IL-17A在CVB3感染早期胰腺显着上调并促进病毒性胰腺炎损伤 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 小鼠、细胞和病毒 |
| 2.2 试剂与耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了严重的致死性急性病毒性胰腺炎 |
| 3.2 CVB3感染显着上调胰腺局部早期IL-17A分泌 |
| 3.3 上调的IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎中发挥促炎有害作用 |
| 4、讨论 |
| 第二部分 γδT细胞是急性胰腺炎小鼠胰腺早期IL-17A的重要来源 |
| 1、引言 |
| 2、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 胰腺早期innate IL-17A的主要来源之一是胰腺浸润γδT细胞 |
| 4、讨论 |
| 第三部分: IL-17A~+γδT增加小鼠对CVB3的易感性并显着促进急性胰腺炎发病 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 γδT细胞促进CVB3急性胰腺炎发病 |
| 3.2 中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后病毒性胰腺炎显着减轻 |
| 3.3 TCRδ~(-/-)小鼠回输WT小鼠Vγ4 γδT细胞加重病毒性胰腺炎 |
| 4、讨论 |
| 第四部分 γδT17细胞促进CVB3病毒性胰腺炎的机制与促进中性粒细胞胰腺浸润和诱导Th17应答相关 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 缺失IL-17A或γδT小鼠胰腺炎减轻均伴随胰腺浸润中性粒细胞显着减少 |
| 3.2 中和抗体清除Vγ4γδT细胞后胰腺浸润中性粒细胞显着减少 |
| 3.3 清除Vγ4 γδT小鼠感染CVB3后上调IFNγ~+CD4~+Th1下调IL-17A~+Th17应答 |
| 4、讨论 |
| 第五部分 早期IL-23-IL-17通路激活胰腺γδT17细胞的机制探讨 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 CVB3感染第1天诱导胰腺IL-23显着上调表达 |
| 3.2 注射重组IL-23显着加重CVB3诱导胰腺炎的严重程度 |
| 3.3 注射重组IL-23后显着增加体内诱导的IL-17A~+γδT应答 |
| 4、讨论 |
| 结论和思考 |
| 1、结论 |
| 2、创新性 |
| 3、不足和未尽工作 |
| 参考文献 |
| 综述: IL- 17A~+γδT细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
（7）Annexin A1调控的中性粒细胞心脏浸润在病毒性心肌炎发病中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CVB3感染早期诱导了中性粒细胞快速优势的心脏浸润 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 CVB3感染BALB/c小鼠诱导急性病毒性心肌炎 |
| 3.2 CVB3诱导的外周血中性粒细胞、单核细胞扩增 |
| 3.3 CVB3感染上调心脏组织内中性粒趋化因子表达 |
| 3.4 CVB3感染3天诱导的心脏组织中性粒细胞优势浸润 |
| 3.5 CVB3体内外均激活中性粒细胞上调功能性分子MPO及ROS的表达 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 注射膜联蛋白ANXA1模拟肽通过抑制中性粒细胞心脏浸润显着减轻CVB3急性心肌炎 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 CVB3感染上调小鼠心脏内源性膜联蛋白表达 |
| 3.2 外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26可治疗急性病毒性心肌炎 |
| 3.3 外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26显着改善了小鼠心脏舒张功能 |
| 3.4 外源注射Ac2-26可显着抑制心脏组织病毒载量及复制 |
| 3.5 外源注射Ac2-26显着减少外周血中性粒细胞扩增 |
| 3.6 外源注射Ac2-26显着减少心脏组织内中性粒细胞与单核细胞的浸润 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 心脏浸润中性粒细胞促进急性心肌炎的可能机制及ANXA1对其功能的调节 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 中性粒细胞分泌ROS对原代心肌细胞活性的影响 |
| 3.2 CVB3刺激骨髓来源中性粒细胞形成胞外诱捕网及NET对于原代心肌细胞活性的影响 |
| 3.3 小鼠体内注射NET抑制剂提高了小鼠感染CVB3后的生存率 |
| 4.讨论 |
| 结论和思考 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
（8）B细胞在小鼠病毒性心肌炎中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 B细胞的免疫学特征在小鼠病毒性心肌炎中的变化 |
| 研究一 小鼠病毒性心肌炎模型的建立及心肌病理改变 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 B细胞在小鼠病毒性心肌炎不同时期免疫学特征的变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 B细胞在小鼠病毒性心肌炎中的作用 |
| 研究一 B细胞缺失对小鼠病毒性心肌炎心肌损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 B细胞缺失对小鼠病毒性心肌炎相关细胞因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 B细胞在小鼠病毒性心肌炎中对Th细胞分化的影响 |
| 研究一 B细胞缺失后Th细胞数及其转录因子的变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究二 体外实验探讨B细胞对Th细胞分化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本研究的创新点 |
| 附录1 中英文缩略语表 |
| 附录2 综述 |
| 综述一 B细胞分泌抗体之外的功能在自身免疫性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 B细胞在心血管疾病中的作用及其机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）Calpain1和Calpain2的活性对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Calpain蛋白在CVB3感染诱发的病毒性心肌炎小鼠心脏中的活性 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、CVB3感染雄性C57BL/6 小鼠建立病毒性心肌炎模型 |
| 二、Calpain蛋白活性在CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心脏组织的水平 |
| 讨论 |
| 第二部分 体外抑制Calpain酶活性可减少CVB3病毒复制 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、体外CVB3对原代心肌细胞的感染模型建立 |
| 二、抑制原代心肌细胞中calpain1和calpain2活性对CVB3病毒复制的影响 |
| 三、抑制原代心肌细胞中calpain1和calpain2活性对自噬的影响 |
| 讨论 |
| 第三部分 心肌细胞特异性敲除CAPN4对病毒性心肌炎的影响 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、心肌细胞特异性敲除capn4对calpain1和calpain2的蛋白稳定性的影响 |
| 二、抑制小鼠体内心肌细胞calpain1和calpain2的活性加重VMC |
| 讨论 |
| 第四部分 心肌特异性敲除ATG7加重CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、ATG7心肌特异性敲除小鼠的鉴定 |
| 二、心肌细胞敲除ATG7后加重VMC小鼠的心脏炎症域损伤 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 柯萨奇病毒B3型研究进展 |
| 2 中医药防治柯萨奇病毒B3实验研究进展 |
| 3 PI3K-Akt-mTOR信号通路研究进展 |
| 实验研究 |
| 1 新扶正除疫颗粒体外抗柯萨奇病毒B3作用研究 |
| 2 新扶正除疫颗粒体内抗柯萨奇病毒B3作用研究 |
| 3 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠T细胞亚群的影响 |
| 4 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α表达的影响 |
| 5 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠心肌组织中Caspase-9表达的影响 |
| 6 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠心肌组织中P-AKT和NF-κB表达的影响 |
| 讨论 |
| 1 柯萨奇病毒B3感染模型的建立 |
| 2 新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3作用研究 |
| 3 新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3的作用机制研究 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、Role of Dendritic Cells in Myocarditis Induced by Coxsackie B_3 Virus in Mouse（论文参考文献）
- [1]IL-37通过抑制p38 MAPK信号通路缓解病毒性心肌炎心肌细胞凋亡[D]. 孙琳. 山东大学, 2021(12)
- [2]白介素37通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡减轻病毒性心肌炎[D]. 孙琳. 山东大学, 2021(09)
- [3]干扰TLR9-IRF5信号通路对柯萨奇病毒性心肌炎的保护作用[D]. 聂抒. 吉林大学, 2020(08)
- [4]芩芪口服液的毒性研究及其对EMCV致小鼠心肌炎的治疗作用[D]. 杨慧. 山西农业大学, 2019(07)
- [5]组织蛋白酶B在病毒性心肌炎中的作用及机制研究[D]. 汪亚萍. 浙江大学, 2019(03)
- [6]固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制[D]. 颜克鹏. 苏州大学, 2018(06)
- [7]Annexin A1调控的中性粒细胞心脏浸润在病毒性心肌炎发病中的作用及机制[D]. 杨洋. 苏州大学, 2018(01)
- [8]B细胞在小鼠病毒性心肌炎中的作用及其机制[D]. 黄炎兰. 广西医科大学, 2018(12)
- [9]Calpain1和Calpain2的活性对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎的作用及机制研究[D]. 孟雅雯. 苏州大学, 2018(12)
- [10]基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3机制研究[D]. 朱同刚. 长春中医药大学, 2018(03)