一、转双抗虫基因741杨组培苗的温室驯化及大田移栽技术（论文文献综述）
武玉永[1]（2019）在《一种简单稳定的质体转化体系的建立及其在木本植物中的应用》文中研究表明质体工程技术是一种具有很强应用前景的植物生物技术,不同于传统的植物细胞核转化体系,质体转化通过同源重组方式使外源基因整合到质体的基因组中。具有高效表达,多基因共转化,产物区域化,无基因漂移等优势。利用质体作为植物生物反应器表达重组蛋白可实现植物分子农场,通过质体代谢工程可生产高附加值代谢产物。但是,应用此技术仍然存在一些技术瓶颈,比如,目前能进行稳定质体转化的高等植物仅有6种,且均属于草本植物。主要原因在于较多的植物尚未建立良好的外植体再生条件,质体转化载体构建过程繁琐,缺乏合适的筛选方法等。杨树和猕猴桃是我国种植范围最广、经济重要性最强的木本植物之一,但均无成熟的质体转化体系。为了拓宽可稳定质体转化的植物种类,扩大该技术的应用范围,本研究以山杨树、猕猴桃为主要研究对象,利用质体转化技术对这两种植物进行质体转基因研究。得到的主要研究结果如下:1.我们采用在大肠杆菌体内克隆技术（i VEC）来快速组装质体转化载体。首先,通过一步法把组成质体转化载体的5个DNA片段无缝拼接,构建了烟草质体转化载体pYY12。该载体包括烟草质体基因组的左同源序列（trnf M-psa B段）和右同源序列（trn Gpsb Z段）、aad A表达盒、绿色荧光蛋白（GFP）表达盒、以及去除多克隆位点的质粒p Bluescript II SK（+）作为载体骨架。采用基因枪转化法将pYY12载体成功导入烟草质体基因组中,通过Southern杂交和种子测试分析验证了获得的质体转gfp基因烟草达到了同质化;激光共聚焦显微镜证实了GFP在质体转基因烟草中的存在位置;SDS-PAGE定量分析表明GFP在质体中高水平的积累量,达到总可溶性蛋白～9%。鉴于以上结果中的高GFP积累量,可以将pYY12载体中的表达元件（aad A表达盒和gfp表达盒）应用到其他植物的质体转化载体的构建。2.利用pYY12载体中的表达元件及山新杨基因组中的左右同源序列,我们构建了杨树质体转化载体pYY20（gfp）。利用山新杨叶片再生体系,我们成功地将pYY20导入杨树质体基因组中,通过2～3轮再生,获得了转化同质化的质体转化植株。同质化的Pa-YY20杨树植株中,GFP的积累量仅占总可溶性蛋白的0.005%。用苏云金芽孢杆菌（Bt）cry1C基因和cry3Bb基因分别替换杨树质体转化载体pYY20中的gfp基因,我们分别获得了pYY25（cry1C）和pYY26（cry3Bb）等两个质体转化载体。在得到的同质化Pa-YY25转基因山新杨植株中,发现Cry1C蛋白在不同组织中的积累量不同,在叶片中积累量最高达到20.74μg/g鲜重,其次是在成熟叶片和老叶片中,在非绿质体（韧皮部、木质部和根）中的含量极其微弱。Pa-YY25转基因山新杨对美国白蛾1-4龄幼虫3天的致死率均为100%,而Pa-YY26转基因山新杨对柳蓝叶甲1龄幼虫1天的致死率和成虫6天的致死率均为100%。获得了质体Bt基因工程产生抗虫杨树第一个成功实例,为今后杨树的遗传改良开辟了新的途径。3.构建了红阳猕猴桃质体转化载体pYY34,通过基因枪转化法成功获得了1株同质化的质体转gfp基因猕猴桃植株Ad-YY34,在其叶片中观察到了GFP的荧光信号,GFP在叶片中的积累量约占总可溶性蛋白的0.02%。本研究是猕猴桃质体中转基因的第一个成功案例,该质体表达系统的建立为高效生产可食用疫苗、药物和抗体提供了研究基础。综上所述,本研究成功的建立了一种基于i VEC法构建质体转化载体的方法;以及在木本植物山新杨、猕猴桃中的建立了质体转化体系,并获得了高效抗虫的质体转Bt山新杨植株,为植物的遗传改良提供了一条新的途径和方法。
张俊杰[2]（2018）在《辣木再生体系的优化和遗传转化体系的建立与四倍体诱导育种》文中研究表明辣木（Moringa oleifera Lam.）又名鼓槌树,是辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa Adans.）多年生木本植物,具有重要的经济价值。目前,辣木仍主要以播种育苗的传统方式进行种植生产,实生群体性状分离严重,难以进行规范化栽培管理。值得庆幸的是,植物组织培养技术已日趋成熟,并且辣木全基因组测序和注释工作也已基本完成,为克隆生产性状整齐划一的辣木种苗和开展辣木分子育种提供了先决条件。本研究首先在辣木全基因组范围内进行了WRKY基因家族的搜索,利用生物信息学方法全面分析基因组中WRKY基因家族成员的数目、种类、结构、保守基序,并进行了筛选压及表达模式分析。另一方面,本研究还通过不定芽直接发生途径建立辣木再生体系,并在此基础上通过农杆菌介导法构建辣木遗传转化体系,以及秋水仙素处理诱导染色体加倍以创制新的种质资源。主要结果如下:以辣木全基因组及蛋白质序列为材料,用多种生物信息学软件在全基因组内进行搜索、比对和筛选,同时结合Pfam在线工具进行验证,共获得54个WRKY基因,命名为MoWRKY1-54。对获得的辣木WRKY基因及保守结构域进行多重序列比对,并构建MoWRKY结构域及基因的系统进化树,二者得到类似的进化关系,表明WRKY结构域是WRKY基因重要进化单位。参照Somssich的分组原则并结合辣木WRKY结构域多重比对结果对其进一步分组,将辣木WRKY基因分为I、II、III三组,其中II组又可分为IIa、IIb、IIc、IId和IIe五个亚组。对54个辣木WRKY基因保守结构域进行蛋白序列分析,发现MoWRKY24存在变异,核心序列由WRKYGQK变异为WRKYGKK。在MEME网站上,对获得的WRKY蛋白进行保守基序分析,结果显示在MoWRKY基因中可以找到20个保守基序,同一类型的WRKY基因含有的基序类型和数目具有一定的相似性。环境选择压力分析表明WRKY基因家族主要经历了强烈的纯化选择作用,有少数基因经历着正向选择,也有少数基因处在中性选择下不存在任何的选择压力。进一步比较不同亚组间的进化速率,发现辣木WRKY基因不同的亚组进化速率并不一致,其中II c组进化速率最快。基因表达模式分析表明辣木WRKY基因在不同生长条件不同组织中的表达水平差异较大。以辣木叶片为外植体成功构建了一套全新的、高效的不定芽直接发生体系。基因型、发育时期、接种方式及激素均对辣木叶片再生效率有影响。在MS基础培养基中添加0.8 mg/L BA,0.2 mg/L KT和0.05 mg/L NAA不定芽再生效果最佳,再生效率高达93.3%,平均每个外植体获得不定芽4.4个。另外,叶片外植体远轴端直接接触培养基的接种方式效率高于近轴端直接接触培养基。虽然该再生体系受基因型影响,仍具有较广的适用性。以构建的辣木再生体系为基础,通过农杆菌介导法,成功建立了一套辣木遗传转化体系。用携带质粒pCAMBIA1301的农杆菌菌株EHA105直接侵染未经预培养的外植体,抽真空,侵染后共培养2天,可显着提高侵染效率。基因的整合和表达通过GUS染色、PCR、Southern杂交和RT-qPCR得到了确认。该体系可为辣木的基因功能研究和分子育种提供基础。在构建的辣木不定芽直接再生体系基础上,用秋水仙素诱导多倍体辣木。秋水仙素对外植体都有一定的毒害作用,经秋水仙素处理后,外植体的再生效率大幅度下降。权衡再生效率和四倍体诱导比率,发现用500 mg/L秋水仙素处理3 d加倍效果最好,四倍体诱导比率达21%。四倍体辣木较二倍体叶面积大,气孔大。同时比较了四倍体和二倍体辣木枝叶中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、钙和磷7种饲料相关营养物质,四倍体均不同程度地高于二倍体。
王沛雅,杨晖,郭琪,杜维波,张军,杨涛[3]（2017）在《分子遗传改良技术在杨树上的研究与应用进展》文中提出杨树作为全球使用最为广泛的生态、能源、分子遗传木本模式植物之一,其种质资源研究改良对我国生态环境建设意义重大。综述不同目的基因（抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆境、降低木质素、促生长等）转化杨属植物的研究与应用,分析目前为止杨树分子改良研究应用发展现状、存在问题及解决途径,为杨树遗传改良的进一步发展提供参考。
卢楠[4]（2017）在《转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究》文中研究说明培育杨树耐盐新品种对于加强我国盐碱地的综合开发与利用,以及满足我国对杨树用材的需求具有重要意义。利用基因工程技术进行育种,能够克服传统育种方法周期较长、针对性不强的缺点。已有研究表明,异源转化AhDREB1转录因子在一定程度上可提高杨树的耐盐能力,但外源基因是否会造成非预期效应及转基因植株是否具备田间的长期稳定性和安全性尚不确定,能否进一步提高AhDREB1转基因毛白杨的耐盐能力也有待深入研究。为此,本研究以AhDREB1转基因毛白杨组培苗、大田种植苗为材料,通过盆栽盐胁迫试验分析转基因植株和非转基因植株在不同程度盐胁迫下的生理生化指标,并筛选出在非盐胁迫和盐胁迫下的转基因毛白杨和非转基因对照的差异表达基因,分析这些差异基因可能对受体植株的影响以及受外源基因调控的耐盐基因的功能,研究AhDREB1的耐盐机理;为了进一步提高受体植株的耐盐能力,以84K杨为受体植株,在AhDREB1转录因子的基础上,克隆了柽柳TaMnSOD、TaLea、拟南芥AtNHX3个不同耐盐途径的功能基因,构建多基因共表达载体,进行遗传转化;对比分析田间种植10年的AhDREB1转基因毛白杨的外源基因存在情况、表达量及转录组表达差异,评价AhDREB1转基因毛白杨的田间稳定性,同时,通过土壤微生物多样性、花粉可育性、化感作用等的检测,综合评估了AhDREB1转基因毛白杨的安全性。研究旨为杨树耐盐转基因育种提供重要参考,主要研究结果如下:（1）对在盐胁迫下和非盐胁迫下的AhDREB1转基因毛白杨和非转基因对照植株进行了盐胁迫试验和生理生化指标的检测,并且进行了转录组分析。AhDREB1异源转化杂种毛白杨显着的提高了受体植株的耐盐能力,增加了转基因植株在盐胁迫下的POD和SOD的活性以及脯氨酸的含量,同时,减轻了盐胁迫对植株的生长、光合作用等方面的抑制,降低了植物细胞受到的损伤;AhDREB1转录因子可能是通过调控部分耐盐胁迫的转录因子及抗盐胁迫基因增强转基因植株的耐盐能力,在上调的基因中共筛选出51个和胁迫相关的基因,其中包括转录因子10个,相关功能基因41个,包括:胁迫防御相关蛋白,氧化酶或氧合酶,胁迫应激蛋白等。（2）在非盐胁迫条件下,共发现转基因植株和非转基因差异基因52个,没有发现差异基因有明显的代谢通路富集,没有发现显着的非预期效应;而在胁迫条件下,对其中差异表达基因进行分析后发现,部分木质素合成的相关基因以及和发育相关的基因显着上调,外源基因可能会对受体植株的材性和生殖生长产生一定的影响。（3）通过设计特异性引物进行PCR扩增的方法,成功的从柽柳和拟南芥的cDNA中克隆出了TaMnSOD,TaLea,和AtNHX基因,并且从拟南芥的基因组中克隆出来了“胁迫响应型”启动子:拟南芥RD29a启动子,完成了由拟南芥RD29a启动子驱动的TaMnSOD,TaLea,AtNHX和AhDREB1基因的多基因共转化载体的构建并进行了银腺杨84K的遗传转化,目前获得少量卡那霉素抗性植株。（4）转基因毛白杨大田种植多年后,基因仍然稳定的存在于植株中,并且在各个器官中仍然能够表达,但是表达量有所下降。将大田苗重新组培化后与实验室保存相同时间的组培苗相比,发现外源基因的表达量有所降低,并且部分耐盐相关基因的表达量下调,对大田苗进行重新组培后,发现外源基因的表达量要显着低于保存同样时间的组培苗,并且发现33个抗逆相关基因的表达量显着下调。（5）化感作用试验和转基因植株林下土壤微生物多样性检测结果表明,AhDREB1转基因毛白杨与非转基因对照毛白杨相比并没有显着差异,说明目前转基因植株的次生代谢产物对周边的植物和微生物的影响相比于普通的三倍体毛白杨并没有显着差异;转基因毛白杨叶片中的外源基因会在叶片开始降解后的二至三个月完全降解;对转基因毛白杨林下土壤中的卡那霉素抗性微生物的基因组PCR检测结果表明,多年种植后外源基因暂未发生水平转移;对转基因毛白杨和非转基因对照毛白杨的花粉活力和杂交可育性结果表明,转基因毛白杨和非转基因对照毛白杨的花粉活力极低,与毛新杨雌株杂交没有获得种子。目前尚未没有发现潜在的危害。综上所述,本研究以AhDREB1转基因毛白杨为材料,对AhDREB1转录因子的耐盐相关机制进行了初步分析,并尝试进一步的耐盐性改良工作;对AhDREB1的非预期效应及AhDREB1转基因毛白杨的田间安全性及稳定性进行了评估,为杨树转基因育种工作提供了重要的参考。
朱伟康[5]（2016）在《转Bt基因欧洲黑杨组织培养再生体系优化及其TA29-Barnase基因遗传转化》文中指出转Bt基因欧洲黑杨是我国通过基因工程培育出的抗虫杨树新品种。由于受到转基因漂流及其可能引起的潜在生物安全问题的限制,转Bt基因欧洲黑杨种植推广一直进展缓慢。雄性不育基因工程最早应用在制备杂交种中,后来逐渐被人们利用到限控基因飘流中。近年来雄性不育基因工程技术成为解决转基因植物生物安全性问题的一种极具潜力的方法,对进一步推动转基因林木商业化种植具有重要意义。本文以转Bt基因欧洲黑杨叶片为实验材料,研究并优化了转Bt基因欧洲黑杨叶片再生体系,探讨不同条件对转Bt基因欧洲黑杨遗传转化的影响,建立了转Bt基因欧洲黑杨遗传转化体系。农杆菌介导的TA29-Barnase基因遗传转化,旨在减少因基因漂流造成的潜在威胁,使转基因林木更好的应用于生产实践中。主要结果具体如下:1.以1年生转Bt基因欧洲黑杨苗干的水培苗新生嫩枝为外植体,先用75%乙醇灭菌30s,再用0.1%升汞灭菌8min,消毒效果最好,此时污染率最小仅有15.0%,死亡率23.5%;以无菌苗茎段为外植体,通过比较萌发率和增殖系数,筛选出转Bt基因欧洲黑杨最适萌发和增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,萌发率为86.7%,增殖系数为3.10。2.以无菌苗叶片为外植体,通过比较叶片不定芽分化率和平均不定芽数,筛选出最适叶片不定芽分化培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.01 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,不定芽分化率和平均不定芽数分别高达100%和18个;叶片经过暗培养10d后,再转入弱光照下进行培养,有利于叶片不定芽的分化,不定芽再生率高达90%;最适不定芽生根培养基为1/2MS+0.05mg/L NAA+0.2mg/L IBA+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,生根率高达100%,40 d后,平均根长6.5cm。3.抑菌剂羧苄青霉素Carb浓度为400 mg/L,能有效抑制农杆菌生长,同时对叶片分化影响最小;在叶片分化不定芽中,抗性芽PPT选择压为2.0 mg/L;在不定芽诱导生根中,抗性芽PPT选择压为1.0mg/L;菌液浓度OD600值0.3,侵染时间10 min,共培养时间2 d,为转Bt基因欧洲黑杨遗传转化最佳条件,转化率为18.0%。4.经除草剂PPT筛选,共获得9个抗性芽。经PCR检测,有5株呈阳性反应植株,转化阳性率55.6%,初步证明目的基因已转入转Bt基因欧洲黑杨基因组中。
王奥漩[6]（2015）在《转多基因107杨遗传检测及抗性表达研究》文中研究说明为了培育抗逆、速生、优质杨树新品种,本试验对通过农杆菌介导法获得的13个转p209-Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨株系进行遗传检测和抗性表达研究。通过PCR检测,筛选转基因107杨株系;通过荧光定量PCR分析,获得外源基因在转录水平上进行表达的转基因株系;ELISA毒蛋白检测,获得目的基因在翻译水平上进行表达的转基因株系;抗虫性试验和耐盐性试验进一步鉴定筛选转基因高抗株系,最终获得3个转多基因高抗株系。主要研究结果如下:1.将13个经抗性筛选的转基因株系组培苗扩繁、驯化后,移栽至大田,获得转基因株系大田苗。分别以质粒p209-Cry1Ac-Cry3A-BADH和未转基因107杨为阳性对照和阴性对照,对13个转基因株系进行PCR检测:NPTⅡ基因的检测结果显示,13个转基因株系和阳性质粒均扩增出约473 bp的目的条带;Cry1Ac基因检测结果显示,10个转基因株系和阳性质粒扩增出约546bp的目的条带;Cry3A基因检测结果显示,5个转基因株系和阳性质粒可扩增出大小约667bp的目的条带;BADH基因检测显示,4个转基因株系和阳性质粒可扩增出507bp的目的条带,未转基因107杨无目的片段的扩增。由于时间和栽植苗木的存活问题,最终获得8个转基因株系进行后续试验。2.对PCR初步筛选获得的8个转基因株系和未转基因107杨（CK）,提取总RNA后,反转录合成c DNA,进行荧光定量PCR检测。检测获得3个转多基因（10、11、13）株系,1个转双Bt基因株系（1）,4个转Cry1Ac基因株系（3、4、6、8）。8个株系的Cry1Ac基因均在转录水平上表达,转录丰度为3.127E+032.652E+05;4个株系的Cry3基因转录丰度为2.916E+035.699E+04;3个株系的BADH基因转录丰度为1.910E+031.010E+04;CK未检测到荧光扩增信号。3.采用美国Agdia公司ELISA试剂盒对8个转基因株系和未转基因107杨（CK）进行Cry1Ac毒蛋白检测,3个转多基因株系（10、11、13）,1个转双Bt基因株系（1）,4个转Cry1Ac基因株系（3、4、6、8）均呈阳性显色反应,CK无显色现象。表明转基因株系均在翻译水平上有Cry1Ac基因表达,Cry1Ac毒蛋白含量为7.99ng·g-126.32 ng·g-1;根据Cry1Ac毒蛋白含量多少对3个转多基因株系排序为10>11>13号株系,10、11、13号株系间存在一定差异性但未到达显着水平。4个含双Bt基因株系的Cry3A毒蛋白检测结果均呈阳性反应,CK无显色反应。说明Cry3A基因进行了翻译表达,表达量为2108.91 ng·g-12724.79 ng·g-1。3个转多基因株系Cry3A毒蛋白含量排序为10>11>13号株系。各株系Cry3A毒蛋白含量显着高于Cry1Ac毒蛋白含量。4.分别用已知美国白蛾高抗株系PB29、柳蓝叶甲高抗株系CC84,未转基因107杨（CK）为阳性对照和阴性对照,对8个转基因株系进行饲虫试验。对比判断转基因株系的抗虫性,最终筛选获得3个对美国白蛾中抗同时对柳蓝叶甲高抗的转多基因株系,1个对美国白蛾和柳蓝叶甲均表现中抗的转双Bt基因株系,4个对美国白蛾低抗的转基因株系;转多基因株系中Cry1Ac基因抗虫性强弱为10>11>13号株系,Cry3A基因抗虫性强弱为10>11>13号株系。5.对3个含BADH基因的转多基因株系（10、11、13）进行耐盐试验,筛选获得3个转多基因高抗株系。通过盐胁迫下转基因株系成活率、苗高、地径、叶数变化等形态指标及净光合速率、叶绿素荧光参数、生物量、叶绿素含量等生理指标分析,证明3个转基因株系均表现出耐盐性,耐性强弱为11>10>13号株系。
任亚超[7]（2013）在《多基因植物转化载体对烟草和欧美杨107杨的遗传转化》文中研究指明为了实现多基因对烟草和杨树的遗传转化，本研究将多基因植物转化载体p209-BtCry1Ac-BADH和p209-BtCry1Ac-BtCry3A-BADH导入农杆菌中，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草（wisconsin35），获得了经PCR、荧光定量PCR检测的转基因植株，毒蛋白检测和抗性试验证明载体转化植物后，目的基因能够表达，并且转基因植株表现出一定的抗性。在此基础上进一步转化欧美杨107杨，获得了经PCR初步检测的转基因株系。主要研究结果如下：1. p209-BtCry1Ac-BADH载体对烟草的遗传转化及表达检测。确定了烟草遗传转化中分化培养基中硫酸卡那霉素（Kan）的筛选浓度为50mg·L-1，生根培养基中Kan的筛选浓度为75mg·L-1，在筛选过程中头孢噻肟钠（Cef）的使用浓度为400mg·L-1。利用农杆菌介导法转化烟草后，获得了经Kan筛选的完整再生植株。经PCR检测证明，4个株系中检测到BtCry1Ac和BADH基因；2个株系只检测到BtCry1Ac基因。荧光定量PCR检测表明，检测到所有目的基因的株系中有3个株系的2个目的基因均在转录水平得到表达，且存在表达差异，有1个株系未检测到BADH基因的表达。只检测到BtCry1Ac基因的2个株系均检测到目的基因的表达。ELISA毒蛋白检测表明，经荧光定量PCR筛选的3个株系均检测到BtCry1Ac毒蛋白的表达，含量最高为414.63ng·g-1，只检测到BtCry1Ac基因的2个株系也检测到毒蛋白。室内饲虫试验表明，3个转基因株系中只有2个株系对斜纹夜蛾幼虫表现出抗虫性，校正死亡率最高为38.2%，其余均没有表现出明显抗虫性。选取2个株系进行组培苗耐盐试验，表明在不同NaCl浓度下，转基因株系与对照之间没有明显差异。2.载体p209-BtCry1Ac-BtCry3A-BADH对烟草的遗传转化及表达检测。利用农杆菌介导法转化烟草后，获得了经Kan筛选的完整再生植株。经PCR检测证明，7个株系中检测到BtCry1Ac、BtCry3A和BADH三个基因；1个株系检测到BtCry1Ac和BtCry3A基因；1个株系只检测到BtCry1Ac基因。荧光定量PCR检测表明，检测到所有目的基因的株系中有4个株系的3个目的基因在转录水平得到表达且存在表达差异，有3个株系未检测到BADH基因的表达。检测到BtCry1Ac和BtCry3A基因的株系检测到目的基因的表达，只检测到BtCry1Ac基因的株系也检测到目的基因的表达。ELISA毒蛋白检测表明，经荧光定量PCR筛选的4个株系均检测到BtCry1Ac和BtCry3A毒蛋白的表达，BtCry1Ac毒蛋白的含量最高为267.90ng·g-1，BtCry3A毒蛋白的含量最高为13749.30ng·g-1，BtCry3A毒蛋白含量明显高于BtCry1Ac毒蛋白。另外3个只检测到BtCry1Ac和BtCry3A基因表达的株系也检测到BtCry1Ac毒蛋白，含量最高为369.92ng·g-1，其中2个株系检测到BtCry3A毒蛋白，含量最高为3262.86ng·g-1。其余部分株系也检测到毒蛋白。室内饲虫试验表明，7个转基因株系对斜纹夜蛾幼虫均具有抗性，校正死亡率最高为69.5%，其他检测到BtCry1Ac基因的株系对斜纹夜蛾幼虫也具有抗性，校正死亡率最高为59.3%。选取2个株系进行组培苗耐盐试验，表明在不同NaCl浓度下，转基因株系与对照之间没有明显差异。3.多基因植物转化载体对107杨的遗传转化。通过外植体培养，获得无菌107杨组培苗，经分化和生根交替繁殖，生长良好。确定了107杨遗传转化中分化培养基中Kan的筛选浓度为30mg·L-1，生根培养基中Kan的筛选浓度为50mg·L-1，在筛选过程中Cef的使用浓度为400mg·L-1。采用农杆菌介导法，将两个植物转化载体分别转化107杨，获得了经Kan筛选的完整再生植株。经PCR初步检测，获得10个转p209-BtCry1Ac-BADH的转基因株系和4个转p209-BtCry1Ac-BtCry3A-BADH的转基因株系。
王桂英[8]（2012）在《双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究》文中指出为鉴定并筛选出转双Bt基因741杨对鳞翅目和鞘翅目害虫同时具有较强抗性的株系，明确联合使用两种或两种以上的抗虫基因的抗虫效果。以8个转三基因双Bt （Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨株系、1个转双抗虫基因（Cry1Ac+API）741杨株系和3个转单抗虫基因（Cry3Aa）741杨株系为实验材料，未转基因741杨为对照，进行了外源基因表达测定和抗虫性对比试验。同时借助农杆菌介导，采用共转化法，用构建在同一表达载体pCAMBIA1305-Cry1Ac-Cry3Aa上的双Bt基因对巨霸杨进行遗传转化，获得了4株潮霉素抗性植株。经过PCR初步检测，表明双Bt基因已经整合进了巨霸杨基因组中。主要研究结果如下：1.转抗虫基因741杨分别为：单转Bt Cry3Aa基因741杨pCC系列3个株系pCC11、pCC53、pCC84；转双抗虫基因（Cry1Ac+API）741杨1个株系pB29；在pB29基础上通过二次转化法将Cry3Aa基因转入获得的转三基因双Bt（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨pCCA系列8个株系pCCA1、pCCA2、pCCA3、pCCA4、pCCA5、pCCA6、pCCA7和pCCA9。对各转基因株系及对照进行组培快繁，筛选确立了诱导741杨分化和生根的适宜培养基。分化培养基为：MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；生根培养基为：1/2MS+IBA0.3mg·L-1。2.转双Bt基因741杨等13个参试材料经特异引物PCR扩增Cry1Ac基因和Cry3Aa基因： pB29和转双Bt基因pCCA系列均扩增得到了Cry1Ac基因特异条带，对照741和pCC系列基因组未出现扩增条带。pCC系列和转双Bt基因pCCA系列均得到了Cry3Aa基因特异条带，对照741和pB29基因组未出现扩增条带。说明pB29中Cry1Ac基因和pCC系列中的Cry3Aa基因稳定存在。在pB29基础上，通过二次介导法外源Cry3Aa基因已整合到pCCA各无性系基因组中。3.通过RT-PCR和荧光定量PCR结合，在转录水平对外源基因的表达进行了检测。实时荧光监测表明：8个双Bt株系即检测到了Cry1Ac荧光扩增信号又检测到了Cry3Aa基因的荧光扩增信号。pCC-11、53、84只有Cry3Aa基因的荧光信号表达，而pB29只有Cry1Ac基因的荧光信号表达，对照741没有显现双Bt基因的荧光扩增信号。根据测得的Ct值，计算出了各样品中Cry1Ac基因和Cry3Aa基因在mRNA转录本中的表达量。双Bt株系pCCA系列及pB29中Cry1Ac基因的起始表达量在3.26×1047.50×105之间；双Bt株系pCCA系列及pCC系列Cry3Aa基因的起始表达量在1.79×1086.05×109之间。数据显示Cry3Aa基因的起始表达量在108109数量级，比Cry1Ac的起始表达量（104105数量级）高出了一万倍。4.用Bt-Cry1Ab/1Ac和Bt-Cry3A ELISA蛋白检测试剂盒，检测Cry1Ac蛋白：双Bt741杨pCCA系列的8个系号和pB29呈现蓝色阳性反应，蛋白含量在16.4460.32ng·g-1（FW）；pCC系列和对照741无显色反应。检测Cry3Aa蛋白：双Bt741杨8个系号及pCC系列呈现黄色阳性反应，蛋白含量在2.2413.30μg·g-1（FW）；pB29和对照741无显色反应。检测结果表明，双Bt株系能同时表达两种Bt毒蛋白，单Bt株系也表达了与各自所含基因相应的蛋白。从毒蛋白表达量看Cry3Aa蛋白表达量远远高于Cry1Ac蛋白表达量。Cry3Aa蛋白表达量在微克级，Cry1Ac蛋白表达量在纳克级。5.用转基因株系新鲜叶片进行柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）13龄幼虫和成虫及美国白蛾（Hyphantria cunea）1龄和4龄幼虫室内饲虫实验表明：转入不同抗虫基因的杨树对昆虫的抗性具有选择性，对非靶标昆虫没有毒杀作用。转双Bt基因741杨对鳞翅目的美国白蛾和鞘翅目的柳蓝叶甲具有双抗性，不同转基因株系表现出高中低的抗性水平。pCCA-1、2、5、6、9对柳蓝叶甲表现高抗，pCCA-3、4、7表现中低抗性。5个高抗株系的抗性水平明显比单Bt Cry3Aa基因的3个高抗株系(pCC-11、53、84)的抗虫性高，用这5个系号饲喂的柳蓝叶甲成虫3天时60%以上死亡，5天时死亡率达到85%100%；而pCC的3个系号3天时死亡率在50%以下，5天时也只有60%70%。在对美国白蛾的抗性上，有7个双Bt株系（pCCA2-7和pCCA9）的抗性水平与pB29表现一致，4龄幼虫在第79天时死亡率达100%；只有1个系号pCCA1对美国白蛾表现出了极低的抗性，4龄幼虫在第7天和第9天时的死亡率分别只有7%和23%。pCC系列不含抗鳞翅目的Bt Cry1Ac基因，对美国白蛾未表现抗虫性。6.饲虫结果还表明无论是柳蓝叶甲还是美国白蛾，1龄幼虫对Bt毒蛋白的耐受性比较差，取食23天全部死亡；柳蓝叶甲成虫及美国白蛾4龄幼虫耐受性明显增强，取食可延长到711天。通过对取食叶片实时拍照记录的取食危害面积来看，转基因株系同对照比，即使中低抗株系也能对叶片起到很好的保护作用。7.对美国白蛾4龄幼虫的总排粪量和体长调查表明：低抗株系pCCA1的总排粪量是高抗株系pCCA2-7、pCCA9和pB29的723倍，但跟对照的总排粪量比，只有对照的25%。从体长来看，未转基因741杨上的美国白蛾幼虫体长达到了19mm，pCCA2-7、pCCA9和pB29的体长在1012mm之间，而取食低抗株系pCCA1的最后体长也只有13mm（为对照的68%）。从虫粪和体长这两个指标分析来看，充分说明了转基因植株对昆虫的生长发育起到了明显的抑制作用。8.采用农杆菌介导法，以潮霉素做筛选标记，用构建在同一表达载体上的双Bt基因（Cry3Aa+Cry1Ac）对巨霸杨进行遗传转化。实验对诱导叶片分化适宜培养基和适宜潮霉素浓度这两个影响转化的关键因素进行了深入研究。确定诱导叶片分化不定芽的最佳培养基为MS+6BA0.25mg·L-1+IBA0.1mg·L-1。通过潮霉素在0mg·L-115mg·L-1范围内不同浓度梯度对叶片分化和茎尖生长影响的实验，确定诱导抗性芽分化的潮霉素临界筛选浓度为5mg·L-1。经过对再生抗性芽的多次潮霉素筛选，获得抗性稳定的转双Bt基因巨霸杨无性系4个，编号为JB1、JB2、JB3和JB4。9.用特异引物分别对获得的转双Bt基因巨霸杨无性系进行PCR检测，结果显示：JB1、JB2、JB3和JB4均扩增得到一条与阳性质粒作模板PCR扩增条带大小相同的749bp（Cry1Ac基因）和612bp（Cry3Aa基因）的特异条带，而对照未转化巨霸杨基因组未出现PCR扩增特异条带。初步证明双Bt基因已经整合进了巨霸杨基因组中。
杨艳丽[9]（2012）在《双抗虫基因转化欧美杨107杨的研究》文中研究表明杨树在全球分布十分广泛,是重要的造林树种和生态防护林树种。其树干通直,树形优美,是很好的园林绿化树种,广泛应用于园林中,通常做植物造景树和景观背景树。杨树由于其速生性以及高度的观赏价值在园林绿化和经济林中得到了越来越广泛的应用,然而,近年来,病虫害的侵犯也造成了重大的损失。转双抗虫基因欧美杨107杨的获得不但能有效地解决杨树的虫害问题,而且该树种的速生性也将使其成为园林绿化应用的首选树种,转双抗虫基因欧美杨107杨的获得不管是从社会需求还是从经济效益上考虑,它的研发和培育都是必要的。目前,在杨树的众多树种中,只有白杨派树种在组织培养和遗传转化方面相对成熟。本试验主要采用农杆介导法将构建在一个载体上的双抗虫基因（BtCry1Ac基因+API慈姑蛋白酶抑制剂基因）对欧美杨107杨进行遗传转化研究,并对转基因植株进行了分子生物学检测和初步饲虫试验,获得了转双抗虫基因的欧美杨107杨株系。（1）针对影响欧美杨107杨的遗传转化的不同因素,初步建立了欧美杨107杨品种高效组织培养再生体系及遗传转化体系,以材料的茎段和叶片为外植体,通过筛选获得最佳分化培养基,建立了其稳定高效的再生体系,结果表明:不定芽诱导分化最佳培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.15mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L,确定生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g+琼脂7g/L。同时研究结果表明:叶片主叶脉及叶柄和茎段伤口处发芽状况相似,因此选取叶片或茎段作为试验材料对本次试验影响不大。（2）采用农杆菌介导法进行基因转化,对影响转化的各个因素进行了优化研究。结果表明:在浸菌15min,共培养3d,得到抗性芽,诱导率为16.7%。经过卡那霉素的筛选,生根培养,炼苗和移栽,获得抗性植株。（3）根据PCR分析及ELISA毒蛋白检测结果,证明Bt基因和蛋白酶抑制剂基因已经整合到欧美杨107杨基因组DNA中。通过本试验的研究,获得了转双抗虫基因的欧美杨107杨10个系号,其中10个系号进行PCR检测都为阳性, ELISA检测10个系号中毒蛋白含量测定占总蛋白最高表达量为0.0336%。（4）用转基因欧美杨107杨的幼嫩叶片喂养美国白蛾1龄幼虫的虫试结果表明,转双抗虫基因欧美杨107杨对幼虫的毒杀率明显高于对照未转基因杨树,6个编号的植株叶片被美国白蛾取食后,其中4个号系死亡率能达到100%。说明这2个基因在植物细胞内均能够有效地表达,其表达产物对美国白蛾幼虫具有较强的毒性。（5）经分子生物学检测和虫试效果,证明了目的基因已经整合到欧美杨107杨的基因组中,从转基因株系中筛选出生长发育正常并抗虫能力强的优良株系。
贾香楠[10]（2010）在《转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建》文中研究指明本文以4个转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨株系和1个对照株系PT-16为材料,探讨了rolB-pttGA20ox双价基因对毛白杨生根生理、光合特性、抗逆性以及生长的影响。为进一步提高毛白杨的抗虫性和耐盐碱能力,采用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因（BtCrylAc）、甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）、GA20氧化酶基因（pttGA20ox）和rolB基因构建于同一植物表达载体pYL1305上,转化烟草,验证了多基因的表达和功能。主要研究结果如下：1、转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨试管苗生根过程中内源IAA、GA3、ZR和ABA含量变化与对照差异明显,各项生根指标均高于对照。转基因株系不同程度地增大了对光的生态适应范围,其净光合速率与地径显着相关,与苗高相关不显着。盆栽期,各株系间苗高存在极显着差异,RG-1、RG-2和RG-3显着的高于RG-4和对照PT-16,地径差异不显着；移入大田后,各株系间苗高差异不显着,而地径出现显着差异,RG-4的平均苗高最高,达到了231.25cm,转基因株系中RG-4的平均地径最大,为13.91mm。对各株系的SOD活性和MDA含量测定表明,转基因株系RG-4对逆境的抵抗力最强,但与对照PT-16差异不显着。rolB-pttGA20ox双价基因的表达可能改变了毛白杨相关的生理代谢途径,同时,转基因株系在光合特性、生长、抗逆性等方面的差异明显,这也为选择优良的转基因株系提供了材料。2、采用PCR方法,扩增Bt基因,替换植物表达载体pYL1305中的gus基因,得到pYL1305-Bt。扩增CaMV35S-BADH-nos表达盒,并插入到pYL1305-Bt的多克隆位点,得到载体pYL 1305-Bt-BADH。将CaMV35S-GA20ox-nos表达盒、GH3-rolB-nos表达盒分别克隆到供给载体pYL-d1、pYL-d2上,经两轮重组得到多基因单载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB,并将其转化根癌农杆菌菌株EHA105。3、采用农杆菌介导的叶盘法将多基因转化烟草,对获得的抗性芽在含25mg／LHyg的培养基中进一步选择后进行分子检测,PCR检测和Southern杂交检测证明多基因已插入到烟草基因组中。进一步的RT-PCR检测证明,外源基因均得到表达,多基因表现为串联在一起插入到同一位点,其中转基因株系T2中各基因的表达量最高。4、转多基因烟草植株根部、茎部和叶片中IAA的含量均高于对照,分别是是对照的1.90倍、1.92倍和1.17倍；转化植株各部位的GA3含量均高于对照,转化植株中茎部GA3含量最高,叶片最低；转化植株的根、茎部ABA含量略低于对照,叶片中ABA含量高于对照；转化植株各部位的IAA/ABA比值均高于对照,其中根部的IAA/ABA值最高,是对照的1.82倍。5、转多基因烟草耐盐性试验表明,当NaCl为300mM时,对照生长受到抑制,叶片膨大黄化,不能生根,转基因植株生长正常,叶片保持绿色,并能正常生根。转基因烟草经不同浓度的NaCl长时间胁迫,其SOD活性高于对照,MDA含量变化幅度较小,而对照MDA含量随盐浓度升高而大幅降低。6、转基因烟草植株的茎、叶中均检测到了Bt毒蛋白,T2株系Bt毒蛋白含量最高,叶片中达到了585.53 ng/g.FW,茎中为573.66 ng/g.FW,而对照中没有检测到Bt毒蛋白。抗虫试验结果表明,饲喂一周后,转基因烟草对2龄舞毒蛾的校正死亡率为78.05%,对3龄斜纹夜蛾的死亡率为30.00%,并明显抑制了存活幼虫的生长发育。7、移栽后的转基因烟草植株高生长更加明显,节间伸长,表现出了pttGA20ox基因表达的性状特征,转基因植株地径也显着增大、叶片大而深绿、植株健壮,移栽4 W后转化植株平均苗高为19.28cm,地径为5.34mm,分别是对照的1.61倍和1.37倍。多基因在烟草中均能正常表达,没有出现基因沉默等现象,说明在构建多基因表达载体时,使用一定数目的同源序列的启动子和终止子是可行的,但随着基因的增多应该考虑更换不同启动子或在基因两端添加核基质结合区（MAR）序列以避免转基因沉默。多基因单载体的构建和各基因的正常表达为进一步的毛白杨等林木改良奠定了重要基础。
二、转双抗虫基因741杨组培苗的温室驯化及大田移栽技术（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转双抗虫基因741杨组培苗的温室驯化及大田移栽技术（论文提纲范文）
（1）一种简单稳定的质体转化体系的建立及其在木本植物中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 质体(叶绿体)生物技术研究的现状 |
| 1.1.1 质体生物技术概述 |
| 1.1.2 质体生物技术的优势 |
| 1.1.3 质体表达系统的构建 |
| 1.1.4 质体生物技术在转化植物上的限制 |
| 1.2 基于同源重组的克隆方法研究进展 |
| 1.3 杨树抗虫基因工程研究现状 |
| 1.3.1 国外杨树抗虫基因工程研究现状 |
| 1.3.2 国内杨树抗虫基因工程研究现状 |
| 1.4 转抗虫基因杨树具有良好的生物安全性 |
| 1.5 杨树抗虫基因工程存在的问题和对策 |
| 1.5.1 制约杨树转基因的重要因素 |
| 1.5.2 转Bt杨树在应用中的问题和对策 |
| 1.6 杨树质体转基因研究现状 |
| 1.7 红阳猕猴桃转基因研究进展 |
| 第2章 质体转化体系的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 实验菌株与质粒 |
| 2.2.3 试剂盒、酶和试剂耗材 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 扩增引物序列 |
| 2.2.6 引物合成、基因合成和测序 |
| 2.2.7 仪器设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 烟草质体转化载体构建 |
| 2.3.2 烟草的生长条件 |
| 2.3.3 烟草质体转化方法 |
| 2.3.4 质体转化和转质体株系的筛选 |
| 2.3.5 DNA提取和抗性芽的PCR分析 |
| 2.3.6 抗性芽的Southern Blot分析 |
| 2.3.7 RNA分离提取和Norther Blot分析 |
| 2.3.8 蛋白质的提取和GFP的定量分析(SDS-PAGE法) |
| 2.3.9 荧光显微镜检测GFP |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 质体转化载体的构建 |
| 2.4.2 转质体烟草的产生 |
| 2.4.3 在质体转基因烟草株系中检测GFP的表达水平 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 杨树质体表达系统的建立和抗虫研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 实验菌株与质粒 |
| 3.2.3 测试昆虫 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 扩增引物序列 |
| 3.2.6 试剂盒、酶、试剂耗材 |
| 3.2.7 引物合成、基因合成和测序 |
| 3.2.8 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 山新杨高效叶片再生体系的建立 |
| 3.3.2 山新杨对壮观霉素敏感度测试 |
| 3.3.3 山新杨叶绿体同源片段的克隆 |
| 3.3.4 山新杨质体转化载体的构建 |
| 3.3.5 转Bt基因山新杨质体转化载体的构建 |
| 3.3.6 杨树质体基因枪转化方法步骤 |
| 3.3.7 杨树抗性苗的筛选 |
| 3.3.8 同质化转基因杨树组培苗的炼苗和移栽 |
| 3.3.9 山新杨总DNA的提取和抗性芽的PCR检测 |
| 3.3.10 抗性芽的Southern bolt分析 |
| 3.3.11 RNA的提取和Northern bolt分析 |
| 3.3.12 蛋白的提取和SDS-PAGE |
| 3.3.13 Western bolt分析和GFP的定量 |
| 3.3.14 GFP的荧光检测 |
| 3.3.15 Bt蛋白在转基因植物中的积累量的测定 |
| 3.3.16 质体转Bt-cry1C基因山新杨抗虫性试验 |
| 3.3.17 质体转Bt-cry3Bb基因山新杨抗虫性试验 |
| 3.3.18 质体转Bt基因山新杨植株抗虫数据统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 山新杨叶片高效再生体系的建立 |
| 3.4.2 山新杨对壮观霉素敏感度测试结果 |
| 3.4.3 山新杨叶绿体同源片段的获得 |
| 3.4.4 山新杨质体转化载体的构建 |
| 3.4.5 质体转gfp基因山新杨抗性芽的初步鉴定 |
| 3.4.6 质体转gfp基因山新杨抗性芽的Southern blot分析 |
| 3.4.7 质体转gfp基因表型情况 |
| 3.4.8 gfp基因在质体中的转录与表达 |
| 3.4.9 转Bt基因山新杨质体转化载体的构建 |
| 3.4.10 质体转Bt-cry1C基因山新杨抗性芽的PCR初步鉴定 |
| 3.4.11 质体转cry1C基因山新杨抗性芽的分子鉴定 |
| 3.4.12 质体转cry1C基因山新杨Northern bolt分析 |
| 3.4.13 质体转cry1C基因杨树表型情况 |
| 3.4.14 质体转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-Cry1C蛋白的定量分析 |
| 3.4.15 质体转Bt-cry1C基因山新杨抗虫性试验 |
| 3.4.16 质体转Bt-cry3Bb基因山新杨抗性芽的PCR初步鉴定 |
| 3.4.17 质体转cry3Bb基因山新杨抗性芽的Southern blot分析 |
| 3.4.18 质体转cry3Bb基因山新杨Northern bolt分析 |
| 3.4.19 质体转cry3Bb基因表型情况 |
| 3.4.20 质体转Bt-cry3Bb基因山新杨抗虫性试验 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 杨树质体转基因的意义 |
| 3.5.2 质体转gfp基因杨树中gfp基因转录和表达问题 |
| 3.5.3 质体转cry1C基因山新杨中cry1C基因的表达情况与其他文献的比较,以及其它转cry1类基因在转基因植物中的表达情况和抗虫情况比较 |
| 3.5.4 质体转Bt-cry3Bb基因山新杨中Bt-cry3Bb基因的表达情况与其他文献的比较以及其它转cry3类基因在转基因植物中的表达情况比较 |
| 3.5.5 Bt蛋白在质体转Bt植物中的积累量、抗虫性和对植物表型影响 |
| 3.5.6 转Bt基因杨树的生物安全性 |
| 第4章 猕猴桃质体表达系统的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 实验菌株与质粒 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 扩增引物序列 |
| 4.2.5 试剂盒、酶、试剂和其他耗材 |
| 4.2.6 引物合成、基因合成和测序 |
| 4.2.7 仪器设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 红阳猕猴桃叶片再生体系的优化 |
| 4.3.2 红阳猕猴桃生根及移栽 |
| 4.3.3 红阳猕猴桃叶绿体同源片段的克隆 |
| 4.3.4 红阳猕猴桃质体转化载体的构建 |
| 4.3.5 红阳猕猴桃壮观霉素敏感度测试 |
| 4.3.6 猕猴桃质体基因枪转化方法 |
| 4.3.7 猕猴桃抗性芽的筛选 |
| 4.3.8 猕猴桃总DNA的提取和抗性芽的PCR检测 |
| 4.3.9 抗性芽的Southern bolt分析 |
| 4.3.10 RNA的提取和Northern bolt分析 |
| 4.3.11 蛋白的提取和SDS-PAGE |
| 4.3.12 Western bolt分析和GFP的定量 |
| 4.3.13 GFP的荧光检测 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 猕猴桃叶片高效再生体系的建立 |
| 4.4.2 红阳猕猴桃叶绿体同源片段的BLAST分析 |
| 4.4.3 红阳猕猴桃质体转化载体的构建 |
| 4.4.4 红阳猕猴桃壮观霉素敏感度测试 |
| 4.4.5 质体转gfp基因红阳猕猴桃植株的获得 |
| 4.4.6 质体转gfp基因猕猴桃组培苗的炼苗、移栽和表型情况 |
| 4.4.7 质体转基因红阳猕猴桃中gfp的表达水平 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）辣木再生体系的优化和遗传转化体系的建立与四倍体诱导育种（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 辣木简介 |
| 1.1.2 植物WRKY基因家族研究进展 |
| 1.1.2.1 WRKY转录因子超家族介绍 |
| 1.1.2.2 WRKY转录因子超家族的生物学功能 |
| 1.1.2.3 生物信息学在WRKY基因家族研究中的应用 |
| 1.1.3 植物组织培养研究进展 |
| 1.1.3.1 植物组织培养的概况 |
| 1.1.3.2 植物组织培养影响因素 |
| 1.1.4 辣木无性繁殖与多倍体育种现状 |
| 1.1.5 农杆菌介导的遗传转化研究进展 |
| 1.1.5.1 农杆菌介导的遗传转化研究概况 |
| 1.1.5.2 影响农杆菌介导林木遗传转化效率的因素 |
| 1.1.5.3 遗传转化在林木育种中的运用 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 辣木WRKY基因家族进化分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 基因组数据库来源 |
| 2.2.2 辣木WRKY基因鉴定 |
| 2.2.3 辣木WRKY蛋白多重序列比对和进化树构建 |
| 2.2.4 辣木WRKY基因保守基序分析 |
| 2.2.5 辣木WRKY基因结构分析 |
| 2.2.6 辣木WRKY基因启动子区顺式作用元件分析 |
| 2.2.7 环境选择压力分析 |
| 2.2.8 植物材料及处理 |
| 2.2.9 RNA提取及反转录 |
| 2.2.10 引物的设定 |
| 2.2.11 表达模式分析 |
| 2.2.12 仪器设备 |
| 2.2.13 试剂 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 辣木WRKY基因的鉴定及命名 |
| 2.3.2 辣木WRKY基因及结构域的系统发生学分析及分类 |
| 2.3.3 辣木WRKY基因保守域的变异 |
| 2.3.4 辣木WRKY基序分析 |
| 2.3.5 辣木WRKY基因结构分析 |
| 2.3.6 第三组WRKY基因在陆地植物中的快速扩增 |
| 2.3.7 辣木WRKY基因启动子区顺式作用元件分析 |
| 2.3.8 基因重复后的环境选择压力分析 |
| 2.3.9 辣木WRKY基因的表达模式分析 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 辣木叶片外植体不定芽直接再生体系研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与外植体来源 |
| 3.2.2 培养基及培养条件 |
| 3.2.3 辣木叶片不定芽的直接诱导及伸长 |
| 3.2.3.1 激素 |
| 3.2.3.2 外植体年龄 |
| 3.2.3.3 基因型 |
| 3.2.4 辣木叶片再生不定芽的生根培养 |
| 3.2.5 再生苗的驯化与移栽 |
| 3.2.6 试剂 |
| 3.2.7 主要仪器设备 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 激素对不定芽诱导的影响 |
| 3.3.2 外植体发育阶段对不定芽诱导的影响 |
| 3.3.3 外植体放置方式对不定芽诱导的影响 |
| 3.3.4 基因型对不定芽诱导的影响 |
| 3.3.5 NAA对不定芽生根的影响 |
| 3.3.6 炼苗及移栽 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 农杆菌介导的辣木转化体系的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌株和载体 |
| 4.2.3 主要仪器和试剂 |
| 4.2.4 培养基及培养条件 |
| 4.2.5 农杆菌介导的遗传转化 |
| 4.2.5.1 抗生素配制及农杆菌培养 |
| 4.2.5.2 遗传转化操作步骤 |
| 4.2.5.3 头孢霉素抑制农杆菌及对外植体选择压的确定 |
| 4.2.5.4 潮霉素对外植体选择压的确定 |
| 4.2.6 影响农杆菌介导的遗传转化效率相关因素的优化 |
| 4.2.6.1 预培养时间 |
| 4.2.6.2 共培养时间 |
| 4.2.6.3 常压或真空 |
| 4.2.7 GUS基因瞬时表达的组织化学分析 |
| 4.2.8 转基因植株分子生物学鉴定 |
| 4.2.8.1 转基因植株PCR检测 |
| 4.2.8.2 Southern杂交 |
| 4.2.8.3 RT-qPCR |
| 4.2.9 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 头孢霉素对辣木外植体不定芽发生的影响 |
| 4.3.2 潮霉素对辣木外植体不定芽发生及不定芽生根的影响 |
| 4.3.3 预培养时间对转化效率的影响 |
| 4.3.4 共培养时间对转化效率的影响 |
| 4.3.5 转化植株GUS瞬时表达 |
| 4.3.6 转化植株PCR鉴定 |
| 4.3.7 转化植株Southernblot检测 |
| 4.3.8 转化植株RT-qPCR检测 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 四倍体辣木诱导研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 培养基及培养条件 |
| 5.2.3 四倍体辣木的诱导 |
| 5.2.4 倍性鉴定 |
| 5.2.5 二倍体与四倍体辣木比较 |
| 5.2.5.1 二倍体与四倍体气孔比较 |
| 5.2.5.2 二倍体与四倍体辣木叶面积比较 |
| 5.2.5.3 二倍体与四倍体辣木饲料相关营养物质含量比较 |
| 5.2.6 试剂 |
| 5.2.7 主要仪器设备 |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 根尖染色体计数 |
| 5.3.2 秋水仙素处理对辣木外植体不定芽再生的影响 |
| 5.3.3 秋水仙素浓度对辣木多倍体诱导的影响 |
| 5.3.4 秋水仙素处理时间对辣木外植体再生的影响 |
| 5.3.5 秋水仙素处理时间对辣木染色体加倍的影响 |
| 5.3.6 二倍体与四倍体辣木比较 |
| 5.3.6.1 二倍体与四倍体辣木气孔比较 |
| 5.3.6.2 二倍体与四倍体辣木叶面积比较 |
| 5.3.6.3 二倍体与四倍体辣木饲料相关营养物质含量比较 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文讨论与结论 |
| 6.1 辣木WRKY基因家族进化分析 |
| 6.2 辣木再生体系 |
| 6.3 辣木遗传转化体系 |
| 6.4 辣木四倍体育种 |
| 6.5 论文创新之处 |
| 6.6 下一步研究计划 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 1 博士期间主要成果 |
| 附录 2 GUS染液配方 |
（3）分子遗传改良技术在杨树上的研究与应用进展（论文提纲范文）
| 1 不同目的基因的杨树转化 |
| 1.1 抗虫基因转化 |
| 1.1.1 转单个抗虫基因 |
| 1.1.2 转双抗虫基因 |
| 1.1.3 转抗虫基因杨树的生物安全性研究 |
| 1.2 抗病基因转化 |
| 1.2.1 抗病毒基因转化 |
| 1.2.2 抗病菌基因转化 |
| 1.3 抗除草剂基因转化 |
| 1.4 抗逆境基因转化 |
| 1.4.1 抗旱及耐盐碱基因转化 |
| 1.4.2 抗氧化基因转化 |
| 1.4.3 抗寒、耐涝基因转化 |
| 1.5 降木质素基因转化 |
| 1.6 激素合成酶相关基因转化 |
| 2 研究进展 |
| 2.1 我国抗虫转基因研究应用处于世界先列, 安全性评价同步进行 |
| 2.2 耐寒转基因杨树研究尚在探索阶段进展缓慢 |
| 2.3 多基因共转化研究初见成效 |
| 3 杨树转基因研究存在问题及展望 |
（4）转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文缩略词(Abbreviation) |
| 引言 |
| 1. 国内外耐盐转基因育种相关研究进展 |
| 1.1 植物的耐盐机理研究 |
| 1.1.1 植物的耐盐机制 |
| 1.1.2 不同耐盐机制的相关基因 |
| 1.2 杨树耐盐碱相关转基因育种研究 |
| 1.2.1 Na~+/H~+逆向蛋白运转基因 |
| 1.2.2 活性氧清除的酶类基因 |
| 1.2.3 胚胎发育晚期丰富蛋白 |
| 1.2.4 DREB转录因子 |
| 1.2.5 多基因转化育种 |
| 1.3 外源基因的非预期效应 |
| 1.3.1 外源基因非预期效应的类型 |
| 1.3.2 外源基因非预期效应的评估内容及检测方法 |
| 1.4 转基因植株田间稳定性及安全性 |
| 1.4.1 转基因林木田间外源基因表达稳定性 |
| 1.4.2 转基因植株的安全性监测 |
| 1.5 研究内容、技术路线与拟解决的主要问题 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线图 |
| 1.5.3 拟解决问题 |
| 2. AhDREB1转基因毛白杨耐盐机理及非预期效应的分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 盆栽盐胁迫试验设计 |
| 2.1.3 基质盐分的测定 |
| 2.1.4 植株增长量的测定 |
| 2.1.5 叶绿素含量和光合参数测定 |
| 2.1.6 电解质渗透率(RCE)和丙二醛(MDA)的测定 |
| 2.1.7 脯氨酸、超氧物歧化酶、过氧化物酶活性的测定 |
| 2.1.8 AhDREB1转基因毛白杨cDNA文库建立和转录组测序 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨生长量 |
| 2.2.2 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨REC和MDA的含量 |
| 2.2.3 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨叶片的Pro含量,SOD活性,POD活性、叶绿素含量变化的测定结果 |
| 2.2.4 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因光合参数测定 |
| 2.2.5 转录组测序结果 |
| 2.2.6 差异基因的筛选及注释 |
| 2.3 小结 |
| 3 多耐盐碱基因共转化载体构建及遗传转化银腺杨84K |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌种与载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 溶液、培养基配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 柽柳TaMnSOD等耐盐碱基因及拟南芥RD29A基因启动子克隆 |
| 3.2.2 多基因共转化载体构建 |
| 3.2.3 多基因共表达载体遗传转化银腺杨84K |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TaMnSOD,TaLEA,AtNHX基因及RD29A启动子片段的克隆 |
| 3.3.2 克隆片段测序结果与公布序列结果对比 |
| 3.3.3 多基因共转化载体3452A-SDLN的PCR验证 |
| 3.3.4 多基因共转化载体3452A-SDLN的测序验证 |
| 3.3.5 多耐盐碱基因遗传共转化银腺杨84K |
| 3.4 小结 |
| 4. AhDREB1转基因植株多年田间稳定性及安全性监测试验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料与试验地信息 |
| 4.1.2 转基因毛白杨外源基因稳定性的检测 |
| 4.1.3 转基因毛白杨化感作用分析 |
| 4.1.4 转基因毛白杨林下土壤微生物多样性检测 |
| 4.1.5 外源基因水平转移监测 |
| 4.1.6 外源基因在叶片中的降解速度检测 |
| 4.1.7 转基因毛白杨花粉可育性分析 |
| 4.1.8 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 田间多年种植后外源基因稳定性检测结果 |
| 4.2.2 转基因杨树叶片化感作用检测结果 |
| 4.2.3 对转基因杨树外源基因水平转移情况分析 |
| 4.2.4 转基因杨树林下土壤微生物多样性检测 |
| 4.2.5 转基因杨树叶片降解叶片中外源基因残留情况监测 |
| 4.2.6 对成熟转基因毛白杨花粉可育性分析 |
| 4.3 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 AhDREB1转基因毛白杨的耐盐机制及非预期效应分析 |
| 5.2 多耐盐基因共转化对受体植株耐盐能力的改良的效果 |
| 5.3 田间多年种植的转基因毛白杨外源基因表达量下降 |
| 5.4 田间多年种植的AhDREB1转基因毛白杨没有发现潜在危害 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（5）转Bt基因欧洲黑杨组织培养再生体系优化及其TA29-Barnase基因遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因发展趋势及研究现状 |
| 1.1.1 转基因发展趋势 |
| 1.1.2 林木转基因研究现状 |
| 1.2 林木转基因研究 |
| 1.2.1 抗除草剂基因 |
| 1.2.2 抗虫基因 |
| 1.2.3 抗病基因 |
| 1.2.4 抗逆性基因 |
| 1.3 转基因林木生物安全性限控研究 |
| 1.3.1 叶绿体转化技术 |
| 1.3.2 种子不育技术 |
| 1.3.3 无融合生殖和闭花受精 |
| 1.3.4 基因拆分技术 |
| 1.3.5 外源基因敲除技术 |
| 1.4 雄性不育基因工程研究现状 |
| 1.4.1 利用细胞毒素创造植物雄性不育 |
| 1.4.2 降解胼胝质产生雄性不育 |
| 1.4.3 反义RNA技术创造的植物雄性不育 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 转Bt基因欧洲黑杨组织培养再生体系优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 消毒时间外植体的影响 |
| 2.3.2 增殖培养基的筛选 |
| 2.3.3 叶片再生体系优化 |
| 2.3.4 不定芽生根体系优化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 TA29-Barnase基因转化转Bt基因欧洲黑杨 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 农杆菌中目的基因的PCR检测 |
| 3.3.2 抑菌剂Carb抑菌浓度的选择 |
| 3.3.3 筛选剂除草剂PPT浓度的选择 |
| 3.3.4 转Bt基因欧洲黑杨转化系统的优化 |
| 3.3.5 转基因植株的分子生物学检测 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 消毒时间对外植体的影响 |
| 4.1.2 增殖培养基筛选 |
| 4.1.3 植物生长调剂对叶片分化的影响 |
| 4.1.4 不定芽诱导生根 |
| 4.1.5 遗传转化系统的优化 |
| 4.1.6 转基因植株的获得 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）转多基因107杨遗传检测及抗性表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗虫基因来源及杀虫机理 |
| 1.2 BADH基因及耐盐机制 |
| 1.3 转基因林木研究进展 |
| 1.3.1 转单基因植物的研究进展 |
| 1.3.2 转多基因植物的研究进展 |
| 1.4 转基因植物的遗传检测方法 |
| 1.4.1 标记基因 |
| 1.4.2 DNA水平上的分子检测 |
| 1.4.3 转录水平上的分子检测 |
| 1.4.4 翻译水平上的分子检测 |
| 1.5 抗性基因在杨树中的应用现状 |
| 1.5.1 抗虫基因在杨树中的应用现状 |
| 1.5.2 耐盐基因在杨树中的应用现状 |
| 1.6 本试验的研究目的和意义 |
| 2 转多基因107杨的获得 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、植物转化载体 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 |
| 2.1.4 主要试剂和培养基的配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 PCR检测引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转化107杨的PCR检测 |
| 2.2.2 转基因107杨的获得及移栽 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 目的基因的PCR检测结果 |
| 2.3.2 转多基因107杨的获得及移栽 |
| 2.4 小结 |
| 3 转多基因107杨的外源基因表达检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 酶及生化试剂 |
| 3.1.3 主试剂的配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 荧光定量PCR引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 转多基因107杨外源基因在转录水平上的检测 |
| 3.2.2 转多基因107杨翻译水平的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3.2 Bt基因的ELISA检测结果 |
| 3.4 小结 |
| 4 转多基因107杨抗虫性检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 测试昆虫 |
| 4.1.2 植物材料 |
| 4.1.3 测试昆虫的选取 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 计算方法 |
| 4.2.2 试验数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转多基因株系对美国白蛾的抗性检测 |
| 4.3.2 转基因株系对柳蓝叶甲的抗性检测 |
| 4.4 小结 |
| 5 转多基因107杨耐盐性检测 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 试验设计 |
| 5.3 主要测定指标及方法 |
| 5.3.1 各株系的成活率 |
| 5.3.2 苗高的测定 |
| 5.3.3 地径的测定 |
| 5.3.4 叶数变化的测定 |
| 5.3.5 净光合速率的测定 |
| 5.3.6 叶绿素荧光参数的测定 |
| 5.3.7 生物量的测定 |
| 5.3.8 叶绿素的测定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 盐胁迫下各转基因株系的成活率差异 |
| 5.4.2 盐胁迫下各转基因株系的苗高差异 |
| 5.4.3 盐胁迫下各转基因株系的地径差异 |
| 5.4.4 盐胁迫下各转基因株系的叶数变化 |
| 5.4.5 盐胁迫下各转基因株系的净光合速率差异 |
| 5.4.6 盐胁迫下各转基因株系的叶绿素荧光参数比较 |
| 5.4.7 盐胁迫下各转基因株系的生物量差异 |
| 5.4.8 盐胁迫下各转基因株系的叶绿素含量差异 |
| 5.5 小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 转基因107杨的获得 |
| 6.2 转多基因107杨的转录表达 |
| 6.3 转多基因107杨的抗性检测 |
| 6.4 多基因联合转化效应 |
| 6.5 转基因植物的安全性评估 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）多基因植物转化载体对烟草和欧美杨107杨的遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗虫基因来源及杀虫机理 |
| 1.2 转 Bt 基因植物研究 |
| 1.3 BADH 基因的调节机制和研究进展 |
| 1.4 多基因聚合技术研究进展 |
| 1.4.1 杂交法 |
| 1.4.2 构建多个表达载体进行多次转化 |
| 1.4.3 多载体的共转化 |
| 1.4.4 构建多基因单载体进行一次转化 |
| 1.5 转基因植物的筛选和鉴定方法 |
| 1.5.1 标记基因 |
| 1.5.2 DNA 水平的分子检测 |
| 1.5.3 转录水平的分子检测 |
| 1.5.4 翻译水平的分子检测 |
| 1.6 抗虫基因和耐盐基因在杨树中的应用现状 |
| 1.7 本试验的研究目的和意义 |
| 2 双价基因植物转化载体对烟草的遗传转化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料和测试昆虫 |
| 2.1.2 菌株、载体 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 |
| 2.1.4 主要试剂和培养基的配制 |
| 2.1.5 试验所用 PCR 引物 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Kan 临界浓度的确定 |
| 2.2.2 Cef 使用浓度的确定 |
| 2.2.3 农杆菌侵染液的制备 |
| 2.2.4 农杆菌介导的叶盘法转基因 |
| 2.2.5 转基因株系的 PCR 检测 |
| 2.2.6 转基因株系的荧光定量 PCR 检测 |
| 2.2.7 ELISA 检测 BtCry1Ac 毒蛋白 |
| 2.2.8 抗性试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Kan 及 Cef 浓度的确定 |
| 2.3.2 农杆菌侵染液的制备 |
| 2.3.3 转基因株系的获得 |
| 2.3.4 转基因株系的 PCR 检测 |
| 2.3.5 荧光定量 PCR 鉴定 |
| 2.3.6 BtCry1Ac 毒蛋白的表达量 |
| 2.3.7 抗性试验 |
| 2.4 小结 |
| 3 三价基因转化载体对烟草的遗传转化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料和供试昆虫 |
| 3.1.2 菌株、载体 |
| 3.1.3 酶及生化试剂 |
| 3.1.4 主要试剂及培养基的配制 |
| 3.1.5 试验所用 PCR 引物 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 农杆菌侵染液的制备 |
| 3.2.2 农杆菌介导的叶盘法转基因 |
| 3.2.3 转基因株系的 PCR 检测 |
| 3.2.4 荧光定量 PCR 检测 |
| 3.2.5 ELISA 检测 BtCry1Ac 毒蛋白 |
| 3.2.6 ELISA 检测 BtCry3A 毒蛋白 |
| 3.2.7 抗虫试验 |
| 3.2.8 耐盐试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 农杆菌侵染液的制备 |
| 3.3.2 转基因植株的获得 |
| 3.3.3 转基因株系的 PCR 检测 |
| 3.3.4 荧光定量 PCR 检测 |
| 3.3.5 ELISA 检测 Bt 毒蛋白表达量 |
| 3.3.6 抗虫试验 |
| 3.3.7 耐盐试验 |
| 3.4 小结 |
| 4 多基因转化载体对欧美杨 107 杨的遗传转化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株和载体 |
| 4.1.3 酶、主要试剂及培养基 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 试验所用引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 无菌 107 杨组培苗的获得 |
| 4.2.2 Kan 临界浓度的确定 |
| 4.2.3 Cef 使用浓度的确定 |
| 4.2.4 农杆菌介导的 107 杨遗传转化 |
| 4.2.5 转基因植株的 DNA 提取 |
| 4.2.6 转基因植株的 PCR 检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 无菌组培苗的获得 |
| 4.3.2 Kan 临界浓度的确定 |
| 4.3.3 Cef 的使用浓度的确定 |
| 4.3.4 转基因 107 杨的获得 |
| 4.3.5 转基因植株的 PCR 检测 |
| 4.4 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 转多基因烟草和 107 杨的获得 |
| 5.2 影响农杆菌介导法遗传转化的因素 |
| 5.3 Bt 毒蛋白的表达分析 |
| 5.4 转基因植物中外源基因的失活、沉默与丢失 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗虫基因来源及杀虫机理 |
| 1.1.1 微生物来源的抗虫基因－Bt 基因 |
| 1.1.2 植物来源的抗虫基因 |
| 1.1.3 动物来源的抗虫基因 |
| 1.2 农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.2.1 农杆菌（Agrobacterium） |
| 1.2.2 Ti 质粒及 T-DNA |
| 1.3 多基因聚合的复合性状转基因植物发展趋势 |
| 1.4 获得基因叠加的主要方法 |
| 1.4.1 二次转化法 |
| 1.4.2 杂交聚合法 |
| 1.4.3 共转化法 |
| 1.5 转基因植物的筛选鉴定方法 |
| 1.5.1 选择标记基因与报告基因 |
| 1.5.2 DNA 水平的分子鉴定 |
| 1.5.3 外源基因在转录水平的分子鉴定 |
| 1.5.4 外源基因在翻译水平的分子鉴定 |
| 1.6 抗虫基因在杨树中的应用研究现状 |
| 1.6.1 单 Bt 基因在杨树中的应用 |
| 1.6.2 蛋白酶抑制剂等其它抗虫基因在杨树中的应用 |
| 1.7 转双价或多价抗虫杨研究 |
| 1.7.1 Bt 基因与慈姑蛋白酶抑制剂 API 基因联合策略 |
| 1.7.2 Bt 基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂 CpTI 基因联合策略 |
| 1.7.3 Bt 基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因联合策略 |
| 1.7.4 Bt 基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因 OC-I 联合策略 |
| 1.7.5 蛋白酶抑制剂基因之间的联合策略 |
| 1.7.6 Bt 基因和半夏凝集素基因 pta 联合策略 |
| 1.7.7 Bt 基因和蜘蛛杀虫肽联合策略 |
| 1.7.8 双 Bt 基因联合策略 |
| 1.8 转双价或多价抗虫基因植物对昆虫的致死效应 |
| 1.9 本课题研究的目的及意义 |
| 2 转单、双 BT 基因 741 杨外源基因表达及抗虫性对比研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 测试昆虫 |
| 2.1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 适宜分化和生根培养基筛选 |
| 2.2.2 转基因植株炼苗移栽及田间管理 |
| 2.2.3 转基因植株的 PCR 检测 |
| 2.2.4 转基因 741 杨的 RT-PCR 和荧光定量 PCR 检测 |
| 2.2.5 转基因植株 Bt 毒蛋白测定 |
| 2.2.6 转基因植株的抗虫性检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 适宜分化培养基的确定 |
| 2.3.2 适宜生根培养基的确定 |
| 2.3.3 生根苗移栽及管理 |
| 2.3.4 转基因 741 杨外源基因的 PCR 检测 |
| 2.3.5 转基因植株的 RT-PCR 和荧光定量 PCR 检测 |
| 2.3.6 转基因植株 Bt 毒蛋白的 ELISA 检测 |
| 2.3.7 转基因株系对柳蓝叶甲的致死效应对比 |
| 2.3.8 转基因株系对美国白蛾的致死效应对比 |
| 2.4 小结 |
| 3 巨霸杨双 BT 基因遗传转化及转基因植株的检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要试剂、酶和试剂盒 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验药品的配制 |
| 3.2.2 巨霸杨再生体系的建立 |
| 3.2.3 潮霉素（Hyg）对叶片分化及茎尖生长的影响 |
| 3.2.4 农杆菌介导的巨霸杨遗传转化 |
| 3.2.5 转基因植株的抗性鉴定 |
| 3.2.6 转基因植株的 DNA 水平检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 无菌组培苗建立 |
| 3.3.2 叶片再生体系的确立 |
| 3.3.3 潮霉素（Hyg）对叶片分化及茎尖生长的影响 |
| 3.3.4 转双 Bt 基因巨霸杨植株的获得 |
| 3.3.5 转基因植株的抗性鉴定 |
| 3.3.6 转基因植株的 PCR 检测 |
| 3.4 小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RT-PCR 与荧光定量 PCR 技术结合 |
| 4.2 多抗虫基因聚合的抗虫效应 |
| 4.3 转基因植株中外源基因的表达与沉默 |
| 4.4 农杆菌介导遗传转化的影响因素 |
| 4.5 抗生素在转基因研究中的作用 |
| 4.6 筛选标记潮霉素的使用浓度 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）双抗虫基因转化欧美杨107杨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 发根农杆菌和 Ri 质粒 |
| 1.2 农杆菌转化机制 |
| 1.3 毛状根遗传转化的特性 |
| 1.4 发根农杆菌的研究进展 |
| 1.5 抗虫基因的种类及研究 |
| 1.5.1 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.5.2 蛋白酶抑制基因 |
| 1.6 杨树抗虫基因工程研究 |
| 1.7 杨树基因工程育种中存在的问题 |
| 1.7.1 遗传转化频率低 |
| 1.7.2 转基因杨树的稳定表达 |
| 1.7.3 转基因杨树的性状变异 |
| 1.7.4 田间释放后的安全性 |
| 1.8 本试验研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 欧美杨107 杨再生体系的建立 |
| 2.3.2 欧美杨107 杨遗传转化及转基因幼苗的获得 |
| 2.3.3 转基因欧美杨107 杨DNA 水平的检测 |
| 2.3.4 转基因材料外源基因表达的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 欧美杨107 杨叶片及茎段分化培养基的筛选 |
| 3.2 不同器官对欧美杨107 杨转化的影响 |
| 3.3 生根培养基的确定 |
| 3.4 抗生素临界使用浓度的确定 |
| 3.4.1 卡那霉素浓度对叶片和茎段分化程度的影响 |
| 3.4.2 羧苄青霉素浓度与叶片和茎段分化的关系 |
| 3.4.3 卡那霉素浓度对茎尖生根的影响 |
| 3.5 共培养时间的确定 |
| 3.6 转基因植株的获得及移栽 |
| 3.7 转基因欧美杨107 杨DNA 水平的检测 |
| 3.8 初步饲虫试验 |
| 3.9 BT 毒蛋白的 ELISA 检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 影响农杆菌转化效果的因素 |
| 4.2 转基因植株的筛选 |
| 4.3 转基因欧美杨 107 杨的分子生物学检测 |
| 4.4 转基因植物初步虫试研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附图一 |
| 附图二 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文缩略词 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 植物多基因转化研究方法 |
| 1.2.1 基因枪共转化法 |
| 1.2.2 重复转化法 |
| 1.2.3 杂交法 |
| 1.2.4 质体转化法 |
| 1.2.5 多基因单载体转化法 |
| 1.3 Bt基因功能及在植物基因工程中的应用 |
| 1.3.1 Bt基因的特性和分类 |
| 1.3.2 Bt基因在植物基因工程中的应用 |
| 1.4 甜菜碱与植物抗逆性 |
| 1.4.1 甜菜碱在植物中的代谢途径 |
| 1.4.2 甜菜碱合成相关酶研究进展 |
| 1.5 Ri质粒和rol基因群研究进展 |
| 1.5.1 Ri质粒结构与功能 |
| 1.5.2 rol(rooting locus)基因及其编码蛋白的功能 |
| 1.5.3 rolB基因在植物基因工程中的应用 |
| 1.6 赤霉素与GA20-氧化酶研究进展 |
| 1.7 研究的主要内容和技术路线 |
| 2 转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨生理生化特性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 转双价基因植株分子检测 |
| 2.1.2 转基因植株生根过程中内源激素含量测定 |
| 2.1.3 转基因植株光合特性分析 |
| 2.1.4 转基因植株生长测定 |
| 2.1.5 转基因植株超氧化物岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的测定 |
| 2.1.6 统计方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 转rolB-pttGA20ox双价基因植株的PCR检测 |
| 2.2.2 转rolB-pttGA20ox双价基因植株的PCR-Southem检测 |
| 2.2.3 转rolB-pttGA20ox双价基因植株生根过程中内源激素的变化 |
| 2.2.4 转rolB-pttGA20ox双价基因植株的光合特性分析 |
| 2.2.5 转rolB-pttGA20ox双价基因植株生长测定 |
| 2.2.6 转基因植株的SOD活性和MDA含量测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 无性繁殖阶段外源基因的遗传稳定性 |
| 2.3.2 转基因毛白杨生根过程中内源激素含量变化 |
| 2.3.3 转基因毛白杨盆栽苗光合特性的变化 |
| 2.3.4 转基因植株的SOD活性和MDA含量变化 |
| 2.3.5 转基因毛白杨盆栽期和田间生长的差异 |
| 2.3.6 转基因毛白杨植株间的差异 |
| 2.4 小结 |
| 3 基于Cre/LoxP重组系统的多基因表达载体构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 基因、质粒与菌株 |
| 3.1.2 细菌培养基配方 |
| 3.1.3 酶和试剂 |
| 3.1.4 重要仪器 |
| 3.1.5 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB的构建策略 |
| 3.1.6 质粒提取 |
| 3.1.7 PCR扩增 |
| 3.1.8 目的片段的纯化 |
| 3.1.9 酶切反应 |
| 3.1.10 连接反应 |
| 3.1.11 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.1.12 连接产生转化大肠杆菌 |
| 3.1.13 多基因组装 |
| 3.1.14 植物表达载体转化农杆菌 |
| 3.1.15 PCR鉴定目的基因及测序 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 植物表达载体pYL1305-Bt的构建 |
| 3.2.2 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH的构建 |
| 3.2.3 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox的构建 |
| 3.2.4 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB的构建 |
| 3.2.5 植物表达载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB转化农杆菌 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 农杆菌介导多基因表达载体转化烟草 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 质粒和菌株 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 烟草遗传转化培养基 |
| 4.1.5 烟草对抗生素的敏感性试验 |
| 4.1.6 农杆菌的活化及工程菌液的制备 |
| 4.1.7 叶盘法遗传转化的步骤 |
| 4.1.8 转基因植株的PCR扩增检测 |
| 4.1.9 转基因植株的PCR-Southern和Southern杂交 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 潮霉素对烟草叶片分化不定芽的影响 |
| 4.2.2 潮霉素对烟草生根的影响 |
| 4.2.3 农杆菌介导转化与抗性筛选 |
| 4.2.4 转多基因烟草植株的PCR检测 |
| 4.2.5 转多基因烟草植株的PCR-Southern检测 |
| 4.2.6 转多基因烟草植株的Southern检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 Hyg对烟草W38分化与生长的影响 |
| 4.3.2 Hyg抗性植株的分子检测 |
| 4.4 小结 |
| 5 转Bt-BADH-pttGA20ox-rolB多基因烟草外源基因的表达分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 半定量RT-PCR反应 |
| 5.1.3 转多基因烟草植株内源激素含量的测定 |
| 5.1.4 转多基因烟草植株的耐盐性试验 |
| 5.1.5 转多基因烟草植株的Bt毒蛋白含量测定和抗虫试验 |
| 5.1.6 转多基因烟草植株在温室中的生长测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转多基因烟草中Bt-BADH-pttGA20ox-rolB基因的表达分析 |
| 5.2.2 转多基因烟草植株内源激素含量分析 |
| 5.2.3 转多基因烟草植株的耐盐性分析 |
| 5.2.4 转多基因烟草植株的Bt毒蛋白检测和抗虫试验 |
| 5.2.5 转多基因烟草植株的温室生长观测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 Bt-BADH-pttGA20ox-rolB多基因在烟草中的表达 |
| 5.3.2 BADH基因对转基因烟草耐盐能力的影响 |
| 5.3.3 Bt基因对转基因烟草抗虫能力的影响 |
| 5.3.4 Bt-BADH-pttGA20ox-rolB多基因对转基因烟草生长的影响 |
| 5.4 小结 |
| 6 研究结论与展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 图版Ⅰ |
| 图版Ⅱ |
| 图版Ⅲ |
| 图版Ⅳ |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
四、转双抗虫基因741杨组培苗的温室驯化及大田移栽技术（论文参考文献）
- [1]一种简单稳定的质体转化体系的建立及其在木本植物中的应用[D]. 武玉永. 湖北大学, 2019(04)
- [2]辣木再生体系的优化和遗传转化体系的建立与四倍体诱导育种[D]. 张俊杰. 华南农业大学, 2018(08)
- [3]分子遗传改良技术在杨树上的研究与应用进展[J]. 王沛雅,杨晖,郭琪,杜维波,张军,杨涛. 江苏农业科学, 2017(20)
- [4]转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究[D]. 卢楠. 北京林业大学, 2017(04)
- [5]转Bt基因欧洲黑杨组织培养再生体系优化及其TA29-Barnase基因遗传转化[D]. 朱伟康. 西北农林科技大学, 2016(02)
- [6]转多基因107杨遗传检测及抗性表达研究[D]. 王奥漩. 河北农业大学, 2015(07)
- [7]多基因植物转化载体对烟草和欧美杨107杨的遗传转化[D]. 任亚超. 河北农业大学, 2013(08)
- [8]双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究[D]. 王桂英. 河北农业大学, 2012(06)
- [9]双抗虫基因转化欧美杨107杨的研究[D]. 杨艳丽. 河北农业大学, 2012(08)
- [10]转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建[D]. 贾香楠. 北京林业大学, 2010(09)