一、应用快速引物原位标记技术检测鼻咽癌染色体异常（论文文献综述）
蔡曌[1]（2021）在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中研究表明这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63（p<0.01）、FOSL2（p<0.01）、PAQR6（p<0.01）在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p<0.01）的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p=0.047）的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加（p<0.01）。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数（Prognostic Index,PI）,预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍（p=0.0003）。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍（p=0.0001）。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短（p=0.00056）。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63（p=0.036）与FOSL2（p<0.01）的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63（p<0.01）与FOSL2（p=0.046）的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加（p=0.042）。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加（p<0.01）或FOSL2的拷贝数增加（p=0.018）预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集（n=41）中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集（n=41）中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍（p=0.002）。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中转录组数据和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。
赵晨星[2]（2021）在《EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤的临床特征和环状RNA调控细胞增殖作用的研究》文中研究指明背景EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染发生于9%15%的弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）,与临床不良结局有关。尽管对DLBCL的临床和分子研究已有一定进展,但EBV+DLBCL的临床及基因组学特征仍有待研究。方法为进一步阐明EBV+DLBCL的临床及基因组学特征,本研究以多中心、3期、随机、对照临床试验（NCT01852435）为基础,对429例初诊DLBCL患者肿瘤标本进行EBER原位杂交检测。同时对有血清标本的患者,通过定量PCR和酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测血清EBV DNA和EBV抗体谱情况。进一步在药物杀伤实验中检测提高蒽环类剂量对EBV+DLBCL的疗效。另外,对180例患者肿瘤组织标本进行全外显子/基因组测序、靶向测序和RNA测序的多组学分析来深入剖析EBV+DLBCL的基因组学特征。结果在这429例DLBCL患者中,46例患者（10.7%）为EBER阳性。多因素分析显示肿瘤EBER阳性是影响DLBCL患者的无进展生存期（PFS,风险比:2.58,95%可信区间:1.086.15,P=0.03）和总生存期（OS,风险比:3.71,95%可信区间:1.2511.01,P=0.02）的独立危险因素。在EBV血清学标志物中,血清EBV DNA与肿瘤EBER及患者临床不良结局相关。而VCA IgA阳性与血清LDH升高及中高危国际预后指数有关。临床和体外实验均提示,提高剂量蒽环类药物能够克服EBV不良影响。多组学分析发现,与EBER阴性患者相比,EBER阳性患者表现出显着差异的基因拷贝数变异特征。其中,MHC Ⅰ/Ⅱ类分子的拷贝数缺失导致了病毒感染的激活和抗原呈递介导的免疫应答受损。此外,EBER阳性患者还存在显着高频的致癌基因突变（TET2、DDX3X、MYC、STAT3、TNFAIP3、TNFRSF14和LYN）,以及致癌信号通路（Wnt、JAK-STAT、NF-κB和BCR信号通路）的异常表达。结论EBV感染参与了DLBCL肿瘤进展,并有着显着差异的基因组和转录组学特征。提高蒽环类药物的剂量或将克服EBV带来对临床不良预后的影响。背景剖析EBV+DLBCL进展和化疗耐药的分子机制,对于提高EBV+DLBCL的治疗效果,改善患者生存具有重要意义。越来越多研究表明circRNA在肿瘤生长、进展、转移和耐药中都发挥重要调控作用。目前circRNA在EBV+DLBCL中的作用机制尚不清楚。方法应用Illumina HiSeq测序仪检测8例EBV阳性DLBCL患者和5例EBV阴性DLBCL患者的肿瘤组织中circRNA的序列以及表达。检测100例DLBCL患者肿瘤组织中circRNA的表达情况,结合临床资料分析circRNA表达与EBV感染情况、临床指标和疗效预后的关系。通过Northern印迹杂交术、RNase R消化和放线菌素D处理鉴定circRNA环形结构。通过RNA pull down技术和双荧光素酶报告基因实验,检测circRNA特异性结合的miRNA。分别构建circRNA/miRNA过表达细胞株观察肿瘤细胞的增殖、凋亡、药敏感实验等生物学行为。应用Western Blot检测信号通路重要分子的表达情况。构建淋巴瘤动物模型分析circRNA对肿瘤细胞生长及化疗药物疗效的影响。结果circEAF2在EBV+DLBCL淋巴瘤组织中显着低表达,且circEAF2低表达水平与EBV+DLBCL患者的化疗耐药及预后不良密切相关。circEAF2的封闭环状结构不受RNase R影响,不易降解。体内外实验表明,过表达circEAF2促进EBV+DLBCL肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和提高阿霉素药物敏感性。RNA pull down实验和双荧光素酶实验表明,EBV源miR-BART19可被circEAF2特异性结合,以达到促进淋巴瘤细胞凋亡、抑制细胞过度增殖和提高阿霉素药敏感性。进一步研究发现,circEAF2通过调控miR-BART19/APC轴来抑制Wnt/β-cantenin信号通路,最终抑制了EBV+DLBCL的恶性进展。结论circEAF2表达降低与EBV+DLBCL细胞恶性表型和患者不良预后有关。circEAF2通过作用于miR-BART19来调控APC靶基因和Wnt/β-catenin通路表达,抑制EBV+DLBCL的进展和耐药。提示circEAF2可能作为EBV+DLBCL的潜在预后生物标志物和靶向治疗靶点。
李东杰[3]（2021）在《基于微阵列比较基因组杂交技术对喉鳞癌全基因组染色体拷贝数变异的整合分析》文中研究说明喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤,发病率高,约占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%,其死亡率高、预后较差。然而近年来LSCC患者5年生存率及生活质量并无提高,其发病率亦呈逐年升高趋势,并且逐渐年轻化,严重破坏患者的发音、呼吸及吞咽三大功能,威胁患者的生存质量和生存期。对于LSCC的治疗,较晚期患者往往以牺牲喉的功能为代价来延长生命。LSCC是一种基因机制复杂的肿瘤类型,目前其病因和发病机制尚不明确,且尚缺乏用于指导诊断、治疗及预后的特异性肿瘤标志物。因此探究LSCC的发生机理,分析LSCC发生的分子机制以及找出LSCC的分子标志物对于LSCC的早期诊断及治疗越来越重要。遗传不稳定性如染色体不稳定性与LSCC的发生密切有关。拷贝数变异（Copy Number Variations,CNVs）是人类基因组内从1Kb到数个Mb不等的DNA片段拷贝数,包括DNA片段的删除、插入、复制和复合多位点的变异等类型。CNVs是造成个体表型差异的重要遗传基础,其在人类基因组中分布广泛,极大地丰富了基因组遗传变异的多样性。在人类肿瘤中,CNV是可能导致原癌基因的活化和抑癌基因的钝化的重要原因,这些基因在参与调控细胞生长、增殖、凋亡和转移等机制方面发挥着至关重要的作用。Array-CGH（Microarray comparative genomic hybrization）是一种高通量的基因组检测技术,一次实验就能对基因组的变化进行整体检测,并且能筛查出全部染色体的微重复、微缺失和非整倍体等变异,可成为筛选肿瘤发生、转移、复发、耐药等相关候选基因的研究靶点,对于寻找原癌基因和抑癌基因,监测肿瘤发生、发展过程及判断预后有重要的分子遗传学意义。在本研究中,我们通过array-CGH检测获得了LSCC的全基因组的缺失及扩增图谱。同时研究染色体畸变与临床病理特征的关系,通过整合GEO（Gene Expression Omnibus）数据库分析获得各染色体异常数据,进而对与LSCC发生及发展相关的基因进行筛选,为研究LSCC发生及发展提供相关候选基因。目的:通过array-CGH分析LSCC肿瘤组织的全基因组染色体的缺失及扩增图谱,探讨LSCC染色体水平拷贝数变异,并分析染色体CNVs与喉鳞癌临床及病理特征之间的关系,结合GEO数据库分析获得差异表达基因数据,进而对与LSCC发生及发展相关的基因进行筛选,为研究LSCC发生及发展提供相关候选基因。方法:我们使用Agilent公司的基因芯片对66例LSCC进行array-CGH检测,使用Cytogenomics 4.0对实验结果进行数据分析,同时分析染色体CNVs与临床及病理特征之间的关系,结合GEO数据库分析获得差异表达基因,同时绘制火山图及热图,进而对与LSCC发生及发展相关的基因进行整合分析筛选获得LSCC候选靶基因,通过免疫组织化学进一步分析候选基因在癌组织及癌旁组织中的表达,以及其与临床病理参数之间的相关性。结果:（1）本次研究的66例LSCC标本中,经array-CGH检测均有不同数目及大小的基因组CNVs（扩增、丢失、重复和纯合缺失）。66例LSCC中所检测到的基因组不平衡频率较高的染色体片段包括9个重复片段:3q26.1-qter,5pter-p12,7p22.3p14.1,8p12p11.22,8q24.13q24.3,11q13.2q13.4,12pter-p12.2,18pter-p11.31和20p13p12.1,以及5个缺失片段:3pter-p21.32,4q28.1-q35.2,5q13.2-qter,9pter-p21.3以及13 monosomy。3q26.32q27.2区域重复频率最高,其中最小重叠区域（smallest region of overlap,SRO）包含SOX2,EIF4G1,FXR1,DVL3,DCUN1D1和IGF2BP2等基因。8号染色体上有两个高度扩增片段,其中长臂8p11.2和短臂8q24.21,分别包含ADAM2和CCDC26基因。本实验中检测到4个纯合子缺失片段,其所覆盖NEIL3,CSMD1,CDKN2A和PCDH20等可能的抑癌基因。（2）根据临床特征及病理特点,高频染色体片段变异与淋巴结分期、肿瘤分期统计无相关性,3q26.1-qter、5pter-p12重复以及5q13.2-qter缺失在吸烟组与非吸烟组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）整合GEO数据库差异表达基因分析确定SOX2、EIF4G1、FXR1、DVL3、DCUN1D1、IGF2BP2、CCDC26以及CDKN2A、SPINK5、PCDH20、CSMD1、NEIL3候选基因。（4）PCDH20、NEIL3、DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2在喉癌和癌旁组织高表达率比较差异均有统计学意义,PCDH20表达与淋巴结转移、吸烟史负相关,NEIL3表达与淋巴结转移负相关,DCUN1D1表达与TNM分期正相关,EIF4G1、IGF2BP2表达与淋巴结转移正相关。结论:（1）本次研究的66例LSCC组织标本中,经array-CGH检测均有不同数目及大小片段的基因组CNVs（扩增、丢失、重复和纯合缺失）。（2）在LSCC中所检测到的高频扩增及纯合子缺失片段中含有重要相关癌基因以及抑癌基因。（3）特定染色体片段的重复及缺失与吸烟史存在一定相关性,部分筛选基因的表达与临床病理参数相关。（4）结合GEO数据库差异表达基因的整合分析可推定LSCC相关候选靶基因,为进一步研究LSCC的分子发生机制提供参考。
欧阳颖[4]（2020）在《向心组装蛋白STIL基因敲除用于鼻咽癌治疗的探索研究》文中研究指明鼻咽癌是一种发生在鼻咽粘膜内层的上皮性癌,发作多由EBV感染、遗传易感性以及环境等多因素引发的。鼻咽癌的全球分布极其不平衡,尽管鼻咽癌的发生率和致死率在逐渐下降,但鼻咽癌仍然是中国最常见的原发恶性肿瘤之一。目前鼻咽癌的治疗主要以放化疗为主,分子靶向治疗和免疫治疗为辅。放化疗联合分子靶向治疗的方案,明显的提高了鼻咽癌晚期患者的存活率,提示了我们分子靶点在鼻咽癌治疗中的重要作用。前期研究中我们使用m RNA芯片鉴定了20个可能在鼻咽癌增殖中发挥重要作用的基因,高通量sh RNA筛选和q PCR验证结果表明STIL对鼻咽癌细胞增殖率的影响最大。STIL敲除的CNE-2Z细胞生物学特性分析结果表明STIL敲除抑制了细胞的增殖和诱导细胞凋亡,且影响了细胞周期。本研究进一步研究STIL对鼻咽癌增殖、侵袭和远处转移的影响,可能有助于开发以STIL为靶点的新治疗策略或更准确的预后预测。在前期研究的基础上,我们分析了肿瘤基因组图谱（TCGA）公共数据库中STIL基因与多种肿瘤类型的关系,并在动物水平上进一步验证了前期的结论。再对STIL敲除的CNE-2Z细胞进行了转录组芯片的检测,包括STIL相关差异基因的分析以及细胞侵袭迁移能力测定。还对鼻咽癌转移样本的血清进行了质谱检测及差异蛋白的ELISA测定。结果如下:1)TCGA数据库的STIL基因表达分析表示,STIL在多种肿瘤如鼻咽癌、多形性胶质母细胞瘤等中均表达上调,生存率分析表示STIL的高表达导致了肾透明细胞癌（p=0.00024）和肝脏肝细胞癌（p=0.0003）的不良预后。2)BALB/c小鼠成瘤实验中,sh STIL组的小鼠肿瘤平均重量为0.116g,sh Ctrl组的小鼠肿瘤重量为1.117g,sh STIL组的小鼠肿瘤比sh Ctrl组的体积小且重量轻,表明STIL的敲除抑制了肿瘤的生长;3)sh STIL细胞转录组分析构建差异基因的相互作用网络,包括ITGA2、ITGAV、SMAD2、JAK1、PTEN五个基因。Western Blot检测以上基因的蛋白表达,均发现表达下调。q PCR检测以上基因的m RNA表达,发现ITGA2、SMAD2、JAK1、CD44、ITGAV均表达下调,PTEN表达上调;4)用sh Ctrl细胞做校正,sh STIL细胞的转移侵袭能力分别为0.1和0.16,细胞的侵袭迁移能力受到显着的抑制（p<0.05）;5)质谱分析筛选出鼻咽癌转移样本血清中8个差异蛋白,对HBD、KRT1以及SERPINA4蛋白进行了ELISA检测,未发现蛋白有显着差异,与数据分析结果不一致,后续需进一步验证。综上所述,我们的研究证实STIL是促进鼻咽癌增殖、转移和侵袭的关键调控因子,为鼻咽癌的分子机制研究提供了思路,并提出了一种新的治疗策略。
张长凯[5]（2019）在《EB病毒感染与淋巴瘤及骨髓增生异常综合征的相关性研究》文中研究说明目的通过检测淋巴瘤及骨髓异常增生综合征（MDS）病人骨髓细胞中EB病毒（EBV）DNA（EBV-DNA）的拷贝数,以探讨EBV感染与淋巴瘤及MDS的发生、发展及染色体改变的相关性,同时探讨EBV感染在淋巴瘤的免疫分型及淋巴瘤与MDS病人预后判断中的价值。方法采集198例淋巴瘤及MDS病人的骨髓标本作为实验病例组,其中包括霍奇金淋巴瘤（HL）病人14例,非霍奇金淋巴瘤（NHL）病人136例,骨髓异常增生综合征（MDS）病人48例,同时采集37例健康者（骨髓象正常且无任何血液系统疾病）的骨髓作为对照组。运用苯酚-氯仿-异戊醇法提取骨髓液中单个核细胞中的DNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术检测所提取的全部样本骨髓液细胞中的EBV-DNA;采取骨髓细胞短期培养法制备染色体标本,用R显带技术分析染色体核型;采用流式细胞技术对NHL病人进行免疫表型分析,探讨T-NHL和B-NHL与EBV感染的相关性。并对部分病人进行了临床随访,以进一步探讨EBV感染与淋巴瘤、MDS病人的复发及死亡的影响。结果198例淋巴瘤及MDS病人中有76例检测到EBV-DNA,总体阳性率38.4%,而对照组仅中有2例（5.4%）检测到EBV-DNA,病例组中EBV-DNA的阳性率明显高于对照组（χ2=13.8,p<0.01）。HL、NHL和MDS病人EBV-DNA的阳性率分别为64.3%（9/14）、36.8%（50/136）和35.4%（17/48）,均显着高于对照组（χ2=17.4,12.1,10.7,p<0.01）,其中HL组EBV-DNA的阳性率高于NHL（χ2=4.03,p<0.05）,但HL与MDS,NHL与MDS间EBV-DNA的阳性率无差异（χ2=3.71,0.03,p>0.05）。结合流式细胞仪的分型结果,110例B-NHL中40例检测到EBV-DNA,阳性率为36.4%（40/110）;26例T-NHL中10检测到EBV-DNA,其阳性率为38.5%（10/26）,B-NHL与T-NHL病人间EBV-DNA的阳性率没有差异（χ2=0.04,p>0.05）。染色体R显带核型分析显示,20例EBV-DNA阳性患者（NHL、MDS各10例）检测到染色体核型异常,染色体异常的检出率为26.3%（20/76）,而在EBV-DNA阴性的患者中有27例（NHL 12例、MDS 15例）检测到染色体核型的异常,染色体异常的检出率为22.1%（27/122）,EBV感染与染色体异常无显着相关性（χ2=0.45,p>0.05）。临床随访显示,2年内EBV阳性病人和EBV阴性病人的复发率和死亡率分别为56.1%（23/41）、31.7%（20/63）和24.4%（10/41）、3.2%（2/63）（p<0.05）。与EBV阴性病人相比,EBV阳性病人具有更高的复发率和死亡率。在进展为急性白血病的11例MDS中有8例（72.7%）为EBV阳性,有3例（27.3%）为EBV阴性,MDS中EBV阳性病人的转白率明显高于EBV阴性病人（χ2=6.70,p<0.05）,表明MDS转白与EBV感染之间存在一定的相关性。结论EBV感染与淋巴瘤、MDS的发生及病情进展有关,但与染色体改变及HL的免疫分型没有相关性;EBV感染与淋巴瘤、MDS病人的预后有关,EBV-DNA阳性病人有较高的复发率和死亡率,预后不佳。
陈秋惠[6]（2019）在《巴西橡胶树遗传图谱第11号、13号和14号连锁群26个遗传标记的物理定位研究》文中指出巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是一种大戟科橡胶树属的、多年生的、能生产天然橡胶的热带经济乔木。前人已构建有多张遗传图谱,大多数图谱都分为18条连锁群,而少数分为22或23条不等的连锁群。因此,就会存在多个连锁群对应一条染色体的情况,连锁群上的遗传标记在染色体上的真实位置也尚未清楚。橡胶树分子细胞遗传图谱是研究橡胶树的基因组学和橡胶树遗传发育的重要工具,能够揭示连锁群与染色体的对应关系,遗传标记在染色体上的排布及真实的物理位置,为橡胶树基因克隆和标记辅助育种提供了宝贵的理论依据。本研究选择了 Lespinasse等（2000）构建的巴西橡胶树遗传图谱中的第1 1号、第13号和第14号三个连锁群上的26个遗传标记,其中24个RFLP标记,2个SSR标记。通过荧光原位杂交和原位PCR的定位检测,经核型整合分析,构建了第1 1号、第13号和第14号三个连锁群的分子细胞遗传图。具体研究结果如下:（1）利用生物信息学方法,在NCBI上找到26个标记的DNA序列,并通过NCBI的Blast在线比对,获取含有标记在内的2500-3500bp左右大小的DNA序列进行引物设计,经电泳检测、生物公司PCR产物测序和序列比对等过程,最终筛选出特异性最强的26对引物。（2）利用FISH检测方法对第1 1号连锁群上的4个遗传标记MnSoD、M613、gHbCIR295.PB和gHbCIR636进行物理定位,结果全部定位在巴西橡胶树热研7-33-97第16号染色体上。遗传标记MnSoD和gHbCIR295.PB位于染色体短臂上,标记信号与着丝粒的平均百分距离依次是63.82和46.27;gHbCIR636和M613位于染色体长臂上,标记信号与着丝粒的平均百分距离分别为28.34和65.82。由此可知,第11号连锁群与第16号染色体存在对应关系,并构建了 16号染色体的细胞遗传图谱。（3）从第13号连锁群中选取了 9个遗传标记gHbCIR671.L2、gHbCIR402、gHbCIR506.L2、gHbCIR31、gHbCIR333、gHbCIR287、gHbCIR360、gHbCIR303 和gHbCIR670.PB进行荧光原位杂交实验。经核型分析,9个标记均定位在了巴西橡胶树热研7-33-97第18号染色体上,其中gHbCIR671.L2和gHbCIR31位于18号染色体的短臂上,标记信号与着丝粒平均百分距离分别是57.22和11.27;而余下7个标记 gHbCIR402、gHbCIR506.L2、gHbCIR287、gHbCIR360、gHbCIR333、gHbCIR303和gHbCIR670.PB均位于18号染色体的长臂上,标记信号与着丝粒平均百分距离分别是 8.39、23.51、29.14、40.18、41.65、60.48 和 60.59。由此可知,13 号连锁群与热研7-33-97的第18号染色体对应关系,并构建了 18号染色体的细胞遗传图谱。（4）从第14号连锁群上共选取了 13个遗传标记,gHbCIR686、gHbCIR425、gHbCIR261、gHbCIR682.L2、gHbCIR631.L2、gHbCIR330、gHbCIR412-493、gHbCIR602、gHbCIR20.L1、gHbCIR290、gHbCIR409415 和 gHbCIR644 用 FISH 检测方法,gHbCIR365.L2进行原位PCR检测。结果显示,14号连锁群上的13个遗传标记均位于第12号染色体上,其中gHbCIR686、gHbCIR365.L2、gHbCIR425、gHbCIR261、gHbCIR631.L2位于第12染色体短臂上,信号位点到着丝粒平均百分距离分别是 32.67、44.56、31.53、29.10 和1 1.46;gHbCIR682.L2、gHbCIR330、gHbCIR412493、gHbCIR602、gHbCIR20.L1、gHbCIR290、gHbCIR409415和gHbCIR644位于长臂上,信号位点到着丝粒平均百分距离分别是9.87、45.59、53.82、48.40、53.24、55.24、65.51和75.74。由此可知,第14号连锁群与第12号染色体存在对应关系,并构建了 12号染色体的细胞遗传图谱。
赵充[7]（2019）在《转铁蛋白受体TFRC调节鼻咽癌放射敏感性的作用和机制以及化疗联合靶向治疗提高转移鼻咽癌疗效的临床试验》文中认为鼻咽癌是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一。放射治疗一直是初治无转移鼻咽癌最主要的治疗手段。近十余年来,精确的调强放疗（intensity-modulated radiation therapy,IMRT）技术的普遍临床应用,显着地提高了鼻咽癌的局部和区域控制率,总生存率也得到了一定程度的提高。然而,治疗后仍然有部分患者出现局部复发或远处转移。局部复发或远处转移一旦发生,治疗的疗效较差,生存率极低。因此,降低鼻咽癌的复发率和转移率、提高复发和转移鼻咽癌的治疗疗效是进一步提高鼻咽癌治愈率的关键,也一直是研究的重点。本研究针对治疗失败的关键因素,拟开展:1、通过探索转铁蛋白受体TFRC影响鼻咽癌放射敏感性的作用和机制,寻找预测鼻咽癌放射敏感性的新的分子标记物和增敏放疗的新靶点,为将来筛选放疗不敏感病例,并制定相应的干预措施,降低鼻咽癌局部复发率提供基础研究的数据;2、针对远处转移鼻咽癌,在目前一线化疗方案的基础上,加用已被证实对鼻咽癌有效的抗表皮生长因子受体单克隆抗体进行治疗,观察其治疗的有效性和不良反应,为进一步研究提高远处转移患者临床疗效的综合治疗方案提供依据。该课题的研究对于最终达到提高鼻咽癌患者的治愈率有着非常重要的意义。第一部分转铁蛋白受体TFRC调节鼻咽癌放射敏感性的作用和机制目的:探索TFRC调节鼻咽癌放射治疗敏感性的作用和机制,为预测鼻咽癌放疗敏感性提出新的分子标记物和为放疗增敏提出新的治疗靶点提供基础研究数据。方法:利用公共数据库分析正常组织与头颈部鳞癌组织和鼻咽癌组织的TFRC表达的差异;采用Real-time PCR及Western blot分别检测TFRC在新鲜鼻咽癌组织和正常组织、鼻咽癌细胞株和永生化鼻咽粘膜上皮细胞株中mRNA及蛋白水平的表达差异。进一步在鼻咽癌患者的石蜡包埋标本中检测并分析TFRC的表达水平与临床预后的关系,其中生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素分析采用Cox比例风险模型。构建TFRC过表达的CNE1和CNE2稳定细胞株,利用克隆形成实验并绘制剂量-存活曲线检测TFRC表达上调对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响;采用凋亡流式细胞术检测TFRC表达上调对电离辐射所诱导的鼻咽癌细胞凋亡的影响。接着建立裸鼠皮下成瘤放射治疗模型验证TFRC表达上调后对鼻咽癌细胞在体内放射敏感性的影响;再通过细胞内铁含量的测定、细胞内活性氧水平的测定和Western bolt检测凋亡相关蛋白的水平变化研究TFRC表达上调影响鼻咽癌细胞放射敏感性的具体分子机制;最后,在Cbioportal公共数据分析网站探索头颈部鳞癌组织中TFRC表达上调的机制。结果:TCGA头颈部鳞癌数据库显示TFRC在头颈部鳞癌组织中的表达显着高于正常组织（P<0.0001）;成对组织样品中也呈现头颈部鳞癌组织中TFRC的表达显着高于正常组织（P<0.0001）;鼻咽癌GSE芯片数据（GSE12452）也同样显示TFRC在鼻咽癌中的表达显着高于正常组织（P<0.0001）;已发表的鼻咽癌表达谱（GSE12452）的基因集富集分析（GSEA）证明TFRC表达与鼻咽癌上调基因标签呈正相关（P<0.0001）。Real-time PCR分析显示10例鼻咽癌新鲜组织中TFRC的mRNA表达水平均显着高于3例正常鼻咽组织（P<0.0001）,9株鼻咽癌细胞株（HNE1、CNE1,CNE2、SUNE1、HONE1、6-10B、5-8F、S26和S18）中TFRC的表达显着高于3株永生化鼻咽上皮细胞（N2、N5、NP69）（P<0.0001）;通过免疫印迹法检测以上样品中TFRC的蛋白水平与上述结果一致。对100例鼻咽癌患者的石蜡包埋标本进行TFRC蛋白免疫组化染色并将患者分为TFRC高表达和低表达组,结果放射敏感组中TFRC高表达的患者比例明显高于放射抵抗组（P<0.001）;单因素分析显示TFRC高表达组5年无局部复发生存率明显高于低表达组（89.2%vs.73.2%,P=0.041）,多因素分析表明,TFRC表达水平是患者无局部复发生存的独立预测因子（P=0.017）。克隆形成实验分析显示,上调TFRC表达水平的鼻咽癌细胞接受电离辐射后,克隆团数量和大小显着减小;流式细胞术分析接受6Gy电离辐射后不同时间点（0h,24h,48h,72h）的鼻咽癌细胞凋亡情况发现,TFRC表达上调的鼻咽癌细胞的凋亡细胞比例较对照组显着增加;动物皮下瘤放射治疗模型结果显示,未接受放射治疗的注射CNE1-TFRC细胞和CNE1-Vector细胞的裸鼠皮下瘤的体积之间无显着差异（P>0.05）;注射CNE1-TFRC细胞的裸鼠皮下瘤在第15天后体积不再增大反而缩小,而注射CNE1-Vector细胞的裸鼠皮下瘤在接受电离辐射后短时间内体积增长缓慢,两组裸鼠皮下瘤的体积之间具有显着差异（P<0.001）。免疫印迹实验结果显示,TFRC表达上调后,鼻咽癌细胞在接受电离辐射后细胞内线粒体途径的凋亡相关蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3激活更加明显,由线粒体释放到细胞浆中细胞色素C（Cyto C）水平也明显增高。上调TFRC表达后鼻咽癌细胞内铁含量均显着增高（P<0.05）;鼻咽癌细胞TFRC表达上调后在接受6Gy电离辐射后细胞内活性氧（ROS）水平显着升高（P<0.001）;当ROS被ROS抑制剂GSH抑制后TFRC引起的细胞内铁含量增高所促进电离辐射诱导的细胞内ROS水平的增高的作用被抵消（P<0.001）。在未接受电离辐射时,TFRC过表达细胞和Vector细胞的细胞活力无显着差异（P>0.05）;然而,在接受6Gy电离辐射后,TFRC过表达细胞和Vector细胞的细胞活力均下降,且TFRC过表达细胞的细胞活力下降较Vector细胞更显着（P<0.001）;当ROS被ROS抑制剂GSH抑制后TFRC上调联合电离辐射引起的细胞内ROS水平的增高所引起的细胞活力下降的作用被抵消（P<0.001）。最后通过Cbioportal分析,发现头颈部鳞癌中TFRC存在的基因拷贝数扩增,并且基因TFRC扩增与其mRNA表达上调显着相关（P<0.001）。结论:TFRC在鼻咽癌中表达显着上调,是鼻咽癌复发的独立预测因子;上调TFRC表达,在体外可以促进电离辐射抑制鼻咽癌细胞的克隆形成能力和促进电离辐射诱导的细胞凋亡,在体内可明显增强鼻咽癌细胞皮下瘤对于电离辐射的敏感性;TFRC通过将铁转运进入细胞,细胞内铁含量升高,促进电离辐射诱导的细胞内ROS水平的升高,激活线粒体凋亡途径ROS-Cyto C-Caspase-9-Caspase-3信号通路,促进细胞凋亡,增强肿瘤细胞放射敏感性;Cbioportal公共数据分析网站分析发现头颈部鳞癌TFRC表达上调可能是由于TFRC基因扩增。该研究揭示了TFRC在鼻咽癌放射敏感性中的作用,并提示该蛋白质有望成为新的潜在预测鼻咽癌放射敏感性的生物标志物和增敏放射治疗的新靶点。第二部分顺铂和5-氟脲嘧啶联合尼妥珠单抗作为一线方案治疗转移鼻咽癌的前瞻性、开放性、多中心Ⅱ期临床试验目的:观察顺铂和5-氟尿嘧啶化疗联合抗表皮生长因子受体单克隆抗体（尼妥珠单抗）作为一线方案治疗转移鼻咽癌的疗效和不良反应,为进一步进行III期临床研究提供依据。方法:本研究为前瞻性、开放性、多中心II期临床试验。主要的入组标准为接受根治性放疗后6个月发生远处转移、至少有一处可测量病灶、且未接受过任何针对远处转移治疗的患者。治疗方案如下:顺铂100mg/m2,第1天静脉注射;5-氟尿嘧啶4g/m2,第1至第4天持续微量静脉泵入,每3周为1个疗程;同时给予尼妥珠单抗200mg静脉注射,每周一次。顺铂和5-氟尿嘧啶化疗最多6个疗程;若6程顺铂和5-氟尿嘧啶方案化疗后疾病稳定则给予尼妥珠单抗200mg静脉注射、每周一次单药维持治疗,直至出现不能耐受的毒性或疾病进展。样本量的计算采用Simon二阶段设计。化疗期间每两个疗程、尼妥珠单抗维持治疗阶段和治疗结束后每3个月分别评价患者的疗效和不良反应。主要的观察指标为客观有效率（objective response rate,ORR）,次要观察指标为疾病控制率（disease control rate,DCR）、无进展生存（progression free survival,PFS）、总生存（overall survival,OS）和不良反应（adverse effects,AEs）。数据分析采用SPSS 22.0软件包。本研究在clinicaltrials.gov注册,注册号为NCT01616849。结果:国内共十家医院参与本研究。2012年6月至2015年4月,共招募39例患者参加本临床试验,其中第一阶段13例,第二阶段26例;4例第二阶段入组的患者在治疗开始前退出本临床试验,故共35例患者接受了规定方案的治疗并纳入分析。在35例患者中,1例完全缓解,24例部分缓解,5例疾病稳定,3例疾病进展,2例无法评价疗效;ORR和DCR分别为71.4%（25/35）和85.7%（30/35）,中位PFS和OS分别为7.0个月（95%CI,5.8-8.2）和16.3个月（95%CI,11.4-21.3）。亚组分析显示,接受≥4个疗程顺铂和5-氟尿嘧啶化疗和≥2400mg尼妥珠单抗治疗组患者的疗效优于接受<4个疗程顺铂和5-氟尿嘧啶化疗和<2400mg尼妥珠单抗治疗组的患者,两组的ORR分别为88.9%和12.5%（P<0.001）,中位PFS分别为7.4个月和2.7个月（P=0.081）,中位OS分别为17.0个月和8.0个月（P=0.202）;此外,首程治疗结束至发生远处转移的时间间隔>12个月（HR 0.307[95%CI,0.131-0.724],P=0.004）的患者中位生存时间明显较长,但寡转移和多发转移患者之间疗效并无统计学差异。常见的不良反应包括白细胞降低（94.3%）和胃肠道反应（97.1%）,3/4级不良反应主要为白细胞降低（62.9%）。结论:对接受根治性治疗后发生远处转移的鼻咽癌患者,顺铂和5-氟尿嘧啶联合尼妥珠单抗作为一线治疗方案取得了较好的疗效,尤其是接受足够剂量化疗和尼妥珠单抗的患者;该治疗方案并未增加不良反应,值得进一步开展III期临床研究。
林慧晶,吴琼,徐两蒲,孙艳,林多,陈冠楠,陈荣[8]（2019）在《基于光谱技术的产前检测方法研究进展》文中进行了进一步梳理优生优育是我们重要的国策。自二胎政策颁布以来,高龄产妇数量呈现明显上升的趋势,先天性畸形儿的发生几率变大。传统的产前检测方法存在较高流产风险、灵敏度低、耗时等问题,探寻一种无损快捷、经济灵敏的产前检测方法至关重要。本文首先介绍了常见的胎儿出生缺陷及当前临床常见的产前检测方法的优缺点,重点综述了光谱技术的特点及其在产前检测中的应用。其中包括光谱核型、实时荧光定量PCR、SNP等位基因位点分析等利用荧光光谱分析方法和拉曼光谱在产前检测中的应用情况。特别阐述了表面增强拉曼光谱SERS在生物检测中的优势,最后总结并展望了SERS光谱在产前检测的应用。
杨桃梅[9]（2018）在《TCEA1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究》文中研究说明研究背景急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是由造血干细胞或造血祖细胞异常增殖、细胞成熟发生障碍所引起的一种恶性血液肿瘤。AML的发生及预后与染色体易位、基因表达异常、环境及年龄等诸多因素相关。尽管多种治疗方法如诱导化疗、缓解后化疗、靶向药物治疗及造血干细胞移植等已应用于急性髓细胞白血病的治疗。但是急性髓细胞白血病仍然是临床上预后可变且患者死亡率比较高的一种恶性血液肿瘤。为此发现新的具有调节髓细胞增殖潜能的功能基因不仅有助于提升对白血病生成的认识,而且将会为白血病患者的提早诊断、及时治疗及预后提供潜在靶点。起初人们认为转录延伸是一个不受调控的机械添加碱基的过程并主要致力于对转录起始阶段的研究。直到后来,人们才渐渐关注并对转录延伸的调控进行研究,发现转录延伸的调节是控制基因表达的关键步骤。在转录起始不久后RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ,RNAP Ⅱ）便被DRB敏感性诱导因子（DRB sensitivity inducing factor,DSIF）因子及负延伸因子（negtive elongation factor,NELF）阻滞在转录起始位点下游。此时,阻滞释放因子需要募集正性延伸因子到阻滞位点进行解阻滞作用从而刺激RNAPⅡ的延伸活性以保证转录延伸的进行。S-Ⅱ 又名 TFIIS（Transcription elongation factor S-Ⅱ）,是一种比较保守的转录延伸因子。S-Ⅱ能使受到转录阻滞的RNAPⅡ恢复转录活性并顺利通过转录阻滞位点,从而极大地提高了基因转录效率。目前普遍地认为S-Ⅱ有三个家族成员,其中 TCEA1（Transcription elongation factor A1）是 S-Ⅱ 中最常见的形式、是最早被报道的与RNAP Ⅱ阻滞释放相关的转录延伸因子。研究显示TCEA1通过刺激RNAP Ⅱ对初期转录本进行切割从而促进基因的转录延伸。在髓细胞生长发育的各个阶段中涉及不同专一性基因的表达,如在细胞分化成熟阶段主要表达与分化成熟相关的基因,而与增殖相关基因的表达受到严格限制。专一性基因表达失控或异常与造血紊乱及白血病发生发展息息相关。目前对TCEA1的研究报道多集中于对其结构、在转录阻滞释放中的机制、在实体瘤及红细胞生成中相关作用的研究。但是关于TCEA1在粒细胞生成过程中的作用目前尚未可知。本研究主要利用shRNA文库（Cancer 1000 Library）筛选具有调节粒细胞增殖潜能的功能基因,并深入分析重要功能基因TCEA1对粒细胞增殖、分化及凋亡的作用。本研究的完成不仅筛选出18个具有调节粒细胞增殖及分化潜能的功能基因,同时也明确了重要功能基因TCEA1在粒细胞生成中的重要作用。这些发现进一步补充了我们对TCEA1生物学功能的认知,强调了转录延伸对造血细胞命运及对髓祖细胞向粒细胞转化的影响,并且有可能为髓细胞白血病的临床诊断、治疗提供潜在作用靶点。研究目的1.应用shRNA文库结合甲基纤维素筛选培养基筛选出具有调节粒细胞增殖及分化潜能的功能基因。2.通过一系列细胞功能学实验验证所筛选的功能基因对粒细胞生长发育的调节作用。研究方法1.细胞培养1.1.BOSC23 细胞用含 10%FBS、100U/ml青霉素及 100μg/ml 链霉素的 DMEM培养基培养;32Dcl3细胞用含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及IL-3（1ng/ml）的1640培养基培养。2.shRNA文库筛选2.1.shRNA文库（Cancer 1000 library）的获得:运用分子克隆技术将靶向肿瘤相关基因（1000个）的shRNA文库（约含2300个shRNA）克隆到MSCV-LTR-miR30-SV40-GFP载体（LMS）上,构建出本研究中需要用到的shRNA文库。2.2.分离 FVB/n小鼠骨髓（Bone Marrow,BM）细胞:实验前 5天用150mg/kg的5-FU处理10只成年的FVB/n小鼠。在实验当天运用常规颈椎脱臼法将小鼠处死并在无菌条件下获取小鼠股骨中的BM细胞备用。2.3.建立筛选系统:阴性对照组细胞采用上述获取的小鼠BM细胞（2×106）,阳性对照组细胞采用转染MycT58A的BM细胞（1×106）,阴性和阳性对照组细胞均于甲基纤维素粒细胞克隆形成培养基（含100ug/ml的G-CSF,100ug/ml的SCF）中首次培养5天后收集细胞并制作成单细胞悬液,进行二次铺板再培养7天。在第5、7天通过计数克隆球数及Wright-Giemsa染色方法分析细胞增殖及分化情况。2.4.shRNA文库逆转录病毒包装:转染前一天将BOSC23细胞铺板于10cm培养皿中,次日用脂质体2000将shRNAs转染入BOSC23细胞,转染6小时后弃掉旧培养液并加入10ml新鲜培养液继续培养,分别在48、72小时时收集病毒上清液,病毒上清液经0.45μM滤膜过滤后可直接用于细胞感染,也可分装成小体积管保存于-80℃备用。2.5.shRNA文库逆转录病毒感染BM细胞:病毒解冻,将1百万shRNA文库逆转录病毒（添加有2ug/ml的聚凝胺）与2百万个BM细胞混合,2400rpm离心2小时;弃上清,用2ml预处理过的新鲜培养基重悬细胞并置于37℃、5%CO2细胞培养箱进行培养。次日,重复上述感染步骤后于37℃、5%CO2细胞培养箱继续培养细胞。2.6.甲基纤维素克降形成实验:第二次感染次日,收集上述细胞,加入7-AAD染料使其终浓度为40ug/ml,用流式分选出成功感染逆转录病毒的BM 阳性细胞（GFP+7-AAD-）;添加适量甲基纤维素粒细胞克隆形成培养基（含 100ug/ml的 G-CSF,100ug/ml 的 SCF）于 37℃、5%CO2 培养箱培养5天。5天后统计克隆球数目,运用Wright-Giemsa染色方法对克隆球细胞进行形态学分析。收集每个克隆球细胞并进行二次铺板再培养7天,7天后再次统计克隆球数目及分析克隆球中细胞形态学特征。2.7.获取克隆球细胞中的shRNAs信息:用20-200ul的枪尖吸取克隆球细胞并移至含100ul FACS缓冲液的的离心管（RNase/DNase Free）中;1000rmp离心5分钟;弃掉上清,按传统提取方法提取出细胞的基因组;PCR方法扩增出细胞中所整合的shRNA片段;将shRNA片段连接到TA TOPO测序载体中,通过基因测序及序列比对获知shRNA片段对应的基因信息。3.质粒构建3.1.将shRNA文库筛选结果中得分较高的shTCEA1、shZNF212、shEPS8片段分别构建到MSCV-LTR-miR30-SV40-GFP（LMS）表达载体上,同时构建相应的对照质粒。测序核实后用于建立表达shTCEA1、shEPS8、shZNF212及相应对照质粒的稳转细胞系。3.2.设计多个针对TCEA1的不同shRNAs及相关对照,并将这些shRNAs分别构建到MSCV-LTR-miR30-SV40-GFP（LMS）表达载体上,构建出shTCEA1.2031、shTCEA1.1669、shTCEA1.538、shTCEA1.454 及相应对照质粒。通过逆转录病毒包装、感染建立的方法构建出 32Dc13-shTCEA1.2031、32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538、32Dcl3-shTCEA1.454及表达相应对照质粒的稳转细胞系。4.建立稳转细胞系4.1.逆转录病毒包装:同shRNA文库病毒包装方法一致。4.2.收集逆转录病毒,在病毒液中添加适量体积的聚凝胺使其终浓度为2ug/ml;用1ml含聚凝胺的病毒液重悬32Dcl3细胞并以2400rpm离心2小时;弃上清,用2ml含IL-3的1640培养基重悬细胞,置于37℃、5%CO2培养箱进行培养。次日,重复上述步骤再次进行感染。培养2天后,用添加有2ug/ml嘌呤霉素的1640培养基进行培养并筛选出阳性细胞。5.蛋白提取5.1.离心收集细胞沉淀,用PBS缓冲液（预先于4℃预冷）洗涤细胞沉淀三遍后再用含1×Cocktail（蛋白酶抑制剂混合液）的RIPA裂解液（强）于冰上裂解20min。4℃、12000rpm离心20min收集蛋白上清。所提取出的蛋白样品浓度用碧云天BCA试剂盒测定。6.蛋白免疫印迹6.1.所提取蛋白经97℃变性。取30微克蛋白进行SDS-PAGE凝胶（10%）电泳分离,将凝胶分离后的蛋白条带转至预活化过的PVDF膜上,PVDF膜在室温条件下用TBST配制的5%BSA封闭2小时。2小时后配制1000倍稀释的TCEA1抗体稀释液于4℃条件下孵育PVDF膜。次日,将洗涤后的PVDF膜转入盛有二抗稀释液的器皿中并在室温条件下孵育2小时。2小时后用TBST再洗涤三次。洗涤完毕后用ECL发光液孵育PVDF膜并在显影仪中曝光成像,检测32Dcl3-shTCEA1.2031、32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538、32Dcl3-shTCEA1.454 细胞中 TCEA1 蛋白表达水平。7.总RNA提取7.1.32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538 细胞及对照细胞于诱导分化培养基中培养24h后,离心收集细胞沉淀;加入1ml TRIzol试剂处理5min使细胞内RNA释放至溶液中;加入200ul氯仿室温处理5min,4℃、12000rpm离心15min使溶液分相;收集上清,500ul异丙醇沉淀RNA;75%乙醇洗涤RNA沉淀;室温放置10min使乙醇挥发干净,10min后用一定体积无RNaseA的双蒸水溶解沉淀团块;Nanodrop测定RNA浓度及纯度。8.实时荧光定量PCR（qPCR）8.1.以上述所提取的RNA为模板,利用逆转录聚合酶链式反应合成相应cDNA;用 Thermo 公司的 SYBR Green Supermix 试剂及 50ng 的 cDNA 模板进行实时荧光定量PCR分析诱导分化培养条件下32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538 细胞及对照细胞中 MPO、PRTN3、ELANE、LTF、MMP9及CRISP3的mRNA表达水平。9.细胞增殖9.1.台盼蓝染色、细胞计数:32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538 细胞及对照细胞系用生长培养基（添加有1ng/ml IL-3的1640培养基）培养1、3、5、7天或用诱导分化培养基（添加有50ng/ml G-CSF的1640培养基）培养5天后用0.4%台盼蓝着色液使细胞着色并在显微镜下计数细胞数目,着色的为死细胞,未被着色并且折光性好的为活细胞,以此检测各细胞系细胞增殖/存活情况。并且在每一次实验中每一个样品设置3个重复复孔。9.2.细胞周期实验:收集1×106个由生长培养基（添加有lng/ml IL-3的1640培养基）或诱导分化培养基（添加有50ng/ml G-CSF的1640培养基）培养的细胞,细胞用PBS洗涤2遍后再用预冷的70%乙醇固定过夜（24小时以上）。在37℃条件下用200ug/ml的RNase A处理半小时。50ug/ml碘化丙啶（PI）于冰上对细胞进行染色5min,5min后用流式细胞仪测定各细胞系细胞周期分布的情况。10.细胞凋亡10.1.收集1×106个生长培养基或诱导分化培养基培养的细胞,用Annexin V-PE及7-AAD染料使细胞着色,流式细胞仪测定各细胞系细胞凋亡情况。11.形态学染色分析11.1.收集细胞并制成小体积细胞悬液,细胞悬液制成细胞涂片后用Wright-Giemsa染色法进行着色:用600ul试剂一固定1min;加1200ul试剂二染色7min;双蒸水清洗30-40s;自然晾干、镜检;中性树脂封片;Olympus显微拍摄,从细胞形态学水平分析各细胞系细胞分化情况。12.GEO数据库分析12.1.运用GEO数据库分析正常细胞及肿瘤细胞中TCEA1表达水平。12.2.运用GEO数据库分析TCEA1表达下调后重要转录因子表达变化情况。13.数据统计分析13.1.数据用Mean±-SD表示,结果应用GraphPad Prism 5统计软件进行统计分析,实验组和对照组间显着性检验用t检验完成。P值小于0.05为显着性差异,表明实验结果有统计学意义。研究结果1.通过shRNA文库筛选出具有调节粒细胞增殖潜能的功能基因:在shRNA文库筛选中我们首先将shRNA文库包装成逆转录病毒并感染从小鼠股骨分离得到的BM细胞,通过病毒感染的方法将这些shRNA整合到细胞基因组中,最后利用流式分选仪分选出被shRNA文库病毒感染的BM细胞（GFP+7-AAD-的细胞）。然后,我们通过甲基纤维素筛选培养筛选出28个具有促细胞增殖表型的阳性克隆。通过测序、序列比对等步骤最终获得了具有促增殖功能的shRNA序列。这些shRNAs最后分别对应18个基因,它们涉及细胞功能调节的诸多方面包括基因表达调控、细胞信号转导、细胞周期调控及转录调节等。最后,我们选取了 shRNA文库筛选中得分较高的候选基因Tcea1、Eps8及Znf212,并通过体外细胞实验初步验证了这几个基因沉默对粒细胞增殖的作用,结果显示Tcea1、Eps8、Znf212基因沉默均能促进粒细胞增殖。流式分析显示shTCEA1、shEPS8、shZNF212病毒感染的细胞中S期细胞比例分别较对照组升高13.89%、9.39%、5.3%;细胞计数实验显示感染shTCEA1、shEPS8、shZNF212病毒的细胞存活分别较对照组上升271.95%、254.88%、60.98%。这些均表明我们有效的从混合文库中筛选出了具有促粒细胞增殖潜能的基因,并且沉默Tcea1对粒细胞增殖的促进作用最为明显,因此我们将Tcea1基因作为后续重点研究的基因代表。2.GEO数据库（GSE47044）分析显示TCEA1在淋巴瘤（一种血液细胞肿瘤）中表达下调:该数据库分析结果提示TCEA1功能失活与血液细胞增殖的潜在关联。3.细胞增殖实验表明沉默TCEA1促进粒细胞增殖/存活能力:含IL-3或G-CSF的培养基培养细胞计数结果显示TCEA1沉默的32Dcl3-shTCEA1.1669、32Dcl3-shTCEA1.538细胞存活能力高于对照组细胞;用含1ng/ml IL-3的培养基培养细胞时细胞周期流式分析结果显示32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞系S期细胞分别比对照组升高8%和12%;用含50ng/ml G-CSF的培养基培养细胞时细胞周期流式分析结果显示32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞系S期细胞分别比对照组升高5%、8%。4.分子及细胞形态学实验表明沉默TCEA1阻碍粒细胞分化进程:qPCR结果显示 TCEA1 沉默的细胞系 32Dcl3-shTCEA1.1669 和 32Dcl3-shTCEA1.538细胞表达高水平的初期颗粒蛋白如绿过氧物酶（MPO）、弹性蛋白酶（ELANE）及蛋白酶3（PRTN3）,而表达低水平的次级颗粒蛋白如乳运铁蛋白（LTF）、富含半光氨酸的分泌蛋白3（CRISP3）及三级颗粒蛋白如基质金属蛋白酶9（MMP9）;细胞形态学分析显示TCEA1沉默的32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞处于粒细胞分化早期相对幼稚阶段:细胞核质比例大、细胞核成圆形或卵圆形、细胞核边缘清晰、极少数细胞的细胞核中出现中心小洞、因细胞含大量早期的嗜苯胺蓝颗粒细胞染色偏紫蓝色。而对照细胞呈现成熟粒细胞形态:细胞核形态古怪并呈分叶现象,有马蹄形细胞核、分叶形细胞核（有的细胞核分2叶、3叶、4叶,甚至分5叶）、细胞因分化成熟胞质嗜碱性减少从而染色偏玫红色。5.细胞凋亡实验表明沉默TCEA1抑制粒细胞凋亡:在含IL-3的培养基中培养 TCEA1 沉默的 32Dcl3-shTCEA1.1669 和 32Dcl3-shTCEA1.538 细胞,Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测显示凋亡细胞分别较对照组下降8.17%、6.77%;在G-CSF诱导培养条件下培养的32Dcl3-shTCEA1.1669和32Dcl3-shTCEA1.538细胞,凋亡细胞分别较对照组下降了 37.5%、31.37%。6.GEO数据库分析表明沉默TCEA1影响某些转录因子表达:TCEA1沉默的细胞中C/EBPα、GFI-1转录因子表达水平升高,而C/EBPε、IRF8转录因子的表达水平降低。结论1.初步筛选出以TCEA1、EPS8及ZNF212为代表的18个具有调节粒细胞增殖潜能的候选功能基因。2.TCEA1在粒细胞生长发育过程中扮演着重要角色:沉默TCEA1通过促进粒细胞增殖、抑制粒细胞凋亡同时阻碍粒细胞正常分化进程从而使幼稚细胞大量积累并缺少成熟的免疫细胞。3.TCEA1表达下调与血液肿瘤发生发展具有相关性。4.TCEA1可能通过调节与成熟分化相关的基因表达从而调控粒细胞生长发育。研究背景乳腺癌是目前女性中较为常见的恶性肿瘤之…,具有发病机理复杂、类型多样等特点。目前该恶性肿瘤的发病率1丨:在以每年3%的速度持续上升。在世界各地每年约有上百万人被检齐出患冇乳腺癌,其中就有数十万人不幸死于乳腺癌。目前针对乳腺癌患者的临床治疗策略丨?:要冇:传统的手术切除联合化疗法、对雌激素阳性的病人所采用的内分泌治疗法、对于HER2阳性、EGFR突变病人的靶向治疗法等。但对于高转移性的乳腺癌患者而言,上述疗法预后差、易复发。为此在乳腺癌中发现新的致癌抑癌机制、揭不新的分子治疗靶标及其应用,对乳腺癌的临床治疗将要价饥。Chromosome 2 open reading frame 40（C2ORF40）,XNEsophagealcancerrelated gene 4（￡C7?GV）,是一个抑癌棊W。C26W却在人组织中广泛表达并锚定于细胞表面。作为抑癌耗因,参与众多生物学进程如细胞增殖、分化、衰老、侵袭、迁移、先天免疫、炎症等的调节。在诸多肿瘤如食道管癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胶质瘤等肿瘤组织中C26IAF洲表达水平降低,并且高水平表达与患者无病存活期及无转移存活呈正相关性,C20i?/却低表达可作为乳腺癌、鼻咽癌等肿瘤患者预后差的重要标志。C20/JF扣高表达可通过抑制细胞增殖、侵袭、迁移及促进细胞凋亡从而发挥抑癌功能。目前认为C2ORF40是通过旁分泌机制起抑癌作用,在发挥抑癌作用时,C2ORF40如何将抑癌信号转移至细胞内,目前尚不明确。受体酷氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase,RTK）即是一种受体也是一■种激酶,均含有一个胞外配体结合域、一个疏水跨膜域和一个包含保守激酶域的胞内片段,负责细胞夕卜配体刺激信息至细胞内的跨膜信号转导。受体酪氨酸激酶及其下游胞内信号可以调节多种生物学进程包括细胞增殖、分化、侵袭、迁移以及凋亡。在多种肿瘤如乳腺癌中均发现酪氨酸激酶受体信号的异常,酷氨酸激酶受体功能获得性突变、高表达、基因扩增均与多种疾病相关。表皮生长因子受体1（Epidermal growth factor receptor 1,EGFR又称ErbBl）是1型酪氨酸激酶受体的重要成员,属于ErbB家族受体,EGFR在不同类型乳腺癌中高表达及其介导的跨膜信号转导是促进乳腺癌细胞增殖的机制之一,为此EGFR阳性可以作为三阴性乳腺癌预后不良的独立性指标。成纤维生长因子受体1（Fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1）是另-受体酪氨酸激酶家族的成员,在进化上比较保守,能调节许多的生物学进程如组织发育、血管生成以及组织再生等。FGFR1介导的跨膜转导信号异常与乳腺癌的发生具有显着相关性,许多证据显示FGFR1信号的异常活化与肿瘤的发病机理、肿瘤治疗耐药性有关,研宄表明肿瘤细胞（如非小细胞肺癌细胞）耐药性是由FGF-2-FGFR1及其下游信号上调所引起的。Vascular endothelial growth factor receptor 1（VEGFR1也叫Fltl）是VEGFR家族中两个最重要的酪氨酸激酶受体之一,具有调节血管生成、血管再生及肿瘤发生、肿瘤转移等过程的功能。有研究表明在血管生成及再生过程中VEGFR1具有正负调节功能。近年来,越来越多的证据显示VEGFR1在血管生成的调控中不仅仅局限于是一个诱饵受体这么简单,在血管生成中VEGFR1是一个正调控因子。VEGFR1高表达及其信号的异常活化可促进乳腺癌细胞生长并与乳腺癌高转移风险及复发相关,当用VEGFR1专一性抗体或针对VEGFR1的抗血管生成小肽F56处理时可抑制其信号传递从而抑制乳腺癌细胞生长。本研究主要探讨利用串联亲和质谱纯化技术鉴定出与C2ORF40相互作用的跨膜蛋白,并试图建立C2ORF40抑制乳腺癌的跨膜信号转导机制。本研究的完成初步建立了C2ORF40发挥其抑功能癌的一种新的潜在机制,为理解C2ORF40的抑癌机制提供了新的理论基础。研究目的1.应用TAP-MS技术寻找并鉴定与C2ORF40相互作用的蛋白。为进一步建立C2ORF40抑癌信号跨膜转导机制的研宄奠定基础。2.建立C2ORF40抑制乳腺癌的跨膜信号转导机制。研究方法1.细胞培养1.1.HEK293T细胞、人乳腺癌MDAMB468细胞系用添加有10%FBS、100u/ml青霉桌、丨OOug/m丨链霉素的DMEM培养基培养;人乳腺癌BT549细胞系、MDAMB23丨细胞系用添加有10%FBS、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPM丨丨640养基培养。1质粒构建2.1.C2ORF40序列从pBabe-puro-C2ORF40质粒上扩增下来构建到逆转录病毒表达载体pBabe-puro1-.,构建出pBabe-3xFlag-C2ORF40-HA、pBabe-3xFlag-HA-C2OHF40质粒及其和关对照质粒,构建成功后经测序验证。2.2.以pCMV10-3xFlag-MCS-HA及pCMV10-3xFlag-HA-MCS为载体分别构建出瞬时高表达C2ORF40的质粒pCMV10-3xFlag-C20RF40-HA和pCMV10-3xFlag-HA-C2（）RF40,|nj时构建相应对照空白质粒。构建成功后经测序验证。2.3.构建shFGFRl、shVEGFRl、shHGFR及相应对照质粒,并经测序验证。3.稳转细胞系建立3.1.运用Phi-NX细胞将pBabe-puro-3xFlag-HAC2ORF40、pBabe-puro-3xFlagC2ORF40-HA及其相设对照质粒包装成逆转录病毒。将逆转录病毒感染BT549及MDAMB231乳腺癌细胞系建立C2ORF40高表达的BT549-C2ORF40和MDAMB231-C2ORF40细胞系及相应对照细胞系BT549和MDAMB231。C2ORF40沉默的MDAMB468-shC2ORF40细胞系及相应对照细胞系MDAMB468在实验室的前期研究中己经建立。4.串联亲和纯化与C2ORF40相互结合的蛋白质4.1.上述瞬时高表达C2ORF40的双标签质粒及其对照质粒经威格拉斯大提试剂盒纯化后用lip2000转染到HEK293T中,48h后收集细胞沉淀并提取蛋白质。所得蛋白提取物用偶联3xFlag蛋白标签的琼脂糖珠进行首次纯化,纯化蛋白经3xFlag多肽置换下来后再用偶联HA蛋白标签的琼脂珠进行二次纯化。二次纯化复合物用10%SDS-PAGE胶分离。凝胶电泳分离完成后用银染试剂盒对电泳条带进行染色并用手术刀切下高表达C2ORF40组中的特异性蛋白条带于1.5mlEP管中,4摄氏度储存。5.质谱鉴定与C2ORF40相互结合的蛋白质5.1.按标准蛋白胶内酶解的方法对蛋白条带进行脱色、还原、酶解、萃取、Zip-tip柱子脱盐等步骤后用LC-MS/MS分离分析。5.2.LC-MS/MS分析:上述样品用赛默公司的高压液相色谱串联的混合线性离子井质谱仪进行鉴定。二级质谱数据采用Mascot和Sequest数据库进行搜索并用Proteome Discovererl.4进行分析与鉴定。6.免疫共沉淀验证串联亲和纯化质谱鉴定结果6.1.将C2ORF40瞬时高表达的双标签质粒及其对照分别转染HEK293T,C2ORF40在HEK293T细胞中瞬时高表达48h后提取蛋白质,用3xFlag标签抗体免疫沉淀C2ORF40蛋白及其互作蛋白GRB2,Western blot检测GRB2蛋白。7.免疫共沉淀检测C2ORF40与RTKs之间的结合情况7.1.在HEK293T细胞中瞬时高表达C2ORF40双标签质粒,用3xFlag标签抗体免疫沉淀C2ORF40及其相互作用蛋白复合物,Western blot检测各受体与C2ORF40之间的结合情况。8.检测C2ORF40与RTKs在乳腺癌细胞中的结合情况8.1.在稳定表达pBabe-3xFlag-C2〇RF40-HA质粒的乳腺癌MDAMB231细胞中,运用免疫共沉淀技术验证C2ORF40与GRB2以及各RTKs的专一性结合情况,并用相关受体抗体反向免疫共沉淀C2ORF40进行验证.,9.分别干扰FGFR1、VEGFR1、EGFR表达后检测GRB2、FGFR1、VEGFR1、EGFR与C2ORF40之间结合情况9.1.将shVEGFRl、shFGFRl、shEGFR干扰质粒及相应对照质粒瞬时转染稳定表达pBabe-3xFlag-C2ORF40-HA质粒的MDAMB231-C2ORF40细胞,免疫共沉淀检测各受体GRB2与C2ORF40的相互结合、FGFR1与C2ORF40之间的相互结合、VEGFR1与C2ORF40之间的相互结合及EGFR与C2ORF40之间的相互结合情况。10?检测C2ORF40对FGFR1、VEGFR1及EGFR受体磷酸化及其下游信号磷酸化的影响10.1.提取高表达C2ORF40或其对照质粒的MDAMB231蛋白,运用相应受体的抗体进行免疫沉淀富集,酪氨酸磷酸化抗体p-Tyr-100检测C2ORF40高表达纟U及其对照组中VEGFR1、FGFR1、EGFR受体磷酸化情况。10.2.Western blot检测高表达C2ORF40或沉默C2ORF40乳腺癌细胞系中受体酪斌酸激酶信号通路h游靶蛋白ERK的激活情况11?检测C2ORF40对生长因子诱导的受体磷酸化的彩响11.1.MDAMB231-C2ORF40及其对照MDAMB231细胞密度至80%左右时血清饥饿过夜G分别用VEGF、FGF-2、EGF生长因子刺激20min。提取总蛋门,川VEGFR1、FGFR1、EGFR抗体进行免疫沉淀进行富集。酪氨酸磷酸化抗体p-Tyr-100及Western blot检测C2ORF40高表达对VEGF诱导的VEGFR1受体怜酸化、对FGF-2诱导的FGFR1受体怜酸化、以及对EGF诱导的EGFR磷酸化的影响。12.检测C2ORF40高表达情况下RTKs抑制剂单独用药或联合用药对RTKs下游ERK蛋白活化的影响12.1.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）单独用药或以ZM306416、PD173074联合用药为例处理C2ORF40高表达或不表达的乳腺癌细胞48h。48h后提取总蛋白,Western blot检测各处理组中ERK活化情况。13.检测受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响13.1.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）、EGFR抑制剂（Gefitinib）分别处理高表达C2ORF40质粒或其相应空载质粒的各乳腺癌细胞系,通过MTT实验、克隆形成实验检测受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞增殖能力的影响。13.2.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）、EGFR抑制剂（Gefitinib）分别处理高表达C2ORF40质粒或其相应空载质粒的各乳腺癌细胞系,运用划痕愈合能力实验及Tramwell实验检测各受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞迁移能力的影响。13.3.VEGFR1抑制剂（ZM 306416）、FGFR1抑制剂（PD173074）、EGFR抑制剂（Gefitinib）分别处理高表达C2ORF40质粒或其相应空载质粒的各乳腺癌细胞系,应用Matrigel实验检测各受体酪氨酸激酶抑制剂处理后C2ORF40高表达对肿瘤细胞侵袭能力的影响。14.数据统计分析14.1.Western blot结果用ImageJ软件进行灰度分析。数据用Mean士SD表示,应用GrphPad Prism 5统计软件进行统计分析,实验组和对照组间显着性检验用f检验完成。P值小于0.05为显着性差异,实验结果有统计学意义。研究结果1.成功构建瞬时高表达C2ORF40或基于逆转录病毒载体的双标签质粒和乳腺癌细胞系:成功构建高表达C2ORF40的双标签质粒pCMV10-3xFlagC2ORF40-HA、pCMV10-3xFlag-HA-C20RF40、pBabe-puro-3xFlagC2ORF40-HA、pBabe-puro-3xFlag-HA-C20RF40及其相应对照质粒。并构建出稳定表达pBabe-puro-3xFlag-C2ORF40-HA、pBabe-puro-3xFlag-HAC2ORF40及其相应对照质粒的稳转乳腺癌细胞系:MDAMB231-C2ORF40、MDAMB231、BT549-C2ORF40、BT549。2.运用串联亲和纯化结合质谱技术成功鉴定并验证C2ORF40与GRB2之间的结合:在HEK293T细胞中瞬时高表达pCMV10-3xFlag-C20RF40-HA质粒,运用Falg、HA抗体进行两次免疫共沉淀富集C2ORF40及与C2ORF40相互结合的蛋白复合物。SDS-PAGE凝胶分离、银染显色出特异性蛋白条带。切下特异性蛋白条带运用胶内酶解法对胶块脱色及酶解等处理,最终通过质谱鉴定出与C2ORF40结合的GRB2蛋白。3.C2ORF40与RTKs的相互结合:在HEK293T及乳腺癌MDAMB231细胞中通过免疫共沉淀技术检测出C2ORF40与乳腺癌中常见的VEGFR1、FGFR1、EGFR之间存在结合关系,并在乳腺癌细胞中通过VEGFR1、FGFR1、EGFR抗体反向免疫共沉淀的方法证实这些互作关系。当用分别针对VEGFR1、FGFR1、EGFR的shRNA处理MDAMB231-C2ORF40细胞后,与C2ORF40结合的VEGR1、FGFR1、EGFR及GRB2蛋白均明显减少,这一现象进一步证实上述受体与C2ORF40之间的结合关系。而C2ORF40 4乳腺癌中其他常见的RTKs（VEGR2、FGFR2、HER2、HER4、IGF1R）之间无结合。4.C2ORF40高表达阻断了相应RTKs及其下游信号蛋白的激活:在C2ORF40高表达的乳腺癌细胞系MDAMB231-C2ORF40中VEGFR1、FGFR1、EGFR的磷酸化水平均明显减少,并且在C2ORF40高表达的MDAMB23卜C2ORF40及BT549-C2ORF40细胞中RTKs经典卜游蛋白ERK的磷酸化水平也明显下降,当在C2ORF40本底表达较高的MDAMB468细胞中用基因沉默技术干扰掉C2ORF40表达后ERK的磷酸化水平升高。5.C2ORF40髙表达引起的受体酪?酸激酶激活受阻不能够被生长因子逆转:50ng/ml VEGF处理乳腺癌细胞20min,免疫共沉淀及Western blot联合检测细胞内P-VEGFR1水平,VEGF处理后MDAMB231细胞p-VEGFRl显着升高,而MDAMB231-C2ORF40内p-VEGFRl水平改变不明显;10ng/ml FGF-2处理乳腺癌细胞20min,免疫共沉淀及Western blot联合检测细胞内p-FGFRl水平,FGF-2处理后MDAMB231细胞p-FGFRl姑着升高,而MDAMB23卜C2ORF40内p-FGFRl水平改变不明显;100ng/ml KGF处理乳腺癌细胞20min,免疫共沉淀及Western blot联合检测细胞内p-EGFR水f,EGF处理后MDAMB231细胞p-EGFR显着升高,而MDAMB231-C2ORF40内p-EGFR水平改变不明显。6.C2ORF40同时靶向VEGFR1、FGFR1、EGFR抑制RTKs下游ERK信号激活:VEGFR1抑制剂（ZM 3064 1 6）、FGFR1抑制剂（PD173074）、KGFR抑制剂（Gefitinib）单独用药或以ZM306416、PD173074联合用药为例处理C2ORF40高表达及相应对照乳腺癌细胞。对照组细胞表达高水平的pERK,加酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞内p-ERK水平明显下降,当ZM306416与PD173074联合用药后对照组细胞内p-ERK水平进一步下降;与之对应,C2ORF40高表达细胞内p-ERK水平显着下降,且在酪氨酸激酶抑制剂单独用药或联合用药时C2ORF40高表达组中的p-ERK水平不再明显下降;此外,C2ORF40高表达对乳腺癌细胞内p-ERK的抑制作用可堪比酪氨酸激酶抑制剂联合用药对P-ERK产生的抑制效果。7.C2ORF40通过RTKs信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力:C2ORF40通过RTKs通路抑制乳腺癌细胞增殖:首先,MTT实验表明C2ORF40高表达组乳腺癌细胞增殖能力明显受到抑制,且当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理（以ZM306416、PD173074为例）后细胞增殖能力不再明显下降;而对照组细胞具备高增殖能力并在受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的增殖能力明显受到抑制。其次,克隆形成实验表明C2ORF40高表达组细胞克隆形成能力明显受到抑制,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的克隆所形成数目变化不明显;而对照组细胞具备高克隆形成能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的克隆形成能力明显受到抑制。C2ORF40通过RTKs通路抑制乳腺癌细胞迀移:首先,划痕愈合能力实验结果表明C2ORF40高表达明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞划痕愈合能力不再明显下降;而对照细胞具备高划痕愈合能力,并且使用受体酪氨酸激酶抑制剂后该愈合能力明显下降。其次,Transwell小室实验表明C2ORF40高表达抑制乳腺癌细胞迁移能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞迁移能力不再明显下降;而对照组细胞具备高迁移能力,并且该能力在受体酪氨酸激酶抑制剂处理后明显下降。C2ORF40通过RTKs通路抑制乳腺癌细胞侵袭能力:Matrigel实验表明C2ORF40高表达组细胞迁移能力明显受到抑制,且在用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的迁移能力不再继续下降;而对照组细胞具备高侵袭能力,当用受体酪氨酸激酶抑制剂处理后细胞的侵袭能力明显受到抑制。结论1.我们通过串联亲和纯化质谱技术鉴定出了与C2ORF40结合的GRB2蛋白,并由此进一步明确了与C2ORF40结合的酩氨酸激酶受体VEGFR1、FGFR1、EGFR。提示C2ORF40可能通过以上酪氨酸激酶受体将胞外抑癌信号传递到了胞内。2.C2ORF40与VEGR1、FGFR1及EGFR结合从而阻断了相应受体酪氨酸激酶的激活,并进一步阻断了这些受体酪氨酸激酶信号通路下游经典蛋白ERK的激活3.C2ORF40通过阻断受体酪氨酸激酶（VEGFR1、FGFR1、EGFR）信号通路从而发挥其抑癌功能,并最终抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
朱旗[10]（2018）在《孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用》文中研究表明早期胚胎停育,又称稽留流产（missed abortion,MA）,是指妊娠早期胚胎停止发育、胚胎未见孕囊或心血管搏动等,是一种特殊类型的自然流产。我国MS的临床发病率为13%,且近年来呈现上升趋势,已经成为育龄妇女面临的一个重大健康问题。然而,但MA发生的确切机制至今尚未完全清楚。胎盘是妊娠期保证胎儿正常生长发育的临时性器官,是胎儿与母体进行营养和气体交换的唯一渠道。在胚胎发育过程中胎盘血管的形成和发育程度与妊娠的成功与否关系密切。胎盘发育异常是引起稽留流产的一个重要原因。在稽留流产中胎盘的病理生理变化尚不十分清楚,并且胎盘异常发生的分子机制也有待深入研究。MicroRNA（miRNA）是一种仅有18-25个核苷酸的内源性单链小分子RNA,广泛存在真核生物中,具有高度的保守性、组织特异性和时序性,在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中发挥着重要的作用。我们实验室的前期研究显示胎盘miRNAs异常表达参与了妊娠糖尿病的发生,而同样作为妊娠期相关疾病的稽留流产,miRNAs在其胎盘组织异常发育过程中的作用尚不明确。为了观察MA胎盘绒毛组织的病理学变化,采用免疫组化法检测了标记胎盘血管生成和滋养层细胞入侵情况的血管内皮生长因子（VEGF）、反应滋养层细胞分布情况的细胞角蛋白（CK19）和反应蜕膜间充质细胞分布情况的波形蛋白（Vimentin）在MA患者和正常早孕对照绒毛组织中的表达差异;通过Tunel检测法测定了 MS患者和正常对照胎盘绒毛组织的凋亡情况。结果显示,VEGF、CK19及Vimentin在胚胎停育的胎盘绒毛组织及正常对照绒毛组织中均有表达,VEGF的阳性信号主要定位于绒毛滋养细胞（包括细胞滋养细胞和合体滋养细胞）及间质细胞,CK19主要表达于滋养层细胞,Vimentin在间充质细胞及血管内皮细胞中表达丰富。利用H-score评分分析病例组及对照组的VEGF、CK19及Vimentin表达差异发现,病例组VEGF的表达水平显着低于对照组（P<0.001）,其与已经报道的自然流产中VEGF表达水平较低的研究结果相一致。对照组及病例组的CK19和Vimentin表达没有明显差异。在MA患者及正常早孕对照胎盘绒毛中均存在细胞凋亡,病例组的凋亡指数显着高于对照组（P<0.001）。这些结果提示MA发生时胎盘血管形成和绒毛滋养层细胞入侵受阻,滋养层细胞发生凋亡,其可能引起绒毛生长受限、侵袭不足,阻碍孕卵发育,从而发生胚胎停育。为了研究MA患者胎盘异常发育的分子机制,我们首先筛选了在MA患者胎盘组织中差异表达的miRNAs。miRNA探针原位杂交和RT-PCR方法被用来检测miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者胎盘中的表达。原位杂交结果显示miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者及正常早孕绒毛组织中的均有广泛表达,主要分布于细胞滋养层细胞、合体滋养层及间质细胞。对miRNAs的阳性信号进行平均光密度统计分析发现,与对照组相比,miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a的表达在MA患者绒毛组织中均有显着升高（均P<0.05）。Real-time PCR结果显示miR-98、miR-16和miR-125a在对照组和病例组间的表达差异与其原位杂交结果一致（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。这些结果提示miR-98、miR-16和miR-125a表达上调可能是引起胚胎停育的相关因素。我们实验室前期的研究结果显示miR-98和miR-125a在胚胎植入和复发性流产中发挥重要作用,故本研究选择miR-98和miR-125a进行深入研究。为了进一步分析这些miRNAs与MA的关系,我们研究了 miRNAs在滋养层细胞中的作用及机制。Edu、MTT、transwell小室法被用来分析miRNA对人绒毛滋养细胞功能的影响;miRWalk、targetscan数据库被用来预测miRNA的靶基因;双荧光素酶报告基因检测系统和Real-time PCR被用来鉴定及验证miRNA的靶基因;基因补偿实验被用来进一步证实miRNAs与靶基因的作用关系。研究结果显示,过表达miR-98,滋养层细胞HTR8的迁移能力及活性显着降低（P<0.01,P<0.05）,敲低miR-98,HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高（P<0.05,P<0.05）,提示miR-98对细胞、增殖及迁移起抑制作用。生物信息学预测显示GDF6和PLEKHA8是miR-98的靶基因。利用双荧光素酶系统验证显示,含GDF6 3’UTR种子序列的重组质粒与miR-98模拟物共转染可以显着降低荧光素酶活性（P<0.01）,与miR-98抑制物共转染可以显着增加荧光素酶活性（P<0.05）,提示miR-98能够与GDF6 3’UTR发生结合。突变预测的miR-98与GDF6 3’UTR识别序列,荧光素酶的活性显着增加（P<0.05）,提示该位点突变可以抑制miR-98与GDF6 3’UTR结合。miR-98过表达,可以降低细胞中GDF6 mRNA表达水平（P<0.001）,敲低miR-98,GDF6表达量显着升高（P<0.05）。这些结果提示GDF6为miR-98靶基因。同样,双荧光素酶实验显示miR-98过表达可以显着抑制PLEKHA8的活性（P<0.05）,敲低可以明显促进PLEKHA8的活性（P<0.05）,突变miR-98识别的PLEKHA8 3’UTR位点,可以显着抑制miR-98与PLEKHA8 3’UTR结合（P<0.001）。qRT-PCR结果显示miR-98过表达可以降低细胞中PLEKHA8 mRNA表达水平（P<0.001）,miR-98低表达可以显着升高PLEKHA8 mRNA表达水平（P<0.05）。这些结果提示PLEKHA8为miR-98靶基因。靶基因RESCUE实验显示,敲低miR-98的同时抑制其靶基因PLEKHA8表达,可以使细胞增殖和迁移能力恢复到正常水平。过表达miR-125a,HTR8细胞的迁移能力及增殖显着降低（P<0.05,P<0.05）,敲低miR-125a,HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高（P<0.05,P<0.05）,说明miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用。过表达miR-125a可以抑制CBX7的表达,提示CBX7可能是miR-125a的靶基因。结论:胚胎停育的患者中,滋养层细胞与间质细胞的分布没有明显变化,而绒毛滋养细胞侵袭能力下降,细胞过度凋亡,说明VEGF低表达和细胞凋亡异常与MA发生相关;miR-98、miR-16和miR-125a的过表达参与了MA的发生;miR-98和miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用,miR-98通过下调GDF6及PLEKHA8发挥作用,miR-125a通过调节CBX7发挥作用。
二、应用快速引物原位标记技术检测鼻咽癌染色体异常（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用快速引物原位标记技术检测鼻咽癌染色体异常（论文提纲范文）
（1）1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 |
| 导论 |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 基因拷贝数变异的生物学意义 |
| 3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常 |
| 5. 问题与展望 |
| 6. 本项研究的目的和基本策略 |
| 结果 |
| 第一节 本研究入组病例及其临床病理特征 |
| 1. 膀胱癌肿瘤组织病例 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况 |
| 2. 膀胱癌尿样本 |
| 2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征 |
| 2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况 |
| 第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析 |
| 2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型 |
| 3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素 |
| 3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型 |
| 3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测 |
| 第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系 |
| 2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性 |
| 2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型 |
| 第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较 |
| 2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能 |
| 2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型 |
| 3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略 |
| 2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用 |
| 5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系 |
| 6. 本项研究的局限性 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、研究病例和实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 3D数字PCR |
| 5. 引物序列 |
| 6. 主要仪器和设备 |
| 7. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 尿沉渣DNA提取 |
| 2. 实时荧光定量PCR |
| 3. 扩增产物质量检测 |
| 4. 引物扩增标准曲线 |
| 5. 3D数字PCR |
| 6. 统计学方法 |
| 第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义 |
| 导论 |
| 1. EB病毒概述 |
| 2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤 |
| 3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系 |
| 5. 本项研究的目的和策略 |
| 结果 |
| 第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达 |
| 1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.1 miRNA芯片质量控制 |
| 1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA |
| 1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能 |
| 2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达 |
| 2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA |
| 3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析 |
| 3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性 |
| 3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性 |
| 3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能 |
| 三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响 |
| 1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因 |
| 1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达 |
| 2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性 |
| 2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因 |
| 2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集 |
| 四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响 |
| 3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响 |
| 4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响 |
| 第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达 |
| 三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究 |
| 3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 |
| 4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究 |
| 5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品 |
| 2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品 |
| 3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 4. 主要试剂盒 |
| 5. 实时定量荧光PCR试剂 |
| 6. 细胞培养和miRNA转染 |
| 7. 常用试剂配制 |
| 8. 细胞培养用主要器皿 |
| 9. 主要仪器 |
| 10. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因表达谱芯片技术 |
| 2. 芯片数据读取 |
| 3. 芯片数据预处理和标准化 |
| 4. 第二代测序 |
| 5. miRNA实时定量荧光PCR |
| 6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 7. 细胞生物学实验方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（2）EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤的临床特征和环状RNA调控细胞增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤的临床及基因组学特征 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 环状RNA对EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤的调控增殖细胞作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤的诊疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）基于微阵列比较基因组杂交技术对喉鳞癌全基因组染色体拷贝数变异的整合分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 Array-CGH的研究进展 |
| 1.1.1 CGH技术概述 |
| 1.1.2 Array-CGH技术的发展 |
| 1.1.3 Array-CGH的基本原理 |
| 1.1.4 Array-CGH的应用 |
| 1.1.5 Array-CGH的优势及局限 |
| 1.1.6 Array-CGH的前景与展望 |
| 1.2 拷贝数变异(CNVs) |
| 1.2.1 CNVs概述 |
| 1.2.2 CNVs的检测方法 |
| 1.2.3 CNVs与肿瘤 |
| 1.2.4 CNVs研究展望 |
| 1.3 喉癌的分子遗传学研究进展 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 喉癌与CNVs |
| 1.3.3 喉癌相关基因 |
| 1.3.4 展望 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究样品采集 |
| 2.1.2 临床信息采集 |
| 2.1.3 研究样品的保存 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2.1 实验仪器及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 试剂配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 喉癌肿瘤组织标本基因组DNA提取 |
| 2.3.2 喉癌基因组DNA质量检验 |
| 2.3.3 喉癌基因组DNA和对照DNA标记 |
| 2.3.4 Array-CGH样品杂交 |
| 2.3.5 Array-CGH基因芯片的洗涤 |
| 2.3.6 Array-CGH基因芯片的扫描 |
| 2.3.7 Array-CGH数据分析 |
| 2.3.8 GEO数据提取 |
| 2.3.9 数据库数据处理 |
| 2.3.10 绘制火山图和热图 |
| 2.3.11 RT-PCR检测基因表达 |
| 2.3.12 免疫组织化学染色 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 喉癌DNA微阵列比较基因组杂交分析 |
| 3.1.1 病例资料分析 |
| 3.1.2 Array-CGH结果分析 |
| 3.1.3 基因组不平衡与临床病理特征的相关性 |
| 3.2 基于GEO数据库HNSCC差异表达基因的筛选 |
| 3.2.1 GEO数据库差异表达基因分析 |
| 3.2.2 筛选LSCC相关候选基因 |
| 3.3 检测基因在喉癌中的表达及临床意义 |
| 3.4 免疫组化结果分析 |
| 3.4.1 PCDH20、NEIL3、SPINK5、CDKN2A在喉癌组织中表达情况 |
| 3.4.2 喉癌组织PCDH20、NEIL3、SPINK5、CDKN2A表达与患者临床病理特征的关系 |
| 3.4.3 DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2 在喉癌组织中表达情况 |
| 3.4.4 喉癌组织DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2表达与患者临床病理特征的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）向心组装蛋白STIL基因敲除用于鼻咽癌治疗的探索研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 1.1 鼻咽癌 |
| 1.1.1 鼻咽癌的病因及风险因素 |
| 1.1.2 鼻咽癌的治疗进展 |
| 1.1.3 鼻咽癌的分子遗传学研究 |
| 1.2 STIL中心粒组装蛋白的相关研究 |
| 1.2.1 STIL基因的结构 |
| 1.2.2 STIL基因与中心粒 |
| 1.2.2.1 中心粒与肿瘤 |
| 1.2.2.2 STIL 在中心粒中的作用 |
| 1.2.3 STIL基因与肿瘤 |
| 1.2.4 STIL与全脑先天性畸形(HPE) |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 本研究的创新点 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 基于公共数据库TCGA分析STIL与肿瘤的关系 |
| 2.1.1 分析STIL在其他肿瘤中的表达 |
| 2.1.2 分析STIL对肿瘤生存率的影响 |
| 2.2 STIL干扰细胞在动物水平的验证 |
| 2.2.1 实验耗材 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 STIL干扰后细胞生物特性检测 |
| 2.3.1 STIL RNA干扰慢病毒感染细胞 |
| 2.3.2 qPCR内源检测RNAi效率 |
| 2.3.3 STIL干扰细胞的Affymetrix芯片检测 |
| 2.3.4 Western Blot下游基因检测 |
| 2.3.5 qPCR下游基因检测 |
| 2.4 STIL干扰后对肿瘤侵袭和迁移的影响 |
| 2.4.1 Transwell检测细胞迁移 |
| 2.4.2 侵袭小室检测侵袭能力 |
| 2.5 鼻咽癌转移样本的蛋白质组学研究 |
| 2.5.1 鼻咽癌血清样本的DIA质谱检测 |
| 2.5.2 差异蛋白的ELISA检测 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 基于TCGA公共数据库对STIL与肿瘤关系的分析 |
| 3.1.2 动物水平验证STIL干扰后鼻咽癌的增殖 |
| 3.1.3 STIL基因干扰后细胞生物特性 |
| 3.1.4 STIL干扰后细胞的侵袭和迁移能力 |
| 3.1.5 鼻咽癌转移血清样本的蛋白组学分析 |
| 3.2 讨论与总结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 答辩委员签名的答辩决议书 |
（5）EB病毒感染与淋巴瘤及骨髓增生异常综合征的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA提取及检测 |
| 2.1.1 骨髓细胞基因组DNA提取 |
| 2.1.2 DNA浓度和纯度检测 |
| 2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR) |
| 2.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.2 PCR反应结果解读 |
| 2.3 细胞免疫学分型 |
| 2.4 制备染色体与R显带 |
| 2.4.1 染色体的制备 |
| 2.4.2 染色体R显带 |
| 2.4.3 染色体核型分析 |
| 2.5 临床随访 |
| 2.6 数据处理方法 |
| 结果 |
| 1 EBV在淋巴瘤及MDS中的表达 |
| 2 非霍奇金淋巴瘤(NHL)的免疫表型与 EBV |
| 3 EBV感染与核型异常的相关性 |
| 4 EBV感染与MDS的进展 |
| 5 EBV与其它临床及实验指标的相关性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（6）巴西橡胶树遗传图谱第11号、13号和14号连锁群26个遗传标记的物理定位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 橡胶树种质资源和品种选育 |
| 1.2 巴西橡胶树遗传图谱的研究进展 |
| 1.2.1 遗传图谱概述 |
| 1.2.2 遗传标记分类 |
| 1.2.3 巴西橡胶树分子遗传图谱的构建及研究现状 |
| 1.3 细胞遗传图谱的研究进展 |
| 1.3.1 细胞遗传图谱概述 |
| 1.3.2 细胞遗传图谱在植物中的应用 |
| 1.3.3 巴西橡胶树细胞遗传图谱的研究进展 |
| 1.4 分子细胞遗传图谱构建的几种关键技术 |
| 1.4.1 荧光原位杂交的应用及研究进展 |
| 1.4.2 原位PCR技术的研究进展 |
| 1.4.3 植物染色体核型分析 |
| 1.4.4 染色体标本制备方法及研究现状 |
| 1.5 本研究的目的意义与及技术路线 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 生化试剂 |
| 2.1.3 主要器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 橡胶树染色体标本的制备 |
| 2.2.2 橡胶树基因组DNA的提取及检测 |
| 2.2.3 特异性引物的设计、合成和筛选 |
| 2.2.4 特异性引物的PCR反应体系和扩增程序 |
| 2.2.5 特异性条带回收纯化 |
| 2.2.6 序列比对 |
| 2.2.7 荧光原位杂交探针的制备 |
| 2.2.8 原位PCR操作流程 |
| 2.2.9 荧光原位杂交操作流程 |
| 2.2.10 染色体上信号位点的位置计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树热研7-33-97基因组DNA的提取和纯度的检测 |
| 3.2 26个遗传标记特异序列的PCR扩增与测序比对结果 |
| 3.3 巴西橡胶树11号连锁群的4个遗传标记的物理定位分析 |
| 3.3.1 M613和MnSoD遗传标记的物理定位结果 |
| 3.3.2 gHbCIR295.PB和gHbCIR636遗传标记的物理定位结果 |
| 3.4 巴西橡胶树13号连锁群的5个遗传标记的物理定位分析 |
| 3.4.1 gHbCIR333遗传标记的物理定位结果 |
| 3.4.2 gHbCIR402和gHbCIR506.L2遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5 巴西橡胶树14号连锁群的9个遗传标记的物理定位分析 |
| 3.5.1 gHbCIR365.L2遗传标记原位PCR检测的物理定位结果 |
| 3.5.2 gHbCIR425遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.3 gHbCIR602遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.4 gHbCIR330和gHbCIR412_493遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.5 gHbCIR261和gHbCIR20.LI遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.6 gHbCIR290和gHbCIR409_415遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6 巴西橡胶树13号和14号连锁群8个遗传标记的双探针物理定位分析 |
| 3.6.1 gHbCIR671.L2和gHb_CIR644遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6.2 gHbCIR631.L2和gHbCIR670.PB遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6.3 gHbCIR686和gHbCIR31遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6.4 gHbCIR682.L2和gHbCIR360遗传标记的物理定位结果 |
| 3.7 巴西橡胶树连锁群的物理定位与其对应染色体的整合 |
| 4 讨论 |
| 4.1 染色体标本制备过程中的优化 |
| 4.2 橡胶树幼叶的采摘和适于制片时间的讨论 |
| 4.3 荧光原位杂交(FISH)注意事项的讨论 |
| 4.4 遗传标记在连锁群与染色体上位置关系的讨论 |
| 4.5 对含有已定位遗传标记的基因组scaffold的染色体归属问题的讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 附图3 |
| 附图4 |
| 附图5 |
| 附图6 |
| 附图7 |
| 附图8 |
| 附图9 |
| 附图10 |
| 附图11 |
| 附图12 |
| 附图13 |
| 附图14 |
| 附图15 |
| 附图16 |
| 附图17 |
| 附图18 |
| 附图19 |
| 附图20 |
| 附图21 |
| 附图22 |
| 附图23 |
| 附图24 |
| 附图25 |
| 附图26 |
| 附录Ⅰ 主要试剂的配制 |
| 附录Ⅱ 缩略语 |
| 附录Ⅲ 项目来源与硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）转铁蛋白受体TFRC调节鼻咽癌放射敏感性的作用和机制以及化疗联合靶向治疗提高转移鼻咽癌疗效的临床试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 转铁蛋白受体TFRC调节鼻咽癌放射敏感性的作用和机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 顺铂和 5-氟脲嘧啶联合尼妥珠单抗作为一线方案治疗转移鼻咽癌的开放性、多中心Ⅱ期临床试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）基于光谱技术的产前检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 荧光光谱技术在产前检测中的应用 |
| 1.1 光谱核型分析技术 (spectral karyotyping anal-ysis, SKY) 在产前检测中的应用 |
| 1.2 荧光定量PCR技术在产前检测中的应用 |
| 1.3 利用荧光光谱分析鉴别SNP等位位点比例诊断唐氏综合症 |
| 2 拉曼光谱在产前检测中的应用 |
| 2.1 常规拉曼光谱在产前检测中的应用 |
| 2.2 表面增强拉曼在产前检测中的应用 |
| 3 总结与展望 |
（9）TCEA1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ: TCEA 1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ: C2ORF40通过抑制受体酩氨酸激酶激活发挥抑制乳腺癌作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学位论文目录 |
| 博士在读期间参与的科研课题 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（10）孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 研究样本基本信息 |
| 2 早期停育胎盘绒毛组织病理变化研究 |
| 2.1 停育胎盘绒毛滋养层细胞入侵情况 |
| 2.2 滋养层细胞和蜕膜间质细胞分布的情况 |
| 2.3 胎盘细胞凋亡情况 |
| 3 胚胎停育组织差异表达miRNA的筛选 |
| 3.1 组织芯片的排列方式 |
| 3.2 miR-98在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.3 miR-16在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.4 miR-503在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.5 miR-125a在胚胎停育组织中的表达 |
| 4 候选miRNA在胎盘绒毛组织中的作用机制研究 |
| 4.1 miR-98在胎盘绒毛组织中的作用机制研究 |
| 4.2 miR-125a在胎盘绒毛组织中的作用研究 |
| 讨论 |
| 1. 早期停育胎盘绒毛组织中的病理学变化 |
| 2. miRNA与胚胎停育发生的相关性 |
| 3. miR-98和miR-125a在胚胎停育发生中的作用机制 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、应用快速引物原位标记技术检测鼻咽癌染色体异常（论文参考文献）
- [1]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
- [2]EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤的临床特征和环状RNA调控细胞增殖作用的研究[D]. 赵晨星. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]基于微阵列比较基因组杂交技术对喉鳞癌全基因组染色体拷贝数变异的整合分析[D]. 李东杰. 吉林大学, 2021(01)
- [4]向心组装蛋白STIL基因敲除用于鼻咽癌治疗的探索研究[D]. 欧阳颖. 华南理工大学, 2020(02)
- [5]EB病毒感染与淋巴瘤及骨髓增生异常综合征的相关性研究[D]. 张长凯. 青岛大学, 2019(03)
- [6]巴西橡胶树遗传图谱第11号、13号和14号连锁群26个遗传标记的物理定位研究[D]. 陈秋惠. 海南大学, 2019
- [7]转铁蛋白受体TFRC调节鼻咽癌放射敏感性的作用和机制以及化疗联合靶向治疗提高转移鼻咽癌疗效的临床试验[D]. 赵充. 武汉大学, 2019(08)
- [8]基于光谱技术的产前检测方法研究进展[J]. 林慧晶,吴琼,徐两蒲,孙艳,林多,陈冠楠,陈荣. 激光生物学报, 2019(01)
- [9]TCEA1对小鼠粒细胞增殖及分化潜能的调节作用研究[D]. 杨桃梅. 山东大学, 2018(06)
- [10]孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用[D]. 朱旗. 北京协和医学院, 2018(02)