一、锰对神经细胞超微结构的影响（论文文献综述）
刘宽[1]（2020）在《海藻糖对锰诱导的小鼠纹状体神经细胞线粒体损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理目的:锰（Manganese,Mn）是人体必需的微量元素,因为它可以维持正常的免疫功能,抗氧化防御,能量代谢,调节生殖,消化,骨骼生长,凝血和止血。除此之外,锰还是重要的职业毒物和环境污染物,慢性锰暴露可引起神经毒性,其特征是基底神经节锥体外系运动系统受损,表现为类帕金森样综合征,称为锰中毒。在世界范围内,锰中毒是由于环境暴露,特别是空气中的暴露。典型的空气接触途径有汽车尾气和职业接触（焊工、铁合金行业工人）。目前研究主要集中在以下几种机制:多巴胺耗竭、线粒体损伤,神经递质释放异常,氧化应激和自噬功能异常等等,但锰在细胞水平的稳态机制尚待阐明。在过去的几十年里,许多证据表明线粒体是锰诱导的细胞功能障碍最重要的位点之一。线粒体中锰的过量积累破坏了线粒体的稳态,损害了线粒体功能。线粒体是一种高度动态的双膜细胞器,作为细胞的“动力源泉”,主要以三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）的形式为细胞提供能量。神经元对能量的需求非常高,所以它们受到能量供应受损的强烈影响,导致神经元细胞坏死或凋亡性死亡。及时清除由锰引起的功能失调的线粒体对预防或减轻锰造成的神经毒性来说至关重要。海藻糖（Trehalose,Tre）是一种天然的双糖,存在于植物、细菌、酵母和真菌等多种生物体中,海藻糖在氧化损伤、脱水、温度变化等多种应激条件下对细胞具有保护作用。虽然已有多项研究报道海藻糖在体内和体外均可减轻神经细胞损伤,但关于海藻糖保护锰诱导的线粒体功能障碍的证据很少,这一信息对于更全面地评价锰诱导的神经毒性至关重要。本研究以成年C57小鼠为研究对象,建立锰中毒小鼠模型,以线粒体的损伤为立足点,通过分析线粒体损伤与线粒体自噬的关系,揭示海藻糖活化自噬减轻锰诱导线粒体损伤的具体分子机制,为锰致神经毒性机制的研究提供试验依据。研究方法:实验动物野生型小鼠C57/BL6是由实验动物中心提供的。动物室保持在温度为21-24℃,湿度为30-40%的饲养环境。动物可以自由饮食。领取动物后一周之内,按体重进行随机分组。分组情况如下:生理盐水对照组,50、100、200μmol/kg氯化锰染毒组,4%海藻糖对照组:提供4%（W/V）的海藻糖溶液作为饮用水;海藻糖干预的高剂量氯化锰染毒组:腹腔注射200μmol/kgMnCl2,分别提供2%（W/V）和4%（W/V）的海藻糖溶液作为饮用水,自由饮用,每组10只,雌雄各半。周一到周五染毒,连续6周后,进行相关指标检测。采用旷场试验和步态实验检测小鼠行为学改变,采用微波消解-原子吸收法检测纹状体锰含量,通过透射电镜进行线粒体超微结构观察,用流式细胞仪检测线粒体ROS、细胞ROS、细胞凋亡以及自噬发生情况,MDC染色观察自噬囊泡,JC-1染色检测线粒体膜电位,多功能酶标仪检测ATP水平,用邻位连接技术（Proximity ligation assay,PLA）和免疫共沉淀法（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测LC3与TOMM20之间的相互作用,用Western blot法检测Beclin1,LC3 II/I,p62,Bcl-2,Bax,PARP,Cyt C,PINK1,Parkin蛋白水平。结果:染锰6周会导致小鼠神经行为异常。旷场实验显示其平均速度和中心区域停留时间与对照组相比都明显下降;步态实验检测出200μmol/kg染锰组小鼠发生步态迟缓与步态稳定性下降,这些结果提示了小鼠亚急性锰暴露模型建立成功。染锰组小鼠纹状体锰含量均显着高于对照组,海藻糖对照组未见纹状体锰含量增多;与对照组相比,染锰组的ATP水平和线粒体膜电位均显着下降,电镜结果显示随着染锰剂量的增加,线粒体超微结构破坏;与对照组相比,线粒体ROS和细胞ROS形成显着增多,SOD活性与MDA水平均显着增加;与对照组相比,染锰组的神经细胞凋亡（流式细胞术检测凋亡水平升高,胞浆中的Bax/Bcl-2,PARP cleaved/Full和Cyt C蛋白表达增多）和自噬水平（流式细胞术检测自噬囊泡水平升高,胞浆中的Beclin1和LC3 II/I蛋白表达增多,p62蛋白表达下降,线粒体中的PINK1和Parkin蛋白表达增多）均显着升高;随着染锰剂量的增加,TOMM20与LC3相互作用位点增多,线粒体自噬增强。与200μmol/kg染锰组相比,海藻糖干预后可以缓解神经细胞凋亡,减轻氧化损伤和线粒体损伤,并进一步活化线粒体自噬。结论:锰可以诱导小鼠纹状体神经细胞线粒体损伤,海藻糖具有抗氧化和活化线粒体自噬的作用,从而减轻神经细胞线粒体损伤,缓解锰对神经细胞的毒性作用。
李佳铄[2]（2020）在《RNA去甲基化酶FTO在锰致海马学习记忆障碍中的作用》文中进行了进一步梳理目的:锰（manganese,Mn）是人体中必不可少的微量元素,但是在与Mn化合物长期紧密接触和缺乏保护的情况下,会导致锰中毒。锰中毒早期表现为头昏头痛,且伴有记忆力减退。过量Mn进入机体后,可以部分蓄积在学习记忆的重要器官海马中。干扰海马体内学习记忆信号通路,诱发学习记忆障碍。近年的研究发现,mRNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）甲基化修饰在神经系统中具有潜在的神经生物学功能。脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）作为m6A去甲基化酶,在小鼠海马依赖性记忆的形成中起重要作用。本研究旨在探究FTO在Mn致海马学习记忆障碍中发挥的作用,为深入研究Mn毒性的作用机制和防治策略提供实验依据。研究方法:选取清洁级成年野生型C57BL/6小鼠,雌雄各半,体重20±2 g。分2阶段进行,分为11组,每组10只,共110只。体内实验中采用脑立体定位法对C57BL/6小鼠海马进行了注射。注射MnCl2以构建染Mn模型,注射AAV5-FTO以构建FTO过表达模型。染毒后恢复1周,每周称量记录小鼠体重。进行小动物体成分分析、Morris水迷宫、T迷宫和八臂迷宫行为学实验。每组取4只小鼠,进行4%多聚甲醛灌流,2只包埋全脑,2只取海马体做透射电镜实验。每组取6只小鼠的全脑,分离双侧海马体,称量全脑和海马体的重量。取每只鼠单侧海马体,放入EP管中标记并冻存,用于提取蛋白。另一侧海马体,放入无酶的EP管中,加入RNAiso用于提取RNA。振动切片机切脑片,使用带有药物的人工脑脊液灌流对脑片进行染毒和干预。构建脑片染Mn模型和脑片MA2 FTO抑制模型。染毒并干预后,使用MED64系统对脑片进行电生理检测。使用SH-SY5Y细胞进行体外实验,MnCl2暴露24 h以建立细胞染Mn模型,MA2干预2 h以构建FTO抑制模型。染毒并干预后,CCK-8法检测细胞毒性,用倒置显微镜观察细胞形态,提取蛋白质和RNA进行检测。结果:行为学测试发现,Mn暴露可降低小鼠的空间记忆、交替记忆、工作记忆和参考记忆能力。称重后计算发现,Mn暴露不影响小鼠的全脑脏器系数和海马脏器系数。HE染色和尼氏染色后观察发现,Mn会损害小鼠的海马组织形态。透射电镜观察发现,Mn可造成海马超微结构损伤。MED64系统检测显示,海马的电生理情况受损。Western blotting和RT-PCR结果显示,Mn暴露可抑制FTO蛋白和mRNA表达。AAV-5干预过表达FTO,MA2干预抑制FTO功能,进一步证明FTO在Mn诱导的学习和记忆、小鼠海马形态损伤、SH-SY5Y细胞损伤和电生理损伤中起重要作用。结论:Mn可以导致小鼠学习记忆能力下降,损伤海马组织形态。Mn可以降低海马和SH-SY5Y细胞的FTO表达。Mn可以通过下调海马中的FTO表达导致学习和记忆障碍。
董理鑫[3]（2020）在《AMPK/ULK1轴调控线粒体自噬在PBDE-47神经毒性中的作用及褪黑素的干预效果研究》文中认为多溴联苯醚（polybrominated diphenyl ethers,PBDEs）是一类广泛使用的溴代阻燃剂,其产生的发育神经毒性备受人们关注,但具体机制尚未完全阐明。已有研究表明,PBDEs的神经毒性与线粒体损伤密切相关,而线粒体自噬在维持线粒体稳态过程中起着重要作用。线粒体自噬是细胞内清除受损或多余线粒体的过程,对细胞内线粒体质量控制至关重要。当线粒体受损时,线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）丢失,线粒体膜转运酶活性被抑制,线粒体外膜上PTEN诱导的蛋白激酶1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1）无法被正常转运至线粒体内膜完成降解,在线粒体外膜发生蓄积,进而募集胞质中Parkin至受损线粒体。Parkin是一种E3泛素连接酶,在PINK1作用下其酶活性被激活,通过泛素化线粒体外膜蛋白标记受损线粒体。自噬受体蛋白p62通过识别泛素化标记的线粒体,并与自噬体膜蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）结合,形成线粒体自噬体,随后与溶酶体融合,从而实现对线粒体的降解。线粒体自噬受到多种信号通路的调控,当体内单磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）/三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）比例升高时,单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）的苏氨酸172位点被磷酸化,AMPK被激活,活化的AMPK可直接磷酸化并激活自噬起始关键蛋白Unc样激酶1（Unc-like kinase1,ULK1）而诱导自噬的发生。但PBDEs是如何影响神经细胞线粒体自噬过程,以及相关的分子机制尚未见报道。此外,有证据显示褪黑素可通过调控自噬过程而起到神经保护作用。因此,本研究旨在探讨AMPK/ULK1轴调控线粒体自噬在2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenylether,PBDE-47）神经毒性中的作用,以及褪黑素能否通过调控AMPK/ULK1信号通路拮抗PBDE-47神经毒性,从而为进一步阐明PBDE-47神经毒性作用机制以及制定防治措施提供理论依据。第一部分AMPK/ULK1轴调控线粒体自噬在PBDE-47神经毒性中的作用目的:探讨AMPK/ULK1轴调控线粒体自噬在PBDE-47神经毒性中的作用,为进一步阐明PBDE-47神经毒性机制提供依据。方法:（1）体内实验。将48只新生Sprague-Dewley（SD）雄性大鼠按体重和窝别随机分为4组:对照组（玉米油溶剂）、1.0 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg PBDE-47处理组。在大鼠出生后第10天（postnatal day 10,PND 10;大脑发育突增期）进行单次PBDE-47灌胃染毒。将大鼠继续饲养至PND 60后,采用Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）实验检测大鼠的学习记忆能力;应用旷场实验（open field test,OFT）观察大鼠自主行为改变;利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）观察纹状体神经细胞超微结构变化;采用Western blot技术检测纹状体组织中凋亡关键蛋白剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP ribose polymerase,cleaved PARP）、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（active cysteine containing aspartate specific protease-3,active caspase-3）、线粒体数目标志蛋白细胞色素c氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV,COX IV）、线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin、自噬相关蛋白7（autophagy-related protein 7,ATG7）、LC3-Ⅱ、p62以及自噬上游AMPK/ULK1轴相关分子磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK,p-AMPK）和磷酸化ULK1（phosphorylated ULK1,p-ULK1）蛋白的水平。（2）体外实验。不同浓度PBDE-47（1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）处理PC12细胞24 h后,利用TEM观察细胞超微结构改变;采用流式细胞术检测MMP水平;利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）检测试剂盒检测ATP水平;采用Western blot技术检测COXⅣ、PINK1、Parkin、ATG7、LC3-II、p62蛋白以及p-AMPK、p-ULK1蛋白的水平。为明确线粒体自噬在PBDE-47致神经细胞毒性中的作用,采用Parkin过表达腺病毒（adenovirus expressing Parkin,Ad-Parkin）或空载腺病毒转染PC12细胞24 h,再用20μmol/L PBDE-47或二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）处理细胞24 h;并以ATG7为靶点,采用腺病毒过表达Atg7（Ad-Atg7）或小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）沉默Atg7（si RNA-Atg7）24 h后,再用PBDE-47或DMSO处理细胞24 h;为进一步揭示在PBDE-47致神经细胞损伤时AMPK/ULK1轴对线粒体自噬的调控作用,以AMPK为靶点,利用AMPK抑制剂Compound C或AMPK激动剂阿卡地新（acadesine,AICAR）预处理细胞2 h,再与PBDE-47或DMSO联合处理24 h。采用Western blot技术检测AMPK/ULK1轴、线粒体自噬和凋亡相关蛋白的水平;利用ATP检测试剂盒检测ATP水平;采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit 8,CCK8）检测细胞存活率。结果:（1）体内实验。MWM实验结果显示,与对照组相比,PBDE-47处理组大鼠到达平台的逃避潜伏期以及游泳路程明显增加,在目标象限的时间占比和距离占比显着减少,且大鼠穿越平台所在位置次数也显着降低（P<0.05）。OFT结果发现,PBDE-47处理组大鼠在中心区域的运动距离占比和运动时间占比与对照组相比明显减少（P<0.05）。TEM观察到与对照组相比,PBDE-47处理组神经细胞内自噬囊泡明显增多,线粒体结构损伤明显且数量减少。Western blot结果显示,与对照组相比,PBDE-47处理组cleaved PARP与active caspase-3蛋白表达水平明显增加,COXⅣ蛋白表达显着降低,此外PINK1、Parkin和ATG7蛋白表达也明显减少,而LC3-II与p62蛋白水平显着增多,p-AMPK与p-ULK1蛋白表达水平也明显增高（P<0.05）。（2）体外实验。TEM观察到PBDE-47处理组细胞内自噬囊泡数量增加,线粒体数量减少、结构受损。与对照组相比,PBDE-47处理组COXⅣ蛋白、MMP和ATP水平显着降低,PINK1、Parkin、ATG7蛋白表达明显减少,LC3-Ⅱ与p62蛋白水平明显增多,p-AMPK和p-ULK1蛋白表达水平也显着增高（P<0.05）。与PBDE-47处理组相比,PBDE-47+Ad-Parkin处理组PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ和p62蛋白水平升高、COXⅣ蛋白表达和ATP水平减少、cleaved PARP与active caspase-3蛋白表达增强、细胞存活率降低（P<0.05）;PBDE-47+Ad-ATG7处理组结果与此类似,但LC3-Ⅱ蛋白水平没有明显变化;与之相反,PBDE-47+si RNA-ATG7处理组ATG7、PINK1、Parkin和LC3-Ⅱ蛋白水平降低,但p62蛋白水平明显升高,COXⅣ蛋白表达和ATP水平显着增高、cleaved PARP与active caspase-3蛋白表达水平明显下降、细胞存活率升高（P<0.05）;PBDE-47+Compound C处理组p-AMPK、p-ULK1蛋白表达减少,PINK1、Parkin、ATG7、LC3-Ⅱ与p62蛋白水平明显增多,COXⅣ蛋白与ATP水平显着降低,cleaved PARP、active caspase-3蛋白表达和细胞死亡进一步增多（P<0.05）;PBDE-47+AICAR处理组p-AMPK、p-ULK1蛋白表达明显升高,ATG7、PINK1、Parkin、p62蛋白水平降低,COXⅣ蛋白与ATP水平明显增强,cleaved PARP、active caspase-3蛋白表达和细胞死亡显着减少（P<0.05）,但LC3-Ⅱ蛋白水平没有明显变化。结论:PBDE-47一方面抑制神经细胞中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬形成,另一方面也能阻碍自噬体的降解,引起线粒体清除障碍,从而导致线粒体损伤,并触发细胞凋亡,减少细胞存活;激活而非抑制AMPK/ULK1轴能显着缓解PBDE-47诱导的线粒体自噬障碍和细胞死亡。第二部分褪黑素调控AMPK/ULK1信号通路对PBDE-47神经毒性的干预效果目的:探讨褪黑素能否通过调控AMPK/ULK1信号通路拮抗PBDE-47神经毒性,从而为PBDE-47神经毒性的防治提供理论依据。方法:（1）体内试验。将48只新生SD雄性大鼠按体重和窝别随机分为4组:对照组、PBDE-47处理组、PBDE-47+褪黑素处理组和褪黑素处理组。在大鼠PND10进行单次20 mg/kg PBDE-47或玉米油灌胃处理。从大鼠PND 8至PND 60模型结束,每天19:0020:00腹腔注射10 mg/kg/day褪黑素或溶剂对照（0.9%生理盐水+2%乙醇）。采用MWM实验检测大鼠的学习记忆能力;应用OFT观察大鼠自主行为改变;利用TEM观察纹状体神经细胞超微结构变化;采用Western blot技术检测纹状体组织AMPK/ULK1轴、线粒体自噬和凋亡相关蛋白p-AMPK、p-ULK1、COX IV、PINK1、Parkin、ATG7、LC3、p62、cleaved PARP和active caspase-3的水平。（2）体外试验。将PC12细胞分成对照组、PBDE-47处理组、PBDE-47+褪黑素处理组和褪黑素处理组4组。先用25μmol/L褪黑素或DMSO预处理细胞2 h,再与PBDE-47或DMSO联合处理24 h后,采用Western blot技术检测AMPK/ULK1轴、线粒体自噬和凋亡相关蛋白的水平;利用ATP检测试剂盒检测ATP水平;采用CCK8检测细胞存活率。为进一步明确褪黑素能否通过调控AMPK/ULK1信号通路改善PBDE-47对神经细胞的毒性作用,采用褪黑素与AMPK抑制剂Compound C联合处理,将PC12细胞分为对照组、PBDE-47处理组、PBDE-47+褪黑素处理组和PBDE-47+褪黑素+Compound C处理组4组。先用褪黑素与Compound C预处理细胞2 h,再与PBDE-47共同处理24 h后,再检测上述指标。结果:（1）体内试验。MWM实验结果显示,与PBDE-47处理组相比,PBDE-47+褪黑素处理组大鼠在MWM实验中到达平台的逃避潜伏期明显减少,穿越平台所在位置次数显着增多。OFT结果发现,PBDE-47+褪黑素处理组大鼠在中心区域的运动比例相比PBDE-47处理组动物明显增多（P<0.05）。TEM观察到与PBDE-47处理组相比,褪黑素+PBDE-47处理组大鼠纹状体神经细胞中自噬囊泡减少,线粒体结构损伤减轻且数量增多。此外,与PBDE-47处理组相比,PBDE-47+褪黑素处理组纹状体组织COXⅣ、p-AMPK、p-ULK1、Parkin、ATG7蛋白表达增多,但LC3-II、p62、cleaved PARP与active caspase-3蛋白的水平减少（P<0.05）。（2）体外试验。与PBDE-47处理组相比,PBDE-47+褪黑素处理组p-AMPK、p-ULK1、COXⅣ、PINK1、Parkin、ATG7蛋白表达显着升高,ATP水平增加,但LC3-II、p62、cleaved PARP与active caspase-3蛋白的水平显着减少,细胞存活率明显升高;与PBDE-47+褪黑素处理组相比,PBDE-47+褪黑素+Compound C处理组p-AMPK、p-ULK1、COXⅣ、PINK1、Parkin、ATG7蛋白表达显着降低,ATP水平减少,但LC3-II、p62、cleaved PARP与active caspase-3蛋白水平显着升高,细胞存活率明显减低。结论:褪黑素可通过激活AMPK/ULK1轴缓解PBDE-47所致神经细胞线粒体自噬障碍,减轻自噬体蓄积,提升线粒体数量和功能,抑制细胞凋亡,促进细胞存活,从而在PBDE-47的神经毒性中发挥保护作用。褪黑素激活AMPK/ULK1轴可能作为PBDE-47神经发育毒性的潜在防治策略。
温平镜[4]（2019）在《PAS-Na对ERS-Txnip/Nlrp3炎症通路介导锰神经毒性的干预研究》文中研究表明目的锰（Mn）是人体必需微量元素,参与身体各种重要的生理过程。但长期过量锰暴露会引起锰中毒,损害椎体外系和学习记忆力。海马是主导学习记忆的主要脑区,也是锰中毒累及的主要脑区之一。据研究,锰暴露激活小鼠海马小胶质细胞,NOD样受体蛋白3（Nlrp3）炎性体表达增高,炎症反应增强。细胞内质网应激（ERS）可促进细胞氧化应激,进而诱导硫氧还蛋白互作蛋白（Txnip）高表达,并激活Nlrp3炎症小体。对氨基水杨酸钠（PAS-Na）属于非甾体抗炎药,具有抗炎、抗氧化作用,可抑制小胶质细胞的活化和炎症反应,且本团队此前研究发现PAS-Na治疗对锰中毒患者疗效较好。因此,本研究拟通过体内外实验探讨PAS-Na对ERS-Txnip/Nlrp3炎症小体信号通路介导锰神经毒性的干预作用机制。方法1体外研究:体外试验选大鼠小胶质细胞系-HAPI细胞为研究对象。（1）首先用噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度锰、PAS-Na暴露24h后的HAPI细胞存活率;（2）药物试验分组及处理如下:①锰损伤模型:分为对照、低、中、高锰组,分别给予0、50、100、200 μmol/L（μM）Mn暴露;②PAS-Na干预组:分为对照组、染锰组、低、中、高PAS-Na组（L-、M-、H-PAS-Na组）及PAS-Na组,分别给予完全培养基、Mn 200 μM、Mn 200 μM+PAS-Na 100、Mn 200μM+PAS-Na 200、Mn 200 μM+PAS-Na 400 μM及PAS-Na 400 μM;③牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA）抑制组:对照组、染锰组、二甲基亚砜组（DMSO组）、TUDCA组、TUDCA抑制组,分别给予完全培养基、Mn 200μM、DMSO、TUDCA 100 μM、TUDCA 100+Mn 200μM暴露;④白藜芦醇（Resveratrol）抑制组:对照组、染锰组、DMSO组、Resveratrol组、Resveratrol抑制组分别给予完全培养基、Mn 200μM、DMSO、Resveratrol 20 μM、Resveratrol 20+Mn 200 μM 暴露;（3）用活性氧族（ROS）试剂盒检测锰损伤模型组、PAS-Na干预组及TUDCA抑制组的ROS生成水平;（4）蛋白免疫印迹法（WB）检测淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2x蛋白（Bax）、Nlrp3、Caspase-1、Txnip、（肌醇酶-1）IRE1蛋白表达;（5）酶联免疫吸附试验（Elisa）检测丙二醛（MDA）、蛋白质羰基（PCO）、白细胞介素（IL）-18、IL-1β、Txnip;（6）实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测:Bcl-2、Bax、Nlrp3、Caspase-1、Txnip、IRE1、IL-18、IL-1β信使核糖核酸（mRNA）表达。2体内试验:（1）动物分组:①锰中毒模型:48只SD大鼠按体重随机分为对照组、低、中、高锰组,每组12只,锰（MnC12.4H20）剂量分别为5、10、20mg/kg,对照组腹腔注射等量生理盐水,1次/天×5天/周×8周;②PAS-Na治疗模型:72只SD大鼠按体重随机分为6组,每组12只,分别为对照组、染锰组、L-、M-、H-PAS-Na组及PAS-Na组。首先对照组和PAS-Na组均腹腔注射灭菌生理盐水,染锰组、L-、M-、H-PAS-Na组均腹腔注射Mn C12·4H20,剂量为20 mg/kg,1次/天×5天/周×8周。接着对照组和染锰组腹腔注射生理盐水,L-、M-、H-PAS-Na组及PAS-Na组分别背部皮下注射 PAS-Na 100、200、300、300 mg/kg,1 次/天 × 5 天/周 × 6 周。（2）观察指标:①每天观察动物症状、记录并称重;②学习记忆能力检测:每组选9只大鼠进行Morris水迷宫实验;③实验结束,收集血样,分离脑组织及其他脏器并称重计算脏器系数;④用石墨炉原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分别检测血锰和海马锰浓度。⑤透射电镜观察海马神经元超微结构改变;⑥免疫组化法检测Bax、Bcl-2阳性细胞表达。WB、PCR、Elisa检测指标与体外试验一致。结果1体外研究:（1）PAS-Na及锰对HAPI细胞存活率的影响:染锰200、300、400 μM使HAPI细胞存活率分别下降至86.6%、73.6%、57.4%（P<0.01或0.05）。100、200、300、400、600μM PAS-Na 暴露 24h 对 HAPI 细胞存活率无影响（P>0.05）。（2）PAS-Na对染锰HAPI细胞凋亡相关基因表达的影响:与对照组比较,高锰组Bax mRNA和蛋白表达升高（P<0.01）,中、高锰组Bcl-2 mRNA亦升高（P<0.05）。在PAS-Na干预试验中,染锰组Bax mRNA及蛋白表达均升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达均降低（P<0.01或0.05）;与染锰组比较,各浓度PAS-Na干预组Bax表达降低,Bcl-2表达升高,提示PAS-Na对Bax和Bcl-2基因的异常表达有拮抗作用（P<0.01或0.05）。（3）PAS-Na对染锰HAPI细胞炎症反应的影响:与对照组比较,染锰使Nlrp3 mRNA和蛋白、Caspase-1蛋白表达升高（P<0.01）。IL-18含量、IL-1β mRNA及含量亦升高（P<0.01 或0.05）。经PAS-Na干预后,Nlrp3 mRNA和蛋白、Caspase-1蛋白、IL-1β mRNA低于染锰组（P<0.01或0.05）。（4）PAS-Na对染锰HAPI细胞氧化应激的影响:HAPI细胞ROS水平随着染锰剂量增加而升高。高锰组MDA含量亦高于对照组（P<0.05）。染锰组ROS阳性细胞明显增多,L-、M-、H-PAS-Na干预均可拮抗这种效应。（5）PAS-Na对染锰HAPI细胞Txnip表达的影响:高锰组Txnip蛋白相对表达量和蛋白浓度升高（P<0.01或0.05）。L-、M-、H-PAS-Na组Txnip蛋白相对表量低于染锰组（P<0.01或0.05）。（6）PAS-Na对染锰HAPI细胞IRE1表达的干预作用:高锰组IRE1 mRNA和蛋白表达高于对照组（P<0.01）。H-PAS-Na治疗组IRE1 mRNA和蛋白表达低于染锰组（P<0.01）。（7）TUDCA对Txnip/Nlrp3信号通路的抑制作用:与染锰组比较,TUDCA抑制组ROS生成水平下降,IRE1 mRNA及蛋白、Txnip蛋白相对表达量和蛋白浓度、Caspase-1 mRNA、IL-1β mRNA及含量均有不同程度降低（P<0.01 或 0.05）。（8）Resveratrol对Txnip/Nlrp3信号通路的抑制作用:与染锰组比较,Resveratrol 抑制组 Txnip mRNA 及蛋白、Nlrp3 mRNA 及蛋白、Caspase-1 和IL-1β mRNA均有不同程度降低CP<0.01或0.05)。2.体内研究:（1）PAS-Na对染锰大鼠生长发育的影响:8周染锰大鼠出现腹泻、食欲不振、易激惹现象,大鼠体重随染锰剂量增加而减轻（P<0.05或0.01）,高锰组肝、肾系数明显高于对照组。经6周PAS-Na治疗后,大鼠中毒症状消失,各组大鼠体重及肝、肾系数亦未见明显差异。（2）PAS-Na对染锰大鼠血、海马锰含量的影响:8周染锰大鼠血锰浓度随染锰剂量增加而升高（P<0.01）。低、中、高染锰组海马锰浓度都高于对照组（P<0.01）。而L-、M-、H-PAS-Na组血、脑锰随PAS-Na治疗剂量增加而降低（P<0.01或0.05）。（3）PAS-Na对染锰大鼠学习记忆的影响:Morris水迷宫试验第三至第五天高锰组大鼠游泳路程和逃避潜伏期均大于对照组（P<0.01或0.05）。高锰组大鼠平台穿越次数显着下降（P<0.05）。经6周PAS-Na治疗后,各组动物游泳路程、逃避潜伏期均有所恢复,并接近至对照组水平,其平台穿越次数亦无差异。（4）PAS-Na对染锰大鼠海马损伤的干预作用:锰暴露使海马Bax阳性细胞增多,且BaxmRNA和蛋白表达亦升高（P<0.01或0.05）,高锰组Bcl-2 mRNA和蛋白表达低于对照组（P<0.01）,中、高锰组海马神经元均出现不同程度变性。经6周PAS-Na治疗后,染锰组仍见较多Bax阳性细胞,各PAS-Na治疗组只见少量Bax阳性细胞。染锰组Bax mRNA及蛋白表达均升高,Bcl-2蛋白表达降低（P<0.01或0.05）,PAS-Na治疗对染锰组Bax和Bcl-2异常表达有拮抗作用。染锰组神经元仍有轻微变性,PAS-Na治疗组海马神经元均恢复正常。（5）PAS-Na对染锰大鼠海马炎症反应的影响:高锰组Nlrp3 mRNA及蛋白表达高于对照组和低、中锰组（P<0.01）,中、高锰组Caspase-1 mRNA及蛋白表达升高（P<0.01或0.05）。中锰组IL-18 mRNA及含量和中、高锰组 IL-1β mRNA 高于对照组（P<0.01 或 0.05）。H-PAS-Na 组 Nlrp3 mRNA和Caspase-1蛋白表达低于染锰组,M-、H-PAS-Na组IL-18 mRNA及含量、IL-1β mRNA及含量亦下降（P<0.01）。（6）PAS-Na对染锰大鼠海马氧化应激的影响:与对照组比较,高锰组 MDA、PCO 均升高（P<0.01或 0.05）。H-PAS-Na 组 MDA 和 PCO 含量均低于染锰组（均P<0.05）。（7）PAS-Na对染锰大鼠海马Txnip表达的影响:高锰组Txnip蛋白相对表达量和蛋白含量高于对照组（P<0.01或0.05）。H-PAS-Na组Txnip mRNA和蛋白表达低于染锰组（均P<0.01）。（8）PAS-Na对染锰大鼠海马IRE1表达的影响:中、高锰组IRE1 mRNA和蛋白表达高于对照组（P<0.01或0.05）。H-PAS-Na组IRE1mRNA和蛋白表达低于染锰组（均P<0.01）。结论（1）染锰可影响大鼠生长发育,导致其体重减轻,肝、肾系数增高,PAS-Na对锰中毒大鼠生长发育有一定干预作用。（2）染锰使大鼠血、海马锰浓度升高,损害海马进而影响学习记忆能力。PAS-Na具有促排锰作用,可缓解海马损伤。（3）染锰可能诱导了 HAPI细胞和海马小胶质细胞ERS,引起细胞氧化损伤,激活Txnip/Nlrp3信号通路介导炎症反应,使神经细胞损伤。PAS-Na治疗可抑制ERS-Txnip/N1rp3炎症小体信号通路激活,使锰中毒炎症反应减轻。
李红威[5]（2019）在《甲醇致恒河猴认知障碍模型的建立与相关机制研究》文中进行了进一步梳理背景 认知障碍是脑疾病中诊治最困难的疾病之一,阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是老年人最常见的以认知功能障碍为主要表现的神经退行性疾病。近年来研究发现,长期暴露于浓度超标的甲醛环境,会损伤人的学习记忆、情感认知等功能,也有报道称AD病人和小鼠模型尿液和脑组织中内源性甲醛含量均升高。甲醇是一种毒性物质,有研究认为它在体内发挥毒性主要通过中间代谢产物甲醛,低浓度甲醇慢性喂养恒河猴,可以引起认知障碍和磷酸化tau蛋白的增多。但甲醇/内源性甲醛引起认知损伤的机制尚不确定,对于甲醇慢性暴露造成的机体损伤尚无研究全面阐述。本课题拟通过体外实验探讨甲醛对神经细胞的损伤作用,通过体内恒河猴实验建立认知障碍模型,并分析其机制及甲醇慢性暴露对机体的影响。方法 在体外细胞水平,将SH-SY5Y神经瘤细胞暴露于不同浓度的甲醛。采用细胞划痕实验、细胞活性实验检测细胞迁移、形态、活性和增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;透射电镜观察超微结构改变;多因子检测技术检测细胞上清炎性因子;Western Blotting检测细胞内磷酸化tau蛋白、Aβ及线粒体分裂相关蛋白的表达。在体内动物水平,将3-6岁、雄性恒河猴分为实验组和对照组,每组6只,实验组给予低浓度甲醇自由饮用,对照组给普通饮水。处理不同时间进行可变空间延迟反应任务、物体识别实验、取物实验以及Viewpoint等行为学检测;采集动物的脑脊液、血液、尿液、粪便,进行血常规、尿常规、血生化等检测,通过HPLC检测尿液中甲醛含量;甲醇处理3个月、9个月时取脑、肝、肾、胃肠等脏器进行病理学及分子生物学检测;多因子检测技术检测血清、脑脊液及脑组织的炎性细胞因子水平。最后,通过16S rRNA高通量测序技术比较不同组恒河猴肠道菌群丰度及构成的差异,通过LC-MS技术对恒河猴尿液代谢组学进行研究。结果 0.05 mM甲醛即可抑制细胞迁移,0.1 mM作用4小时即可降低细胞活性和增殖能力,与甲醛剂量和作用时间呈正相关;甲醛可以诱导神经细胞凋亡,增加线粒体分裂,使超微结构损伤,上调tau蛋白的磷酸化水平。长期饮用低浓度甲醇可以导致恒河猴认知功能障碍。在病理学方面,大脑轻度萎缩,Aβ阳性斑块增多,磷酸化tau蛋白表达量升高,神经突触显着丢失、神经元数量减少,伴胶质细胞增多,以上改变均与尿液甲醛水平呈正相关。甲醇/内源性甲醛可导致恒河猴肝脏、肾脏、及胃肠道慢性损伤;脑组织、肝脏线粒体超微结构受损明显;可上调自噬相关蛋白和线粒体裂解相关蛋白的表达;另外,甲醇/内源性甲醛可以破坏肠道菌群结构,诱发Firmicutes/Bacteroidetes 比例失衡及代谢紊乱。结论 本研究发现甲醛可以通过抑制迁移,降低生存活性,增加线粒体裂解,促进凋亡等多种途径对神经细胞造成损伤,显着上调神经细胞tau蛋白的磷酸化水平;内源性甲醛通过增强自噬和依赖线粒体的凋亡途径损伤神经系统;可以导致恒河猴认知障碍,具有Aβ阳性斑块和磷酸化tau蛋白增多、神经元减少、突触丢失、胶质细胞增生等AD样病理特征。甲醇/内源性甲醛对机体肝肾及胃肠道会产生慢性损伤,可破坏肠粘膜屏障结构,使肠道菌群失调;同时使恒河猴代谢紊乱,谷氨酸代谢通路异常可能参与了甲醇/内源性甲醛导致的认知障碍。
闫冬莹[6]（2019）在《锰诱导的α-synuclein蛋白寡聚体与自噬的相互作用对神经细胞损伤的分子机制研究》文中认为目的:锰（Manganese,Mn）作为人体必需微量元素之一,参与体内多种重要激酶的构成和生物反应,对维持中枢神经系统的正常功能十分重要。然而,长期慢性的Mn暴露可以引发神经系统损伤,神经行为发生异常改变,表现为类帕金森样综合征,即锰中毒。由于锰在工业生产中的广泛使用,职业性Mn暴露已成为引发神经退行性疾病的重要环境致病因素。关于Mn引起的神经毒作用机制研究有很多,包括线粒体损伤,内质网应激,氧化应激损伤,α-突触核蛋白（Alpha-synuclein,α-Syn）寡聚化,自噬功能异常等等。自噬作为机体的降解/再循环系统,参与维持体内蛋白质稳态,调节凋亡。目前有研究发现自噬功能异常与神经退行性变密切相关,因此,在锰诱导的神经毒性过程中,其诱导的α-Syn寡聚化与自噬功能异常之间存在着非常复杂的关系,亟待研究。自噬作为机体的保护性机制,受多种信号通路调节,如mTOR-ULK和Beclin1-PIK3C3。mTOR（Mammalian target of rapamycin）信号通路的抑制与自噬活化有关。Beclin1可以与胞浆内的高迁移率族蛋白1（High-mobility group box 1,HMGB1）蛋白相互作用参与调节自噬。有研究发现α-Syn过表达可以干扰HMGB1与Beclin1之间的相互作用。这些为研究Mn的神经毒作用机制提供新的思路。近年来柯诺辛碱B（Corynoxine B,Cory B）,又称异钩藤碱,是一种中草药提取物,被发现在多种细胞中具有神经保护性作用。而在Mn引起的神经毒性过程中,其作用以及具体机制均亟待阐明。本研究通过整体动物体内实验和体外细胞实验相结合的方法,全面阐述自噬和α-Syn在Mn诱导的神经毒性中的复杂联系。利用野生型C57小鼠(α-Syn+/+)和α-Syn基因敲除型小鼠(α-Syn-/-)建立Mn暴露动物模型,研究α-Syn蛋白在锰致细胞自噬信号分子变化中的作用;利用Rapamycin（Rap）和3-methyladenine（3-MA）自噬干预剂,建立Mn暴露野生型小鼠(α-Syn+/+)动物模型,研究自噬在Mn诱导的α-Syn寡聚化和神经毒性中的作用;利用人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）建立Mn暴露细胞模型,揭示胞浆中HMGB1在Mn诱导自噬活化中的作用以及阐明Cory B调节Mn诱导自噬失调的具体机制。此研究不仅为预防和治疗锰中毒及其他神经退行性疾病提供一定的实验和理论依据,而且在加强锰中毒早期防治和保护锰接触者健康方面有重要的现实意义,也为神经退行性疾病的治疗提供了另一种重要的研究思路。研究方法:1、整体动物体内实验研究α-Syn对锰诱导自噬和神经细胞损伤的影响:从美国Jackson Labs引进了α-Syn基因敲除的纯合子雄性小鼠（B6;129X-SncatmlRosl,stock#3692）,并与国内雌性小鼠（C57/Bl6J）建立了稳定的α-Syn基因敲除小鼠(α-Syn-/-)模型。同代随机选取24只雌雄各半野生型小鼠(α-Syn+/+)和24只雌雄各半α-Syn-/-小鼠进行以下实验。根据随机化原则将α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠分为对照组和低,中,高剂量染锰组,每组6只（雌性:雄性=1:1）,对照组的α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠腹腔注射生理盐水,低剂量染锰组的α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠腹腔注射50μmol/kg MnCl2,中剂量染锰组的α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠腹腔注射100μmol/kg MnCl2,高剂量染锰组的α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠腹腔注射200μmol/kg MnCl2,每周5次注射容量5 ml/kg,染毒6周,进行相关指标检测。采用旷场实验、强迫游泳实验、双足平衡实验以及爪抓力实验检测小鼠行为学改变,采用原子吸收分光光度火焰法测定纹状体Mn含量,流式细胞仪检测细胞凋亡以及自噬发生情况,透射电子显微镜技术观察神经细胞内自噬体的超微结构变化,激光共聚焦显微镜观察Lamp 2A和HSC70、Lamp 2A和α-Syn的共定位情况,免疫共沉淀检测Lamp 2A和HSC70、Lamp 2A和α-Syn蛋白间的相互作用,采用Real time PCR法检测Lamp 2A、HSC70和α-Syn mRNA水平,非变性Western blot方法检测α-Syn单体及寡聚体,Western blot法检测Lamp 2A、HSC70、Beclin1、LC3B、p62蛋白水平。2、整体动物体内实验研究自噬对锰诱导α-Syn寡聚化和神经细胞损伤的影响:由中国医科大学实验动物中心提供的36只雌雄各半野生型（C57/Bl6）小鼠进行以下实验。随机分为6组:对照组,高剂量染锰组,Rap对照组,Rap干预组,3-MA对照组,3-MA干预组,每组6只（雌性:雄性=1:1）。对照组腹腔注射生理盐水,高剂量染锰组腹腔注射200μmol/kg MnCl2,Rap对照组隔日1次皮下注射5 mg/kg Rap,2 h后再给予腹腔注射生理盐水,Rap预处理组隔日1次皮下注射5 mg/kg Rap,2 h后再给予腹腔注射200μmol/kg MnCl2,3-MA对照组隔日1次皮下注射5 mg/kg3-MA,2 h后再给予腹腔注射生理盐水,3-MA干预组隔日1次皮下注射5 mg/kg3-MA,2 h后再给予腹腔注射200μmol/kg MnCl2,每周5次,连续预处理与染毒6周,进行相关指标检测。采用旷场实验、强迫游泳实验、双足平衡实验以及爪抓力实验检测小鼠行为学改变,采用原子吸收分光光度火焰法测定纹状体Mn含量,流式细胞仪检测细胞凋亡以及自噬发生情况,采用Real time PCR法检测α-Syn mRNA水平,非变形Western blot方法检测α-Syn单体及寡聚体,Western blot法检测Beclin1、LC3B、p62蛋白水平。3、体外人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）培养研究Cory B缓解锰诱导SH-SY5Y细胞自噬功能异常和细胞损伤的潜在保护性分子机制:将细胞分别设立对照组（培养基）、不同剂量的染锰组（50、100、200μM）、Cory B阳性对照组以及不同剂量的Cory B干预组（25、50、100μM）。染毒24 h后,收集细胞进行相关指标的检测。采用商品化试剂盒检测LDH释放量和CCK-8水平,利用商品化试剂盒提取胞浆胞核蛋白,激光共聚焦显微镜观察HMGB1亚细胞定位以及HMGB1与Beclin1、HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2的共定位情况,免疫共沉淀技术检测胞浆内蛋白间相互作用（HMGB1-Beclin1、HMGB1-α-Syn、Beclin1-Bcl2）,Real time PCR检测HMGB1 mRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡和自噬发生水平,MDC染色观察自噬囊泡,Ad-mCherry-CFP-LC3B腺病毒转染观察自噬流,Western blot法检测胞浆胞核HMGB1、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3II/I、p62）、α-Syn、Bcl2、mTOR下游相关蛋白（mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、S6K1、p-S6K1）。结果:1、染锰6周可以引起α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠行为发生异常改变。与对照组比较,随着染毒剂量增加,总移动距离以及站立次数逐渐减少,悬浮时间、爪抓力逐渐增加,双足平衡越来越差。与染锰组α-Syn+/+小鼠比较,染锰组α-Syn-/-小鼠神经行为损伤更为严重;纹状体锰含量对染锰剂量增高而增多,凋亡和自噬水平（电镜观察自噬体形成增多、流式细胞术检测自噬囊泡水平升高）均高于对照组,且染锰组α-Syn-/-小鼠表现更为剧烈相比于α-Syn+/+小鼠;锰暴露上调α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠神经细胞内Lamp 2A、HSC70 mRNA和蛋白表达水平,以及增强二者的共定位和蛋白间相互作用,即活化分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophay,CMA）;在α-Syn+/+小鼠中,锰暴露使α-Syn mRNA和蛋白表达水平增加,使Lamp 2A与α-Syn之间的共定位和相互作用均增强;锰暴露使α-Syn-/-和α-Syn+/+小鼠神经细胞内Beclin1、LC3II/I蛋白表达增多,p62蛋白表达下降,与染锰组α-Syn+/+小鼠比较,α-Syn-/-小鼠LC3II/I蛋白表达显着增多。2、染锰6周后,200μmol/kg染锰组、Rap、3-MA干预组小鼠行为发生异常改变,与对照组比较,总移动距离和站立次数均明显下降,悬浮时间、爪抓力以及双后肢重力差值均显着增加,Rap、3-MA对照组未见明显改变;200μmol/kg染锰组、Rap、3-MA干预组小鼠纹状体锰含量均显着高于对照组,Rap、3-MA对照组未见纹状体锰含量增多;与对照组比较,200μmol/kg染锰组神经细胞凋亡和自噬水平（流式细胞术检测自噬囊泡水平升高、Beclin1和LC3II/I蛋白表达增多,p62蛋白表达下降）均显着升高,α-Syn mRNA和寡聚化水平均显着增加,Rap、3-MA对照组凋亡以及α-Syn mRNA和蛋白水平均未见明显改变,Rap对照组LC3II/I蛋白表达显着增多且伴有p62下降,3-MA对照组p62蛋白表达增多,流式细胞术分析自噬囊泡水平未见明显改变;与200μmol/kg染锰组比较,Rap干预后可以缓解凋亡,增强自噬,促进α-Syn单体和寡聚体蛋白水平降解。而3-MA干预后表现为凋亡加剧,抑制自噬,α-Syn寡聚体进一步蓄积。3、Mn诱导的α-Syn过表达影响SH-SY5Y胞浆内HMGB1调控的自噬活化,随着染锰剂量增加,HMGB1 mRNA水平上升且逐渐转位至胞浆内,胞浆HMGB1、α-Syn、Bcl2蛋白表达水平升高,胞浆内的HMGB1与Beclin1、HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2结合增多,自噬增强,凋亡加剧;与100μM染锰组比较,200μM染Mn组α-Syn蛋白表达显着增多,自噬减弱,胞浆内的HMGB1与Beclin1结合显着减少,而HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2结合显着增多。Cory B通过解离胞浆内的HMGB1与α-Syn的结合以及抑制mTOR信号通路来调节Mn诱导SH-SY5Y的自噬功能异常和神经毒性,与200μM染Mn组比较,100μM Cory B干预可以明显缓解Mn引起的细胞损伤以及凋亡情况,促进自噬,α-Syn、Bcl2蛋白表达水平未见改变,胞浆内的HMGB1与Beclin1结合显着增多,而HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2结合显着减少。此外,Cory B干预组可以进一步使p-mTOR/t-mTOR、p-4EBP1/t-4EBP1、p-S6K1/t-S6K1蛋白表达相对灰度值下降,有效抑制mTOR信号通路活化。结论:1、锰活化CMA与α-Syn无关,活化的CMA参与锰诱导的α-Syn过表达的降解。2、锰活化巨自噬,且α-Syn-/-小鼠自噬和凋亡更剧烈,行为损伤更明显。3、Rap活化自噬促进锰诱导的α-Syn寡聚体清除可以缓解锰引起的凋亡,3-MA则反之。4、Mn暴露使神经细胞内过多的α-Syn与HMGB1结合,干扰HMGB1蛋白的转位及与Beclin1的结合,影响Beclin1-Bcl-2复合物的解离,引起自噬功能异常和凋亡加重。5、Cory B通过减弱α-Syn与HMGB1蛋白相互作用以及有效抑制mTOR信号通路,缓解锰对神经细胞的毒性作用。
张坤[7]（2018）在《过量锰导致鸡脑组织和神经细胞凋亡的机理研究》文中认为锰（Manganese,Mn）是一种人和动物必需的微量元素,随着锰在工业和农业广泛使用,引起了锰污染。神经系统是过量锰作用的对象之一,锰污染能使工人出现精神疾病症状,影响儿童智力发育。畜禽误食过量锰会出现精神萎靡症状,甚至死亡,造成畜禽养殖损失。本试验旨在研究过量锰对鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡的影响,为鸡锰神经毒性提供基础数据,同时为诊断、治疗畜禽生产中动物锰中毒提供参考。本试验包括体内试验和体外试验。体内试验中,将240只1日龄海兰公鸡用标准日粮饲喂7天,然后随机分为对照组和3个处理组,对照组饲喂标准日粮（含锰127.88 mg/kg）,3个处理组在标准日粮中分别添加不同水平氯化锰,使日粮锰水平分别达到600、900和1800mg/kg。饲喂30、60和90天时采集鸡大脑、小脑、丘脑和脑干组织进行相关指标的检测。体外试验中,取6-8日龄鸡胚,分离出鸡胚神经细胞。试验分为一个对照组和6个锰处理组,对照组使用DMEM培养基培养,6个处理组在DMEM培养基添加不同浓度的氯化锰,使培养基中氯化锰的浓度分别达到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mM,培养12、24、36和48小时时,收集细胞,进行相关指标的检测。鸡饲养和采集样品时观察鸡临床症状和剖检症状,采用火焰原子吸收法和石墨炉原子吸收法分别检测鸡脑组织和血液锰含量,采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色法和醋酸铀和柠檬酸铅双染色法分别观察鸡脑组织显微和超微结构,采用细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）法和吖啶橙/溴化乙锭（Acridine orange/Ethidium bromide,AO/EB）双染色法分别检测鸡胚神经细胞活力和凋亡状态,采用试剂盒法检测鸡脑组织和鸡胚神经细胞超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）活性和一氧化氮（Nitric oxide,NO）含量和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）活性,采用实时定量PCR法（Real time quantitative PCR,qPCR）检测炎症因子核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、iNOS、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）和前列腺素E合成酶（prostaglandin E synthase,PTGEs）、细胞因子白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）、IL-7、IL-10、IL-17、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）和转化生长因子-β4（Transforming growth factor-β4,TGF-β4）、凋亡基因p53、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-加长（B-cell lymphoma-extra large,Bcl-x）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma2-associated X protein,Bax）、B细胞淋巴瘤2同源拮抗剂/杀手（B-cell lymphoma 2 homologous antagonist/killer,Bak）、fas和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和热休克蛋白（Heat Shock Protein,HSP）HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表达,采用蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测炎症因子NF-κB、iNOS和PTGEs,凋亡基因p53、Bcl-2、Bax和caspase-3和热休克蛋白HSP60、HSP70和HSP90蛋白表达。结果表明:（1）过量锰导致鸡脑组织和血液锰含量升高,且鸡脑组织锰具有时间和剂量效应,鸡血液锰具有剂量效应,过量锰导致鸡脑组织锰蓄积。（2）过量锰导致鸡脑组织炎症损伤,炎症损伤程度随着锰处理剂量和处理时间的增加而增加。过量锰诱导鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2和PTGEs mRNA表达以及NF-κB、iNOS和PTGEs蛋白表达,增加NO含量和iNOS活性,且鸡脑组织的以上指标具有时间和剂量效应量,鸡胚神经细胞炎症因子蛋白表达具有剂量效应和时间效应,鸡胚神经细胞炎症因子mRNA表达、NO含量和iNOS活性具有剂量效应。过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎性反应和炎性损伤。（3）过量锰从组织形态学角度导致了鸡脑组织凋亡,且随着锰处理剂量和处理时间的增加,鸡脑组织凋亡程度加剧。过量锰从细胞形态学角度导致鸡胚神经细胞凋亡,且细胞凋亡的数目随着剂量的增加而增加。过量锰诱导了鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡基因p53、Bax、Bak、fas和caspase-3 mRNA表达以及p53、Bax和caspase-3蛋白表达,抑制了Bcl-2和Bcl-x mRNA表达以及Bcl-2蛋白表达。鸡脑组织凋亡基因mRNA和蛋白表达以及鸡胚神经细胞凋亡基因蛋白表达具有剂量效应和时间效应,鸡胚神经细胞凋亡基因mRNA表达具有剂量效应。过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡。（4）过量锰降低了鸡脑组织和鸡胚神经细胞SOD和T-AOC活性,且鸡脑组织SOD和T-AOC活性具有剂量效应和时间效应,鸡胚神经细胞SOD和T-AOC活性具有剂量效应。过量锰导致了鸡脑组织和鸡胚神经细胞氧化应激。（5）过量锰诱导了鸡脑组织和鸡胚神经细胞细胞因子IL-7和IFN-γmRNA表达,抑制了细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和TGF-β4 mRNA表达,且鸡脑组织细胞因子mRNA表达具有剂量效应和时间效应,鸡胚神经细胞细胞因子mRNA表达具有剂量效应。过量锰引起了鸡脑组织和鸡胚神经细胞免疫反应。（6）过量锰诱导鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表达以及HSP60、HSP70和HSP90蛋白表达。鸡脑组织热休克蛋白mRNA和蛋白表达以及鸡胚神经细胞热休克蛋白蛋白表达具有剂量效应和时间效应,鸡胚神经细胞热休克蛋白mRNA表达具有剂量效应。热休克蛋白在过量锰诱导的鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡中发生保护性反应。（7）过量锰对大脑NF-κB和TNF-αmRNA表达,NF-κB、iNOS和PTGEs蛋白表达的影响最大,对丘脑Bcl-2、HSP60和HSP90蛋白表达的影响最大,对大脑和丘脑NF-κB、IL-4和IL-17 mRNA表达以及p53蛋白表达的影响最大。过量锰对大脑和丘脑的毒性大于小脑和脑干的毒性。过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡,氧化应激、炎性损伤、免疫反应和热休克蛋白参与了过量锰导致的鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡。
磨洁琳[8]（2018）在《程序性坏死参与锰致神经元死亡机制的研究》文中进行了进一步梳理锰是公认的急、慢性蓄积性神经毒素,锰中毒可产生类似于帕金森样中枢神经损伤的症状且脱毒后症状持续存在,原因在于锰在大脑聚积诱发特定区域的神经细胞死亡和功能丧失,进而使中枢神经发生退行性变。锰中毒诱发的神经细胞死亡方式包括凋亡、自噬及坏死三种形式,目前锰中毒的神经元死亡机制研究主要集中于神经元凋亡。近年的研究表明,细胞的坏死也具有细胞内特定的信号转导系统,与受体相互作用蛋白3（Receptor interacting protein 3,RIP3）密切相关,RIP3被认为是调节依赖于RIP1介导的细胞凋亡与坏死间发生转换的关键因子。这一RIP3和混合系列激酶样结构域蛋白(（Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL）的顺序激活诱导的可调控性细胞死亡称为程序性坏死（Necroptosis）。我们前期的实验证实锰中毒可诱发神经元的坏死,坏死细胞的超微结构表现为趋向于凋亡细胞的形态特征,提示锰中毒诱导的神经元坏死可能具有程序性坏死的调节机制,而锰诱导的细胞坏死是否与Necroptosis有关,目前尚无报道。本研究拟通过体内、外实验,运用细胞凋亡Caspase抑制剂zVAD-fmk和程序性坏死信号通路的特异性阻滞剂necrostatin-1（Nec-1）、RNA干扰等研究策略,探讨RIP3介导的程序性坏死信号通路在锰致神经元死亡中的作用。方法（一）zVAD-fmk、Nec-1对染锰SK-N-SH细胞的影响（1）以400 uM MnCL2.2H2O建立SK-N-SH细胞染锰模型,然后应用不同浓度zVAD-fmk、Nec-1进行干预。取对数生长期SK-N-SH细胞进行干预,分为Control group、400μmol/L Mn、0.5μmol/L zVAD-fmk、2μmol/L zVAD-fmk、60μmol/L Nec-1、120μmol/L Nec-1、Mn+0.5μmol/L zVAD-fmk、Mn+2μmol/L z VAD-fmk、Mn+60μmol/L Nec-1、Mn+120μmol/L Nec-1共10组,通过观察细胞形态、MTT法及流式细胞术观察染锰与药物干预对SK-N-SH细胞存活、凋亡及坏死的影响;（2）取对数生长期细胞分成5组,分别为Control group、200μmol/L Mn、400μmol/L Mn、400μmol/L Mn+0.5μmol/L zVAD-fmk、400μmol/L Mn+120μmol/L Nec-1,通过Western blot检测RIP3的蛋白表达量变化、DCFH-DA探针检测各组细胞ROS的生成情况。（二）慢病毒介导RIP3 RNAi对染锰SK-N-SH细胞的影响（1）构建慢病毒介导的RIP3 RNAi SK-N-SH细胞株;（2）降低（Knock down,KD）SK-N-SH细胞的RIP3基因表达后,进行染锰实验,并进行Nec-1干预。具体分组为:空白SK-N-SH细胞组（Control group）,SK-N-SH细胞染400μmol/L Mn组,RIP3 Scrambled细胞组（NC）,RIP3 RNAi细胞组,RIP3 RNAi细胞+Mn组,RIP3 RNAi细胞+Mn+120μmol/L Nec-1组。通过MTT法、流式细胞术检测RIP3表达降低后染锰及Nec-1干预对SK-N-SH细胞存活、凋亡及坏死的影响;Western blot检测各组RIP3和磷酸化MLKL的蛋白表达变化。（三）Nec-1对亚急性锰暴露大鼠黑质和海马的影响（1）Sprague Dawley（SD）大鼠60只分为对照组、Nec-1对照组、锰中毒组和Nec-1干预锰中毒组。所有动物均先通过手术作侧脑室埋管,然后通过腹腔注射锰溶液建立亚急性锰中毒模型（15 mg/kg,5天/w,共4w）,同时对药物干预组给予侧脑室内注射Nec-1（19.28 mmol/L,5μL/次,3次/w,共4w）,染锰及干预结束后拔除侧脑室置管,连续饲养动物两周;（2）大鼠经灌注固定后,免疫组织化学法观察黑质酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）阳性细胞和海马CA1区胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）阳性细胞表达的变化,透射电镜观察海马神经元细胞的超微结构变化;（3）大鼠经颈椎脱臼法处死动物,取黑质组织,PCR荧光定量法检测RIP3、Bcl-2、Caspase3、NOX2和NOX4基因的表达。结果（一）程序性坏死抑制剂Nec-1可减少染锰SK-N-SH细胞的死亡（1）与对照组相比较,人SK-N-SH细胞染锰24h后,细胞胞体皱缩变圆、突起回缩变短、胞浆内可见大量泡沬状改变;0.5μmol/L zVAD-fmk及Nec-1干预染锰细胞后,细胞密度较染锰组有所增高,胞体病理变化程度减轻,突起重新形成丰富网络,泡沬状改变的细胞减少。（2）细胞存活率随染锰浓度升高而降低;400μmol/L Mn组及Mn+2μmol/L zVAD-fmk组的细胞存活率较对照组低（P<0.05）,而0.5μmol/L zVAD-fmk及Nec-1干预后可提高染锰细胞存活率（P<0.05）。（3）与对照组比较,染锰细胞凋亡及坏死率均明显升高（P<0.05）;0.5μmol/L zVAD-fmk干预染锰细胞可降低细胞凋亡率（P<0.05）,但坏死率较对照组升高（P<0.05）;Nec-1干预可降低染锰细胞坏死率（P<0.05）,但凋亡率较对照组有所提升（P<0.05）。（4）与对照组比较,染锰组RIP3蛋白表达量上调,zVAD-fmk及Nec-1干预后RIP3蛋白表达稍降低,但与染锰组无显着性差异。（5）与对照组比较,染锰细胞强荧光细胞数目多（P<0.05）,说明ROS产生增多,zVAD-fmk干预组与染锰组无明显差异,而Nec-1干预组强荧光细胞数目减少（P<0.05）。（二）慢病毒介导RIP3 RNAi可降低染锰SK-N-SH细胞的死亡率（1）成功建立慢病毒介导的RIP3 RNAi SK-N-SH细胞株。（2）与染锰SK-N-SH细胞组比较,RIP3-KD SK-N-SH细胞染锰后细胞存活率升高（P<0.05）。染锰RIP3-KD细胞的坏死率较染锰SK-N-SH细胞组显着下降（P<0.05）,与nec-1干预染锰RIP3-KD细胞组无明显差异。（3）与对照组比较,SK-N-SH细胞染锰后RIP3蛋白表达及MLKL磷酸化水平升高（P<0.05）,而RIP3-KD细胞RIP3蛋白表达及MLKL磷酸化降低（P<0.05）,蛋白表达量在染锰前后无明显差异。（三）Nec-1可保护亚急性锰暴露大鼠神经元（1）与对照组比较,锰中毒组大鼠黑质TH阳性细胞数无明显下降,与其余各组比较无显着性差异;锰中毒组大鼠海马CA1区GFAP阳性细胞明显增多（P<0.05）;Nec-1可以减少锰中毒大鼠海马GFAP阳性细胞数,两组比较有统计学差异（P<0.05）。（2）与对照组比较,亚急性锰暴露组大鼠海马电镜下可观察到坏死神经元（胞体肿胀透亮,细胞器稀疏,胞核染色质浓聚、边集,核膜溶解）和凋亡神经元（胞体皱缩且电子密度增高,核膜不规则,核质浓缩边聚,胞质呈泡沫状改变）,线粒体嵴间隙变宽、崩解,神经突起水肿,突触间隙模糊。Nec-1干预可减轻细胞肿胀程度和神经突起水肿程度,坏死神经元胞内残存的细胞器增多,形态表现不典型,线粒体完整但嵴间隙稍有扩大。（3）与对照组比较,染锰大鼠Caspase-3基因呈高表达且Bcl-2基因表达显着降（P<0.05）,NOX4基因表达升高（P<0.05）;与染锰组比较,Nec-1干预组NOX4基因表达显着降低,组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论（1）程序性坏死参与了染锰的SK-N-SH细胞死亡;由RIP3介导的信号转导机制与染锰SK-N-SH细胞的程序性坏死有密切关系;（2）Nec-1的干扰能在一定程度上保护亚急性锰暴露的大鼠神经元,减少海马神经元的死亡,机制可能与其拮抗神经元程序性坏死的发生、抑制星形胶质细胞增生及降低中枢神经的炎症反应等机制有关。
朱轶豪[9]（2017）在《硒对铅引起鸡神经毒性的缓解作用》文中研究表明铅在生活和工业生产中广泛使用,是一种常见的环境污染物。铅对环境造成污染的同时对人和禽类的健康带来了不利的影响。铅通过污染空气、水和土壤经食物链等途径进入人和动物体内,蓄积在脑组织中,对神经系统造成损伤,神经系统是铅中毒的靶器官之一。硒是人和动物机体必需的微量元素,具有抗氧化、拮抗和减弱重金属毒性的作用。本研究旨在讨论硒对铅引起的鸡神经毒性的缓解作用,为更好地理解硒对鸡神经铅毒性的缓解作用提供基础数据,为丰富铅的毒理学和硒的保护机制提供参考。本试验通过体内鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织与体外鸡胚神经细胞两部分来研究硒对铅引起鸡神经毒性的缓解作用。体内试验中,将180只1日龄的海蓝蛋公鸡任其自由采食和饮水饲喂到第7天后,随机分为对照组、硒组、铅组和硒铅组,每组45只鸡。对照组饲喂标准商品日粮（含硒量为0.4mg/kg）和饮用水;硒组饲喂添加硒的标准商品日粮（含硒量为1mg/kg）和饮用水;铅组饲喂标准商品日粮和含醋酸铅饮用水（含铅量为350mg/L）;硒铅组饲喂添加硒的标准商品日粮（含硒量为1mg/kg）和含醋酸铅饮用水（含铅量为350mg/L）。分别于第30、60和90天每组随机抽取15只鸡进行安乐死,取出脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织进行各项试验检测。在体外试验,从6至9日龄的鸡胚中分离出鸡胚神经细胞,将鸡胚神经细胞分为对照组、硒组（硒浓度为10-7mol/L）、铅组（铅浓度为10-6mol/L）和硒铅组（硒浓度为10-7mol/L,铅浓度为10-6 mol/L）,培养12、24、36和48h后进行各项试验检测。我们检测了以下内容:大脑（白质）、小脑、丘脑和鸡胚神经细胞中抗氧化指标（SOD、GPx、GST、CAT、T-AOC和NOS活性、MDA、NO、H2O2和GSH含量）、鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑、脑干组织和鸡胚神经细胞中硒蛋白（GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Dio1、Dio2、Dio3、Sel T、Sel K、Sel S、Sel H、Sel M、Sel U、Sel I、Sel O、Selpb、Sepn1、Sepp1、Sepx1、Sepw1、Sep15和SPS2）、细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17和IFN-γ）、热休克蛋白（HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90）、细胞凋亡相关因子（Bcl-2、p53、Bax、Cyt c和Caspase-3）的mRNA表达、脑白质和胚神经细胞中细胞凋亡相关因子（Bcl-2、p53、Bax、Cyt c和Caspase-3）的蛋白表达、脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干的显微和超微结构和鸡胚神经细胞AO/EB染色,得出结论如下:（1）铅抑制了鸡脑组织和鸡胚神经细胞中SOD、GPx、GST、CAT、T-AOC和NOS的活性、诱导了MDA、H2O2和NO的含量、抑制了GSH的含量。大脑（白质）铅组中MDA含量随着时间的增加而增加,具有时间效应。硒缓解了铅引起的鸡脑组织和胚神经细胞中氧化应激指标的变化,铅中毒引起了氧化应激,硒缓解了铅中毒引起的氧化应激。（2）铅抑制了鸡脑组织和鸡胚神经细胞中硒蛋白GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Dio1、Dio2、Dio3、Sel T、Sel K、Sel S、Sel H、Sel M、Sel U、Sel I、Sel O、Selpb、Sepn1、Sepp1、Sepx1、Sepw1、Sep15和SPS2的m RNA表达。脑白质铅组中GPx4的m RNA表达、丘脑和脑干铅组中Txnrd3的mRNA表达、丘脑铅组中Sel U和Sel O的mRNA表达、小脑铅组中SPS2的m RNA表达和鸡胚神经细胞中Sel U的m RNA表达随着时间的增加而下降,具有时间效应。硒缓解了铅引起的鸡脑组织和胚神经细胞中上述25个硒蛋白的降低。（3）铅抑制了鸡脑组织和鸡胚神经细胞中IL-2和IFN-γ的m RNA表达,引起免疫抑制;诱导了IL-4、IL-6、IL-12β和IL-17的mRNA表达,诱导炎症反应。脑灰质铅组中IFN-γ的m RNA表达随着时间的增加而降低,脑干铅组中IL-4和IL-12β的mRNA表达随着时间的增加而增加,具有时间效应。硒缓解了铅引起的炎症相关因子的变化,铅中毒引起了免疫抑制和炎症反应,硒缓解了鸡脑组织和鸡胚神经细胞中免疫抑制和炎症反应。（4）铅诱导了鸡脑组织和鸡胚神经细胞中HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90的mRNA表达。脑灰质铅组中HSP40和HSP60的mRNA表达、脑干铅组中HSP70的m RNA表达随着时间的增加而增加,具有时间效应。硒缓解了铅诱导的鸡脑组织和鸡胚神经细胞中HSP的表达。（5）铅抑制了鸡脑组织和鸡胚神经细胞中Bcl-2的mRNA表达,脑白质和胚神经细胞中Bcl-2的蛋白表达,诱导了脑组织和胚神经细胞中p53、Bax、Cyt c和Caspase-3的m RNA表达,脑白质和胚神经细胞中p53、Bax、Cyt c和Caspase-3的蛋白表达。小脑铅组中Bax和Cyt c的m RNA表达、脑干铅组中Caspase-3的m RNA表达随着时间的增加而增加,具有时间效应。硒缓解了细胞凋亡相关因子Bcl-2、p53、Bax、Cyt c和Caspase-3的m RNA和蛋白表达,缓解了鸡脑组织和胚神经细胞的细胞凋亡。（6）铅引起了鸡脑组织炎性细胞浸润和细胞凋亡,诱导鸡胚神经细胞发生凋亡。硒缓解了铅引起的鸡脑组织炎性细胞浸润,缓解了鸡脑组织和胚神经细胞凋亡。铅诱导鸡神经组织发生氧化应激、引起炎症反应和脑组织损伤,诱导发生细胞凋亡,铅诱导了鸡的神经毒性,硒对铅引起的鸡神经毒性具有缓解作用。
吴松林,郭松超,秦绚,陈维平,邝晓聪[10]（2012）在《牛磺酸对锰染毒大鼠纹状体神经组织细胞损伤影响》文中指出目的探讨不同剂量牛磺酸对锰染毒大鼠纹状体神经组织细胞损伤的影响。方法 SD健康雄性大鼠162只,随机分为对照组,10、15、20 mg/kg 3个剂量的染锰组和9个牛磺酸干预组,每组12只大鼠,余6只用于对照组、染锰组、牛磺酸干预组作电镜观察。干预12周后,开颅分离出大鼠纹状体,分别进行Tunel染色、透射电镜观察、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）水平测定。结果染锰组和牛磺酸干预组纹状体细胞凋亡指数均高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;150、200 mg/kg牛磺酸干预对10、15、20 mg/kg染锰组大鼠纹状体细胞凋亡指数有降低作用,差异有统计学意义（P<0.05）;大鼠纹状体透射电镜观察可见,15 mg/kg染锰组部分神经细胞出现核固缩等细胞凋亡的特征性改变,200 mg/kg牛磺酸干预可减轻其细胞凋亡程度;染锰组大鼠纹状体DA、5-HT水平均低于对照组（P<0.05）,150、200mg/kg牛磺酸对10 mg/kg染锰组大鼠纹状体DA和5-HT水平增加效果显着（P<0.05）。结论锰可致大鼠纹状体神经组织细胞出现程度不同的细胞凋亡,降低纹状体中DA和5-HT的水平。牛磺酸在一定程度上对锰诱导的大鼠纹状体神经组织细胞凋亡及DA和5-HT的减少有保护作用。
二、锰对神经细胞超微结构的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、锰对神经细胞超微结构的影响（论文提纲范文）
（1）海藻糖对锰诱导的小鼠纹状体神经细胞线粒体损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 测定指标及方法 |
| 2.3.1 旷场实验 |
| 2.3.2 步态实验 |
| 2.3.3 脑锰含量测定 |
| 2.3.4 神经细胞凋亡率检测 |
| 2.3.5 ATP水平检测 |
| 2.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 2.3.7 透射电镜观察线粒体超微结构 |
| 2.3.8 细胞ROS检测 |
| 2.3.9 线粒体ROS检测 |
| 2.3.10 自噬囊泡检测 |
| 2.3.11 氧化损伤检测 |
| 2.3.12 检测纹状体内Bax,Bcl-2,Cyt C,Parkin,Beclin1,LC3,p62,β-actin蛋白和线粒体蛋白PARP,PINK1和COXIV的蛋白表达水平 |
| 2.3.13 邻位连接技术检测TOMM20和LC3蛋白共定位情况 |
| 2.3.14 免疫共沉淀法检测TOMM20和LC3之间的蛋白相互作用 |
| 2.3.15 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 锰暴露和海藻糖干预对小鼠体重与血糖值的影响 |
| 3.2 锰暴露导致小鼠行为学异常改变 |
| 3.2.1 旷场实验结果 |
| 3.2.2 步态实验结果 |
| 3.3 纹状体部位锰含量 |
| 3.4 海藻糖对锰诱导的神经细胞凋亡率的影响 |
| 3.4.1 流式细胞术检测各组小鼠的神经细胞凋亡率 |
| 3.4.2 小鼠纹状体Bax,Bcl-2,Cyt C,PARP的表达水平 |
| 3.5 海藻糖对锰诱导的氧化应激的影响 |
| 3.5.1 细胞ROS水平和线粒体ROS水平 |
| 3.5.2 SOD活性和MDA水平 |
| 3.6 海藻糖对锰诱导的线粒体损伤的影响 |
| 3.6.1 海藻糖对锰暴露小鼠纹状体神经细胞ATP水平的影响 |
| 3.6.2 海藻糖对锰暴露小鼠纹状体线粒体膜电位的影响 |
| 3.6.3 透射电镜下线粒体的病理学改变 |
| 3.7 海藻糖和锰对小鼠纹状体神经细胞自噬的影响 |
| 3.7.1 透射电镜观察纹状体神经元自噬囊泡形成 |
| 3.7.2 流式细胞术检测小鼠纹状体神经元自噬囊泡形成 |
| 3.7.3 海藻糖对锰诱导自噬相关蛋白表达的影响 |
| 3.8 海藻糖对线粒体自噬的影响 |
| 3.8.1 小鼠纹状体部位线粒体蛋白PINK1,Parkin的表达水平 |
| 3.8.2 邻位连接技术检测TOMM20与LC3蛋白相互作用 |
| 3.8.3 免疫共沉淀法检测TOMM20与LC3蛋白相互作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 实践报告 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）RNA去甲基化酶FTO在锰致海马学习记忆障碍中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 海马脑片 |
| 2.2.3 SH-SY5Y细胞系 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 腺病毒相关载体构建 |
| 2.3.2 脑立体定位法进行染毒和干预 |
| 2.3.3 小动物体成分分析并排除脂肪干扰 |
| 2.3.4 Morris水迷宫检测小鼠空间记忆能力 |
| 2.3.5 T迷宫检测小鼠交替记忆能力 |
| 2.3.6 八臂迷宫检测小鼠工作记忆和参考记忆能力 |
| 2.3.7 全脑系数和海马系数的检测 |
| 2.3.8 全脑石蜡包埋 |
| 2.3.9 HE染色法观察海马组织形态 |
| 2.3.10 尼氏染色法观察海马组织形态 |
| 2.3.11 透射电镜观察海马组织超微结构 |
| 2.3.12 平面微电极阵列MED64系统检测海马脑片电生理 |
| 2.3.13 Western blotting检测蛋白表达水平 |
| 2.3.14 CCK-8检测细胞活力 |
| 2.3.15 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 2.3.16 RT-PCR检测m RNA表达水平 |
| 2.3.17 数据处理和统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Mn暴露可降低小鼠的学习和记忆能力 |
| 3.1.1 Mn暴露前后小鼠的体重和身体组成成分 |
| 3.1.2 Mn暴露组小鼠行为学测试 |
| 3.2 Mn暴露可引起小鼠海马体损伤 |
| 3.2.1 Mn暴露组小鼠全脑和海马体的脏器系数 |
| 3.2.2 HE染色法观察Mn暴露组小鼠海马体的病理变化 |
| 3.2.3 尼氏染色法观察Mn暴露组小鼠海马体的病理变化 |
| 3.2.4 透射电镜观察Mn暴露组小鼠海马神经元的超微结构变化 |
| 3.2.5 MED64系统检测Mn暴露组小鼠海马脑片电生理功能 |
| 3.3 Mn暴露可引起SH-SY5Y细胞损伤 |
| 3.3.1 CCK-8法确定Mn暴露的剂量和时间 |
| 3.3.2 Mn暴露对细胞形态的影响 |
| 3.4 FTO在Mn诱导的学习和记忆功能障碍中的作用 |
| 3.4.1 Mn暴露组细胞和海马的FTO表达 |
| 3.4.2 CCK-8法确定细胞干预的剂量和时间 |
| 3.4.3 FTO抑制组细胞的细胞形态 |
| 3.4.4 FTO抑制组细胞的FTO表达 |
| 3.4.5 FTO抑制组海马脑片的电生理 |
| 3.4.6 FTO过表达组小鼠海马FTO表达水平 |
| 3.4.7 FTO过表达前后小鼠的体重和身体组成成分 |
| 3.4.8 FTO过表达组小鼠行为学测试 |
| 3.4.9 FTO过表达组小鼠海马的脏器系数 |
| 3.4.10 FTO过表达组小鼠海马的形态 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 实践报告 |
| 讨论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）AMPK/ULK1轴调控线粒体自噬在PBDE-47神经毒性中的作用及褪黑素的干预效果研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 AMPK/ULK1 轴调控线粒体自噬在PBDE-47 神经毒性中的作用 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 褪黑素调控AMPK/ULK1 信号通路对PBDE-47 神经毒性的干预效果 |
| 前言 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体自噬在细胞生理及病理进程中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 博士研究生期间工作小结 |
| 致谢 |
（4）PAS-Na对ERS-Txnip/Nlrp3炎症通路介导锰神经毒性的干预研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PAS-Na对ERS-Txnip/Nlrp3炎症通路介导锰神经毒性的体外干预研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 细胞药物处理染毒 |
| 2.3 荧光定量PCR |
| 2.4 Western Blot实验 |
| 2.5 Elisa实验 |
| 2.6 细胞ROS检测 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同浓度锰、PAS-Na暴露对HAPI细胞存活率的影响 |
| 3.2 PAS-Na对染锰HAPI细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 3.3 PAS-Na对染锰HAPI细胞炎症因子释放的影响 |
| 3.4 PAS-Na对染锰HAPI细胞炎症小体表达的影响 |
| 3.5 PAS-Na对染锰HAPI细胞氧化损伤的影响 |
| 3.6 PAS-Na对染锰HAPI细胞IRE1表达的影响 |
| 3.7 TUDCA对染锰HAPI细胞Txnip/Nlrp3信号通路的影响 |
| 3.8 Resveratrol对染锰HAPI细胞Txnip/Nlrp3信号通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PAS-Na对ERS-Txnip/Nlrp3炎症通路介导锰神经毒性的体内干预研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物饲养 |
| 2.2 大鼠学习记忆能力测试 |
| 2.3 大鼠样本的采集与处理 |
| 2.4 大鼠海马超微结构观察 |
| 2.5 免疫组化 |
| 2.6 相关元素含量测定 |
| 2.7 荧光定量PCR |
| 2.8 Western Blot实验 |
| 2.9 Elisa实验 |
| 2.10 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 染锰对大鼠生长发育的影响及PAS-Na的干预作用 |
| 3.2 染锰对大鼠血、脑锰的影响及PAS-Na的干预作用 |
| 3.3 PAS-Na对染锰大鼠学习记忆的影响 |
| 3.4 PAS-Na对染锰大鼠海马损伤的影响 |
| 3.5 PAS-Na对染锰大鼠海马炎症因子表达的影响 |
| 3.6 PAS-Na对染锰大鼠海马炎症小体表达的影响 |
| 3.7 PAS-Na对染锰大鼠海马氧化损伤的影响 |
| 3.8 PAS-Na对染锰大鼠海马Txnip表达的影响 |
| 3.9 PAS-Na对染锰大鼠海马IRE1表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
（5）甲醇致恒河猴认知障碍模型的建立与相关机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 甲醛对SH-SY5Y细胞的损伤作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞系来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备和耗材 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞实验分组与处理 |
| 2.3 细胞划痕实验 |
| 2.4 细胞活性检测实验 |
| 2.5 细胞凋亡检测 |
| 2.6 细胞炎性因子检测 |
| 2.7 透射电镜观察细胞超微结构 |
| 2.8 免疫印迹法检测相关蛋白表达情况 |
| 3. 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 甲醛对SH-SY5Y细胞迁移能力的影响 |
| 2. 甲醛对SH-SY5Y细胞活性的影响 |
| 3. 甲醛促进SH-SY5Y细胞凋亡 |
| 4. 甲醛对SH-SY5Y细胞炎性因子的影响 |
| 5. 甲醛促进SH-SY5Y细胞超微结构的损伤 |
| 6. 甲醛上调SH-SY5Y细胞磷酸化tau蛋白及线粒体裂解相关蛋白 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 甲醇致恒河猴认知障碍模型的建立与相关机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要抗体 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 主要耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 恒河猴分组与处理 |
| 2.2 行为学训练及实验 |
| 2.3 恒河猴标本采集(血液、脑脊液、尿液及粪便) |
| 2.4 尿液甲醛含量检测 |
| 2.5 病理学方法检测 |
| 2.6 炎性多因子检测 |
| 2.7 免疫印迹法检测脑组织蛋白表达 |
| 2.8 恒河猴肠道微生物菌群检测 |
| 2.9 恒河猴尿液代谢组学检测 |
| 3. 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 行为学结果 |
| 1.1 VSDRT检测到恒河猴记忆能力下降 |
| 1.2 空间识别转换任务结果 |
| 1.3 ORT实验检测到恒河猴认知能力下降 |
| 1.4 OR实验检测到恒河猴认知能力下降 |
| 1.5 Viewpoint测试检测到恒河猴运动量的增加 |
| 1.6 Viewpoint测试未检测到恒河猴睡眠障碍 |
| 2. 病理学检测结果 |
| 3. 尿液甲醛含量检测结果 |
| 4. 炎性多因子检测结果 |
| 5. 血常规及生化、便常规及镜检检测结果 |
| 6. 免疫印迹检测结果 |
| 7. 恒河猴肠道微生物菌群检测结果 |
| 7.1 物种相对丰度分析 |
| 7.2 组间差异物种分析 |
| 7.3 组间肠道菌群差异分析(T-test检验法) |
| 8. 恒河猴尿液代谢组学检测结果 |
| 8.1 恒河猴尿液差异代谢物分析 |
| 8.2 恒河猴尿液差异代谢物KEGG通路分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）锰诱导的α-synuclein蛋白寡聚体与自噬的相互作用对神经细胞损伤的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:α-Syn蛋白对锰诱导小鼠神经细胞自噬的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 测定指标及方法 |
| 2.3.1 基因型鉴定 |
| 2.3.2 神经行为学测试 |
| 2.3.3 纹状体锰含量测定 |
| 2.3.4 脑内Lamp2A、HSC70和α-Syn mRNA相对表达水平检测 |
| 2.3.5 检测纹状体内Lamp2A、HSC70、Beclin1、LC3B、p62和α-Syn蛋白寡聚体的表达水平 |
| 2.3.6 检测纹状体细胞凋亡和自噬发生水平 |
| 2.3.7 激光共聚焦观察Lamp2A与 HSC70、α-Syn蛋白共定位情况 |
| 2.3.8 免疫共沉淀技术分析Lamp2A与 HSC70、α-Syn蛋白间的相互作用 |
| 2.3.9 透射电镜观察自噬体的形成 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 锰暴露引起α-Syn~(+/+)和α-Syn~(-/-)小鼠的异常行为学改变 |
| 3.1.1 Open field实验结果 |
| 3.1.2 强迫游泳、爪抓力以及双足平衡实验结果 |
| 3.2 α-Syn对脑锰含量及神经细胞损伤的影响 |
| 3.2.1 纹状体锰含量情况 |
| 3.2.2 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠神经细胞凋亡的影响 |
| 3.3 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠神经细胞自噬的影响 |
| 3.4 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠自噬CMA途径的影响 |
| 3.4.1 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠Lamp2A和 HSC70 mRNA及蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠Lamp2A和 HSC70共定位以及相互作用的影响 |
| 3.4.3 CMA途径可能参与锰诱导的α-Syn过表达的降解 |
| 3.5 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠巨自噬的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:自噬对锰诱导小鼠神经细胞α-Syn蛋白寡聚化的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 测定指标及方法 |
| 2.3.1 神经行为学测试 |
| 2.3.2 纹状体锰含量测定 |
| 2.3.3 检测纹状体细胞凋亡和自噬发生水平 |
| 2.3.4 纹状体α-Syn mRNA相对表达水平检测 |
| 2.3.5 检测纹状体内Beclin1、LC3B、p62和α-Syn蛋白寡聚体的表达水平 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 锰暴露对小鼠神经行为的影响 |
| 3.1.1 Open field实验结果 |
| 3.1.2 强迫游泳、爪抓力以及双足平衡实验结果 |
| 3.2 Rap和3-MA对锰神经毒性的影响 |
| 3.2.1 Rap和3-MA对纹状体锰含量的影响 |
| 3.2.2 Rap和3-MA对锰诱导神经细胞凋亡的影响 |
| 3.3 Rap和3-MA对锰诱导自噬的影响 |
| 3.3.1 Rap和3-MA对锰诱导自噬水平的影响 |
| 3.3.2 Rap和3-MA对锰诱导自噬相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 Rap和3-MA对锰诱导α-Syn寡聚化的影响 |
| 3.4.1 Rap和3-MA对锰诱导α-Syn mRNA转录水平的影响 |
| 3.4.2 Rap和3-MA对锰诱导α-Syn蛋白表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:柯诺辛碱B缓解锰诱导的α-Syn干扰自噬活化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 SH-SY5Y细胞培养、传代和处理 |
| 2.3 测定指标及方法 |
| 2.3.1 细胞活力和毒性分析 |
| 2.3.2 Western blot检测相关蛋白表达水平 |
| 2.3.3 细胞凋亡检测 |
| 2.3.4 细胞自噬水平分析 |
| 2.3.5 激光共聚焦观察HMGB1与α-Syn、HMGB1与Beclin1、Beclin1 与Bcl2 的共定位以及HMGB1 的亚细胞定位情况 |
| 2.3.6 免疫共沉淀分析胞浆内HMGB1与α-Syn、HMGB1与Beclin1、Beclin1与Bcl2 蛋白间相互作用 |
| 2.3.7 Real-time PCR检测HMGB1 mRNA水平 |
| 2.3.8 Ad-mCherry-CFP-LC3B腺病毒检测自噬流变化 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 锰的细胞毒性分析 |
| 3.2 锰暴露诱导HMGB1 发生胞浆转位 |
| 3.3 锰暴露对HMGB1与Beclin1 蛋白相互作用的影响 |
| 3.4 锰对SH-SY5Y细胞自噬的影响 |
| 3.5 锰诱导α-Syn过表达干扰HMGB1与Beclin1、Beclin1与Bcl2 的结合 |
| 3.5.1 锰诱导α-Syn、Bcl2 蛋白表达增多 |
| 3.5.2 锰诱导SH-SY5Y细胞胞浆中α-Syn与 HMGB1 结合增多 |
| 3.5.3 锰暴露引起Beclin1与Bcl2 结合增多 |
| 3.6 Cory B可以缓解锰引起的神经细胞损伤和自噬功能障碍 |
| 3.6.1 Cory B缓解锰引起的细胞损伤 |
| 3.6.2 Cory B缓解锰引起自噬功能异常 |
| 3.7 Cory B可以解离α-Syn与 HMGB1 的结合,增强HMGB1与Beclin1,减弱Beclin1与Bcl2 的结合 |
| 3.7.1 Cory B对 α-Syn、Bcl2 表达的影响 |
| 3.7.2 Cory B减弱锰诱导的α-Syn与 HMGB1 结合增多 |
| 3.7.3 Cory B改善锰诱导HMGB1与Beclin1 结合减少 |
| 3.7.4 Cory B减弱锰诱导的Beclin1与Bcl2 结合增多 |
| 3.8 Cory B可以调控mTOR信号通路,影响自噬 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）过量锰导致鸡脑组织和神经细胞凋亡的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 锰与畜牧生产 |
| 1.2 锰污染 |
| 1.3 过量锰对神经系统的危害 |
| 1.4 过量锰能导致氧化应激 |
| 1.5 过量锰能导致炎症反应 |
| 1.6 过量重金属能导致免疫反应 |
| 1.7 过量锰能导致细胞凋亡 |
| 1.8 过量锰能增加热休克蛋白表达 |
| 1.9 研究目的,意义及创新点 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 标准日粮组成、试验动物模型和动物管理方案 |
| 2.3.1 标准日粮组成 |
| 2.3.2 试验动物模型 |
| 2.3.3 动物管理方案 |
| 2.4 鸡脑组织样品的采集与处理 |
| 2.5 鸡临床症状与剖检观察 |
| 2.6 鸡脑组织和血液锰含量检测 |
| 2.7 鸡脑组织显微结构的观察 |
| 2.8 鸡脑组织超微结构的观察 |
| 2.9 体外试验模型 |
| 2.10 鸡胚神经细胞活力检测 |
| 2.11 鸡胚神经细胞凋亡检测 |
| 2.12 鸡脑组织和鸡胚神经细胞试剂盒检测 |
| 2.13 鸡脑组织和鸡胚神经细胞基因mRNA表达检测 |
| 2.13.1 引物设计与合成 |
| 2.13.2 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.13.3 实时定量PCR |
| 2.14 鸡脑组织和鸡胚神经细胞基因蛋白表达检测 |
| 2.15 试验数据的分析与统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡临床症状与剖检观察 |
| 3.2 鸡脑组织和血液锰含量 |
| 3.3 鸡脑组织形态学观察 |
| 3.3.1 鸡脑组织显微结构观察 |
| 3.3.2 鸡脑组织超微结构观察 |
| 3.4 鸡胚神经细胞细胞活力 |
| 3.5 鸡胚神经细胞凋亡观察 |
| 3.6 鸡脑组织和鸡胚神经细胞试剂盒 |
| 3.6.1 鸡脑组织和鸡胚神经细胞SOD活性 |
| 3.6.2 鸡脑组织和鸡胚神经细胞T-AOC活性 |
| 3.6.3 鸡脑组织和鸡胚神经细胞NO含量 |
| 3.6.4 鸡脑组织和鸡胚神经细胞iNOS活性 |
| 3.7 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子、细胞因子、凋亡基因和热休克蛋白mRNA表达 |
| 3.7.1 基因qPCR检测方法的鉴定 |
| 3.7.2 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子(NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2和PTGEs)mRNA表达 |
| 3.7.3 鸡脑组织和鸡胚神经细胞细胞因子(IL-4、IL-7、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β4)mRNA表达 |
| 3.7.4 鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡基因(p53、Bcl-2、Bcl-x、Bax、Bak、fas和caspase-3)mRNA表达 |
| 3.7.5 鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白(HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90)mRNA表达 |
| 3.8 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子、凋亡基因和热休克蛋白蛋白表达 |
| 3.8.1 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子(NF-κB、iNOS和PTGEs)蛋白表达 |
| 3.8.2 鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡基因(p53、Bcl-2、Bax和caspase-3)蛋白表达.. |
| 3.8.3 鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白(HSP60、HSP70和HSP90)蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞氧化应激 |
| 4.2 过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎性损伤 |
| 4.3 过量锰引起鸡脑组织和鸡胚神经细胞免疫反应 |
| 4.4 过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡 |
| 4.5 过量锰增加鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白表达 |
| 4.6 过量锰对鸡大脑、小脑、丘脑和脑干毒性的差异 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）程序性坏死参与锰致神经元死亡机制的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 程序性坏死参与了染锰SK-N-SH细胞死亡 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验步骤 |
| 2.1 MTT法检测染锰SK-N-SH细胞存活率 |
| 2.2 MTT法检测zVAD-fmk、Nec-1干预染锰SK-N-SH细胞的存活率 |
| 2.3 流式细胞术检测zVAD-fmk、Nec-1干预后染锰SK-N-SH细胞凋亡及坏死 |
| 2.4 Westernblot法检测zVAD-fmk、Nec-1干预染锰SK-N-SH细胞的RIP3蛋白表达量 |
| 2.5 SK-N-SH细胞内ROS测定 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SK-N-SH细胞存活率随着染锰浓度增高而降低 |
| 3.2 程序性坏死抑制剂Nec-1可升高染锰SK-N-SH细胞存活率 |
| 3.3 zVAD-fmk、Nec-1对染锰SK-N-SH细胞凋亡和坏死的影响 |
| 3.4 zVAD-fmk及Nec-1对染锰SK-N-SH细胞的RIP3蛋白表达量的影响 |
| 3.5 zVAD-fmk、nec-1对染锰SK-N-SH细胞内平均活性氧水平(ROS)的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 染锰SK-N-SH细胞的程序性坏死由RIP3介导 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 DNA模版、引物及质粒载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 实验方法及步骤 |
| 2.1 人慢病毒RIP3RNAi载体的构建和鉴定 |
| 2.2 慢病毒颗粒的制备 |
| 2.3 SK-N-SH细胞转染效率评价 |
| 2.4 SK-N-SH细胞最小致死浓度筛选 |
| 2.5 RIP3-shRNA慢病毒转染SK-N-SH细胞 |
| 2.6 MTT法检测染锰后RIP3-RNAiSK-N-SH细胞存活率 |
| 2.8 WB检测染锰后各组RIP3蛋白表达量和MLKL磷酸化水平变化 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LV-RIP3-shRNA载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒的测序鉴定结果 |
| 3.3 SK-N-SH细胞病毒转染效率评价结果 |
| 3.4 SK-N-SH细胞最小致死浓度筛选结果 |
| 3.5 不同RIP3-shRNA病毒转染SK-N-SH细胞效率 |
| 3.6 RNA提取质量检测 |
| 3.7 RT-PCR检测不同shRNA序列干扰细胞RIP3mRNA表达量结果 |
| 3.8 WesternBlot检测不同shRNA序列干扰细胞RIP3蛋白表达量结果 |
| 3.9 染锰对RIP3-RNAiSK-N-SH细胞存活率的影响 |
| 3.10 流式细胞术检测染锰对RIP3-RNAiSK-N-SH细胞死亡的影响.. |
| 3.11 锰暴露对RIP3-KD细胞RIP3蛋白表达量及MLKL磷酸化水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Nec-1对于亚急性锰暴露所诱导的大鼠神经元死亡的保护作用. |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物及饲养条件 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法及步骤 |
| 2.1 实验动物侧脑室埋管及分组 |
| 2.2 动物染锰及侧脑室注射给药 |
| 2.3 大鼠体重和一般情况记录 |
| 2.4 免疫组织化学法检测脑黑质TH阳性细胞及海马GFAP阳性细胞 |
| 2.5 透射电镜超薄切片制作及观察 |
| 2.6 PCR荧光定量法检测RIP3、Bcl2、Caspase3、NOX2、NOX4基因的表达 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nec-1对亚急性锰暴露大鼠黑质核团TH阳性细胞的影响 |
| 3.2 Nec-1对亚急性锰暴露大鼠黑质核团凋亡及坏死相关基因表达的影响 |
| 3.3 Nec-1对亚急性锰暴露大鼠海马CA1区GFAP阳性细胞的影响 |
| 3.4 Nec-1干预对亚急性锰暴露大鼠海马超微结构的影响 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录I 英文缩略词表 |
| 综述：锰的神经毒性与可调控性细胞死亡 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表(或待发表)的文章 |
（9）硒对铅引起鸡神经毒性的缓解作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 铅污染 |
| 1.1.1 铅污染对人和野生鸟类的影响 |
| 1.1.2 鸡饲料、鸡及其食品铅污染 |
| 1.2 铅中毒对神经系统的影响 |
| 1.3 重金属对氧化应激、硒蛋白、热休克蛋白、细胞因子和细胞凋亡的影响 |
| 1.3.1 重金属对氧化应激的影响 |
| 1.3.2 重金属对硒蛋白的影响 |
| 1.3.3 重金属对细胞因子的影响 |
| 1.3.4 重金属对热休克蛋白的影响 |
| 1.3.5 重金属对细胞凋亡的影响 |
| 1.4 硒对重金属引起的氧化应激、硒蛋白、热休克蛋白、细胞因子和细胞凋亡因子改变的缓解作用 |
| 1.4.1 硒对重金属引起氧化应激的缓解作用 |
| 1.4.2 硒通过硒蛋白缓解重金属的毒性作用 |
| 1.4.3 硒对重金属引起细胞因子改变的缓解作用 |
| 1.4.4 硒对重金属引起热休克蛋白改变的缓解作用 |
| 1.4.5 硒对重金属引起细胞凋亡的缓解作用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 动物模型的建立 |
| 2.2.1 体内动物模型 |
| 2.2.2 体外动物模型 |
| 2.3 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干和鸡胚神经细胞样品的采集与处理 |
| 2.3.1 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织的采集与处理 |
| 2.3.2 鸡胚神经细胞的采集与处理 |
| 2.4 铅致鸡胚神经细胞半数抑制浓度（IC50）的检测 |
| 2.5 抗氧化指标的检测 |
| 2.6 荧光定量PCR的检测 |
| 2.6.1 引物合成 |
| 2.6.2 总RNA提取 |
| 2.6.3 反转录 |
| 2.6.4 PCR扩增 |
| 2.7 蛋白免疫印迹的检测 |
| 2.8 形态学的检测 |
| 2.8.1 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织显微结构的检测 |
| 2.8.2 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织超微结构的检测 |
| 2.8.3 鸡胚神经细胞AO/EB的检测 |
| 2.9 试验数据的分析和统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 铅致鸡胚神经细胞半数抑制浓度（IC50）的测定结果 |
| 3.2 鸡大脑（白质）、小脑、丘脑和鸡胚神经细胞抗氧化功能的结果与分析 |
| 3.2.1 SOD活性的结果与分析 |
| 3.2.2 GPx活性的结果与分析 |
| 3.2.3 GST活性的结果与分析 |
| 3.2.4 CAT活性的结果与分析 |
| 3.2.5 T-AOC活性的结果与分析 |
| 3.2.6 NOS活性的结果与分析 |
| 3.2.7 MDA含量的结果与分析 |
| 3.2.8 NO含量的结果与分析 |
| 3.2.9 H_2O_2含量的结果与分析 |
| 3.2.10 GSH含量的结果与分析 |
| 3.3 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑、脑干和神经细胞硒蛋白中硒蛋白的结果与分析 |
| 3.3.1 GPx1、GPx2、GPx3和GPx4的mRNA表达结果与分析 |
| 3.3.2 Txnrd1、Txnrd2和Txnrd3的mRNA表达结果与分析 |
| 3.3.3 Dio1、Dio2和Dio3的mRNA表达结果与分析 |
| 3.3.4 SelT、SelK、SelS、SelH、SelM、SelU、SelI、SelO、Selpb、Selpn1、Sepp1、Sepx1、Sepw1、Sep15和SPS2的mRNA表达结果与分析 |
| 3.4 脑白质、脑灰质、小脑、丘脑、脑干和鸡胚神经细胞中细胞因子的结果与分析 |
| 3.4.1 IL-2 的mRNA表达结果与分析 |
| 3.4.2 IL-4 的mRNA表达结果与分析 |
| 3.4.3 IL-6 的mRNA表达结果与分析 |
| 3.4.4 IL-12β的mRNA表达结果与分析 |
| 3.4.5 IL-17的mRNA表达结果与分析 |
| 3.4.6 IFN-γ的mRNA表达结果与分析 |
| 3.5 脑白质、脑灰质、小脑、丘脑、脑干和鸡胚神经细胞中热休克蛋白的结果与分析 |
| 3.5.1 HSP27的mRNA表达结果与分析 |
| 3.5.2 HSP40的mRNA表达结果与分析 |
| 3.5.3 HSP60的mRNA表达结果与分析 |
| 3.5.4 HSP70的mRNA表达结果与分析 |
| 3.5.5 HSP90的mRNA表达结果与分析 |
| 3.6 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑、脑干和鸡胚神经细胞中细胞凋亡相关基因结果与分析 |
| 3.6.1Bcl-2的mRNA表达结果与分析 |
| 3.6.2 脑白质和胚神经细胞中Bcl-2的蛋白表达结果与分析 |
| 3.6.3 p53的mRNA表达结果与分析 |
| 3.6.4 脑白质和胚神经细胞中p53的蛋白表达结果与分析 |
| 3.6.5 Bax的mRNA表达结果与分析 |
| 3.6.6 脑白质和胚神经细胞中Bax的蛋白表达结果与分析 |
| 3.6.7 Cyt c的mRNA表达结果与分析 |
| 3.6.8 脑白质和胚神经细胞中Cyt c的蛋白表达结果与分析 |
| 3.6.9 Caspase-3的mRNA表达结果与分析 |
| 3.6.10 脑白质和胚神经细胞中Caspase-3的蛋白表达结果与分析 |
| 3.7 形态学观察结果与分析 |
| 3.7.1 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织的显微结构观察结果与分析 |
| 3.7.2 鸡脑白质、脑灰质、小脑、丘脑和脑干组织的超微结构观察结果与分析 |
| 3.7.3 鸡胚神经细胞AO/EB的检测结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 硒对铅中毒引起鸡神经组织氧化应激的缓解作用 |
| 4.2 硒对铅中毒引起鸡神经组织硒蛋白改变的缓解作用 |
| 4.3 硒对铅中毒引起鸡神经组织细胞因子改变的缓解作用 |
| 4.4 硒对铅中毒引起鸡神经组织热休克蛋白改变的缓解作用 |
| 4.5 硒对铅中毒引起鸡神经组织细胞凋亡的缓解作用 |
| 4.6 硒对铅中毒引起鸡神经组织形态学变化的缓解作用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）牛磺酸对锰染毒大鼠纹状体神经组织细胞损伤影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 动物及分组 |
| 1.3 Tunel染色方法 |
| 1.4 电镜切片制备及观察 |
| 1.5 DA和5-HT测定方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 牛磺酸对锰染毒大鼠纹状体中细胞凋亡影响的Tunel染色观察 |
| 2.3 牛磺酸对锰致大鼠纹状体神经细胞超微结构变化的影响 |
| 2.4 牛磺酸对锰染毒大鼠纹状体神经递质的影响 |
| 3 讨论 |
四、锰对神经细胞超微结构的影响（论文参考文献）
- [1]海藻糖对锰诱导的小鼠纹状体神经细胞线粒体损伤的保护作用[D]. 刘宽. 中国医科大学, 2020(01)
- [2]RNA去甲基化酶FTO在锰致海马学习记忆障碍中的作用[D]. 李佳铄. 中国医科大学, 2020
- [3]AMPK/ULK1轴调控线粒体自噬在PBDE-47神经毒性中的作用及褪黑素的干预效果研究[D]. 董理鑫. 华中科技大学, 2020(01)
- [4]PAS-Na对ERS-Txnip/Nlrp3炎症通路介导锰神经毒性的干预研究[D]. 温平镜. 广西医科大学, 2019(08)
- [5]甲醇致恒河猴认知障碍模型的建立与相关机制研究[D]. 李红威. 北京协和医学院, 2019(02)
- [6]锰诱导的α-synuclein蛋白寡聚体与自噬的相互作用对神经细胞损伤的分子机制研究[D]. 闫冬莹. 中国医科大学, 2019(01)
- [7]过量锰导致鸡脑组织和神经细胞凋亡的机理研究[D]. 张坤. 东北农业大学, 2018(02)
- [8]程序性坏死参与锰致神经元死亡机制的研究[D]. 磨洁琳. 广西医科大学, 2018(12)
- [9]硒对铅引起鸡神经毒性的缓解作用[D]. 朱轶豪. 东北农业大学, 2017(01)
- [10]牛磺酸对锰染毒大鼠纹状体神经组织细胞损伤影响[J]. 吴松林,郭松超,秦绚,陈维平,邝晓聪. 中国职业医学, 2012(06)