一、南医大发现人类新基因（论文文献综述）
彭玲[1]（2020）在《非综合征型先天缺牙新致病基因的鉴定及功能研究》文中研究说明研究背景和目的先天缺牙是最常见的牙齿发育异常,其中非综合征型先天缺牙指牙齿发育过程中仅有牙齿的先天缺失,不伴有其他先天性发育畸形。先天缺牙不仅影响患者的咀嚼,多数缺牙者还会影响其容貌、发音甚至生活质量。因此其病因的寻找成为现今众多研究学者关注的热点。目前先天缺牙缺乏从分子水平、细胞到动物水平比较系统的研究,因此对其发病机制进行深入的研究可以为将来进行基因治疗提供遗传学理论基础。本课题组在南方医院口腔科采集到一个非综合征型先天缺牙家系,该家系共有5名患者,均为先天少数牙缺失。通过短串联重复序列（Short Tandem Repeat,STR）连锁分析、全外显子测序（Whole Exome Sequencing,WES）以及家系共分离,本课题组找到了一个与非综合征先天缺牙有关的新致病基因desmoplakin（DSP）,其编码的桥粒斑蛋白desmoplakin（DP）是构成桥粒结构的主要蛋白质,其包含两种亚型DPⅠ和DPⅡ,主要在心肌和皮肤细胞中表达。该基因与牙齿发育之间的关系尚不明确,也未见相关的功能研究。本研究拟通过分析突变蛋白功能、建立细胞模型和斑马鱼模型等体内和体外功能学实验探讨DSP在非综合征先天缺牙中的分子发病机制,为牙齿的生理发育机制提供新的研究线索。材料与方法1.对先天性缺牙家系进行家系调查、病史采集以及血样收集。2.对该家系样本进行STR连锁分析,通过WES技术检测和家系共分离确定新致病基因和突变位点。3.通过预测软件SOPMA和I-TASSER对野生型和突变蛋白进行二级结构和三维结构比对,Polyphen-2预测氨基酸的改变对蛋白功能影响。4.将DSP野生型（WT）与突变（MUT）cDNA克隆到载体pIRES2-EGFP上并分别转染至HEK-293T细胞。转染24h后,Western Blot技术检测DP的表达情况。共聚焦显微镜下观察突变蛋白在细胞中的定位。5.HEK-293T细胞分别转染pIRES2-DSP-WT和pIRES2-DSP-MUT 16h后,采用蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX）对两组细胞分别处理0h、11h、31h、6h、12h和24h,Western Blot技术检测DP的表达。6.HEK-293T细胞共转染三种载体（pTOP/pFOP,pIRES2-DSP-WT/pIRES2-DSP-MUT和pRL-TK）。转染48h后,双荧光素酶实验检测DSP突变后对Wnt/β-catenin信号通路的影响。7.构建DSP抑制人牙髓干细胞（Human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）模型（ShRNA-DSP）,实验分为MOCK组、ShRNA-Ctrl组和ShRNA-DSP组。采用CCK8法、Transwell法和流式细胞术分别检测三组hDPSCs的增殖、迁移和凋亡情况;成牙本质向分化诱导hDPSCs,采用碱性磷酸酶染色检测三组hDPSCs碱性磷酸酶活性,茜素红染色观察矿化结节形成;采用qPCR、WB分别检测三组hDPSCs成牙本质向分化相关基因和蛋白的表达。8.合成两段抑制斑马鱼同源基因dspa表达的morpholino（MO-1,MO-2）并通过显微注射到斑马鱼的受精卵;检测在morpholino作用下斑马鱼中同源基因dspa在mRNA水平的改变。观察并记录受精后第六天（6dpf）牙齿缺失情况。9.合成斑马鱼早期牙齿发育相关基因bmp2a、dlx2b和pitx2的反义RNA探针,采用整胚原位杂交技术分析斑马鱼同源基因dspa表达抑制后对上述斑马鱼早期发育相关基因表达的影响。结果1.非综合征型先天缺牙家系患者临床特征先证者（16岁,女性）下领前牙牙列间隙大,乳牙55,65,75滞留,恒牙15部分萌出并向颊侧倾斜。先证者全景片显示恒牙25,28,35,42和45先天缺失。先证者母亲（Ⅱ-9）先天缺失恒牙32,家系成员（Ⅲ-3）先天缺失恒牙42,家系成员（Ⅱ-3）先天缺失恒牙15,25,38,45和48。2.确定突变位点该家系12位成员进行STR连锁分析,连锁分析定位到6p25.2-6p24.1之间为致病基因所在阳性区域。对患者（Ⅱ1-9,111-9和Ⅲ-3）和健康对照（Ⅲ-4和Ⅲ-10）进行WES分析。测序结果显示三个患者共同存7个基因突变,通过家系共分离,最终确定一个位于DSP基因23号外显子上的错义突变（rs6929069,c.5213 G>A）,该突变存在于所有患者并且在健康家系成员在均不存在。该突变导致DPI蛋白第1738位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺（p.R1738Q）,该突变未改变蛋白的二级结构和三维构象,但突变氨基酸在不同物种之间高度保守。3.p.R1738Q蛋白表达水平分析以及亚细胞定位Western blot结果显示MUT DP表达水平明显高于WT DP（p<0.001）,进一步进行CHX处理后,结果表明DPI发生突变后其半衰期增长,在细胞中更加稳定。亚细胞定位结果显示WT DP和MUT DP均定位于胞浆中,突变未影响DP的亚细胞定位。4.DSP突变干扰Wnt/β-catenin信号通路的转导DSP突变后,细胞核中β-catenin蛋白出现明显下调（p<0.05）;双荧光素酶实验结果表明TCF/LEF转录活性出现明显降低（p<0.01）。5.抑制DSP表达对hDPSCs增殖、凋亡、迁移和成牙本质向分化的影响DSP表达被抑制后,hDPSCs细胞增殖活性在第5天后显着降低（p<0.05）而且hDPSCs凋亡细胞比例显着高于对照组（p<0.05）;Transwell结果显示DSP表达被抑制后,hDPSCs穿过小孔的细胞数量显着低于对照组（p<0.05）,说明其迁移速度明显减慢;进行成牙本质分化诱导21d后,ShRNA-DSP组矿化结节数量明显增多,qPCR和WB结果显示DSP表达被抑制后,成牙本质相关基因（BSP和DSPP）和蛋白（DSPP和ON）表达均显着上调（p<0.05）。6.抑制斑马鱼同源基因dspa对斑马鱼牙齿表型和牙齿发育相关基因的影响同源基因dspa表达被抑制后,斑马鱼牙齿数目出现不同程度的减少。实验组（MO-1和MO-2组）斑马鱼牙齿平均先天缺失率分别是58.21%±1.82%（MO1）和54.67%±4.12%（MO2）,明显低于对照组8.85%±0.73%（p<0.001）。整体原位杂交结果显示同源基因dspa表达被抑制后,牙齿发育相关基因dlx2b和pitx2表达丧失,bmp2a的表达出现下调。结论1.本课题组在一个来自江西的非综合征型先天缺牙家系中鉴别出一个位于DSP基因的错义突变（rs6929069,c.5213 G>A）,这也是首次报道DSP突变与非综合征先天缺牙有关。2.DSP突变后未影响蛋白的三维结构和亚细胞定位,但蛋白突变后在细胞中表达量明显增加,半衰期增长,其长时间的稳定存在抑制了 Wnt/β-catenin信号通路的转导;3.DP蛋白在间充质来源的hDPSCs中高度表达且其功能丧失后抑制了hDPSCs生物学特性的正常发挥;4.通过敲低斑马鱼dspa基因的表达成功复制了斑马鱼牙齿缺失的表型并且抑制了牙齿发育早期相关基因的表达,说明DSP很可能是非综合征先天缺牙的一个新的致病基因,在牙齿发育过程中发挥着重要作用。
陈世豪[2]（2018）在《鸡内源性反转录病毒ALVE1的天然免疫功能及分子机制》文中研究指明DNA甲基化抑制剂5-Aza-2’-Deoxycytidine（5-Aza-dC）是第一个被美国FDA批准,用于治疗人类急性粒细胞白血病的表观修饰药物之一,它能与DNA甲基转移酶DNMT竞争性结合抑制其活性,阻断抑癌基因DNA甲基化反应,是广谱抗肿瘤药物。最新研究表明,在结肠癌和卵巢癌中,5-Aza-dC可激活内源性反转录病毒（ERV）来诱导Ⅰ型干扰素反应,进而发挥抗肿瘤作用。禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）诱发的慢性传染性肿瘤病,对家禽业危害巨大。禽白血病的防治,一直是困扰家禽业的世界性难题。本研究发现,DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC同样具有激活内源性反转录病毒进而抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。由于ERV大多因为突变、缺失而失去编码蛋白的能力,是体内重要的长非编码RNA来源。那么,5-Aza-dC是否通过诱导ERV产生的长非编码RNA来发挥抗肿瘤抗病毒的功能呢?基于以上科学问题,主要研究内容如下:（1）DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC具有抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。本研究先用禽白血病病毒ALVJ感染鸡胚成纤维细胞CEF 24 h,再通过5 μM 5-Aza-dC处理感染ALVJ的鸡胚成纤维细胞96 h,以此探究5-Aza-dC对ALVJ的抑制作用。研究结果表明,5 μM 5-Aza-dC处理CEF细胞对其细胞增殖和活性并没有影响,通过Westenbolt分析可知,5-Aza-dC处理感染ALVJ的CEF细胞能显着抑制ALVJ病毒囊膜蛋白的分泌,即抑制ALVJ病毒的增殖。共聚焦免疫荧光结果也表明,5-Aza-dC处理感染ALVJ的CEF细胞能显着抑制ALVJ病毒的增殖水平。为了进一步揭示5-Aza-dC抗病毒机制,利用高通量测序技术筛选和鉴定源于鸡内源性反转录病毒的长非编码RNA（ERV-lncRNA）。转录组测序结果发现,5-Aza-dC不仅具有激活天然免疫相关基因的功能,而且还诱导长非编码RNA的大量表达。不仅如此,序列比对分析发现,405条差异表达的长非编码RNA中共有59条来源于鸡内源性反转录病毒。这些差异表达的ERV-lncRNA中,5-Aza-dC处理后表达量显着上调的共有51条,显着下调的仅有8条。由此表明,5-Aza-dC抑制禽白血病病毒ALVJ增殖,可能与其激活的天然免疫相关基因有关,也可能与异常激活的ERV-lncRNA有关。（2）源于鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNAlnc-ALVE1-AS1的鉴定。为了验证源于鸡内源性反转录病毒衍生的lncRNA是否参与5-Aza-dC的抗病毒功能,本研究选择5-Aza-dC处理后表达水平上调最大但序列长度不超过3000nt的ERV-lncRNA作进一步功能验证。因此,本研究选择长非编码RNAALDBGALT0000000876进行序列鉴定和功能验证。经序列比对发现,该lncRNA源于鸡内源性反转录病毒ALVE1,与外源性禽白血病病毒ALVJ同源性很高。通过3’和5’RACE技术,鉴定ALDBGALT0000000876两端序列,研究结果发现,获得的全长序列大小为2136 nt,因转录方向与ALVE1相反,因此命名为lnc-ALVE1-AS1。接着,通过地高辛标记的特异性探针杂交lnc-ALVE1-AS1,Norther Blot结果显示lnc-ALVE1-AS1真实存在。进一步通过生物信息学分析其蛋白编码潜能和二级结构,结果表明lnc-ALVE1-AS1不编码蛋白,同时其二级结构复杂或为功能机制研究提供参考。为进一步确认lnc-ALVE1-AS1是否编码蛋白,设计了三种不同编码可能的HA融合的编码序列,经Western blot分析表明,lnc-ALVE1-AS1不编码蛋白,即lnc-ALVE1-AS1是长非编码RNA。另外,通过RNA FISH技术确定lnc-ALVE1-AS1的亚细胞定位,结果表明lnc-ALVE1-AS1定位至胞质和细胞核,且主要分布在胞质。（3）长非编码RNAlnc-ALVE1-AS1具有激活抗病毒天然免疫反应的功能。为了弄清lnc-ALVE1-AS1的生物学功能,尤其在天然免疫抗病毒方面的功能,本研究分析lnc-ALVE1-AS1 功能获得和缺失后对天然免疫相关基因表达水平的影响。通过构建 lnc-ALVE1-AS1过表达载体,将lnc-ALVEl-AS1全长定向克隆至pcDNA3.1表达载体以实现lnc-ALVE1-AS1 瞬时过表达。同 时构建 GFP 和 lnc-ALVE1-AS1 反义序列的表达载体作为 Mock对照。结果表明,过表达lnc-ALVE1-AS1与MOCK对照组相比,显着激活I型干扰素相关的转录因子IRF7和STAT1表达,同时IFN-β的表达水平也上调了近4倍,提示过表达lnc-ALVE1-AS1能够诱导I型干扰素表达。另外,通过荧光定量PCR（qRT-PCR）检测鸡相关的干扰素刺激基因（ISGs）的表达水平,包括IFI27-L2、IFIT5、MX1、OASL、RASD2和ISG12-2在内的6个基因均显着上调,甚至干扰素刺激基因RASD2的表达水平高于对照组40多倍。接着,通过RNAi干扰lnc-ALVE1-AS1表达,结果表明,转录因子IRF7和STAT1表达水平相应降低,IFN-β表达水平也显着降低;同时干扰素刺激基因表达水平也显着降低。总之,lnc-ALVE1-AS1功能获得和缺失后,均影响鸡胚成纤维细胞I型干扰素相关转录因子的表达水平,进而影响干扰素刺激基因,表明lnc-ALVE1-AS1在激活I型干扰素反应过程中起着关键角色。接着,先用ALVJ感染鸡胚成纤维细胞24h,再通过转染lnc-ALVE1-AS1过表达载体,进一步验证lnc-ALVE1-AS1是否抑制禽白血病病毒ALVJ。ELISA结果表明,与对照组相比,感染ALVJ的CEF细胞中过表达lnc-ALVE1-AS1后,ALVJ分泌p27蛋白水平显着被抑制;同时,检测其细胞培养液中ALVJ病毒滴度,结果表明,与对照组相比,过表达lnc-ALVE1-AS1后细胞培养液中ALVJ病毒滴度显着下降;接着,通过间接免疫荧光试验表明,过表达lnc-ALVE1-AS1后显着抑制禽白血病病毒ALVJ的增殖。总之,源于鸡内源性反转录病毒的lnc-ALVE1-AS1具有激活I型干扰素反应并抑制禽白血病病毒ALVJ的能力,该结果也间接揭示了源于鸡内源性反转录病毒的lnc-ALVEl-AS1可能在5-Aza-dC抗病毒过程中发挥重要的作用。（4）长非编码RNA诱导I型干扰素反应而发挥天然免疫抗病毒功能的分子机制。为了阐明lnc-ALVE1-AS1是如何诱导I型干扰素反应而发挥天然免疫抗病毒的功能,进一步研究lnc-ALVE1-AS1与核酸识别因子之间的关系。结果表明,过表达lnc-ALVE1-AS1显着诱导长dsRNA识别因子IFIH1和短dsRNA识别因子TLR3的表达水平,采用RNAi干扰lnc-ALVE1-AS1表达水平时,IFIH1、TLR3和dsDNA识别因子MB21D1表达水平也相应下降。由此,推断过表达lnc-ALVE1-AS1诱导天然免疫反应,很大程度与双链RNA识别因子TLR3和IFIH1有关。进一步,通过生物素标记lnc-ALVEl-AS1,利用RNApulldown技术检测lnc-ALVE1-AS1结合蛋白。质谱分析结果表明,TLR3可在体外结合或识别lnc-ALVE1-AS1。另外,进一步利用RNAFISH和免疫荧光结合的技术,结果表明TLR3和lnc-ALVE1-AS1出现共定位现象。由此表明,TLR3是lnc-ALVE1-AS1诱导天然免疫反应的核酸识别因子。总之,基于以上结果表明,内源性反转录病毒ALVE1通过衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1 能有效抑制外源性反转录病毒-禽白血病病毒 ALVJ 的增殖,说明内源性反转录病毒ALVE1并非“垃圾序列”或“转录噪音”,而是具有重要的生物学功能,尤其在天然免疫反应中扮演重要的生物学角色。该研究结果将有助于了解动物基因组中大量存在的内源性反转录病毒序列的抗病毒天然免疫功能,为更有效地防治禽白血病提供新思路。
陈远程[3]（2018）在《整合分析基因组水平与转录组水平数据以鉴定女性骨密度潜在功能基因及致因位点》文中研究说明背景骨质疏松是一种常见的慢性疾病,以骨量减少和骨强度下降为特征,导致骨脆性增加而易发生骨折。骨质疏松是重要公共卫生问题,尤其在中老人女性中更为突出。由于骨强度测量困难,临床上仍使用骨密度作为骨质疏松的诊断标准。骨密度的遗传力为50%-85%,而目前发现的所有遗传方面的发病机制,包括由全基因组学关联研究（GWAS）发现的位点,仅能解释不到6%的遗传力。大量的研究发现这些丢失的遗传力其他的遗传学机制导致,其中包括基因与基因之间的相互作用。但是俩基因之间的二维作用解释的遗传力有限。通过基因与基因之间的关系,构建网络,可以提高检验效能,为发现疾病剩下的遗传力提供新思路。同时,结合基因组学和转录组学两个组学的信息,可以弥补基因组学研究的不足,提供基因的功能学信息。此外,对发现的潜在功能基因进行精细定位、找到致因位点,可以更好的理解基因与骨密度之间关联的生物学机制,为骨质疏松的治疗提供基因靶点。目的（1）鉴定与女性骨密度有关的基因及模块。（2）探讨鉴定出的基因及模块如何影响骨密度。（3）对潜在功能基因进行精细定位,寻找致因位点。材料与方法使用了全球女性骨密度样本量最大的GWAS数据和转录组水平样本量最大的基因表达数据。利用加权基因共表达网络分析方法（WGCNA）进行网络构建,将P值≤0.05视为有统计学意义。并且,使用生物信息学工具DAVID对模块中的基因进行基因注释和功能富集分析。富集分数ES≥3.0被认为是具有统计学意义。最后,对鉴定所得与骨密度可能相关的功能基因进行精细定位分析,鉴定致因位点。结果经过ProxyGeneLD软件处理后,得到了所有基因在基因水平与骨密度相关性的P值,去掉与骨密度无关的基因并结合表达数据,去掉表达值较少的基因和在表达芯片中缺失的基因,得到1,574个基因进行网络构建,随之得到12个模块。经检验,仅有黄色模块具有统计学意义。因此,我们得到了一个模块（黄色模块）与骨密度相关。对黄色模块中所有的基因进行基因注释和功能富集分析,发现这些基因在肌收缩纤维通路有明显的富集,这一结果提示肌收缩纤维与骨密度相关。并且,根据基因在模块中的位置、既往GWAS研究结果、基因本身与骨密度的相关可能性的大小及功能富集结果,选择RBFOX1、HOMER1和SPTBN1等基因作为感兴趣的基因进行进一步生物功能学探讨及致因位点的精细定位。结论1、整合多组学信息,找到了与女性骨密度有关的潜在功能基因和模块,发现了新的与骨密度有关的基因,可能为解释剩下的遗传力提供新思路。2、对相关基因进行精细定位,鉴定出致因位点,为骨质疏松的后续生物功能学实验研究提供新线索。
何蕾[4]（2017）在《RPA1基因多态性在奥沙利铂治疗结直肠癌敏感性中的研究》文中提出背景:结直肠癌（包括结肠癌与直肠癌）是世界上常见的消化系统恶性肿瘤之一,在我国,结直肠癌的发病率目前已呈逐年上升趋势,严重威胁着人类的健康。尽管目前筛查早期结直肠癌的方法为数不少,但由于结直肠癌起病隐匿,大部分患者确诊时已发展至中晚期,无法进行手术治疗,因而辅助化疗已成为结直肠癌治疗中不可或缺的手段之一。奥沙利铂（oxaliplatin）是第三代铂类化合物,是目前针对中晚期结直肠癌化疗联合方案的标准药物之一,其主要原理是通过与脱氧核糖核酸双链共价结合形成链间交联,阻断肿瘤细胞DNA的复制和转录,从而发挥抗肿瘤作用。核酸切除修复系统（nucleotide excision repair,NER）是DNA修复的基本通路,修复紫外线所致嘧啶二聚体、脱氧核糖核酸加合物、光化合物等累积性损伤,是清除大剂量铂类药所引起的脱氧核糖核酸损伤的重要系统。人类基因组计划已经确认,基因的遗传与变异会影响基因的结构、功能以及表达,进而改变机体的生物学功能。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是最常见的基因遗传变异。能够改变基因结构或调节基因表达量,从而调控机体的作用。研究发现,单个SNP作用或多个SNPs间的联合作用与肿瘤发生发展及预后显着相关。耐药现象主要产生于修复系统清除药物,这是减弱化疗药物疗效的主要原因,而DNA修复基因的SNP密切影响着与修复系统的修复能力。迄今为止,已有多篇DNA修复通路SNPs与肿瘤及结直肠癌发病风险和化疗敏感性研究的报道。大量研究结果证实,NER通路与结直肠癌化疗敏感性以及生存预后存在潜在的关联。方法:本课题通过对166例结直肠癌患者的临床病例研究,筛选NER通路中可能存在的重要基因遗传变异,统计其与结直肠癌化疗敏感性及生存预后的关联,寻找到相关的遗传变异rs5030740及所在基因RPA1。在此基础上,通过分子生物学方法研究关键基因RPA1及遗传变异rs5030740对肿瘤细胞的表型影响,进而揭示其在奥沙利铂化疗敏感性及生存预后中的可能机制,为预测结直肠癌化疗敏感性及进行个体化治疗提供理论依据。结果:对166个以奥沙利铂为主要治疗方式的结直肠癌患者进行化疗敏感性及生存预后与RPA1遗传变异的关联性分析,寻找到相关的遗传变异rs5030740及所在基因RPA1。课题发现rs5030740位点T等位基因突变到C等位基因与结直肠癌患者奥沙利铂化疗敏感性降低有关,并且结直肠癌患者用药后无进展生存期缩短有关。此外,本课题组通过网站预测,数据库分析,细胞学实验等验证了 rs5030740位点的突变导致了 miRNA-let-7e-5p与PPA1基因3’-UTR的结合能力的降低,促使RPA1的表达量上升。最后,课题组通过一系列细胞表型实验（细胞增殖、周期及凋亡）进一步揭示了RPA1的表达量升高可增加肿瘤细胞的增殖能力,减少细胞凋亡数目,而这一现象在奥沙利铂药物的刺激下,更为明显。结论:基因rs5030740的突变可能导致miRNA-let-7e-5p的结合能力减弱,RPA1的异常高表达,进而通过增加肿瘤细胞的增殖力及减少凋亡率来延长肿瘤的生存能力,最终影响了奥沙利铂化疗药物的效果及结直肠癌患者的生存预后。该研究提示了 RPA1基因rs5030740多态性可作为中国结直肠癌人群奥沙利铂疗效及预后的重要的潜在生物学指标。
许红攀[5]（2016）在《新型肝靶向纳米多肽递送系统的构建及性能评价》文中研究表明肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是一个全球公共健康难题,常规治疗策略的效果不尽如人意。基因治疗为肝癌尤其是进展期肝癌的治疗带来了一线曙光,截止目前共有17项肝细胞癌基因治疗临床试验正在进行,有望成为肝癌的克星。基因治疗载体决定了治疗基因表达的特异性和效率,对它的设计和构建是基因治疗的关键因素和研究难点。基因治疗载体要保护治疗基因免遭核酸酶破坏,并能够特异性识别和进入靶细胞,之后还要面临复杂的细胞内环境,完成“逃离内吞体”、避免“溶酶体降解”、定位到细胞核并启动治疗基因表达等一系列极具挑战的任务。近年来,人工设计仿生载体（Designer biomimetic vector, DBV）作为基因治疗载体备受瞩目。一个高效的仿生载体包括核酸浓缩基序（DNA condensing motif, DCM）、靶向肽段（Targeted peptide,TP）、内吞体裂解基序（Endosome disrupting motif, EDM）、核定位信号（Nuclear localization signal, NLS）等基本要素。DBV通过DCM与治疗基因自组装成纳米尺寸的颗粒,防止血清中核酸酶对治疗基因的降解；TP的靶向作用可以经受体介导的内吞途径将基因治疗载体携带至靶细胞内；而EDM能够破坏内吞体膜将基因治疗载体从内吞体释放至胞浆中,并通过NLS的核定位作用将其定位至胞核实现治疗基因的高效表达。本人所在的课题组既往的研究证实来源于疟原虫环子孢子蛋白（Circumsporozoite protein, CSP）的CSR2a肽段是一个新的理想的肝特异性靶向配体分子,对构建高效的肝癌基因治疗靶向递送系统具有较高的研究价值。另外,我们前期通过分析、鉴定获得了一种新型肿瘤特异性启动子-FZD7（Frizzled-7）启动子,研究证实其具有突出的肝癌特异性和转录调控活性。目的在本研究中,我们以CSR2a作为特异配体设计、构建及评价了一种新型肝靶向纳米多肽递送系统,为进一步实现FZD7启动子调控下的肝癌精准治疗奠定基础。方法1.设计并利用基因工程重组技术制备基于CSR2a小肽的肝靶向递送DBV。用免疫印迹实验验证His-tag;采用红细胞溶血和组织蛋白酶D酶切位点鉴定实验,检测DBV pH依赖的内吞体胞膜裂解功能及靶向配体分子的释放效应。2.将DBV与质粒pEGFP-N1进行混合,对影响包裹率的缓冲液、孵育温度及孵育时间等因素进行分析；利用琼脂糖凝胶电泳、Zeta电位仪、Nanosight纳米颗粒分析仪和透射电子显微镜等对所形成纳米颗粒的粒径、负载电荷、pH稳定性、中和效应等表征进行分析。3.通过血清稳定性实验、靶向肽段抑制试验和细胞毒性实验分析纳米粒子DBV/pEGFP-N1的抗核酸酶降解能力、肝靶向性、细胞毒性等性能；最后,采用体外细胞实验、动物体内实验验证DBV的肝靶向递送功能。结果1.成功制得8种较高纯度的DBV,其中只有DBV3的靶向肽段可被切除,被用于后续实验；pH 7.4时DBV3不会使红细胞裂解,而pH 5.5时发生裂解,证实了DBV3在酸性条件下具有胞膜裂解能力。2.室温或者37℃条件下,在pH 5.5的醋酸盐缓冲液中N/P（氮磷比）为10时,孵育1h更利于纳米颗粒的自组装,包裹率达到（99.1±0.7）%,所形成的DBV3/pEGFP-N1球形纳米粒子水合粒径为132±3.1 nm,负载电荷为+28.5+1.3 mV。3. DBV3/pEGFP-N1纳米粒子中的pEGFP-N1质粒不会被血清中的核酸酶降解；靶向肽CSR2a与细胞孵育后,可以竞争性抑制DBV3/pEGFP-N1的肝靶向性能；DBV3/pEGFP-N1对细胞没有明显的毒性效应,且可以靶向进入正常肝细胞和肝癌细胞；硫酸长春新碱可以抑制DBV3/pEGFP-N1向核运输；体内递送实验中,正常肝组织中有明显荧光,而心、肾、脾、胃等组织中并未有荧光蛋白表达。结论本研究成功构建了一种以CSR2a小肽作为特异性肝靶向配体的新型肝靶向纳米多肽递送系统,包含了DCM、EDM、NLS和CSR2a等功能元件,能够在体外与DNA质粒自组装成稳定的纳米粒子,保护DNA质粒不被血清核酸酶降解,与靶向肝细胞特异性结合,通过内吞作用进入细胞,能从溶酶体中释放入细胞质,并在NLS的引导下定位到细胞核,成功表达了目的基因。
樊天禹[6]（2016）在《胶质母细胞瘤中抑制EZH2的表达改善替莫唑胺化疗敏感性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景：胶质母细胞瘤是中枢神经系统中常见的呈进展性的恶性肿瘤,也是人类死亡率最高的肿瘤之一。根据2007年世界卫生组织的分类标准,胶质母细胞瘤被分为四种病理亚型（Ⅰ-Ⅳ）。多形性胶质母细胞瘤（GBM, WHO Ⅳ）是目前公认的恶性程度最高、预后最差的原发性中枢神经系统肿瘤。尽管过去多年对此类的肿瘤的治疗策略发生了很大的变化,多形性胶质母细胞瘤的侵袭性的特性决定了肿瘤的治疗仍然是以手术切除为基础,辅以其他治疗方法以延长患者的存活期。在其他肿瘤患者中放疗能延长患者的存活期,甚至能治愈肿瘤,而放疗辅以化疗较单纯的放疗能延长患者的存活期。在近期的一项随机研究中,放疗辅以替莫唑胺化疗使得多形性胶质母细胞瘤的无进展存活期以及总存活期显着延长,从平均12.1个月延长至14.6个月。替莫唑胺作为一种口服的化疗药物,其副作用较小,通过增加肿瘤对放了的敏感性,已经成为胶质母细胞瘤的标准治疗方案。然而替莫唑胺对患者的存活期的影响、肿瘤的复发以及肿瘤对替莫唑胺的耐药仍然是巨大的挑战。尽管放疗辅以替莫唑胺化疗方案能延长多形性胶质母细胞瘤患者总的存活期,但是手术不能完全切除肿瘤以及肿瘤细胞对放疗得抵抗及对替莫唑胺的耐药仍然使得几乎所有的多形性胶质母细胞瘤患者治疗失败。有些多形性胶质母细胞瘤在首次确诊时就对替莫唑胺耐药,有些肿瘤在治疗的过程中逐渐对替莫唑胺产生耐药。因此对替莫唑胺耐药成了治疗多形性胶质母细胞瘤的一大难题。EZH2蛋白是由EZH2基因编码的一种蛋白质,目前研究证实其存在于染色体的7q35位置,包含20个外显子和19个内含子。EZH2蛋白属于多梳蛋白家族,形成多聚蛋白复合体以维持基因的转录抑制状态。以往的研究显示EZH2发挥转录抑制是通过直接控制DNA的甲基化水平来实现。除了存在于干细胞中,在正常细胞中EZH2的表达较低,难以被常规方法检测到或是处以表达抑制状态。与此相反,在前列腺癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌和肝癌等多种肿瘤细胞中能检测到EZH2的异常高表达,提示EZH2在肿瘤的发生、恶化进展中发挥重要作用。尽管EZH2在多种肿瘤的发生及恶化过程中的作用被广泛研究,但是其在肿瘤细胞对化疗药物的产生耐药中是否发挥作用以及如何发挥作用仍然不清。在本研究中,我们通过U251、U87以及对替莫唑耐药的U251、U87细胞系来研究EZH2在胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药中的机制。材料与方法细胞培养及转染人类胶质母细胞瘤细胞系U251及U87使用含10%胎牛血清、100IU每毫升青霉素、0.1mg每毫升链霉素的培养基（DMEM）在含5% CO2、37。C的环境中培养。在培养基中加入100μM的替莫唑胺连续2个星期来创建替莫唑胺的耐药株。每隔三天更换含有替莫唑胺的培养液,大部分的细胞死亡了,但是有小部分细胞存活并逐渐稳定传代,成功建立了替莫唑胺耐药的U251细胞株（U251/TMZ cells）及U87细胞株（U87/TMZ cells）。使用Lipofectamine 2000转染细胞,严格按操作说明（Invitrogen, Carlsbad,CA）执行。定量RT-PCR使用定量PCR来检验转录的相对水平。使用M-MLV逆转录酶加入提取的2ug大RNA。cDNA用来放大EZH2基因,β-actin基因用作内源性参照物。PCR的条件为：94℃ 4分钟,94℃ 1分钟40个循环,56℃ 1分钟,and 72℃ 1分钟。PCR 引物：EZH2 forward,5’-GCC AGA CTG GGA AGA AAT CTG-3’ reverse, 5’-TGT GCT GGA AAA TCC AAG TCA-3’;内源性参照物P-actin forward,5’-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’and reverse,5’-ATC TTC AAA CCT CAT GAT G-3’。MTT试验通过MTT试验来检测细胞活力。在96孔板上放置5x104细胞/孔,加入替莫唑胺（200 μg/ml）培养24,48,72,96和120小时。经过3天的培养,每孔加入20μl的MTT溶液（5 mg/ml;Sigma）培养4小时,然后移去MTT溶液,加入200μl二甲基亚砜（DMSO; Sigma）来溶解晶体。通过570nnm波长的光密度仪检测。免疫印迹试验培养的细胞裂解：裂解液RIPA（0.1% SDS,1% Triton X-100、1mM MgCl 2、10mM Tris-HCl,pH7.4）4℃ 30分钟,收集裂解液并离心,测定蛋白质浓度。全细胞裂解液（50μG）使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。将蛋白质转到硝酸纤维素膜上。非特异性结合位点使用5%脱脂奶粉TBST溶液（100mM Tris-HC1,pH值7.5,150 mM氯化钠,0.1%Tween 20）封闭,使用抗ezh2和抗GAPDH抗体室温孵育2小时。用TBST洗涤4次后,将膜用羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗孵育（西格玛奥德里奇,圣路易斯,MO）5%脱脂奶粉TBST溶液在室温下反应1小时；采用增强化学发光法显影（Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA）。SiRNA转染EZH2和siRNAs由上海吉玛制药合成（上海,中国）。抗EZH2靶序列及对照序列：5’-GAC UCU GAA UGC AGU UGC UTT-3’和5’-AGC A AC UGC AUU CAG AGU CTT-3’。细胞接种于6孔板中生长在含血清和无抗生素的培养基。转染细胞达到60%融合时,用脂质体2000（Invitrogen）根据制造商的说明进行转染。转染后4-6小时后细胞使用常规培养液冲洗,48小时后测试抑制的效率。流式细胞仪分析按上面描述的转染48小时后,收集细胞,PBS洗两次。洗过的细胞于0.6mlPBS重悬,用1.4毫升加100%乙醇溶液固定在4℃过夜。固定细胞用PBS洗两次,并用碘化丙啶（PI）溶液重悬,PBS溶液包括50 ug/mL的PI和50 ug/ml RNaseA （Sigma）没有钙和镁,并分别在37℃遮光孵育30分钟。染色后的细胞通过尼龙网筛除去细胞团块,用流式细胞仪和Cell Quest软件分析（Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）。流式细胞仪重复分析3次。统计学分析数据使用均数±标准差（SD）表示,使用Students-Newman-Keuls方法比较,P<0.05认为有统计学意义。结果和母系U251及U87细胞系相比,EZH2在U251/TMZ和U87/TMZ中的表达增加。我们检测了U251/TMZ细胞、U87/TMZ细胞及母系U251及U87细胞系的生长活力。结果表明,与U251及U87相比U251/TMZ和U87/TMZ细胞约5倍耐TMZ。我们还检测了EZH2在胶质母细胞瘤细胞和TMZ诱导耐药细胞的蛋白表达。结果表明：在U251/TMZ和U87/TMZ细胞比在母系胶质母细胞瘤细胞EZH2的表达水平更高,提示EZH2可能与胶质母细胞瘤细胞的耐药机制有关。EZH2 siRNA能逆转U251/TMZ和U87/TMZ对替莫唑胺的耐药性。为了确定EZH2在胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药机制中是否起着关键的作用,我们将U251/TMZ和U87/TMZ细胞转染EZH2 siRNA和对照siRNA。转染的效率使用定量RT-PCR证实。Western blot结果表明EZH2 siRNA可有效降低EZH2蛋白水平。MTT试验显示敲除EZH2可以显着降低U251/TMZ和U87/TMZ细胞大约30-40%的活力,提示EZH2可能调节U251/TMZ和U87/TMZ细胞对替莫唑胺的耐药性。EZH2 siRNA转染的U251/TMZ和U87/TMZ细胞进入细胞凋亡。探讨细胞凋亡增加是否是因为在转染了EZH2 siRNA的U251/TMZ和U87 /TMZ细胞的生长抑制,使用Annexin V和PI双染色来观察细胞的凋亡。在转染了EZH2 siRNA的细胞中观察到了凋亡细胞的增加。EZH2 siRNA转染导致U251/TMZ和U87/TMZ的细胞周期阻滞在G1期。细胞周期进展延迟是抑制肿瘤细胞生长的另一个重要机制。通过U251/TMZ和U87/TMZ细胞来研究EZH2 siRNA对细胞周期分布的影响。流式细胞仪分析表明,G1期细胞的比例在抑制EZH2的细胞较对照组增加,提示EZH2的表达上调可促进U251/TMZ和U87/TMZ细胞的细胞周期进程。EZH2 siRNA处理可以降低MDR,MRP和BCRP的表达。肿瘤的多药耐药是针对肿瘤化疗方案能否成功的主要障碍。肿瘤细胞能够抵抗化疗药物的一个关键的机制在于增加ATP结合转运蛋白表达,包括P-糖蛋白（P-gp、MDR1）、多药耐药相关蛋白（MRP）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）等。这些蛋白质发挥了对多种结构不同的化疗药物的能量依赖性的药物外排泵的作用,能够降低细胞内化疗药物蓄积。EZH2 siRNA转染后,我们通过定量RT-PCR和Western blot检测MDR,MRP和BCRP的mRNA和蛋白表达水平,结果表明抑制EZH2的表达水平可以降低MDR,MRP和BCRP的表达。讨论多形性胶质母细胞瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性脑肿瘤,其中位生存期约14个月左右。患者在手术切除肿瘤并取得病理诊断确诊后,于放疗的同时结合替莫唑胺化疗对于胶质母细胞瘤患者能增加其生存的时间,但是几乎所有的患者都因为肿瘤复发、病情恶化而死亡。肿瘤细胞的耐药是多个因素相互作用、共同发展的一个极为复杂的过程,对于原发性肿瘤和继发性肿瘤主要表现出对化疗药物的抵抗,即化疗药物不能完全杀灭肿瘤细胞。多形性胶质母细胞瘤对替莫唑胺产生耐药已经成为该疾病治疗中的一个严重的障碍。目前的研究显示MGMT、MMR酶活性、BER修复途径和药物外排泵被认为是胶质母细胞瘤患者对替莫唑胺产生耐药的最重要的机制。然而,这些机制仍然不能解释该现象所有的耐药机制。在这里,我们试图确定影响替莫唑胺对胶质母细胞瘤的疗效的一些非常规的因素。采用TMZ敏感和耐TMZ-胶质母细胞瘤细胞系的基因表达分析,我们发现在在胶质母细胞瘤细胞中沉默EZH2表达水平与TMZ耐药表型相关。果蝇zeste基因增强子同源物2（EZH2）是多梳组成员（PCG）蛋白质。PeG蛋白是重要的表观遗传调节蛋白,可通过染色质修饰转录抑制沉默特定的基因。PcG蛋白组成的多梳抑制复合物（PRC）。其中PRC2包括增强EZH2、 SUZ12和EED。EZH2属于PRC2复合体的核心成员,目前研究显示其主要作用是使组蛋白的27位赖氨酸三甲基化来抑制特异基因的转录。近年来,越来越多的研究显示EZH2有促进肿瘤形成和进展的作用,包括影响细胞分化和增强肿瘤细胞的增殖和体内肿瘤的生长。EZH2在多种恶性肿瘤中呈过度表达,如卵巢癌、胰腺癌、肝癌等,且其过度表达状态与患者预后不良相关呈正相关。在我们的研究中,我们初步证实EZH2在对替莫唑胺耐药的人脑胶质母细胞瘤细胞U251/TMZ和U87/TMZ中呈高表达。因为EZH2在功能上属于甲基转移酶,过度表达的EZH2可以通过增加DNA组蛋白的甲基化来调控下游基因的转录。为了解释EZH2表达升高的机制,我们采用RNA干扰技术沉默EZH2的表达,发现EZH2 siRNA转染入肿瘤细胞后,能快速有效地沉默EZH2基因mRNA和蛋白水平,转染效率可达到70%以上,表明转染EZH2 siRNA有较好的抑制作用。为了计算细胞生长活力,通过MTT法检测EZH2和TMZ耐药细胞株U251/TMZ和U87／TMZ生长能力之间的关系。EZH2表达下调可显着降低U251/TMZ和U87细胞／TMZ 30-40%的细胞生长活力,提示EZH2可能具有调节细胞增殖的能力,这一结果与在乳腺癌和前列腺癌中的研究结果相一致。EZH2沉默后TMZ对U251/TMZ和U87/TMZ细胞杀伤力明显增强。细胞周期可用于评估肿瘤细胞对化疗的敏感性。我们分析了每一组的细胞周期分布,发现在对照组和转染si EZH2组,在G1期的细胞比例有逐渐增加的趋势,而在S,G2和M期细胞的比例则相应的出现降低,表明细胞周期在G1期发生阻滞。这一发现表明EZH2 siRNA处理可通过阻断从G1期向S期和G2期过渡从而抑制细胞周期的进展。这个发现和在结肠癌中发现的沉默EZH2能降低cyclin D1的表达,导致在细胞周期在G1/S期阻滞相一致。此外,在胰腺癌的研究中,沉默EZH2基因能增强p27Kip1的表达,从而抑制细胞周期G1/S期的过渡。在我们的实验中,我们发现与以前的报道是一致的。肿瘤细胞产生多药耐药的机制是非常复杂的过程,与基因、细胞因子和转运蛋白等因素密切相关。ATP结合盒转运蛋白（ABC转运蛋白）在以往的研究中被认为在多种肿瘤多药耐药性的发展中起着至关重要的作用。肿瘤患者一旦出现多药耐药,其不仅仅对正在服用的化疗药物产生抗药性,同时也对多种从未使用过且作用机制不同的化疗药物产生耐药。这是由几个因素造成的,其中一个是ABC转运蛋白发挥的增加药物从细胞内的排泄的作用。例如,ABCB1蛋白（P-gp）具有将抑制肿瘤药物泵出细胞的功能。P-gp亦称MDR1,ABCB1,是ABC转运蛋白的代表和研究最广泛的基因。P-gp已知具有运输有机阳离子或中性化合物的作用。另外一个ABCC家族成员,也被称为MRP,也被证明具有运输有机阴离子化合物出细胞的作用。ABCG家族研究最多的成员ABCG2,也称BCRP（乳腺癌耐药蛋白）,具有抵抗大多数拓扑异构酶Ⅰ或Ⅱ抑制剂如拓扑替康、伊立替康、多柔比星的作用。我们的研究在基因和蛋白水平证实了这一结论。探讨对替莫唑胺耐药的胶质母细胞瘤细胞在EZH2被抑制后恢复了对化疗敏感性的机制,我们还检测了MDR,MRP和BCRP的表达,发现MDR, MRP和BCRP的表达在EZH2沉默后显着降低。如上所述,MDR,MRP和BCRP,属于ABC转运蛋白家族,作为药物泵能将化疗药物泵出肿瘤细胞。当MDR,MRP和BCRP表达上调时,药物外排泵可以减少化疗药物的细胞内浓度,从而降低TMZ的杀伤肿瘤细胞的作用。EZH2基因沉默能降低MDR,MRP和BCRP mRNA和蛋白水平,从而降低外排泵活性,能增加胶质母细胞瘤细胞的化疗敏感性。因此,EZH2介导的耐药作用可能通过MDR,MRP和BCRP来实现的。研究结论：我们的研究显示EZH2在多形性胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺产生耐药的过程中所发挥关键的作用,研究结果表明抑制EZH2能逆转胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的耐药状态,EZH2介导的耐药作用可能是通过增加MDR,MRP和BCRP等转运蛋白的表达来实现的。
陈婉婷[7]（2015）在《乳腺癌基因表达谱数据的相关性研究》文中进行了进一步梳理基于蛋白质和基因表达谱等高通量数据识别与癌症发生和发展相关的差异表达基因是癌症研究的一个重要方面。尽管相关研究已经取得很大的进展,但也发现了这样的问题:同一种癌症不同研究得到的基因表达谱数据中发现的差异表达基因仅有少部分是重叠的,即重复性低。可重复性低这一问题急需得到解决,否则将会使高通量技术受到质疑,进一步的临床应用也将受到影响。分析原因,数据扰动是引起重复性低的重要原因。基因表达谱数据的扰动由实验误差和生物学误差组成。实验误差可以通过实验手段和技术的提高改进,仪器设备的更新完善等来控制,而生物学误差来源于基因表达调控的多样性与单核苷酸多态性,无法避免,占扰动误差的主要部分。因此,提出少受数据扰动误差影响的筛选差异表达基因的新统计方法来提高可重复性,具有重要的意义。研究发现,由不同研究筛选的癌症差异表达基因重叠率虽然较低,但它们在表达相关的意义上一致性较高,这提示我们有可能通过相关性方面的研究来提高筛选的癌症差异表达基因重叠率。本文选取乳腺癌的表达谱数据为研究对象,通过研究数据之间的相关性,进而提出筛选差异表达基因的改进方法。1.目前在基因表达谱数据筛选差异表达基因中,多使用FDR（false discovery rate）方法,该方法在传统t检验的基础上,通过用ALSU（adaptive 1inear step-up）控制程序进行基因筛选。本文定义和计算了乳腺癌表达谱数据中基因的各种相关系数,发现随着FDR调整的P值增大,基因的总相关系数呈下降趋势。通过差异基因的功能富集分析发现,显着性富集通路中差异基因的平均相关系数,大部分要高于全体差异基因的平均相关系数。这说明功能一致的差异表达基因,它们之间的相关性越强。利用计算机产生不同误差的模拟数据,分别计算和比较平均相关系数和t检验P值的均方根误差,前者要小于后者。这表明表达谱数据的相关性受扰动的影响要小于传统t检验方法。2.本文在FDR方法基础上,提出一种结合相关性的改进方法来筛选乳腺癌的差异表达基因。结果表明,改进方法筛选出的差异基因重复率要高于FDR方法的基因重复率,其中的重复基因含有的已知乳腺癌相关基因也要多于FDR方法。同时,功能富集的结果也更优于FDR筛选出差异基因的功能富集结果,改进方法能够选出更多的与乳腺癌密切相关的通路。由此可见,基于相关性的改进方法是鲁棒和稳定的,效果比传统FDR方法更好。综上所述,本文对乳腺癌基因表达谱数据的相关性进行了研究,提出了结合相关性对FDR方法进行改进的方法用于筛选差异表达基因,提高了不同研究的癌症表达谱数据可重复性,对利用高通量技术研究癌症的发生发展,解决临床问题有积极意义。
孙明[8]（2015）在《长非编码RNA调控非小细胞肺癌、胃癌细胞侵袭转移的机制研究》文中指出新近研究表明长非编码RNA（lncRNA）在调控细胞分化、细胞增殖、细胞侵袭转移等生物学功能中起着重要的作用。许多lncRNA在多种肿瘤中的表达出现异常,可能参与肿瘤的发生发展过程。lncRNA BANCR,SPRY4-IT1在多种肿瘤中表达紊乱参与,但它们在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况及可能的生物学功能尚不清楚,需进一步研究。而lncRNA HOXA11-AS目前尚无相关文献报道其与肿瘤发生发展的关系。本文第一部分研究了lncRNA BANCR在NSCLC中的表达,及其对NSCLC细胞生物学功能的影响和分子机制。第二部分研究了lncRNA SPRY4-IT1在NSCLC组织及细胞中的表达水平对NSCLC细胞增殖,凋亡和侵袭转移能力的影响,及SPRY4-IT1异常表达的分子机制。第三部分研究了反义转录的lncRNA HOXA11-AS在胃癌中的表达水平和调控胃癌细胞增殖及侵袭转移功能的分子机制。以上研究提示lncRNA作为新的RNA调控分子在转录及转录后水平调控下游靶基因的转录表达和蛋白翻译等过程,而lncRNA介导的复杂RNA调控网络在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用,为我们研究NSCLC和胃癌发生发展的分子机制提供了新的思路。第一部分长非编码RNA BANCR调控EMT抑制NSCLC细胞侵袭转移的机制研究目的:研究lncRNA BANCR在NSCLC组织及细胞中的表达水平对细胞增殖,凋亡和侵袭转移功能的影响及分子机制。方法:定量PCR检测了BANCR在NSCLC组织中的表达,并分析了其表达水平与病人临床特征的相关性。MTT,克隆形成,流式细胞技术,Tunel染色检测BANCR对细胞增殖,凋亡的影响;划痕,transwell和活体动物实验检测了BANCR对细胞迁移和侵袭转移能力的影响。Western blot,免疫荧光检测了BANCR对下游靶基因的调控。结果:BANCR在NSCLC组织及细胞中表达下调,并与NSCLC病人的预后差密切相关,且BANCR可能受到组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）调控。NSCLC细胞中过表达BANCR能抑制细胞增殖、侵袭转移能力,并诱导细胞凋亡;干扰BANCR的表达则能促进细胞的侵袭转移能力。Western blot及免疫荧光结果显示BANCR可能是通过调控NSCLC细胞的上皮-间质转化（EMT）影响细胞的增殖和侵袭转移能力。结论:综上所述,本研究提示在NSCLC中lncRNA BANCR作为EMT的调控因子参与NSCLC细胞的侵袭转移过程,并可能作为NSCLC病人预后差的分子标记物。第二部分EZH2抑制长非编码RNA SPRY4-IT1促NSCLC细胞EMT调控细胞侵袭转移的机制研究目的:研究lncRNA SPRY4-IT1在NSCLC组织及细胞中的表达水平对细胞增殖,凋亡和侵袭转移功能的影响及其异常表达的分子机制。方法:定量PCR检测了SPRY4-IT1在NSCLC组织中的表达,并分析了其表达水平与病人临床特征的相关性。ChIP方法检测EZH2对SPRY4-IT1的调控。MTT,克隆形成,流式细胞技术,Tunel染色和皮下成瘤实验检测SPRY4-IT1对细胞增殖,凋亡的影响;划痕,transwell和活体动物实验检测了SPRY4-IT1对细胞迁移和侵袭转移能力的影响。Western blot,免疫荧光检测了SPRY4-IT1对下游靶基因的调控。结果:SPRY4-IT1在NSCLC组织及细胞中表达下调,并与NSCLC病人的预后差密切相关,且SPRY4-IT1可能受到组蛋白甲基化转移酶EZH2的调控。NSCLC细胞中过表达SPRY4-IT1能抑制细胞增殖、侵袭转移能力,并诱导细胞凋亡;干扰SPRY4-IT1的表达则能促进细胞的侵袭转移能力。Western blot及免疫荧光结果显示SPRY4-IT1可能是通过调控NSCLC细胞的上皮-间质转化（EMT）影响细胞的增殖和侵袭转移能力。NSCLC细胞中封闭EZH2的表达同样能抑制细胞增殖和侵袭转移能力,与过表达SPRY4-IT1的结果一致。拯救实验证实SPRY4-IT1是EZH2发挥癌基因的一个重要的下游因子。结论:综上所述,本研究提示在NSCLC中EZH2抑制lncRNA SPRY4-IT1的转录表达,SPRY4-IT1作为EMT的调控因子参与NSCLC细胞的侵袭转移过程,并可能作为NSCLC病人预后差的分子标记物。第三部分长非编码RNA HOXA11-AS调控KLF2、PRSS8影响胃癌细胞增殖和侵袭转移的机制研究目的:研究lncRNA HOXA11-AS在胃癌组织及细胞中的表达水平对细胞增殖,凋亡和侵袭转移功能的影响及其异常表达和调控下游靶基因的分子机制。方法:生物信息学分析胃癌组织中lncRNA HOXA11-AS的表达,定量PCR验证了HOXA11-AS在胃癌组织中的表达水平。ChIP和荧光素酶方法检测E2F1对HOXA11-AS的转录调控。MTT,克隆形成,流式细胞技术,EDU染色,Tunel染色和皮下成瘤实验检测HOXA11-AS对细胞增殖,凋亡的影响;transwell和尾静脉肺转移实验检测了HOXA11-AS对细胞迁移和侵袭转移能力的影响。细胞核质分离实验确定HOXA11-AS的细胞定位。RIP,RNA-seq方法研究HOXA11-AS对下游靶基因的调控。结果:HOXA11-AS在胃癌组织及细胞中表达上调,且胃癌细胞中转录因子E2F1促进HOXA11-AS的转录表达。胃癌细胞中干扰过HOXA11-AS表达抑制细胞增殖、侵袭转移能力,并诱导细胞凋亡;上调HOXA11-AS的表达则能促进细胞的增殖和侵袭能力。RIP结果显示HOXA11-AS在胃癌细胞中绑定募集PRC2,LSD1,DNMT1,WDR5,AGO2和STAU1等RNA结合蛋白。RNA-seq结果显示PRSS8和KLF2可能是HOXA11-AS的下游靶基因。结论:综上所述,本研究提示在胃癌中E2F1促进lncRNA HOXA11-AS的转录表达,HOXA11-AS可能通过募集绑定PRC2/LSD1/DNMT1/STAU1等调控PRSS8和KLF2参与胃癌的发生发展,并可能作为胃癌病人预后差的分子标记物。
王斐斐[9]（2014）在《FBXO8通过泛素化mTOR参与结直肠癌侵袭和转移的分子机制》文中研究表明研究背景和目的目前结直肠癌转移是临床患者的主要死亡原因,当结直肠癌确诊时,大约有20%～40%病例已经发生了远处转移,而根治术后再次发生的肝转移率约为50%;结直肠癌死亡的患者中肝转移率高达45%～71%[1]。因而,加强对结直肠癌发生发展机制的研究,阐明结直肠癌发生转移的分子机制,对结直肠癌的转移进行预测、诊断和相关预后判断等是目前结直肠癌研究的前沿,对于减少死亡率、提高治愈率具有重要的科学意义。本课题前期实验发现miR-223通过其下游靶基因FBXO8促进结直肠癌转移,FBXO8在结直肠癌组织中表达下调,但是FBXO8基因在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制尚不清楚。FBXO8基因是F-box蛋白家族的一名新成员,F-box蛋白家族属于泛素-蛋白酶体系统,该系统可以介导真核细胞内大多数调控性蛋白的降解,所以对于维持细胞内的稳态、调控细胞的增殖、分化、周期和凋亡等过程中发挥及其重要的作用[2]。泛素对于蛋白的转录后修饰由三个酶介导:E1活化酶、E2交联酶和E3连接酶。F-box蛋白家族特征是具有大约40个氨基酸序列的F-box基序,它作为泛素E3连接酶SCF（Skp1/Cullin/F-box）蛋白复合物中的亚单位发挥其作用,F-box蛋白通过与底物的直接结合来决定底物泛素化的特异性[2]。目前仅有3篇文献报道了FBXO8在肿瘤中的作用。FBXO8可抑制ARF6介导的乳腺癌细胞的侵袭能力[3]。FBX08被发现是一个新的c-Myc结合蛋白,c-Myc通过抑制FBX08的相关功能,来提高癌细胞的侵袭能力[4]。本课题组研究发现FBX08可抑制肝癌细胞的侵袭与转移能力并与肝癌病人的低生存率相关[5]。以上均提示FBX08与肿瘤的演进密切相关。本课题选取FBX08作为靶点,进一步探讨FBX08在结直肠癌侵袭和转移中的功能和相关机制,主要内容如下:（1）明确FBX08在结直肠癌侵袭和转移中的作用;（2）揭示FBX08通过泛素化降解mTOR参与结直肠癌侵袭和转移的新机制。本课题旨在阐述结直肠癌转移和侵袭的分子机制,为临床抗结直肠癌侵袭和转移提供一个新的基因靶点。研究方法1.FBX08对结直肠癌细胞生物学行为的影响（1）设计并构建FBX08慢病毒过表达载体,由公司进行慢病毒上清的包装,感染至结直肠癌细胞株HT29及SW480中,应用流式分选技术分选后构建稳定表达基因的细胞株,利用荧光定量PCR以及Western blot验证FBX08蛋白量的表达变化。（2）利用阳离子脂质体法,将3个商品化的FBX08SiRNAs片段瞬时转染至结直肠癌细胞株SW620中,利用荧光定量PCR及Western blot验证FBX08蛋白量的表达变化,得到Sil及Si3是有效率的干扰片段。设计并构建Si3的FBX08慢病毒干扰载体,由公司进行慢病毒上清的包装,感染至结直肠癌细胞株SW620中,应用流式分选技术分选后构建稳定表达的细胞株,利用荧光定量PCR及Western blot实验验证FBX08蛋白量的表达变化。（3）利用MTT比色法、平板克隆形成实验、细胞周期、体外侵袭实验、检测FBX08过表达和干扰后对体外结直肠癌细胞株增殖侵袭能力的影响。（4）利用整体可视化动物模型,观察FBX08过表达及干扰后对裸鼠皮下成瘤及尾静脉体内转移能力的影响。2.FBXO8在结直肠癌侵袭、转移中作用机制探讨（1）利用Western blot实验观察FBXO8对mTOR的泛素化降解。（2）利用激光共聚焦显微镜和CO-IP实验检测FBXO8与mTOR相互作用,以及构建截短子寻找两个蛋白的具体结合位点。（3）利用MTT比色法、体外侵袭实验探讨FBXO8通过泛素化mTOR调控结直肠癌的侵袭和转移。研究结果1.FBXO8对结直肠癌细胞生物学行为的影响1.1建立FBXO8过表达及干扰稳定细胞株（1）FBXO8稳定过表达后,利用荧光定量PCR检测FBXO8在2种结直肠癌细胞株HT29与SW480中的表达量变化,以各自细胞Mock组为对照（mean±SD:1±0.000）,独立样本T检验分析显示,FBXO8在2种细胞株中Mock组与过表达组间的表达具有显着差异。两两比较显示FBXO8在HT29与SW480细胞过表达组中的表达较高,且显着高于各组的Mock组细胞中的表达（P<0.001,P<0.001）。（2）FBXO8瞬时干扰后利用荧光定量PCR检测FBXO8在结直肠癌细胞株SW620中的表达量变化,以细胞NC组为对照（mean±SD:1±0.000）,单因素方差分析显示,FBXO8在细胞株NC组与干扰组1和干扰组3间表达具有显着差异（mean=0.141,mean=0.007）与干扰组2间表达没有显着差异（mean=0.73）,且有差异组中NC组显着高于干扰组1与干扰组3间细胞中的表达（F=10323.340,P<0.001）。选出干扰片段3稳定干扰后利用荧光定量PCR检测FBXO8在结直肠癌细胞株SW620中的表达,以细胞NC组为对照（mean±SD:1±0.000）,独立样本T检验分析显示,FBXO8在细胞株NC组与干扰组3间表达具有显着差异,且NC组显着高于干扰组3细胞中的表达（T=238.247,P<0.001）。（3）FBXO8过表达后利用Western blot检测FBX08在2种结直肠癌细胞株HT29与SW480中的蛋白表达量的变化,结果显示与mock组相比,FBX08在HT29与SW480细胞过表达组中的表达升高。（4）FBXO8瞬时干扰后,利用Western blot检测FBXO8在结直肠癌细胞株SW620中的蛋白表达量的变化,结果显示FBXO8在细胞NC组中的表达最高,在干扰组1与干扰组3中表达较低,NC组与干扰组2间表达没有显着差异。选出干扰片段3进行稳定干扰后结果显示与NC组相比,FBXO8在干扰片段3细胞组表达降低。1.2 FBXO8过表达后对结直肠癌细胞株体外生物学行为的影响（1）利用 MTT 比色法对 HT29/MOCK、HT29/FBXO8、SW480/MOCK、SW480/FBXO8肿瘤细胞的体外增殖能力变化进行检测,并且绘制生长曲线。析因方差分析结果显示:HT29细胞株生长时间水平差异无显着性（F=2490.517,P<0.001）,细胞增殖能力组间的差异具有显着性（F=4459.680P<0.001）;时间与组间的交互效应无显着性差异（F=525.859,P<0.001）;SW480细胞株生长时间水平差异无显着性（F=624.042,P<0.001）,细胞增殖能力组间的差异具有显着性（F=1173.557,P<0.001）,时间与组间的交互效应无显着性差异（F=131.971,P<0.001）。结果表明,与Mock组相比,FBXO8过表达组的增殖速度明显减慢。（2）利用平板克隆形成实验观察HT29/MOCK、HT29/FBXO8、SW480/MOCK、SW480/FBXO8细胞体外增殖能力的变化,独立样本T检验统计结果显示,HT29/MOCK、HT29/FBXO8 和 SW480/MOCK、SW480/FBXO8细胞株中2组细胞组间的克隆形成能力存在显着差异（T=7.379,P=0.002;T=30.765,P<0.001）。结果提示,与Mock组相比,FBXO8过表达组的增殖能力明显降低（P=0.002;P<0.001）。（3）利用Boyden侵袭小室观察FBXO8过表达处理后,HT29和SW480细胞株的体外侵袭能力变化。独立样本T检验分析结果显示,HT29/FBXO8和SW480/FBXO8组与HT29/MOCK、SW480/MOCK组间的细胞侵袭能力的差异具有显着性（T=11.515,P<0.001;T=18.627,P<0.001）。与 Mock 组相比,HT29/FBX08和SW480/FBXO8细胞穿过膜的细胞数目明显减少（P<0.001;P<0.001）,结果表明FBX08抑制肿瘤细胞的体外侵袭能力。1.3 FBXO8干扰后对结直肠癌细胞体外生物学行为的影响（1）采用MTT比色法检测SW620NC、SW620Sil、SW620Si3细胞的体外增殖能力变化进行检测,并绘制生长曲线。析因方差分析结果显示:SW620细胞株生长时间水平差异无显着性（F=1517.886362321,P<0.001）,细胞增殖能力组间差异具有显着性（F=268.6163860441 P<0.001）;时间与组间交互效应无显着性差异（F=1517.886362321,P<0.001）;结果提示,与NC组相比,FBX08干扰组的细胞增殖速度明显升高。（2）利用平板克隆形成实验观察SW620NC、SW620Sil、SW620Si3细胞体外增殖能力的变化,单因素方差分析统计结果显示,SW620NC与SW620Sil、SW620Si3间细胞的克隆形成能力存在显着差异（F=0.19,P=0.011;F=0.24,P=0.009）。结果表明,与NC组相比,FBX08干扰组的增殖能力明显升高。（3）利用细胞周期实验观察SW620NC、SW620Si3细胞周期的变化,两个独立样本T检验分析统计结果显示,SW620NC、SW620Si3组G1期存在显着差异（T=9.624,P=0.001）;S 期也在显着差异（T=-14.970,P<0.001）;G2 期存在显着差异（T=8.060,P=0.001）。结果表明,与SW620NC相比,SW620 Si3组的进入增殖期的细胞数量明显增加。（4）利用Boyden侵袭小室观察FBX08干扰处理后,SW620细胞株的体外侵袭能力变化。单因素方差分析结果显示,SW620NC、与SW620Si1、SW620Si3间的细胞侵袭能力的差异具有显着性（F=199.20,P<0.001;F=305.6,P<0.001）。与NC组相比,两个干扰组细胞的穿膜数目明显增加（P<0.001;P<0.001）,结果表明FBXO8过表达后癌细胞的体外侵袭能力增强。1.4 FBXO8过表达及干扰后对结直肠癌细胞体内生物学行为的影响SW480/MOCK、SW480/FBXO8 与 SW620NC、SW620Si3 4 株不同细胞株进行皮下成瘤和尾静脉注射体内转移实验,裸鼠皮下成瘤单个重复测量因素的方差分析结果显示:两种细胞的组内皮下成瘤能力都具有明显差异（F=9.552,P=0.01487710397974;F=28.525,P<0.001）。比较后发现,MOCK 组的皮下肿瘤生长速度明显快于FBX08过表达组,NC组皮下肿瘤生长速度明显慢于FBX08干扰组。裸鼠的尾静脉体内转移实验结果显示:两种细胞株均在肺脏表面可见明显的转移灶,SW480/MOCK组中裸鼠出现肺脏转移率为100%（6/6）;SW480/FBXO8组中裸鼠出现肺脏转移率为66.7%（4/6）;SW620NC组中裸鼠出现肺脏转移率为66.7%（4/6）;SW620Si3组中裸鼠出现肺脏转移率为100%（6/6）。以上结果显示:FBXO8抑制结直肠癌细胞株的体内成瘤及转移。2.FBXO8在结直肠癌侵袭、转移中作用机制探讨2.1 FBXO8对mTOR的泛素化降解（1）利用 Western blot 检测 SW480/MOCK、SW480/FBXO8 细胞中 Akt/mTOR信号通路及靶基因的表达变化,结果显示:与SW480/MOCK组相比,SW480/FBXO8组中Akt、p-Akt蛋白表达无明显变化,但mTOR、p-mTOR、P70S6K、P-P70S6K蛋白表达水平明显降低。（2）利用MG-132处理结直肠癌细胞株SW620及乳腺癌细胞株MCF-7,Western blot结果显示:MG132处理后,2种细胞株中mTOR、P-mTOR蛋白的表达上调。（3）利用MG-132处理结直肠癌细胞株SW480/FBXO8,Western blot结果显示:MG132处理后,细胞中mTOR、P-mTOR蛋白的表达上调。（4）FBXO8对mTOR的泛素化降解检测试验在进行中。2.2 FBXO8与mTOR的相互作用检测（1）利用激光共聚焦显微镜观察SW480/MOCK与SW480/FBXO8细胞中FBX08与mTOR共定位情况,结果显示:FBXO8与mTOR定位于癌细胞胞浆,且SW480/FBXO8组中FBX08与mTOR共定位处荧光明显强于SW480/MOCK。（2）利用 CO-IP 实验检测 SW480/MOCK 与 SW480/FBXO8 细胞中 FBX08与mTOR结合情况,结果显示:FBXO8与mTOR存在直接结合作用。（3）构建 FBXO8 的两段截短子 FBX-Sec7（1132-1700a）和 FBX-1（851-1247a）,利用CO-IP检测其与mTOR分子的结合,结果显示FBX-Sec7区域能与mTOR结合。（mTOR截短子部分实验正在进行中）2.3 FBXO8通过泛素化mTOR调控结直肠癌增殖和侵袭利用Rapa（雷帕霉素）处理结直肠癌细胞株SW620Si3,利用MTT比色法对SW620Si3细胞的体外增殖能力变化进行检测,Boyden侵袭小室观察SW620Si3细胞株的体外侵袭能力变化。结果显示:Rapa处理后SW620Si3细胞增殖速度明显下降;体外侵袭能力减弱。以上结果显示:FBXO8对结直肠癌侵袭和转移的抑制是通过泛素化降解mTOR作用的。结论1、FBXO8具有抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。2、提出一个新的调控机制,即FBXO8通过泛素化降解mTOR抑制结直肠癌侵袭和转移。
丁一[10]（2014）在《长链非编码RNA在脑胶质瘤中的功能研究》文中指出长链非编码RNA在多种疾病特别在恶性肿瘤中异常表达并在其肿瘤发生发展过程中起关键性作用,但在人类脑胶质瘤中鲜有文献报道。本研究致力于研究lncRNA在脑胶质瘤中可能产生的作用。项目组利用lncRNA表达谱芯片技术对三例胶质瘤组织进行检测,检测结果发现在肿瘤组织中,相对于瘤周组织平均4858条lncRNA发生显着改变,其中2845条lncRNA被检测出在肿瘤中上调（倍数改变>3.0）,2013条lncRNA发生明显下调（倍数改变e<1／3）。同时,平均4084条mRNA表达发生改变,2280条表达量上升（倍数改变>3.0）,1804表达量下降（倍数改变e<1／3）。随后,通过差异表达显着程度和lncRNA在组织中的基础表达量为标准选择了六条lncRNA （ak125809,ak098473, uc002ehu.1, bc043564, NR027322, uc003qmb.2）利用实时定量PCR在40例胶质瘤病人的肿瘤和瘤周组织中进行了验证,6条1ncRNA在肿瘤中有明显的表达差异,并与芯片结果一致。我们利用差异表达的lncRNA和mRNA建立了共表达网络,其中显示很多mRNA,如LOC729991、NUDCD1、SHC3、PDGFA、MDM2等以及lncRNA如 ENST00000425922、ENST00000455568、uc002ukz.1、ENST00000502715和 NR027873在胶质瘤形成中起到关键作用。在通路分析中,我们发现’’GLIOMA"信号通路具有很高的富集度,并且其中的关键基因如SHC3、PDGFA、MDM2等与lncRNA表达改变关系密切,并有作为相应lncRNA下游靶基因的潜力。本研究在全基因组范围内运用lncRNA芯片技术在胶质瘤中进行检测,并在大量病例样本中进行验证,通过建立lncRNA-mRNA共表达网络,以及通路分析等分析,进一步预测了lncRNA的靶基因。研究结果表明,有一系列lncRNA在胶质瘤组织中有显着的表达差异,如ak125809, ak098473, uc002ehu.1等在肿瘤中表达上调,bc043564, NR027322, uc003qmb.2等则在肿瘤中表达量有明显减少,而这种差异提示了lncRNA在肿瘤发生发展中起到关键的作用。’’GLIOMA"signal pathway可能是lncRNA参与调控胶质瘤发生发展的通路之一。近年大量的研究结果证实长链非编码RNA （lncRNAs）在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要的调控作用。报道称LncRNA SPRY4-IT1 （GenBank ID:AK024556）在黑色素瘤中高表达,并且与黑色素瘤细胞的迁移能力相关。本研究拟通过检测SPRY4-IT1在脑胶质瘤中的表达,研究SPRY4-IT1对脑胶质瘤细胞功能的影响,初步揭示SPRY4-IT1在脑胶质瘤中的作用及相关分子机制。收集40例脑胶质瘤手术标本（癌组织和癌旁组织）,荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测40例标本中S PRY4-IT1的表达,并分析其与临床病理资料的关系;qRT-PCR分别检测脑胶质瘤细胞U87, U251和瘤周组织中SPRY4-IT1的表达。构建质粒和慢病毒,建立过表达SPRY4-IT1的稳转细胞株,用CCK-8、流式细胞技术、细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞的增殖、凋亡和迁移能力。显微镜下观察SPRY4-IT1低表达和过表达前后细胞形态的变化；SPRY4-IT1在脑胶质瘤组织中的表达量（1.6±0.4）高于癌旁组织（0.9±0.7）,差异有统计学意义（P<0.05）, SPRY4-IT1在U87,U251细胞中表达明显升高（P<0.05）。成功构建SPRY4-IT1过表达稳转细胞株,划痕实验和Transwell实验证实SPRY4-IT1可促进脑胶质瘤细胞迁移。但CCK-8、流式细胞技术结果显示SPRY4-IT1对细胞增殖和凋亡无明显影响。相较瘤周细胞,SPRY4-IT1在脑胶质瘤细胞中高表达,并促进脑胶质瘤细胞的迁移,对细胞增殖和凋亡无明显影响。
二、南医大发现人类新基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、南医大发现人类新基因（论文提纲范文）
（1）非综合征型先天缺牙新致病基因的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 非综合征型先天缺牙家系病例调查和样本收集 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 非综合征型先天缺牙家系致病基因筛查和确定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 非综合征型先天缺牙家系致病基因突变位点功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 非综合征型先天缺牙家系致病基因在牙齿发育中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 成果 |
| 致谢 |
（2）鸡内源性反转录病毒ALVE1的天然免疫功能及分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 内源性反转录病毒研究进展 |
| 1.1 内源性反转录病毒概述 |
| 1.2 内源性反转录病毒作用机制 |
| 1.3 内源性反转录病毒的天然免疫功能 |
| 2 长链非编码RNA研究进展 |
| 2.1 长链非编码RNA概述 |
| 2.2 长链非编码RNA作用机制 |
| 2.3 长链非编码RNA的天然免疫功能 |
| 3 DNA甲基转移酶抑制剂研究进展 |
| 3.1 DNA甲基转移酶抑制剂概述 |
| 3.2 DNA甲基转移酶抑制剂对基因表达的影响 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒并抑制ALVJ感染 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞与病毒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 3.2 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞 |
| 3.3 共聚焦间接免疫荧光试验 |
| 3.4 总蛋白提取 |
| 3.5 Western blot |
| 3.6 总RNA提取 |
| 3.7 转录组测序 |
| 3.8 cDNA合成和qRT-PCR |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞浓度筛选 |
| 4.2 5-Aza-dC抑制J亚群禽白血病病毒增殖和入侵 |
| 4.3 RNA-Seq测序数据与质量评估 |
| 4.4 RNA-Seq结果验证 |
| 4.5 去甲基化试剂5-Aza-dC激活天然免疫相关基因表达 |
| 4.6 去甲基化试剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒表达 |
| 5 讨论 |
| 第三章 源于鸡内源性反转录病毒ALVE1的lnc-ALVE1-AS1的鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞与载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 总RNA提取及纯化 |
| 3.2 RACE快速扩增转录子两端序列 |
| 3.3 Northerblot试验 |
| 3.4 生物信息学分析 |
| 3.5 RNA FISH试验 |
| 3.6 转录子编码蛋白能力验证 |
| 3.7 细胞转染 |
| 3.8 Westernbolt |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 5'RACE和3'RACE鉴定转录子全长 |
| 4.2 Northern blot鉴定转录子 |
| 4.3 生物信息学预测转录子编码能力和二级结构 |
| 4.4 体外实验验证转录子编码能力 |
| 4.5 RNA FISH鉴定lnc-ALVE1-AS1亚细胞定位 |
| 5 讨论 |
| 第四章 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的天然免疫功能及分子机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞、载体与病毒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 qRT-PCR |
| 3.4 lnc-ALVE1-AS1 RNAi干扰试验 |
| 3.5 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) |
| 3.6 共聚焦免疫荧光 |
| 3.7 RNA Pulldown |
| 3.8 WesternBlot |
| 3.9 RNA FISH |
| 3.10 TLR3干扰试验 |
| 3.11 TLR3信号抑制试验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 lnc-ALVE1-AS1过表达重组质粒的构建 |
| 4.2 lnc-ALVE1-AS1激活I型干扰素信号转录因子表达 |
| 4.3 干扰lnc-ALVE1-AS1抑制干扰素刺激基因表达 |
| 4.4 lnc-ALVE1-AS1抑制禽白血病病毒ALVJ增殖 |
| 4.5 lnc-ALVE1-AS1影响胞内核酸识别因子的表达水平 |
| 4.6 TLR3是lnc-ALVE1-AS1发挥天然免疫抗病毒反应的核酸识别因子 |
| 5 讨论 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（3）整合分析基因组水平与转录组水平数据以鉴定女性骨密度潜在功能基因及致因位点（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 整合分析基因组水平与转录组水平数据以鉴定与女性骨密度相关的潜在功能基因 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 研究结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 结论 |
| 第二部分 女性骨密度潜在功能基因的致因位点的精细定位 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 研究结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 Gene-based分析结果 |
| 附录二 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）RPA1基因多态性在奥沙利铂治疗结直肠癌敏感性中的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 RPA1基因多态性在奥沙利铂治疗结直肠癌敏感性中的研究 |
| 前言 |
| 第一节 NER通路候选SNPs与结直肠癌化疗敏感性的研究 |
| 研究方法 |
| 1. 入组人群信息 |
| 2. NER通路候选基因筛选 |
| 3. NER通路SNPs筛选及基因分型 |
| 4. SNPs与奥沙利铂化疗敏感性及生存预后的关联性分析 |
| 5. 网站预测与RPA1结合的靶miRNA |
| 结果 |
| 1. 人群基本信息 |
| 2. NER通路候选基因筛选 |
| 3. NER通路SNPs筛选及基因分型 |
| 4. SNPs与奥沙利铂化疗敏感性及生存预后的关联性分析 |
| 5. 本课题通过网站预测 |
| 讨论 |
| 第二节 RPA1基因影响奥沙利铂化疗敏感性的研究 |
| 材料与方法 |
| 一、主要仪器设备及材料试剂 |
| 二、细胞株筛选 |
| 三、双荧光素酶报告基因实验 |
| 四、RPA1 siRNA干扰效果的检测 |
| 五、CCK-8测定细胞增殖能力 |
| 六、细胞周期实验 |
| 七、细胞凋亡实验 |
| 结果 |
| 1、rs5030740遗传变异影响基因调控和表达的作用研究 |
| 2、RPA1基因影响奥沙利铂化疗敏感性的研究 |
| 讨论 |
| 第二部分 中医中药治疗结直肠癌的展望 |
| 1. 病名与源流 |
| 2. 中医药治疗结直肠癌的研究现状 |
| 2.1 茶叶提取物EGCG抗肿瘤作用研究进展 |
| 2.2 姜黄提取物姜黄素抗肿瘤研究进展 |
| 2.3 虎杖提取物白藜芦醇抗肿瘤的研究进展 |
| 3. 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）新型肝靶向纳米多肽递送系统的构建及性能评价（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新型肝靶向纳米多肽递送系统的构建、鉴定及体外自组装 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 DBV递送系统的性能评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）胶质母细胞瘤中抑制EZH2的表达改善替莫唑胺化疗敏感性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 TMZ耐药的胶质母细胞瘤细胞中EZH2表达的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 抑制EZH2的表达对胶质母细胞瘤细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 抑制EZH2的表达对MDR,MRP and BCRP表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（7）乳腺癌基因表达谱数据的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乳腺癌发病率与危险因素 |
| 1.2 乳腺癌相关基因研究现状 |
| 1.3 基因研究在乳腺癌预防治疗的应用 |
| 1.4 问题的提出 |
| 第二章 乳腺癌表达谱数据相关系数性质的研究 |
| 2.1 基因芯片 |
| 2.1.1 基因芯片的原理 |
| 2.1.2 基因芯片的分类与应用 |
| 2.2 乳腺癌表达谱数据 |
| 2.2.1 数据集 |
| 2.2.2 GEO数据库 |
| 2.2.3 数据的预处理 |
| 2.3 微阵列数据的相关系数 |
| 2.3.1 相关系数的概念 |
| 2.3.2 微阵列数据的相关系数 |
| 2.4 FDR和相关系数 |
| 2.5 通路和相关系数 |
| 2.5.1 KEGG数据库简介 |
| 2.5.2 通路中的相关系数 |
| 2.5.3 聚类后的相关系数 |
| 2.6 数据扰动与相关系数 |
| 第三章 筛选差异表达基因的改进方法 |
| 3.1 重复率的计算 |
| 3.1.1 差异表达基因的重复率 |
| 3.1.2 功能富集通路的重复率 |
| 3.2 基于相关性的筛选差异表达基因的改进方法 |
| 3.3 重复的癌症相关基因评价改进方法 |
| 3.3.1 改进方法筛选的癌症相关基因 |
| 3.3.2 重复的癌症相关基因 |
| 3.4 重复功能通路评价改进方法 |
| 3.4.1 粘着斑通路 |
| 3.4.2 泛素介导的蛋白质降解通路 |
| 3.4.3 p53信号通路 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读研究生期间发表文章与参加项目 |
| 致谢 |
（8）长非编码RNA调控非小细胞肺癌、胃癌细胞侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 长非编码RNA BANCR调控EMT抑制NSCLC细胞侵袭转移的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分EZH2抑制长非编码RNA SPRY4‐IT1促进NSCLC细胞EMT调控细胞侵袭转移的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 长非编码RNA HOXA11‐AS调控KLF2、PRSS8影响胃癌细胞增殖和侵袭转移的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| （附录一）综述LncRNA在癌症中的研究进展 |
| 概述 |
| LncRNA:非编码RNA界的一颗新星 |
| 肿瘤中的LncRNAs |
| 肿瘤起始与进程中的lncRNAs |
| LncRNAs在肿瘤诊断和治疗中的作用 |
| LncRNA和肿瘤风险 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| （附录二） 缩略词 |
| （附录三） 实验试剂和实验仪器 |
| （附录四） 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）FBXO8通过泛素化mTOR参与结直肠癌侵袭和转移的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 FBXO8在结直肠癌侵袭和转移中的作用 |
| 第一节 FBXO8过表达、干扰稳定株的建立 |
| 1、材料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 第二节 FBXO8对结直肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 1、材料 |
| 2、试剂 |
| 3、方法 |
| 4、统计 |
| 5、结果 |
| 6、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 FBXO8通过泛素化降解MTOR参与结直肠癌侵袭和转移的机制 |
| 第一节 FBXO8对mTOR的泛素化降解 |
| 1、材料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 第二节 FBXO8与mTOR的相互作用检测 |
| 1、材料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 第三节 FBXO8通过泛素化降解mTOR调控结直肠癌增殖和侵袭 |
| 1、材料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 4、统计 |
| 5、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 英文缩写注解 |
| 攻读硕士学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）长链非编码RNA在脑胶质瘤中的功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分：异常表达的长链非编码RNA在脑胶质瘤发生发展中起关键作用 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：长链非编码RNA SPRY4-IT1在脑胶质瘤中的表达及对U87细胞功能的影响 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、南医大发现人类新基因（论文参考文献）
- [1]非综合征型先天缺牙新致病基因的鉴定及功能研究[D]. 彭玲. 南方医科大学, 2020(01)
- [2]鸡内源性反转录病毒ALVE1的天然免疫功能及分子机制[D]. 陈世豪. 扬州大学, 2018(05)
- [3]整合分析基因组水平与转录组水平数据以鉴定女性骨密度潜在功能基因及致因位点[D]. 陈远程. 南方医科大学, 2018(01)
- [4]RPA1基因多态性在奥沙利铂治疗结直肠癌敏感性中的研究[D]. 何蕾. 南京中医药大学, 2017(07)
- [5]新型肝靶向纳米多肽递送系统的构建及性能评价[D]. 许红攀. 南京医科大学, 2016(02)
- [6]胶质母细胞瘤中抑制EZH2的表达改善替莫唑胺化疗敏感性的研究[D]. 樊天禹. 南方医科大学, 2016(02)
- [7]乳腺癌基因表达谱数据的相关性研究[D]. 陈婉婷. 南京医科大学, 2015(01)
- [8]长非编码RNA调控非小细胞肺癌、胃癌细胞侵袭转移的机制研究[D]. 孙明. 南京医科大学, 2015(04)
- [9]FBXO8通过泛素化mTOR参与结直肠癌侵袭和转移的分子机制[D]. 王斐斐. 南方医科大学, 2014(05)
- [10]长链非编码RNA在脑胶质瘤中的功能研究[D]. 丁一. 南京医科大学, 2014(02)