一、蛋白激酶A参与介导大鼠受损背根节神经元的自发放电（论文文献综述）
罗宇婷[1]（2020）在《三法三穴对坐骨神经损伤大鼠背根神经节cAMP-PKA信号通路表达的影响》文中研究表明[目的]为了研究以三法三穴为代表的推拿手法是否通过影响cAMP-PKA信号通路进而促进SNI大鼠的损伤恢复,本研究以大鼠坐骨神经损伤模型（Sciatic Nerve Injury,SNI）为例,通过利用行为学、组织形态学、分子生物学技术对大鼠坐骨神经损伤后的情况进行综合评价,观察SNI大鼠的感觉功能和神经损伤的修复情况,探究推拿的起效机制,为推拿治疗周围神经损伤提供科学依据。[方法]以SD大鼠作为实验动物,将SD雄性大鼠分为正常组、假手术组、模型组及三法三穴组。模型组及三法三穴组通过坐骨神经夹持建立SNI模型,三法三穴组选择殷门、承山、阳陵泉三穴并使用“按摩推拿手法模拟仪”操作点法、拨法、揉法进行干预,每穴每法各1min。运用光热耐痛阈实验来评价大鼠感觉功能（痛温觉）的恢复,运用坐骨神经功能指数评价大鼠神经功能和后肢精细动作恢复情况;运用HE染色、尼氏染色和免疫荧光技术观察坐骨神经及DRG神经元形态;运用分子生物学技术检测背根神经节（DRG）中cAMP、PKA、CREB的表达情况,通过定性定量的检测方法,结合行为学、形态学结果进行综合分析,评价推拿对SNI大鼠感觉功能及神经功能恢复的影响,阐释推拿促进周围神经损伤修复的机理。[结果]1.光热耐痛阈实验—推拿能促进SNI大鼠感觉功能（痛温觉）的恢复光热耐痛阈结果显示SNI大鼠左足（正常侧）的实验结果组间（正常组、假手术组、模型组及三法三穴组）比较无统计学差异,而右足（患侧）差异较明显。造模后7d,正常组与假手术组结果相比无明显差异,而模型组明显高于正常组与假手术组（P<0.05）,提示夹持损伤导致了坐骨神经损伤,神经纤维出现了连续性中断,痛觉传导功能受损。推拿20d后,三法三穴组SNI大鼠的舔舐足部时间明显较造模后7d时缩短,低于模型组（P<0.05）。2.坐骨神经功能指数（SFI）—推拿能改善SNI大鼠的后肢精细动作和受损神经恢复造模后7d,正常组与假手术组实验结果无明显差异,模型组SFI指数与假手术组相比有所降低（P<0.05）。此时可见坐骨神经损伤后大鼠患侧后肢出现无法受力及严重跛行的情况。干预20d后,模型组指数仍低于假手术组（P<0.05）,而三法三穴组指数高于模型组（P<0.05）。3.坐骨神经HE染色—推拿能改善SNI大鼠坐骨神经的结构正常组及假手术组坐骨神经神经纤维结构正常,纤维排列规则有序;模型组神经纤维局部区域排列凌乱松散,纤维丝断裂,神经纤维丝变细或减少;三法三穴组神经组织相较于模型组神经纤维排列规则有序,结构致密,组织结构大体趋向正常。4.尼氏染色—推拿能促进SNI大鼠坐骨神经和DRG形态恢复坐骨神经:正常组可见坐骨神经纤维整体有序,纤维横切面结构完整正常;假手术组中神经纤维细胞排列规则有序,结构致密;模型组中神经纤维横切面可见纤维排列疏松,结构紊乱,神经纤维丝断裂;三法三穴组中神经纤维排列规则有序,部分神经纤维丝结构较细,染色较浅。DRG:正常组中多数神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;假手术组多数神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;少量神经元胞体中尼氏小体崩解至完全溶解消失,胞浆淡染,细胞肿胀;模型组中尼氏体颗粒在所有神经元细胞中整体减少,尼氏染色淡染;较多神经元胞体中尼氏体崩解为细尘状颗粒,进而完全溶解消失;因尼氏体消失,胞浆着色浅,胞体肿胀,细胞由多极形状变为圆形;三法三穴组较模型组神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;少量神经元胞体局部区域尼氏小体崩解至细尘状颗粒,并渐渐向外扩展,胞浆淡染,细胞肿胀。5.荧光染色—推拿能保护并促进SNI大鼠感觉神经元恢复正常组大鼠DRG中神经元大多呈圆形或三角形,核仁居中,染色清晰,形态饱满;假手术组神经元形态与正常组相似;模型组可见神经元数目减少,形态皱褶增多或破裂,有轻微水肿现象,直径增加,核仁部分出现偏移或消失现象;三法三穴组在干预后20d,神经元染色较为清晰,神经元数量较多,核仁大多居中,形态恢复较为饱满。6.Western-blotting—推拿能通过促进通路关键蛋白表达促进坐骨神经恢复6.1 DRG中cAMP表达情况造模后7d,正常组与假手术组cAMP表达量无明显差异;与正常组比较,模型组表达水平显着降低（P<0.05）;干预20d时,与模型组相比,三法三穴组cAMP表达水平呈明显升高趋势（P<0.05）,三法三穴组与模型组相比差异较大（P<0.05）。6.2 DRG中PKA表达情况造模后7d,正常组与假手术组PKA表达量无明显差异,与正常组比较,模型组PKA表达水平显着降低（P<0.05）;干预20d后,与模型组比较,三法三穴组PKA表达量升高明显（P<0.05）;差异较大。6.3 DRG中CREB表达情况造模后7d,正常组与假手术组CREB表达量无明显差异,与正常组相比,模型组表达量虽有所下降但差异不明显;干预20d后,与模型组相比,三法三穴组CREB表达量可以观察到有上升的表现,但无统计学差异。以上结果提示:推拿可以提高DRG中cAMP、PKA、CREB蛋白的表达,进而促进周围神经损伤的恢复。[结论]以三法三穴为代表的推拿手法可以提高DRG中cAMP、PKA、CREB的表达,通过影响cAMP-PKA通路中的三个关键蛋白,从而激活通路;同时也可改善SNI大鼠DRG中神经元的形态,恢复坐骨神经超微结构,加速SNI大鼠感觉功能和后肢精细动作的恢复,进而起到促进周围神经损伤后修复的作用。说明以三法三穴为代表的推拿治疗周围神经损伤的机制之一是激活cAMP-PKA信号通路。
王庆东[2]（2020）在《cAMP-PKA信号传导通路对HCN通道在炎性痛痛觉敏化中作用的影响研究》文中研究表明慢性疼痛又被称为“不死的癌症”,具有病程长且难以治愈的严重危害。慢性疼痛的长期折磨给患者的身心健康和生活质量都带来了严重的危害,患者为治疗慢性疼痛付出了沉重的经济代价。伴随着近年来细胞及分子研究技术的不断提高,有关慢性疼痛发病机制的研究也取得了很大进展,外周及中枢敏化已被证实是导致慢性疼痛的最重要的神经学机制。但是由于对其发病的分子机制不够清楚,缺乏有效的诊断标准和治疗方案,目前治疗效果仍不乐观。临床上使用较多的止疼药还是仅限于阿片类和非甾体类两大类,由于非甾体类药物对于疼痛的治疗效果有限,所以不能作为一种广泛使用的镇痛药;而阿片类药物则更多是因为会导致精神上瘾、呼吸抑制、恶心呕吐等严重毒副作用,导致其使用受到了很大的限制。所以,研究慢性疼痛的起因和发病机理,对于帮助研究人员在疼痛治疗中寻找新靶点、探索新方法和制定新策略,具有重要的医学及社会意义。相关研究指出:环磷酸腺苷（c AMP）-蛋白激酶A（PKA）信号传导通路在神经病理性疼痛的形成过程中发挥了重要的作用,其不但介导了炎症介质引起的外周敏化,还参与了诸多神经病理性疼痛的调节途径。同时,也有研究指出:超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN）与神经病理性疼痛的发生密切相关。根据前期的文献报道,我们发现:c AMP-PKA与HCN都参与了炎性痛痛觉敏化的形成;另有报道指出:在多种生理活动中,HCN通道的激活都受到c AMP-PKA信号通路的调节。为此,我们进一步设计实验,通过应用动物行为学检测手段和分子生物学检测技术,探究c AMP-PKA信号通路与HCN通路是如何参与和介导炎性痛痛觉敏化的形成过程。第一部分探讨c AMP-PKA信号通路在正常生理状态下对基础痛阈的影响以及炎性病理状态下致痛觉敏化的作用目的:验证c AMP-PKA通路在生理状态下对基础痛阈的影响及炎性病理状态下致痛敏的作用。方法:选取WT组小鼠、PKA＿KO组小鼠及行鞘内注射c AMP-PKA激动剂Forsklin组小鼠各16只,按照不同组别随机分成两组,共六组;三组不同组别小鼠用于生理状态下的研究,另外三组不同组别小鼠用于炎性病理状态下的研究;通过对生理状态下WT小鼠、PKA＿KO小鼠及Forsklin小鼠机械痛阈值及热痛阈值的测定,来判断三组小鼠对机械刺激和热刺激的反应性是否不同;对另外三组小鼠的一侧后肢足底注射氟氏完全佐剂建立炎性痛敏模型,通过观察造模前（basal）及造模后的不同时点（6h、12h、24h、48h、96h）三组小鼠的机械痛阈和热痛阈阈值,判断在炎性痛病理状态下三组小鼠的机械痛敏和热痛敏情况是否具有差异。结果:正常生理状态下,与WT组小鼠相比,PKA＿KO组小鼠对机械刺激和热刺激的反应性明显下降,表现为PWTL值和PWMT值显着升高（P<0.001）,而Forsklin组小鼠对机械刺激和热刺激的反应性明显升高,表现为PWTL值和PWMT值显着下降（P<0.001）;重复测量方差分析结果显示:在注射完CFA后,三组小鼠均出现机械痛敏和热痛敏,表现为PWTL值和PWMT值显着下降（P<0.001）;组间比较结果显示:在注射CFA后的不同时间点均发现PKA＿KO组小鼠的PWTL值和PWMT值明显大于WT组小鼠（P<0.001）,而Forsklin组小鼠的PWTL值和PWMT值小于WT组小鼠（P<0.001）。结论:在生理状态下,c AMP-PKA信号传导通路在协同感受外界机械刺激和热刺激方面可能发挥着重要的作用;而在炎性痛病理状态下,c AMP-PKA信号传导通路在机械痛敏和热痛敏的形成过程中可能发挥更为重要的作用。第二部分探讨c AMP-PKA传导通路对正常生理状态下及炎性痛病理状态下DRG神经元的影响目的:验证c AMP-PKA通路在生理及炎性病理状态下对DRG神经元兴奋性的影响。方法:实验小鼠的来源与分组均同于第一部分,行为学测试结束后,将小鼠处死,进行DRG组织取材;利用全细胞膜片钳技术对各组小鼠DRG神经元细胞的主动膜特性（动作电位（AP）的基强度、频率、幅值、阈值及半宽）和被动膜特性（静息电位（RMP）、膜电阻（Rm）、膜电容（Cm））进行记录和分析。通过观察生理状态下及CFA注射24h后三组小鼠DRG神经元主、被动膜特性,来判断不同组别小鼠DRG神经元在不同状态下的兴奋性是否具有差异。结果:在生理状态下,三组小鼠DRG神经元的RMP、Rm、Cm值并无差异（P<0.05）;而AP基强度和频率则存在显着差异,具体表现为与WT组小鼠相比,PKA＿KO组小鼠AP的基强度值显着增加,频率显着下降（P<0.01）,Forsklin组小鼠AP的基强度值着显下降,频率显着增加（P<0.01）;三组小鼠AP的幅值、阈值和半宽无差异（P<0.05）。CFA注射24h后,相比与生理状态下,三组小鼠DRG神经元的兴奋性均有明显增加,表现为AP的基强度明显下降,频率明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）;组间对比结果显示:相比于WT小鼠,PKA＿KO组小鼠AP的基强度明显增加,频率明显下降（P<0.01）,Forsklin组小鼠AP的基强度明显下降,频率明显增加（P<0.01）;三组小鼠间AP的幅值、阈值、半宽以及RMP、Rm、Cm均无显着性差异（P<0.05）。结论:c AMP-PKA信号传导通路对生理状态下DRG神经元的兴奋性以及炎性痛病理状态下DRG神经元的超兴奋状态可能产生重要的影响。第三部分研究c AMP-PKA信号传导通路在炎性痛痛觉敏化中对DRG神经元HCN通道的影响目的:验证c AMP-PKA信号通路在炎性痛痛觉敏化中是否参与了DRG神经元HCN通道的激活。方法:实验小鼠的来源、分组及组织取材方法均同于第二部分,在此不再赘述;分别利用蛋白质免疫印迹法（Western blot）和实时荧光定量PCR技术（q PCR）对生理及炎性痛病理状态下不同组别的小鼠进行HCN通道蛋白和基因的检测,通过观测两种状态下不同组别小鼠的HCN2通道蛋白和基因的表达水平,来验证c AMP-PKA信号传导通路在炎性痛痛觉敏化过程中是否参与了DRG神经元HCN通道的激活。结果:在生理状态下,与WT组相比,PKA＿KO组HCN2蛋白的表达量明显减少（P<0.05）,HCN2-m RNA的表水平明显下降（P<0.01）,而Forsklin组HCN2蛋白的表达量明显增加（P<0.05）,HCN2-m RNA的表达水平明显升高（P<0.01）;在炎性痛病理状态下,三组小鼠DRG中HCN2蛋白及HCN2-m RNA的表达水平均明显高于生理状态下（P<0.05,P<0.01）;组间对比结果显示,与WT组相比,PKA＿KO组HCN2蛋白的表达量明显减少（P<0.05）,HCN2-m RNA的表达水平明显下降（P<0.01）,而Forsklin组HCN2蛋白表达量明显增加（P<0.05）,HCN2-m RNA表达水平明显升高（P<0.01）。结论:1、相比于生理状态下,炎性痛病理状态下的小鼠DRG神经元中HCN2通道的开放明显增加且与c AMP-PKA的含量水平密切相关。2、HCN通道的激活可能参与介导了c AMP-PKA信号传导通路在炎性痛痛觉敏化中的信息传递。
吴磊[3]（2020）在《内皮素-1增强大鼠初级感觉神经元中的酸敏感离子通道电流》文中指出目的:内皮素-1（ET-1）是一种内源性血管活性肽,已发现在外周疼痛信号传导中起着重要作用。酸敏感离子通道（ASICs）是细胞外H+的感受器,介导组织酸化引起的疼痛。初级感觉神经元中ET-1和ASICs之间是否存在相互作用尚不清楚。本项目研究ET-1对大鼠背根神经节（DRG）神经元ASICs活动的增强作用。方法:在DRG神经元和共表达ASIC3与ETA受体的CHO细胞,采用膜片钳电生理技术记录DRG神经元的电生理活动,同时动物行为学检测阿米洛利或APETx2阻断ASICs对ET-1诱发的痛觉过敏的影响。结果:在全细胞电压钳记录中,当AMG9810阻断TRPV1通道激活的条件下,快速给予DRG神经元一个pH 6.0的酸性刺激,可引起ASIC电流。预处理ET-1（1-100 nM）剂量依赖性地增加H+诱发的ASIC电流,EC50值为7.42±0.21 nM。预处理ET-1（30 nM）可使H+的浓度-效应曲线向上移动,最大电流反应增加61.11%±4.33%。在DRG神经元和共表达ASIC3和ETAR的CHO细胞中,ET-1通过内皮素A受体（ETAR）,而不是ETBR,增强了ASIC电流。阻断G蛋白或蛋白激酶C信号通路也可以抑制ET-1对ASIC电流的增强。在电流钳记录模式中,预处理ET-1（30 nM）也明显增加大鼠DRG神经元的H+诱发的放电活动。大鼠痛行为学实验发现,阿米洛利或APETx2阻断ASICs后,ET-1引起的缩腿反应和机械痛觉过敏显着减轻。结论:ET-1通过ETAR和PKC信号通路增强初级感觉神经元中的ASICs的功能活动,有助于外周ET-1介导的伤害性行为。
陶蔚蓝[4]（2019）在《布比卡因纳米颗粒用于大鼠足底切口模型术后镇痛的初步研究》文中认为局部麻醉药在术后镇痛等领域具有良好的应用前景,马超教授课题组前期开发了一种新型的布比卡因制剂。该制剂采用单次乳化-溶剂挥发的方法制得,由聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行包封。扫描电镜提示该制剂的粒径在纳米尺度范围内。课题组前期对该新制剂进行了体外释药研究,并在小鼠慢性神经节压迫模型等动物模型中进行了有效性和安全性的初步研究。本研究利用这一新型的布比卡因纳米颗粒制剂在大鼠足底切口模型上进行术后急性疼痛控制的初步研究。利用生理盐水和布比卡因普通制剂作为对照,共分为3个平行组进行实验。获取术前的基线数据后,为各组大鼠进行足底切口造模手术,并同时在足底浸润注射0.1 ml相应的实验药物。术后记录和观测大鼠的自发痛行为表现,并留取大鼠的外周血样本,检测布比卡因药物分子在血液中的变化情况。结果发现,利用课题组工作人员先期制备的布比卡因纳米颗粒冻干剂配制10 mg/ml的混悬液,在不配合使用其他镇痛手段的情况下,对于大鼠足底切口模型术后急性期的自发痛相关行为,单剂给药没有明显的抑制作用。神经病理性疼痛是与慢性疼痛有着密切关系的一种疼痛的类型,它的定义是由躯体感觉系统的损害或疾病直接引起的疼痛。传入神经元的异位放电是神经病理性疼痛的一种重要致病机制,为了探究在机体的免疫中发挥重要作用的生物大分子FcYRIa是否参与其中,本研究选用大鼠背根神经节慢性压迫模型,开展FcYRIa与该模型病理生理机制的先导性的相关性研究。本研究的前半部分内容是为了评价大鼠模型建立的情况,采用了以下多种方式:观察大鼠的一般情况,利用改良vonFrey纤维丝行足底皮肤机械刺激,用热痛刺激仪行足底皮肤热辐射刺激,处死大鼠后解剖观察造模用的不锈钢小棒所在的解剖层次和对应的脊柱节段。按照行为学实验评估的标准,造模情况达不到预期。成果是总结了在手术中利用骨性标志,定位椎体节段的方法和要点:髋结节平对第6腰椎,髂嵴最头端邻近L5-6的关节突关节,大鼠的前4个腰椎有清楚的副突。本研究的后半部分内容是利用免疫组织化学荧光染色的方法,对大鼠中背根神经节中FcyRIa蛋白进行在体表达检测,出现了神经元胞浆的阳性荧光信号,但时间有限,未来得及进一步确认或排除假阳性的可能。结论:在大鼠背根神经节慢性压迫模型中,暂无明确证据支持FcyRIa与其病理生理机制有相关性。
孙晓东[5]（2019）在《PKA、PKC和SFKs对下丘脑弓状核神经元兴奋性的调节及其机制探讨》文中认为目的:已有文献报道c AMP依赖性蛋白激酶（protein kinase A,PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）和Src家族激酶（Src family kinases,SFKs）在调节神经元可塑性中起着重要作用。本实验主要在正常大鼠离体培养的下丘脑弓状核（hypothalamic arcuate nucleus,ARC）神经元上研究PKA、PKC、SFKs对神经细胞兴奋性的调节作用和三种激酶之间的相互调控关系,并探讨其机制,为课题组深入研究蛋白激酶介导ARC参与中枢敏感化机制提供实验依据。方法:1.原代培养新生1天Sprague-Dawley（SD）大鼠的ARC神经元;2.全细胞膜片钳技术记录神经元放电,并观察PKA、PKC和SFKs对ARC神经元兴奋性的影响;3.Western blot技术检测ARC细胞中p PKA、p PKC和p SFKs表达水平;4.免疫细胞化学技术和Western blot技术检测PKCα和PKCβⅡ的转位情况。结果:1.全细胞膜片钳（电流钳）记录显示:（1）在PKA激动剂forskolin（FSK）（1μM、10μM、50μM和100μM）+50μM IBMX（磷酸二酯酶抑制剂）作用下,ARC神经元放电频率呈剂量依赖性增加,其中50μM和100μM浓度组与对照组相比,有显着性差异（P<0.01,P<0.001）;PKA抑制剂KT5720能够阻断FSK+IBMX的兴奋作用。（2）在PKC激动剂PMA（0.1μM、1μM、5μM和10μM）的作用下,ARC神经元放电频率也呈剂量依赖性增加,其中1μM、5μM和10μM浓度组与对照组相比,均有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.05）;PKC抑制剂GF109203x或Chelerythrine chloride（CC）均可阻断PMA的作用。（3）SFKs激动剂EPQ（p Y）EEIPIA可上调ARC神经元兴奋性,并呈现一定时间效应关系,表现为作用3 min后即开始出现ARC神经元放电频率增加,10 min和15 min时作用显着（P<0.01）,分别达到给药前的1.45±0.11倍和1.49±0.15倍;应用SFKs抑制剂PP2能够阻断EPQ（p Y）EEIPIA引起的神经元兴奋性增加。（4）SFKs抑制剂PP2能够阻断PKA或PKC激动剂所引起的ARC神经元兴奋性增加,与无活性的PP3相比,差异显着（P<0.05,P<0.01）。（5）PKC抑制剂GF109203x能够阻断SFKs激动剂EPQ（p Y）EEIPIA所引起的ARC神经元兴奋性增加,而PKA抑制剂KT5720则不能。2.Western blot结果显示:（1）在PKA激动剂FSK+IBMX作用下,ARC细胞中p PKA表达显着增加,与Naive组相比,具有统计学意义（P<0.01）,同时Y416位点的p SFKs表达也增加（P<0.01）,但p PKC（pan）和p PKCα/βⅡ表达无明显变化;KT5720能够抑制PKA激动剂所引起的p PKA和p SFKs的表达增加。（2）在PKC激动剂PMA作用下,p PKC（pan）、p PKCα/βⅡ和p SFKs（Y416）表达显着增加,与Naive组相比,具有统计学意义（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,而p PKA表达无明显变化;PKC抑制剂GF109203x或CC均可抑制PMA所引起的p PKC（pan）、p PKCα/βⅡ和p SFKs表达增加。（3）PP2预处理后能够抑制PKA激活所引起的p SFKs表达增加,而p PKA表达则不受影响,依然显着增加（P<0.05）;PP2也能够抑制PKC激活所引起的p SFKs表达增加,而不影响p PKC（pan）和p PKCα/βⅡ的表达增加（P<0.01,P<0.05）。3.免疫细胞化学和Western blot结果提示:PKC激动剂PMA能够引起PKCα和PKCβⅡ从胞浆转位到胞膜,PKC抑制剂CC可阻断PMA的作用,而另一个PKC抑制剂GF109203x或SFKs抑制剂PP2则不能阻断PMA所诱导的PKC转位。结论:1.PKA、PKC、SFKs能够调节ARC神经元兴奋性,表现为ARC神经元放电频率增加。2.PKA可能是激活SFKs的上游调控因子,因为SFKs抑制剂可以阻断PKA对ARC神经元的调节作用及p SFKs表达的增加,p PKA表达增加不受抑制;而PKA抑制剂则不能阻断SFKs对ARC神经元的调节作用。3.PKC和SFKs在对ARC细胞活动的调节中可能存在交互作用关系,因为抑制SFKs可消除PKC激活所引起的ARC神经元兴奋性上调及p SFKs表达的增加,而p PKCs表达增加不受抑制;同时,抑制PKC也可阻断SFKs激活对ARC神经元兴奋性的上调。4.PKC调节ARC神经元兴奋性可能并不是通过PKCα和PKCβⅡ转位引起的。
尹业辉[6]（2019）在《电针对直结肠高敏感模型小鼠脊神经节神经元的基因调控研究》文中进行了进一步梳理研究背景内脏高敏感的发生部位深且定位模糊,同时伴有牵涉痛和植物神经反射等临床表现和特点,由于人们对内脏高敏感的认识远滞后于对躯体痛的了解,使得慢性内脏高敏感缺乏特异性的治疗措施;既往关于小鼠内脏高敏感的机制研究发现TRPV1通道与内脏高敏感的发生发展密切相关,且一系列的分子或通路如P物质、神经生长因子等对TRPV1通道具有调控作用,但是具体的调控机制尚未阐述明确,TRPV1通道是一个含有6次跨膜结构的非选择性通透阳离子的离子通道,能够被辣椒素、各种炎性介质（缓激肽、蛋白酶等）、以及内源性大麻素和花生四烯酸等激活;由于能够响应多种刺激,TRPV1也被称为多觉感受器,主要分布在初级感觉神经纤维以及胃肠道、血管平滑肌细胞、T细胞等非神经组织中,其在痛觉信息的传递、调控以及整合方面能够发挥重要作用。目前发现的能激活TRPV1通道蛋白的刺激物大部分是外源性的化学或物理刺激,而内源性的对TRPV1通道参与内脏高敏感过程具有调节作用的分子和通路的报导比较局限,分子及通路间作用机制尚未阐述清楚,转录组测序能够很快锁定与表型变化相关的基因及其显着富集的生物功能和代谢通路,是研究内脏高敏感的一种新方式,但是电针缓解内脏高敏感相关的转录组学特征研究比较缺乏。我们既往研究了电针干预对酵母聚糖诱导的直结肠高敏感模型小鼠脊神经节神经元中TRPV1及P物质的调控,发现:①电针缓解小鼠直结肠高敏感行为与下调高敏感模型小鼠脊神经节神经元中高表达的TRPV1、SP有关。②小型非肽能神经元是TRPV1通道参与电针缓解小鼠直结肠高敏感在脊神经节上的主要神经纤维。基于此我们推测:①TRPV1在初级感觉神经元的活化在内脏高敏感病理形成中扮演重要角色,电针缓解内脏高敏感是通过抑制TRPV1通道的活化、降低组织通透性,减少致痛物质释放,抑制兴奋性神经递质分泌,从而降低了伤害性信息向高级中枢的夸大传递;②TRPV1通道参与电针缓解内脏高敏感过程是由一系列级联的信号通路推动完成的。研究目的获取电针调控小鼠直结肠高敏感过程中参与调控TRPV1通道的分子通路,挖掘潜在的调控基因,阐明电针调控小鼠直结肠高敏感转录组水平的TRPV1调控机制,为确立TRPV1通路作为电针调控外周致痛物质的释放、脊神经节神经元可塑性变化及神经递质分泌的靶点提出更充分的科学依据,为临床IBS患者治疗提供新思路新靶点。研究方法第一部分:普通级健康雄性C57BL/6小鼠24只（20-30g）,随机分为4组:盐水对照组（S+C）6只、盐水电针组（S+A）6只、高敏感模型对照组（Z+C）6只、高敏感模型电针组（Z+A）6只;实验小鼠在第一天进行直结肠球囊扩张测试（CRDO）,第3、4、5天连续3天给予酵母聚糖悬浮液（Zymosan,30 mg/mL,0.2ml/只）或等量生理盐水肛门注射;第7、9、11天所有实验小鼠均进行CRD测试（CRD1、CRD2、CRD3）,通过腹壁回撤反射评分（AWR评分）评估小鼠的直结肠敏感性;并分别在第13、15、17天给予CRD 测试（CRD4、CRD5、CRD6）,其中 Z+A、S+A 组在第 13、14、15、16、17 天给予电针干预（双侧后三里、上巨虚穴位,1mA,2/1511z,每天1次,每次30分钟）。第17天CRD测试完毕,取出各组小鼠L5-S2左侧脊神经节,每次CRD测试均对小鼠腹肌收缩程度进行AWR评分,以检测电针干预后小鼠直结肠高敏感变化状况。第二部分:第一部分干预完成的各组小鼠取出L5-S2左侧脊神经节,对脊神经节进行高通量基因测序,根据基因表达量分析、差异表达分析筛选出电针缓解小鼠直结肠高敏感的相关基因,基于基因本体（GO）数据库、京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路数据库对筛选出的基因进行富集分析,筛选出显着富集的功能和代谢通路;最后进行基因共表达网络分析,筛选出其中调控能力较强的基因,并对其进行功能或代谢通路注释分析。研究结果1、电针缓解小鼠直结肠高敏感症状行为学测试通过AWR评分记录的CRD诱发的腹肌收缩显示:CRD3时高敏感模型组、高敏感模型电针组小鼠在60mmHg压力时腹肌收缩记录的评分值高于其对应CRDO 60mmHg压力下评分值150%,确定高敏感模型组、高敏感模型电针组直结肠高敏感的形成;第三次电针干预后,CRD5诱发的腹肌收缩AWR评分结果显示Z+A组呈下降的趋势,第五次电针干预后,CRD6诱发的腹肌收缩AWR评分结果显示:腹肌收缩由大到小的顺序为:Z+C组>Z+A组>S+A、S+C组,其中Z+C组AWR评分显着高于Z+A、S+C组（P<0.05）,Z+A组与S+C组、S+A组比较无统计学差异,表明电针有效抑制了酵母聚糖诱导的小鼠直结肠高敏感。2、电针能够逆转高敏感模型小鼠脊神经节神经元下调的基因将不同组间差异基因通过维恩图交集筛选出Car3、Hp、Gm29216等56个目的基因,表达趋势均为:56个基因在高敏感模型组的表达较盐水对照组表达下调（P<0.05）,在高敏感模型电针组上的表达较高敏感模型组表达上调（P<0.05）、盐水对照组与盐水电针组上的表达比较无统计学差异（P>0.05）,高敏感模型电针组与盐水对照组上的表达比较无统计学差异（P>0.05）。3、56个基因差异表达分析基于cuffdiff数据处理方法得出的56个差异基因在盐水对照组、高敏感模型组、高敏感模型电针组上的表达,盐水对照组与高敏感模型组相比差异最明显的前24个基因（P=5×10-5）中有23个基因同时也是高敏感模型组、高敏感模型电针组之间差异显着性排名靠前的基因（P=5X 10-5）,即这 23 个基因（Car3、Hp、Gm29216、Hist2h2c、Thbs1、Elane、Klf2、Pglyrpl、Anxal、Ly6c2等）在盐水对照组、高敏感模型组、高敏感模型电针组三组上的表达变化趋势最明显,其中Car3、Hp、Gm29216、Hist2h2ac 4个基因在各组的表达量显着高于其它基因。4、56个基因GO富集分析GO注释的term条目共290条,其中显着富集的前20条分别为:免疫反应正调控、腺苷酸环化酶活化、细胞表面受体信号通路、转化生长因子β受体正调控、cGMP负调控信号通路、蛋白磷酸化、炎症反应、p38MAPK通路正调控、cAMP生物合成过程、电刺激反应;磷脂酰丝氨酸、磷酸脂酶A2抑制剂活化、腺苷酸环化酶结合活性、cAMP结合蛋白活性、钙离子依赖型蛋白激酶活性、丝裂原活化蛋白激酶等;对应的差异基因主要包括:TThbsl（6 次）、Adcy4（3 次）、Anxal（3 次）、Mapkapk3（3 次）、Adrb2（2 次）、Ctsg（2 次）、Elane（2 次）、Xdh（2 次）等。5、56个基因KEGG代谢通路分析根据KEGG注释,56个基因显着定位到20个具体的代谢途径分支,分别为钙离子信号通道、胰岛素分泌、cGMP依耐型蛋白激酶、p53信号通路、脂类代谢、消化道腺体分泌、细胞凋亡、甲状腺激素合成、心肌细胞肾上腺素能信号通路、免疫正调控等;对应的差异基因主要包括:Adcy4（11 次）、Plcb2（9 次）、Adrb2（6 次）、Casp8（3 次）、H2-Q6（2 次）、Thbsl（2 次）、Hk2（2 次）等。6、56个基因共表达网络分析结果表明 Ly6c2、Lrmp、Plcb2、Anxal、Pglyrp1、Ncf4、Sik1、Elf4、Alox5、St k17b、Slc16a10、Fcnb、Vsir、Rin3等共15个基因的调控基因数均超过5个,其中F630028010Rik无显着富集的功能或通路,其余基因主要富集在细胞膜、细胞质囊泡、内质网组织、细胞内外信号转导、蛋白磷酸化、磷酸脂酶A2负调控、钙离子信号通道以及脂类代谢等功能上。研究结论本实验在慢性直结肠高敏感小鼠模型上,实施直结肠球囊扩张刺激、电针治疗,并用腹壁回撤反射评分评估,观察和分析了电针刺激后三里、上巨虚穴位对直结肠高敏感小鼠内脏痛感觉和痛行为的影响,并基于TRPV1探讨分析电针对直结肠高敏感模型小鼠脊神经神经元上基因的调控作用,结果表明:1、电针作用于后三里、上巨虚穴位能明显缓解酵母聚糖诱导的小鼠直结肠高敏感症状,且疗效与电针干预的频次呈正相关。2、电针缓解小鼠高敏感症状与上调高敏感模型小鼠脊神经节神经元中低表达的56个基因有关;56个差异基因显着富集在与TRPV1通道功能的发挥密切相关的组织结构（细胞膜、膜表面受体、细胞质囊泡等）及生物活性物质（蛋白质、脂质代谢中间产物、细胞内外信号转导通路）上;56个基因中Car3、Gm29216、Hist2h2ac、Hp 4个基因在各组的表达值显着高于其它基因;Ly6c2、F630028010Ri.k、Anxal、Pglyrp1、sik1 5个基因在盐水对照组、高敏感模型组、高敏感模型电针组之间变化趋势最明显,同时也是56个基因共表达网络调控中调控能力排名前8的基因,其显着富集功能或通路与TRPV1通道的合成及转运密切相关;56个基因GO、KEGG显着富集的功能及代谢通路所对应的基因中Adcy4、Plcb2、Adrb2、Thbs1出现的频次最高。3、电针治疗通过干预Adcy4、Adrb2、Plcb2等基因以及cAMP-PKA（cGMP-PKG）这条代谢通路来调控TRPV1的功能,达到缓解小鼠直结肠高敏感的效应。
谭朝阳[7]（2019）在《内源性硫化氢上调Nav1.7电压门控钠通道参与神经病理性疼痛》文中研究表明目的:探讨背根神经节（Dorsal Root Ganglion,DRG）神经元上,内源性硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）调节电压门控钠通道1.7（Nav1.7）的内在机制,并阐明其在神经病理性疼痛疾病过程中发挥的作用。方法:本研究以Sprague-Dawley（SD）大鼠为研究对象,建立神经病理性疼痛模型——坐骨神经分支选择性损伤模型（Spared Nerve Injury,SNI）,并运用免疫荧光技术和Western blot技术检测造模前后L4-L6 DRG神经元上,内源性H2S合成酶——胱硫醚β-合成酶（Cystathionineβ-Synthetase,CBS）和Nav1.7蛋白表达变化。运用Western blot技术检测阻断剂对L4-L6 DRG神经元中CBS,MEK/ERK,磷酸化MEK/磷酸化ERK（pMEK/pERK）和Nav1.7蛋白表达的影响。运用全细胞膜片钳技术检测L4-L6 DRG神经元兴奋性指标在造模和给予阻断剂前后的变化。运用Hargreave’s实验和丙酮实验检测大鼠造模及给予阻断剂前后的伤害性行为变化。结果:（1）免疫荧光和结果显示,与Sham组相比,SNI+Vehicle组在造模后第7天,第14天和第21天DRG神经元中CBS和Nav1.7的表达均增加（p<0.05,n=6）。（2）Western blot实验结果显示,与Sham组相比,SNI+Vehicle组在造模后第7天,第14天和第21天DRG神经元中CBS和Nav1.7的表达均增加（p<0.05,n=6）,并且在造模后第21天最明显。（3）CBS阻断剂AOAA可抑制SNI造模诱导的CBS,pMEK1/2,pERK1/2和Nav1.7蛋白表达的增加（p<0.05,n=6）,而Nav1.7特异性阻断剂PF-04856264不能抑制SNI诱导的CBS,pMEK,pERK和Nav1.7蛋白表达增加（p>0.05,n=6）。此外,MEK阻断剂U0126能抑制SNI诱导的pMEK,pERK和Nav1.7蛋白表达的增加（p<0.05,n=6）,但不能抑制SNI造模诱导的CBS增加（p>0.05,n=6）。（4）膜片钳实验结果显示,SNI造模后DRG神经元上动作电位基强度降低且动作电位频数增加（p<0.001,n=8）。（5）运用阻断剂AOAA（p<0.001,n=8）,U0126（p<0.001,n=8）和PF-04856264（p<0.001,n=8）均可显着抑制SNI造模引起的动作电位基强度降低和动作电位频数的增加。（6）行为学实验结果表明,SNI造模后各组间热刺激缩足潜伏期没有显着差异（F=0.130,p=0.941>0.05,n=6）。此外,与Sham组相比,SNI+Vehicle组中冷刺激抬足时间显着增加（F=924.429,p<0.001,n=6）。给予CBS阻断剂AOAA（F=64.280,p<0.001,n=6）,MEK阻断剂U0126（F=46.196,p<0.001,n=6）和Nav1.7特异性阻断剂PF-04856264（F=24.021,p<0.01,n=6）后,抬足时间均显着降低。结论:内源性H2S激活MEK/ERK信号通路,上调Nav1.7通道从而参与神经病理性疼痛的发生,Nav1.7通道有望成为神经病理性疼痛疾病的治疗靶点。
徐岩[8]（2018）在《瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景急性胃黏膜损伤（Acute gastric mucosal lesions,AGML）指胃黏膜屏障保护作用减弱,胃黏膜发生不同程度的水肿、溃疡、糜烂和出血,是一种常见的临床问题。尽管有很多治疗急性胃黏膜损伤的药物,但是胃黏膜损伤经常容易复发,并且患这种疾病病人的数量一直保持在一个稳定状态。过度、持续性伤害性应激是诱发急性胃黏膜损伤的一个关键性致病因素,胃是应激状态下最为敏感的器官之一。现有研究显示,各种困难复杂的手术、休克、严重感染、脓毒症、多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome or failure,MODS or MODF）和严重烧伤、创伤等都可引起AGML。特别是休克引起的低血流灌注,均能减少胃壁血流,损伤胃黏膜屏障,影响胃黏膜上皮细胞的功能,发生应激性胃黏膜水肿、溃疡甚至糜烂出血。与应激相关的胃黏膜损伤估计影响75%以上的急危重病人,其中3%-4%可发生严重的胃出血,这可使原有疾病加重或恶化,病死率明显升高。在ICU与应激相关的胃出血发生率为0.6%-6%。有研究表明应激性溃疡与胃酸分泌增多的关系不大,更依赖于胃黏膜血流量的减少、缺血缺氧和再灌注损伤。任何影响胃壁血流（Gastric wall blood flow,GWBF）的因素都会对胃黏膜上皮细胞（Gastric mucosal epithelial cells,GMEC）的功能产生影响,削弱胃黏膜保护屏障。胃酸增多显然能加重胃黏膜防御系统的负荷,但是应激性溃疡时胃酸一般不高,甚至减少。尽管如此,仍不能否定H+在应激性胃溃疡发病中的作用。由于胃黏膜屏障受损,H+浓度虽然不高,仍可逆行性扩散,出现胃壁内酸化,则可产生急性胃黏膜损害。此外,一些炎性介质的失控和代谢产物也会对胃黏膜的功能产生影响。尽管存在上述一些已经明确影响胃黏膜功能的因素,但是应激诱导急性胃黏膜损伤的病理生理机制仍然还不是很清楚。考虑急性胃黏膜损伤受多因素、多途径调控,因此,迫切需要寻找与急性胃黏膜损伤发病机制相关的新的信号分子和信号传导通路,为防治疗急性胃黏膜损伤提供靶点。目前认为,AGML的发生与神经和体液等诸多因素有关。瞬时受体电位锚蛋白1（Transient receptor potential ankyrin-1,TRPA1）和P物质（Substance P,SP）都丰富表达且共存表达于大鼠的胃组织和支配胃组织相应阶段胸8-胸11（T8-11）背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）,这样二者之间可能存在某种相互作用。Kondo T报道TRPA1参与大鼠内脏痛觉过敏的调节,预先鞘内注射和腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-030031或敲除TRPA1可以有效减轻大鼠胃扩张引起的伤害性刺激。给予P物质神经激肽-1受体拮抗剂SR140333和CP 99994可以分别有效减轻酒精引起的C57/BL6J小鼠胃损伤和SD大鼠浸水束缚应激引起的膀胱损伤。有报道TRPA1和P物质均可引起神经源性炎症和非神经源性炎症。在2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic-acid,TNBS）诱导的小鼠结肠炎模型,TRPA1对P物质的释放具有调控作用,但是二者在急性胃黏膜损伤中的作用尚不明确。研究目的冷水束缚应激（Water immersion restraint stress,WIRS）因为其良好的可重复性和临床相关性,被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此,本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型,初步探讨:1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响,观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate,AITC）,进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制,以及TRPA1对P物质释放的影响。研究方法雄性Wistar大鼠（weight 180-220g,6–8weeks old）,随机分为6组,空白对照组（Control group）,大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组（WIRS group）,大鼠在自制的鼠笼内冷水（16±1℃）浸泡6h,水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组（ITIH group）,大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-030031 10μl（10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亚砜）;腹腔注射HC-030031组（IPIH group）,大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031（150 mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纤维素）。冷水束缚应激6h后,取大鼠的背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜。AITC组,口服AITC 17mg/kg（AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐温的生理盐水中）,AITC对照组口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜,应用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin stain,HE）或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后,分别应用光学显微镜（Optical Microscope,OM）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）、免疫组织化学（IHC）分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胃黏膜中P物质浓度的变化。实验结果1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示,未经处理的Control组:胃黏膜结构正常,层次清楚,上皮完整,上皮层细胞排列紧密、规则,未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集,未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落,多发浅表溃疡,有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落,同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润,毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显,数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较,WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高（P<0.001）。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好,受损黏膜较表浅局限,仅有轻度充血、水肿,偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低（P<0.001）。AITC组:可见胃黏膜受损,上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿,可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较,AITC组胃黏膜损伤评分明显提高（P<0.001）。2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示,未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重,有些完全失去正常结构,轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较,胃黏膜细胞损伤评分明显提高（P<0.001）。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤,但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张,空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低（P<0.001）。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤,多伴有线粒体嵴减少或消失,但轮廓存在;粗面内质网局部扩张,偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较,AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高（P<0.001）。3.同Control组比较,WIRS组大鼠背根神经节（T8-11）和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加（P<0.001）。4.同WIRS组比较,鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003（1ITIH组或IPIH组）,有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中P物质释放（P<0.001）。5.同Control组比较,口服TRPA1特异性激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤,大鼠背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加（P<0.001）。结论1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤,使背根神经节（T8-11）和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关,其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤,其机制可能是HC-030031显着抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放,减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。3.TRPA1激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中,P物质的释放主要由TRPA1调控。
黄士其[9]（2018）在《不同时间针刺对不同状态大鼠穴区神经电活动及P2X3受体影响的研究》文中指出目的:研究不同时间针刺对不同状态大鼠穴区神经电活动的作用及其对穴区、背根神经节、脊髓P2X3受体的影响,以期从经穴反应性动态变化为切入点,揭示择时针刺镇痛的外周机制。方法:实验由三部分组成。（1）将SD雄性大鼠（清洁级）置于动物节律隔离单元,驯化7天后,将大鼠随机分为空白组和空针组,每组根据处理时间的不同,分为ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20,六个亚组。在各时间点对空针组大鼠进行右侧“足三里”穴针刺,每5min行针一次,持续5min,留针30min,同时通过Power Lab对穴区腓总神经神经电活动进行记录,空白组不针刺,只记录神经电活动。（2）将驯化后的大鼠随机分为空白组和造模组。造模组在大鼠右侧足垫部皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml,空白组注射等量的生理盐水。待模型制备成功后,将造模组随机分为模型组与模针组。在造模成功第2天,模针组于各亚组对应的时间点针刺患侧“足三里”穴,每5min行针一次,持续5min,留针30min,同时通过Power Lab对穴区腓总神经神经电活动进行记录,空白组及模型组不针刺,只记录神经电活动。（3）将驯化后的动物按照实验二的方法分为空白组及造模组。待模型复制成功后将造模组大鼠随机分为模型组和模针组。造模成功的第2天,根据实验二统计结果,结合前期不同时间针刺镇痛研究结果选择效应最优和最差时间点进行实验。模针组于特定时间点针刺患肢“足三里”穴,每5min行针一次,持续1min,空白及模型组只在相应时间点作捆绑处理。第7天治疗结束后,采用免疫组化法检测不同组特征时间点“足三里”穴局部皮肤组织、背根神经节（L4-L6）、脊髓（L4-L6）中P2X3受体的表达。结果:1.生理状态下:（1）不同时间点针刺可促进穴区局部神经放电次数。穴区局部神经放电次数:空针组与空白组比较,在ZT0、ZT8、ZT12和ZT20,差异具有统计学意义,P值分别为0.002、0.000、0.044和0.000;在ZT4和ZT16,差异不具有统计学意义,P值分别为0.470和0.237。（2）时间因素与各组穴区局部神经放电次数存在交互效应。在不同时间点,空针组与空白组比较,穴区局部神经放电次数差异具有统计学意义,P=0.000,P<0.05。2.病理状态下:（1）不同时间点针刺可促进穴区局部神经放电次数,降低神经放电平均幅值。穴区局部神经放电次数:模型组与空白组比较,在ZT12和ZT16,差异具有统计学意义,P值分别为0.002和0.000;在ZT0、ZT4、ZT8和ZT20,差异无统计学意义,P值分别为0.948、0.267、0.924、0.408。模针组与空白组比较,在ZT8和ZT20,差异具有统计学意义,P值分别为0.000和0.013;在ZT0、ZT4、ZT12、ZT16,差异无统计学意义,P值分别为0.314、0.665、0.188、0.631。模针组与模型组比较,在ZT4、ZT8、ZT12、ZT16和ZT20,差异具有统计学意义,P值分别为0.001、0.002、0.000、0.000和0.004;在ZT0,差异无统计学意义,P值为0.534。穴区局部神经放电平均幅值:模型组与空白组比较,在ZT4、ZT8、ZT12、ZT16和ZT20,差异具有统计学意义,P值分别为0.000、0.000、0.007、0.009和0.002;在ZT0,差异无统计学意义,P值为0.093。模针组与空白组比较,在ZT0、ZT4、ZT12、ZT16和ZT20,差异具有统计学意义,P值分别为0.001、0.000、0.003、0.016和0.003;在ZT8,差异无统计学意义,P值为0.065。模针组与模型组比较,在ZT4、ZT8、ZT12和ZT20,差异具有统计学意义,P值分别为0.000、0.000、0.037和0.009;在ZT0和ZT16,差异无统计学意义,P值分别为0.271,0.117。（2）时间因素与各组穴区局部神经放电次数存在交互效应。在不同时间点,空白组、模型组与模针组比较,穴区局部神经放电次数差异具有统计学意义,P=0.000,P<0.05;时间因素与各组穴区局部放电平均幅值存在交互效应。在不同时间点,空针组、模型组与模针组比较,穴区局部神经放电平均幅值差异具有统计学意义,F=17.433,P=0.000,P<0.05。3.在“足三里”穴区皮肤组织:ZT8时间点,与空白组相比,模型组的P2X3受体表达明显升高,P=0.000,P<0.01;与模型组相比,模针组的P2X3受体表达明显降低P=0.001,P<0.01。ZT16时间点,与空白组相比,模型组的P2X3受体表达明显升高,P=0.003,P<0.01;与模型组相比,模针组的P2X3受体表达无明显差异。4.在背根神经节（L4-L6）:ZT8时间点,与空白组相比,模型组的P2X3受体表达明显升高,P=0.000,P<0.01;与模型组相比,模针组的P2X3受体表达明显降低,P=0.009,P<0.01。ZT16时间点,与空白组相比,模型组的P2X3受体表达明显升高,P=0.000,P<0.01;与模型组相比,模针组的P2X3受体表达无明显差异。5.在脊髓（L4-L6）:ZT8时间点,与空白组相比,模型组的P2X3受体表达明显升高,P=0.000,P<0.01;与模型组相比,模针组的P2X3受体表达明显降低,P=0.000,P<0.01。ZT16时间点,与空白组相比,模型组的P2X3受体表达明显升高,P=0.000,P<0.01;与模型组相比,模针组的P2X3受体表达无明显差异。结论:1.穴区局部的神经电活动具有时相依赖性,不同时间针刺对穴区局部神经电活动的作用不同,并受机体机能状态的影响。2.择时针刺镇痛的机制可能与不同时间针刺对穴区局部、背根神经节和脊髓P2X3受体表达的影响不同有关。
王俊英[10]（2013）在《电针镇痛的累积效应与海马神经元可塑性及胞内MAPK/ERK信号通路活动关系分析》文中研究表明研究背景慢性疼痛包括慢性神经病理性疼痛是临床上常见的病症,目前采用西医药治疗的效果有限。针刺治疗慢性痛具有较好的疗效,但是其作用机制还不太清楚。海马作为边缘系统的一部分,除参与学习记忆、情绪活动等等的功能外,还参与疼痛信息的加工处理和针刺镇痛的过程。我们前期在慢性坐骨神经结扎造成的神经痛（CCI）大鼠模型上的实验结果表明,重复电针产生累积镇痛效应的同时,可显着改善CCI大鼠海马CA3区神经元突触间隙、突触厚膜厚度、突触活性带长度明显减小的变化,上调海马镇痛物质乙酰胆碱及其M受体、γ-氨基丁酸受体等基因的表达变化密切相关。但是,针刺镇痛累积效应的细胞内分子机制尚不清楚。慢性神经病理性疼痛是神经可塑性的一种表达方式。神经损伤产生的持续性剧烈的伤害性刺激传入导致中枢敏化,该敏化反应是活动-依赖性的功能可塑性的变化；在细胞水平上产生于细胞内各种各样的激酶级联的激活进和许多关键细胞膜受体、离子通道的磷酸化等的变化。MAPK（mitogen-activated protein kinase）/ERK （Extracellular signal-regulated kinases）级联是细胞内一个主要的生化信号通路,参与启动和调节细胞外的各种刺激信息引发的细胞内许多信号通路（蛋白分子转化）加工处理过程,包括神经的可塑性、学习记忆等等,特别是,它还是痛觉过敏中枢敏化过程中细胞内多个信号通路调节的总开关（master switch）。此外,在中枢神经系统中,神经递质和神经营养因子（脑源性神经生长因子brain derived neurophic factor, BDNF等）信号通路之间的相互作用（interplay）可调节中枢神经网络对疼痛过敏条件下环境变化的适应性反应。为此,本研究在CCI大鼠模型上,采用行为学、电生理学、分子生物学等技术,进一步研究针刺累积镇痛效应与海马BDNF/MAPK/ERK/CREB信号通路活动变化的关系。研究方法实验一,行为学实验：Wistar雄性大鼠80只,随机分为正常对照组（n=16）,慢性压迫性损伤（CCI）组（n=16）,CCI+EA2天（D）（n=16）,CCI+EAl周（W）（n=16）,CCI+EA2W （n=16）.采用坐骨神经四道结扎造成CCI神经痛模型,电针双侧“足三里”-“阳陵泉”穴,采用2/15Hz,1-2mA,每天1次,分别为不电针、电针2天、电针1周和电针2周,用热辐射测痛仪测量热痛阈,以手术侧和假手术侧的痛阈值的差值作为痛敏分数来观察动物的痛阈的变化。实验二,生理学实验：Wistar雄性大鼠43只,随机分为正常对照组（n=15）,CCI组（n=13）,U0126组（n=15）,用脑立体定位仪固定大鼠头部,刺激坐骨神经作为伤害性刺激,刺激脉冲（间隔50ms,波宽0.3ms,电流强度5mA）,刺激10s,将微量注射器定位于侧脑室（前囟后1.0mm,旁开1.3-2.0mm,深3.5mm）注射ERK抑制剂U0126,电极尖端定位于海马CA1区（前囟后3.2-3.6mm,旁开2.5-3.0mm,深2.5-3.1mm）记录各组大鼠海马CA1痛相关神经元的自发放电变化,以及电针和U026对自发放电的影响作用。实验三,分子生物学实验：上述行为学动物,正常对照组（n=8）,CCI组（n=8）,CCI+EA2D （n=8）, CCI+EA1W （n=8）, CCI+EA2W （n=8）,应用real-time PCR方法检测大鼠海马部位BDNF, trk2PKA和pCREB的mRNA表达的变化；正常对照组（n=8）, CCI组（n=8）, CCI+EA2D （n=8）, CCI+EA1W （n=8）, CCI+EA2W （n=8）,应用western blot方法检测大鼠海马部位Ras、Raf、MEK、p-ERK1/2、P38、CREB等的蛋白的表达变化。实验结果1、累积电针对各组大鼠行为学表现的影响1.1CCI大鼠行为学表现术后24小时即可见手术组大鼠,手术侧肢体（左侧后肢）自发性抬起,足趾蜷曲、缩回、足掌极少平伸着地。手术后4d,可以观察到有明显的外翻和避免患肢着地,明显的患肢跛行等的行为异常,但没有出现托行。热辐射轻微照射造成热辐射痛,大鼠即长时间舔足,不停甩足,但没有出现自残现象。1.2累积电针对CCI大鼠的热辐射痛阈的影响CCI大鼠在术后4天（3.15±1.05）,痛敏分数明显高于正常对照组（-0.063±0.23）（P<0.05）；在术后18天,也就是取材前,CCI对照组痛敏分数（3.69±0.24）仍然明显高于正常对照组（0.011±0.24,P<0.05）;CCI+EA2D组痛敏分数（3.01±1.65）明显高于正常对照组,明显低于CCI对照组（P<0.05）:CCI+EA1W组痛敏分数（2.34±1.85）明显高于正常对照组（P<0.05）,明显低于CCI对照组和CCI+EA2W组（P<0.05）：CCI+EA2W痛敏分数（0.98±0.1）明显低于CCI对照组、CCI+EA2D组（P<0.05）,与正常对照比较没有显着差异（P>0.05）,说明电针具有明显镇痛效应,且这种镇痛效应具有明显的累积性。2、电针镇痛对大鼠海马痛相关神经元自发放电的影响2.1痛刺激坐骨神经及电针对正常动物自发放电的影响对正常大鼠海马CAl区痛兴奋性神经元（n=17）分析可以看到,在痛刺激后单纯痛刺激组放电频率（134.53%±37）和痛刺激加电针组放电频率（126.1%±20.05）都有明显的增加,且单纯痛刺激组与痛刺激加电针组没有差异（P>0.05）；在痛刺激后2min,单纯痛刺激组的放电频率（168.61%±58.72）明显多于痛刺激加电针组的放电频率（121.76%±21.67,P<0.05）；在痛刺激后4min,单纯痛刺激组放电频率（145.08%±21.67）明显多于痛刺激加电针组的放电频率（108.65%±14.16,P<0.05）,痛刺激加电针组已经基本恢复至痛刺激前水平。在痛刺激后6min单纯痛刺激组的放电频率仍然处于增加的水平（125.87%±23.92）,明显高于痛刺激加电针组的放电频率（105.72%±22.49,P<0.05）；在痛刺激后8min,10min,单纯痛刺激组的放电频率已接近恢复正常水平（116.86%±25.97,103.22%±6.03）,与痛刺激加电针组（102.14%±22.58,97.65%±14.4）相比,没有明显的差异（P>0.05）,但电针组的放电频率仍然低于单纯痛刺激组。这说明电针有抑制痛兴奋神经元自发放电增加的作用。对正常大鼠痛抑制神经元（n=12）分析可以看到,在痛刺激完即刻,单纯痛刺激组放电频率减少（67.88%±14.71）,电针加痛刺激组放电频率为痛刺激前的（93.35%±15.83）,两组有显着差异（P<0.05）；痛刺激后2min,单纯痛刺激组的放电频率（54.35%±19.37）明显低于电针加痛刺激组（74.36%±16.62）；痛刺激后4min,单纯痛刺激组的放电频率（53.01%±19.37）仍然明显低于电针加痛刺激组（87.37%±9.25,P<0.05）；从痛刺激后6min开始,单纯痛刺激组的放电频率开始增加（67.93%±26.47）,慢慢恢复,至10min,已经基本恢复至痛刺激前的放电频率（95.06%±15.92）,而痛刺激加电针组痛刺激后6min已经恢复至痛刺激前的放电频率（100.59%±23.28）,在痛刺激后8min和l0min的放电频率均与痛刺激前的放电频率一致。而单纯痛刺激组和痛刺激加电针组两组在痛刺激后6min,8min,10min均有明显的差异（P<0.05）。电针镇痛有解除痛抑制神经元放电减少的作用。2.2痛刺激坐骨神经及电针对CCI动物自发放电的影响分析在CCI大鼠上记录海马痛兴奋神经元（n=14）可以观察到,在单纯痛刺激后海马神经元放电立刻显着增加（204.24%±95.07）,与痛刺激加电针组（203.34%±127.56）无显着差异（P>0.05）；在痛刺激后2min增加率达到了痛刺激前的193.54%±80.45,并且明显高于痛刺激加电针组（133.41%±43.19）比较（P<0.05）；在痛刺激后6min,单纯痛刺激组仍然处于放电频率增多（188.82%±60.45）,而与痛刺激加电针组有显着的差异（P<0.05）,痛刺激加电针组已经基本恢复到痛刺激前的放电频率（113.6%±64.66）,；在痛刺激后8min和10min,单纯痛刺激组的放电频率仍然明显多于痛刺激前,分别为167.27%±55.60和148.82%±71.75,痛刺激加电针组基本在痛刺激前的状态（108.81%±43.07,99.17%±27.21）,单纯痛刺激组与痛刺激加电针组有显着差异（P<0.05）。在CCI大鼠上记录到的痛抑制神经元（n=4）分析可以看到,在单纯痛刺激后海马神经元放电立刻显着减少（56.44%±17.35）,与痛刺激加电针组（83.21%±36.84）无显着差异（P>0.05）；在痛刺激后2min仍然保持在痛刺激前的59.14%±22.72,并且与痛刺激加电针组（66.54%±27.32）比较无显着差异（P>0.05）；在痛刺激后4min,单纯痛刺激组（67.17%±12.17）和痛刺激加电针组（73.83%±39.81）仍然处于放电频率减少的状态,并且两组无差异（P>0.05）；在痛刺激后6min,单纯痛刺激组减频的影响仍然存在（59.82%±19.14）,而痛刺激加电针组放电频率逐渐恢复（94.22%±41.45）；在痛刺激后8min和l0min,单纯痛刺激组的放电频率逐渐恢复分别为70.65%±20.62和90.75%±18.50,痛刺激加电针组基本在痛刺激前的状态（90.75%±18.50,97.50%±11.28）,单纯痛刺激组与痛刺激加电针组无显着差异（P>0.05）。2.3正常大鼠与CCI大鼠痛刺激和电针对痛相关神经元自发放电变化的比较正常大鼠与CCI大鼠海马CA1痛兴奋神经元自发放电的比较,单纯痛刺激后即可,痛刺激后2min,两组无差异（P>0.05）；痛刺激后4min,6min,8min,CCI大鼠的痛兴奋神经元的自发放电频率明显高于正常组（P<0.05）；痛刺激后10min,两组无明显差异（P>0.05）。两组大鼠海马CA1痛抑制神经元的自发放电在单纯痛刺激即可,痛刺激后2min,4min,6min,8min,10min都有明显的差异（P<0.05）,这可能与CCI组痛抑制神经元数量太少有关。比较正常大鼠和CCI大鼠痛刺激加电针后,痛兴奋神经元和痛抑制神经元的自发放电频率除了痛刺激即刻,痛刺激后各个时间均无显着的差异（P>0.05）。2.4给予ERK抑制剂U0126后对大鼠针刺的影响在大鼠海马部位记录到的痛兴奋神经元（n=9）自发放电的变化,我们可以观察到,在痛刺激后即可,U0126组（128.72%±47.36）与单纯电针组（126.1%±20.05）的放电无差异（P>0.05）,在给药后即可即刺激后2min,U0126组的神经元自发放电（190.52%±49.01）明显高于单纯电针组的自发放电（121.76%±11.41,P<0.05）,在痛刺激后4min,6min,8min, U0126组的神经元自发放电均明显高于单纯电针组（P<0.05）,而在痛刺激后10min,U0126组的神经元自发放电（118.34%±55.03）仍高于单纯电针组（97.65%±15.4）,但无明显差异（P>0.05）。在大鼠海马部位记录到的痛抑制神经元（n=6）自发放电的变化,我们可以观察到,在痛刺激后即刻,U0126组（100.6%±47.22）与单纯电针组（93.35%±15.83）的放电无差异（P>0.05）,在给药后即刻即痛刺激后2min,U0126组的神经元自发放电（55.6%±29.67）低于单纯电针组的自发放电（74.36%±16.62）,但无明显差异（P>0.05）。在痛刺激后4min,U0126组的神经元白发放电（49.67%±19.79）明显低于单纯电针组（87.37%±9.25,P<0.05）,在痛刺激后6min,8min, U0126组的神经元自发放电（45.17%±21.05,42.9%±15.92）仍然明显低于单纯电针组（100.59%±23.28,98.06%±15.92,P<0.05）。在痛刺激后10min,U0126组的自发放电（40.43%±23.37）仍然没有恢复至痛刺激前状态,仍然明显低于单纯电针组（103.45%±9.69,P<0.05）。3、电针镇痛对CCI大鼠海马ERK信号通路的影响3.1电针对BDNF及其受体表达的影响海马的BDNF蛋白在CCI模型组（0.12±0.02）表达显着低于正常对照组（0.40±0.06,p<0.05）。与CCI模型组比,海马CCI+EA2D （0.25±0.02）, CCI+EAIW（0.24±0.03）及CCI+EA2W组（0.35±0.02）的BDNF表达均显着高于CCI组（P<0.05）,其中CCI+EA2D, CCI+EAIW之间BDNF的表达无显着差异（P>0.05）,而CCI+EA2W组的BDNF表达明显高于CCI+EA2D和CCI+EA1W组（p<0.05）,显示出两周电针有累积效应；与正常对照组（0.84±0.2）比较,CCI组（0.17±0.3）海马trk mRNA的相对表达量显着降低（p<0.05）,电针2天（0.13±0.08）、电针1周（0.15±0.06）和电针2周（0.36±0.11）后,海马trkmRNA的相对表达量与CCI对照组比较没有显着差异（P>0.05）。3.2电针对MEK/ERK表达的影响3.2.1电针对各组大鼠Ras、Raf和MEK蛋白的影响CCI组海马组织Ras蛋白（0.74±0.25）和C-Raf蛋白（0.84±0.15）的表达水平均明显的低于正常对照组（1.25±0.38,1.15±0.09,p<0.05）。与CCI模型组比,海马Ras蛋白和c-Raf蛋白的表达在CCI+EA2D （0.89±0.14,0.89±0.18）, CCI+EAIW （1±0.13,0.97±0.3）略有升高,但都没有统计学意义（P>0.5）。与CCI组比较,CCI+EA2W组在海马Ras蛋白（1.35±0.31）和c-Raf蛋白（1.12±0.24）的表达明显上调（p<0.05）。CCI+EAIW组与CCI+EA2D组比较,海马组织的Ras蛋白和c-Raf蛋白的表达没有显着差异（P>0.05）。海马组织Ras蛋白的表达在CCI+EA2W组明显高于CCI+EA2D和CCI+EAIW组（P<0.05）,而c-Raf蛋白在CCI+EA2W组的表达与CCI+EA2D和CCI+EAIW组没有显着的差异（P>0.05）而MEK蛋白在海马组织的表达,在正常对照组（1.08±0.07）和CCI模型组（0.99±0.11）,都没有明显的差异（P>0.05）；不同的电针时间,电针2天（0.98±0.12）、电针1周（1.02±0.15）和电针2周（1.09±0.09）各组对MEK蛋白也没有明显影响（P>0.05）。3.2.2电针对各组大鼠ERK1/2及p-ERK1/2CCI模型组ERKl/2mRNA与ERK1/2蛋白在海马组织的表达与正常对照组比较,均没有显着的差异P>0.05)而电针2天、电针1周与CCI模型组比较,ERK1/2mRNA与ERK1/2蛋白在海马组织的表达均没有显着差异（P>0.05）；CCI+EA2W组与CCI组,CCI+EA2D组,CCI+EA1W组比较,ERKl/2mRNA和ERK2蛋白的表达均没有显着的改变（P>0.05）；仅海马ERK1蛋白在CCI+EA2W组的表达高于CCI组（P<0.05）。与对照组（1.1±0.06）比较,CCI组海马组织磷酸化ERK蛋白（p-ERK）（0.43±0.06）表达水平均显着降低（p<0.05）。与CCI模型组比,海马p-ERK蛋白表达在CCI+EA2D组（0.63±0.03）明显升高（p<0.05）；与CCI+EA2D, CCI+EA1W（0.07±0.05）海马p-ERK蛋白表达没有明显的差异（P>0.05）,但CCI+EA1W组明显高于CCI组（p<0.05）；CCI+EA2W海马p-ERK的表达（0.83±0.45）明显高于CCI组和CCI+EA2D组（p<0.05）,但与CCI+EA1W组无明显的差异（P>0.05）。这说明针刺在上调p-ERK的表达具有一定的累积性。3.3累积电针对各组大鼠p38及p-p38表达的影响与正常对照组比较,海马组织p38MAPKmRNA的表达在CCI组、CCI+EA2D组和CCI+EA1W组都有显着降低（p<0.05）；电针2W组p38MAPKmRNA的表达与CCI,CCI+EA2D组比较都有明显的上调（p<0.05）,但仍明显低于正常对照组（p<0.05）。但是在蛋白的表达与mRNA的表达不是非常一致。与正常对照组比较,海马组织P38MAPK蛋白在CCI组略有降低（p>0.05）；电针各组海马组织p38MAPK蛋白的表达量也没有明显影响（P>0.05）。与正常对照组比较,海马组织的p-p38MAPK蛋白的表达在CCI模型组略有下降,但差异不显着,（p>0.05）; p-p38MAPK蛋白的表达在CCI+EA2D和CCI+EA1W组都略有升高（p>0.05）, p-p38MAPK蛋白在CCI+EA2W组与CCI组比较有较明显的上调（P<0.05）。3.4电针镇痛对CCI大鼠海马PKA和CREB的影响海马PKA mRNA在CCI模型组3.30±1.37的表达明显高于正常对照组（1.62±0.50,P<0.05）；与CCI模型组比较,CCI+EA2D组PKA mRNA的表达（4.65±0.79）明显上调（P<0.05）；CCI+EAIW组（4.30±0.49,P<0.05）PKA mRNA的表达明显高于正常对照组和CCI模型组（P<0.05）,略低于CCI+EA2D组,但无统计学意义（P>0.05）；而CCI+EA2W组（3.38±0.73）PKAmRNA的明显低于CCI+EA2D和CCI+EAIW组（P<0.05）,但仍明显高于正常对照组（P<0.05）。可以看到电针对PKA mRNA的调节作用呈现先上升后下调的作用。与正常对照组（23.98±12.94）比较,CCI模型组（59.77±27.35）海马部位的CREB mRNA表达明显上调P<0.05)海马部位的CREB mRNA表达在CCI+EA2D组（44.25±24.64）明显高于正常对照组（P<0.05）,与CCI组比较,略低但无统计学意义（P>0.05）；与CCI组比较,CCI+EAIW组（32.46±16.91）和CCI+EA2W组（26.85±15.27）,海马部位的CREB mRNA表达量明显降低（P<0.05）,而与CCI+EA2D组比较,CCI+EA1W组和CCI+EA2W组海马部位的CREB mRNA表达量略有降低,但无统计学意义（P>0.05）；CCI+EA2W组与CCI+EAIW组,CREB mRNA表达没有显着差异（P>0.05）。以上结果说明电针1周和电针2周明显累积性下调了由于CCI导致的已经升高的CREBmRNA。与正常对照组比较,海马组织CREB和p-CREB蛋白在CCI组略有降低（p>0.05）；电针2天、1周、2周都有上调,但均无统计学意义（P>0.05）。结论本研究从行为学、电生理和分子生物学的角度探讨了电针镇痛与海马神经元可塑性变化及海马神经元细胞内ERK信号通路的关系。在CCI模型下,大鼠海马神经元的电活动发生异常的变化,电针可以缓解热辐射痛敏的状态,且这种缓解作用与电针时间呈正比。电针的镇痛作用可能与海马内神经元的ERK信号通路的活性有关,电针可能通过激活ERK信号通路来发挥镇痛的目的。
二、蛋白激酶A参与介导大鼠受损背根节神经元的自发放电（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白激酶A参与介导大鼠受损背根节神经元的自发放电（论文提纲范文）
（1）三法三穴对坐骨神经损伤大鼠背根神经节cAMP-PKA信号通路表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 影响周围神经损伤修复的因素 |
| 1. 年龄对修复的影响 |
| 2. 神经修复和重建的时机对修复的影响 |
| 3. 伤害类型和程度对修复的影响 |
| 4. 重建技术对修复的影响 |
| 5. 供体部位发病率对修复的影响 |
| 6. 神经类型对修复的影响 |
| 7. 轴突与靶神经正确联系对修复的影响 |
| 8. 患者自身的认知能力对修复的影响 |
| 综述二 周围神经损伤的治疗 |
| 1. 手术疗法 |
| 2. 低剂量激光疗法可以增强周围神经损伤后的再生过程 |
| 3. 针刺推拿治疗对周围神经损伤有较好效果 |
| 综述三 cAMP-PKA信号通路 |
| 1. 环腺苷酸(cyclicadenylic acid,cAMP) |
| 2. 蛋白激酶A (protein kinase A,PKA) |
| 3. cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB) |
| 4. cAMP-PKA信号通路与周围神经损伤的联系 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 以三法三穴为代表的推拿手法对SNI大鼠行为学的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验二以三法三穴为代表的推拿手法对SNI大鼠形态学的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验三 三法三穴对SNI大鼠cAMP、PKA、CREB蛋白表达的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（2）cAMP-PKA信号传导通路对HCN通道在炎性痛痛觉敏化中作用的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 探讨cAMP-PKA信号通路在正常生理状态下对基础痛阈的影响以及炎性病理状态下致痛觉敏化的作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 探讨cAMP-PKA传导通路对正常生理条件下及炎性痛病理状态下DRG神经元的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 研究cAMP-PKA信号传导通路对炎性痛病理情况下DRG神经元HCN通道的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
| 附图 |
（3）内皮素-1增强大鼠初级感觉神经元中的酸敏感离子通道电流（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制方法 |
| 1.5 玻璃电极的制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 DRG神经元的分离 |
| 2.2 电生理记录 |
| 2.3 药物应用 |
| 2.4细胞学实验 |
| 2.5 动物行为学分析 |
| 2.6 数据处理 |
| 结果 |
| 1.ET-1 对大鼠DRG神经元ASIC电流的增强作用 |
| 2.ETAR和 PKC信号参与ET-1对ASIC电流的增强 |
| 3.ET-1 增强大鼠DRG神经元的H+诱发动作电位 |
| 4.药物阻断ETAR、ETBR或 ASICs抑制ET-1 诱导的缩腿和机械痛过敏 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）布比卡因纳米颗粒用于大鼠足底切口模型术后镇痛的初步研究（论文提纲范文）
| 布比卡因纳米颗粒用于大鼠足底切口模型术后镇痛的初步研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 背景 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| FcγRIa蛋白与大鼠背根神经节慢性压迫模型的病理生理机制的相关性研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述：局部麻醉药长效制剂的研宄进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 后记 |
（5）PKA、PKC和SFKs对下丘脑弓状核神经元兴奋性的调节及其机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要试剂耗材 |
| 3 主要仪器 |
| 4 主要溶液配方 |
| 二、实验方法 |
| 1 下丘脑弓状核神经元原代培养 |
| 2 电生理实验(全细胞膜片钳记录) |
| 3 Western Blot检测 |
| 4 免疫细胞化学 |
| 5 给药方式及时间 |
| 6 数据分析和统计学检验 |
| 实验结果 |
| 第一部分 :PKA、PKC、SFKs对弓状核神经元兴奋性的调节 |
| 一、下丘脑弓状核位置、神经元形态和放电 |
| 二、PKA对 ARC神经元兴奋性的调节 |
| 三、PKC对 ARC神经元兴奋性的调节 |
| 四、SFKs对 ARC神经元兴奋性的调节 |
| 五、PKA、PKC与 SFKs在调节ARC神经元兴奋性中的相互作用 |
| 第二部分 :激活PKA、PKC对蛋白磷酸化水平的影响 |
| 一、激活PKA对 PKA、PKC、SFKs蛋白磷酸化水平的影响 |
| 二、激活PKC对 PKA、PKC、SFKs蛋白磷酸化水平的影响 |
| 第三部分 :激活PKC对其细胞内分布的影响 |
| 一、PMA诱导ARC神经元中的PKC转位 |
| 二、PKC抑制剂GF109203x和 CC对 PMA诱导的ARC神经元中PKC转位的影响 |
| 三、SFKs抑制剂PP2对PMA诱导的ARC神经元中PKC转位的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛋白激酶C通过调控离子通道参与痛觉调制 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（6）电针对直结肠高敏感模型小鼠脊神经节神经元的基因调控研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 研究内容 |
| 第一部分: 实验模型制作 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要化学试剂和仪器 |
| 1.3 分组方法 |
| 1.4 直结肠高敏感模型制作所需辅助器材 |
| 1.5 直结肠高敏感模型建立 |
| 1.6 电针调控直结肠高敏感的治疗方案 |
| 1.7 脊神经节取材 |
| 1.8 统计学处理 |
| 1.9 实验技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分: 实验小鼠脊神经节神经元RNA测序 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与分组 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要软件及数据库 |
| 1.4 脊神经节神经元基因测序步骤 |
| 1.5 RNA测序数据分析方法及统计学处理 |
| 1.6 实验技术路线 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究结论 |
| 局限与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）内源性硫化氢上调Nav1.7电压门控钠通道参与神经病理性疼痛（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 1.SNI造模后Nav1.7和CBS在 DRG神经元上表达增加 |
| 2.内源性H_2S激活MEK/ERK信号通路上调Nav1.7 的表达 |
| 3.内源性H_2S激活MEK/ERK通路上调Nav1.7 增强DRG神经元兴奋性 |
| 4.内源性H_2S通过调节Nav1.7 参与神经病理性疼痛 |
| 讨论 |
| 1.SNI大鼠DRG神经元上内源性H_2S增加能上调Nav1.7 的表达 |
| 2.内源性H_2S通过激活MEK/ERK通路上调Nav1.7 的表达 |
| 3.内源性H_2S上调Nav1.7 通道增强DRG神经元的兴奋性 |
| 4.内源性H_2S通过上调Nav1.7 参与神经病理性疼痛的发生 |
| 5.小结 |
| 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（8）瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 WIRS诱导AGML和DRG、胃组织和胃黏膜中TRPA1和SP表达上调 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 第二部分 HC-030031有效减轻WIRS诱导的AGML和抑制DRG、胃组织和胃黏膜中SP的释放 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 第三部分 AITC诱导AGML和DRG、胃组织和胃黏膜中SP释放 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 综述一、瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1) |
| 参考文献 |
| 综述二、P物质（Substance P，SP） |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及参与科研工作 |
| 致谢 |
（9）不同时间针刺对不同状态大鼠穴区神经电活动及P2X3受体影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 实验研究 |
| 实验一 生理情况下,针刺对穴区局部神经电活动影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 实验二 病理情况下,针刺对穴区局部神经电活动影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 实验三 择时针刺对炎性痛大鼠不同部位P2X3受体表达影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 讨论 |
| 1 节律性是机体生命活动的重要特征 |
| 1.1 节律是机体生理活动时间特征的基本呈现形式 |
| 1.2 病理条件下,机体表现出特征性的病理节律 |
| 1.3 疾病治疗具有节律性,整复病理节律是治疗疾病的重要方式 |
| 2 针灸镇痛效应确切,且痛证时间特性显着,是研究择时针刺的良好载体 |
| 3 关于针灸处方的讨论 |
| 3.1 足三里穴的选取 |
| 3.2 针刺手法的选取 |
| 3.3 时间点的选取 |
| 4 不同时间针刺对大鼠穴区神经电活动影响的研究 |
| 4.1 穴位具有丰富的神经结构,是穴位反应性的基础之一 |
| 4.2 穴区气血的动态变化是时辰针刺产生效应的基础 |
| 4.3 生理情况下,针刺促进穴区局部的神经电活动具有时间特征 |
| 4.4 病理情况下,针刺对穴区局部异常神经电活动的调整作用具有时间差异性 |
| 5.择时针刺对不同部位P2X3受体作用的研究 |
| 5.1 P2X3受体参与了疼痛和针刺信号的传递 |
| 5.2 择时针刺对炎性痛大鼠穴位局部P2X3受体的影响 |
| 5.3 择时针刺对炎性痛大鼠背根神经节的P2X3受体的影响 |
| 5.4 择时针刺对炎性痛大鼠脊髓的P2X3受体的影响 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生期间公开发表的学术论文、专着、科研成果 |
（10）电针镇痛的累积效应与海马神经元可塑性及胞内MAPK/ERK信号通路活动关系分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 |
| 1 海马的主要结构 |
| 2 海马与疼痛的关系研究进展 |
| 3 海马与电针镇痛的关系 |
| 综述二 |
| 1 MAPK/ERK信号转导通路 |
| 2 ERK信号通路参与疼痛的调节 |
| 3 P38信号通路与疼痛的关系研究 |
| 4 PKA及PKA与ERK关系的研究 |
| 5 PKA信号通路与疼痛的关系研究 |
| 6 CREB与PKA、ERK在疼痛中的联系 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 慢性痛模型的制备 |
| 2.3 测痛 |
| 2.4 电针 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 行为学结果 |
| 3.2 热辐射痛阈结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 动物手术 |
| 2.3 记录 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 痛刺激坐骨神经及电针对正常动物自发放电的影响 |
| 3.2 痛刺激及电针对CCI动物自发放电的影响 |
| 3.3 正常大鼠与CCI大鼠痛刺激和电针对痛相关神经元自发放电变化的比较 |
| 3.4 给予ERK抑制剂U0126后对大鼠针刺的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器及药品 |
| 2 实验步骤 |
| 2.1 造模电针 |
| 2.2 Real-time PCR |
| 2.3 WESTERN BLOT |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠海马胞外BDNF及Trk2 mRNA的表达的比较 |
| 3.2 各组大鼠海马胞内ERK信号通路活性的比较 |
| 3.3 各组大鼠海马胞内p38MAPK mRNA、p38MAPK和p-P38MAPK的表达的比较 |
| 3.4 各组大鼠海马PKA mRNA的比较 |
| 3.5 各组大鼠CREBmRNA、CREB和p-CREB表达的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CCI及电针对大鼠海马BDNF及受体的影响 |
| 4.2 CCI及电针对大鼠海马ERK信号通路的影响 |
| 4.3 CCI及电针对大鼠海马p38MAPK的影响 |
| 4.4 CCI及电针对大鼠海马PKA的影响 |
| 4.5 CCI及电针对大鼠海马CREB的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 下一步工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
四、蛋白激酶A参与介导大鼠受损背根节神经元的自发放电（论文参考文献）
- [1]三法三穴对坐骨神经损伤大鼠背根神经节cAMP-PKA信号通路表达的影响[D]. 罗宇婷. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]cAMP-PKA信号传导通路对HCN通道在炎性痛痛觉敏化中作用的影响研究[D]. 王庆东. 佳木斯大学, 2020(03)
- [3]内皮素-1增强大鼠初级感觉神经元中的酸敏感离子通道电流[D]. 吴磊. 湖北科技学院, 2020(08)
- [4]布比卡因纳米颗粒用于大鼠足底切口模型术后镇痛的初步研究[D]. 陶蔚蓝. 北京协和医学院, 2019(02)
- [5]PKA、PKC和SFKs对下丘脑弓状核神经元兴奋性的调节及其机制探讨[D]. 孙晓东. 苏州大学, 2019(06)
- [6]电针对直结肠高敏感模型小鼠脊神经节神经元的基因调控研究[D]. 尹业辉. 中国中医科学院, 2019(01)
- [7]内源性硫化氢上调Nav1.7电压门控钠通道参与神经病理性疼痛[D]. 谭朝阳. 石河子大学, 2019(01)
- [8]瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究[D]. 徐岩. 中国人民解放军海军军医大学, 2018(01)
- [9]不同时间针刺对不同状态大鼠穴区神经电活动及P2X3受体影响的研究[D]. 黄士其. 成都中医药大学, 2018(01)
- [10]电针镇痛的累积效应与海马神经元可塑性及胞内MAPK/ERK信号通路活动关系分析[D]. 王俊英. 中国中医科学院, 2013(11)