一、大鼠肝脏保存中不同器官保存液对肝细胞凋亡的影响（论文文献综述）
严启航[1]（2021）在《HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤》文中认为[目的]缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury,IRI）常发生在肝移植、肝切除、休克等情况下,特别对于肝移植来说,手术过程中不得不先阻断血流,完成血管重建后再恢复肝脏供血,从而导致了 IRI。由于肝移植IRI是不可避免且可以预见的,对于如何减轻IRI以提高供肝质量是目前改善肝移植术后患者预后和生活质量的首要策略。本课题组前期的研究已经发现血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）在肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI）中发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗应激功能。本研究拟通过腺相关病毒（Adeno Associated Virus,AAV）作为载体,构建大鼠HO-1的过表达载体,以及通过RNA干扰技术靶向干扰HO-1 mRNA的shRNA AAV载体,转入大鼠体内从而诱导肝脏HO-1过表达或将其沉默,再通过构建大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型,在诱导供肝HO-1差异性表达的前提下,观察在肝移植缺血再灌注损伤后移植肝局部炎症以及组织病理学的改变,并初步探究其内在分子机制,以为临床上改善肝移植IRI提供一种新的思路和方法。[方法]1 构建大鼠HO-1 AAV载体、HO-1 shRNA AAV载体,分别转入SD大鼠体内,21 d后获取肝脏,荧光显微镜下观察共表达绿色荧光蛋白,qRT-PCR检测肝组织HO-1表达情况,验证转染效果。2 以热缺血10 min、冷缺血4 hr为基础构建SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,采用“二袖套法”吻合门静脉和肝下下腔静脉,采用“支架法”重建胆总管。再灌注后6hr、24hr、3d和7d分别观察肝功能、肝脏组织形态学以及HO-1和炎症因子随时间的变化,明确变化最明显的时间点,进行后续研究。3 通过尾静脉给供体SD大鼠注射AAV载体,诱导供肝HO-1高表达和低表达,并在注射后第21 d构建SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,获取血清检测肝酶ALT和AST变化,获取肝脏组织行HE染色观察组织病理学变化,检测肝组织HO-1、CHOP以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达情况,检测肝组织HO-1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、CHOP以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达情况。[结 果]1 构建HO-1 AAV过表达载体和HO-1 shRNAAAV载体,经测序证明扩增序列正确,表明载体成功构建。2 AAV载体通过尾静脉注射方式能诱导SD大鼠肝脏HO-1转录活性升高和降低,与相应空载AAV病毒组相比有统计学差异（P<0.05）。3 成功构建SD-SD大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型。4 肝移植缺血再灌注后ALT、AST活性迅速升高,并在6-24hr达到峰值,7 d左右降至基本正常;肝组织病理学损伤6 hr已经显现,并在24 hr的时候损伤最重,7 d仍可见坏死灶存在。说明肝移植IRI损伤在再灌注后迅速发生,且病理学改变滞后于分子标志物变化。5 通过术前用AAV对供肝HO-1进行诱导处理,在建立肝移植模型6hr后仍能保持高效诱导HO-1高表达或抑制其表达。HO-1的转录活性和蛋白在过表达组的和shRNA干扰组均比相应空载AAV组升高或降低,其差异有统计学意义（P<0.05）。6 在肝移植IRI后6 hr,sh-HO-1组ALT、AST较AAV空载病毒组明显升高（P<0.05）,AAV-HO-1组ALT、AST较AAV空载病毒组明显降低（P<0.05）。行肝组织切片HE染色,光镜下观察sh-HO-1组的坏死区域更大,炎性细胞浸润更明显（P<0.05）。检测肝脏局部炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6转录活性和蛋白表达,sh-HO-1组的升高和AAV-HO-1组的降低与其对应空载AAV组相比有统计学意义（P<0.05）。同时HO-1的升高伴随着p38 MAPK磷酸化的降低以及CHOP表达的下降,提示HO-1可能是通过减少p38MAPK介导的炎症信号通路的激活以及减少CHOP介导的内质网应激来实现。[结 论]1 成功构建HO-1过表达和HO-1 shRNA AAV载体,能转染并在大鼠肝脏诱导或抑制HO-1表达。2 成功建立SD-SD大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型。3 术前诱导供肝HO-1高表达能减轻肝移植缺血再灌注损伤,而抑制供肝HO-1则会加重损伤。4 HO-1可能通过抑制p38 MAPK介导的炎症信号通路的激活以及减少CHOP介导的内质网应激从而减轻缺血再灌注损伤。
王晨晓[2]（2020）在《基于高内涵分析技术的绒毛诃子肝毒性及毒性物质研究》文中研究指明诃子为使君子科植物诃子（Terminalia chebula Retz.）或绒毛诃子（Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.）的干燥成熟果实,是藏药、蒙药等民族药的常用药。诃子味苦、酸、涩,性平,有涩肠止泻、敛肺止咳、利咽降火的功效。由于诃子的药理学作用广泛,在医疗与食品开发等方面具有广阔的应用前景,通过对市场的前期调研,发现当前藏药标准体系建设相对比较滞后,诃子药源较为复杂,其基源植物绒毛诃子在目前市场流通占比较大。关于诃子的药理学研究较多,对于毒理学报道较少,为了临床合理安全用药,本课题第一部分通过小鼠的急性毒性实验与蓄积毒性实验确定绒毛诃子水煎液的毒性及其毒性靶器官,通过对不同啮齿类动物的重复给药毒性实验,确定绒毛诃子水煎液在不同给药剂量下,对大鼠、小鼠的毒性反应。通过前期系统的动物毒理学实验,评价绒毛诃子的毒性。高内涵筛选分析技术拥有自动定量的细胞成像系统,由荧光试剂标记特定的靶点,可以优化成像方案和进行复杂的数据分析,是一种操作简便、灵敏度高、高通量的筛选技术,被广泛应用于中药的活性成分筛选及药物毒性的筛选。本课题第二部分利用荧光染液对相应靶点进行特异性染色,用高内涵细胞成像分析平台和DILI Assay Template联合考察绒毛诃子中10个化合物对HepG2和L02细胞的毒性作用。通过检测细胞数目、DNA 含量、活性氧簇含量（reactive oxygen species,ROS）、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的改变、谷胱甘肽（L-glutathione,GSH）水平等 5 个指标,建立了高内涵肝毒性筛选方法,可以筛选出待测化合物对细胞形态、复制、周期、转录、翻译、凋亡等方面的影响,从而判断化合物致肝毒性风险。本文主要从两部分来探讨绒毛诃子的肝毒性及其物质基础,第一部分通过不同剂量、不同给药时间对不同啮齿类动物的毒理实验,确定绒毛诃子的毒性及其毒性靶器官。第二部分采用高内涵筛选技术结合高效液相的方法初探绒毛诃子的毒性物质基础。第一部分确定绒毛诃子的肝毒性1.绒毛诃子的小鼠急性毒性实验通过急性毒性实验确定绒毛诃子的毒性及毒性靶器官。采用14天急性毒性经典实验方法,单次给药后,观察记录实验期间小鼠的体质量变化、生理状态变化以及死亡情况,测其生化指标和肝肾脏器系数,计算其半数致死量。绒毛诃子水煎液的半数致死量LD50为18.93 g/kg,是70kg人最大日用量的147.8倍。高剂量组小鼠临床表现异常,出现腹泻、水样下痢,在给药12h后开始出现死亡,集中死亡的时间在24h-72h之间。结合病理切片和血清生化结果综合来看,实验组中的谷丙转氨酶（alanine amiotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartatetransaminase,AST）等血清生化结果异常升高,肝细胞肿胀,细胞核增大,胞浆疏松淡染等,表明肝脏出现损伤,推测绒毛诃子的急性毒性实验的毒性靶器官为肝脏。2.绒毛诃子的小鼠蓄积毒性实验通过经典的20天蓄积毒性实验方法,确定绒毛诃子蓄积实验的毒性特点及其毒性靶器官,为慢性毒性实验与其他毒性实验提供参考。蓄积毒性实验得出,绒毛诃子水提物的蓄积系数K>5,为轻度蓄积。在给药后的第二阶段后,小鼠背毛凌乱,腹泻,呆卧少动,雄性小鼠的体质量增长与对照组相比,增长缓慢,有显着性差异。在给药后第四阶段,小鼠出现死亡,存活小鼠进食量减少,活动减少,部分出现腹部轻微鼓胀现象。结合血清生化和病理切片结果,表明绒毛诃子蓄积毒性实验的毒性靶器官为肝脏,与急性毒性实验结果相一致。3.绒毛诃子的小鼠28天重复给药实验通过对小鼠的28天重复给药实验,预测绒毛诃子在小鼠重复给药过程中引起的临床不良反应及判断药物的安全性和毒性靶器官。实验组小鼠分别灌胃绒毛诃子水煎液,高剂量组15 g/kg,中剂量组7.5 g/kg,低剂量组1.5 g/kg,对照组灌胃等体积生理盐水,14天为一个阶段进行一次取材。在连续给药第四天后,小鼠出现死亡,中剂量组的小鼠死亡数量最多,高剂量组死亡数其次。对存活小鼠进行解剖,结合脏器系数和血清生化结果,推测肝脏为其毒性靶器官,与急毒和蓄积毒性实验结果相一致,表明绒毛诃子水煎液对小鼠具有肝毒性。4.绒毛诃子的大鼠28天重复给药毒性实验本研究采用大鼠连续28天灌服绒毛诃子水煎液,而后设置两周恢复期,观察绒毛诃子水煎液可能引起毒性反应的性质、程度、量效和时效关系及可逆性,确定绒毛诃子水煎液对大鼠的毒性及其毒性靶器官。在实验过程中,高剂量组18.9 g/kg、中剂量组9.5 g/kg、低剂量组1.9 g/kg等分别给予相应浓度的绒毛诃子水煎液,对照组灌胃等体积生理盐水。在实验期间,第16天高剂量组雄性出现动物死亡,第18天中剂量组雌性出现死亡,此后未出现大鼠死亡。在重复给药第14天后,实验组的大鼠并未出现肝损伤。在重复给药第28天后,高中低三个剂量组的大鼠的ALT指标与对照组相比,有显着差异,表明可能有肝损伤。在实验恢复期取材,高中低三个剂量组的大鼠生化指标无异常,表明绒毛诃子对大鼠的肝损伤可能有可逆性。第二部分 用高内涵分析技术初探绒毛诃子肝毒性物质基础1.绒毛诃子中的化合物对HepG2和L02细胞的增殖抑制率测定绒毛诃子中的没食子酸、苯甲酸、莽草酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃里拉京、原儿茶素、鞣花酸、诃子次酸、诃子酸、诃子联苯酸对HepG2和L02细胞在不同孵育时间下的增殖抑制率。测定绒毛诃子中化合物在不同给药剂量和不同孵育时间下的吸光度值,计算出对不同细胞的增殖抑制率。结果表明:没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖在给药浓度为200 μg/mL时,对HepG2细胞的生长抑制率为73.96%、93.77%,对L02细胞的抑制率为99.02%和98.98%。综合分析不同化合物对两个细胞系的增殖抑制率,排名前四位的有没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸和诃子联苯酸,均对L02肝细胞和HepG2肝细胞有明显毒性作用,苯甲酸和莽草酸无明显细胞毒性作用。2.HCS技术筛选绒毛诃子对HepG2细胞的毒性作用成分采用高内涵分析技术,对化合物在不同给药剂量下对HepG2细胞的细胞数目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量和MMP改变的影响判断其是否超出其安全阈值范围,并对化合物进行肝毒性排序。在DILI Assay TemPlate排序中,排名前四位的为没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸和诃子联苯酸,没食子酸对HepG2细胞的肝毒性最大,超过其阳性对照噻氯吡啶,30 μg/mL为没食子酸致肝损伤的临界浓度。结论为没食子酸致肝毒风险最高,而后由高到低依次为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸、诃子联苯酸、诃里拉京、鞣花酸、原儿茶素、苯甲酸、诃子次酸、莽草酸。3.HCS技术筛选绒毛诃子对L02细胞的毒性作用成分通过高内涵筛选技术分析绒毛诃子中的化合物对L02细胞的毒性作用,并初步探讨毒性化合物的损伤机制。实验结果表明,毒性预测风险排名前五位的为没食子酸、诃子联苯酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸、诃里拉京,与HepG2细胞的筛选结果相一致。没食子酸对L02细胞的肝毒性最大,当给药浓度>10μg/mL时,细胞数目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量和MMP改变等指标都超出其安全阈值。没食子酸致肝毒风险最高,而后由高到低依次为诃子联苯酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸、诃里拉京、鞣花酸、苯甲酸、原儿茶素、诃子次酸、莽草酸。4.HPLC检测绒毛诃子中的毒性成分含量用高效液相双波长法建立测定绒毛诃子中诃子次酸、没食子酸、诃里拉京、诃子联苯酸、诃子酸、原儿茶酸等化合物的含量的方法并做方法学考察。绒毛诃子中诃子次酸含量最高,可达38.21 mg/g,没食子酸含量次之,为10.74 mg/g,诃里拉京含量为9.76 mg/g。将测得的成分含量与HCS技术筛选的绒毛诃子中化合物的毒性排序对比,推测没食子酸和诃里拉京为绒毛诃子致肝毒性的物质基础。
兰佳男[3]（2020）在《PP2A在长时间冷保存导致DCD肝脏损伤中的作用及机制研究》文中研究指明目的:肝移植是治疗终末期肝病的最佳选择,而器官短缺促使心脏死亡（donation after circulatory death,DCD）供肝大量应用于临床。目前最常用也是最方便经济的供肝体外保存方式仍是静态低温冷储存（static cold storage,SCS）。移植前多种原因会导致供肝冷保存时间延长损伤肝脏功能,影响肝移植预后。为此,我们拟通过基因干预手段,探究长时间冷保存对DCD供肝造成损伤的机制,并从动物及细胞水平验证蛋白磷脂酶2A（protein phosphatase 2A）在其中的作用。方法:首先建立大鼠DCD模型获取肝脏,分别冷保存12h及24h,应用体外常温灌注系统评估肝脏功能,并检测PP2A,线粒体分裂蛋白Drp1,内质网应激损伤效应蛋白CHOP以及凋亡标记蛋白caspase3,caspase9,Bcl-2,Bax等的表达变化情况。之后采用AAV8病毒转染及特异性药物抑制剂分别对PP2A及线粒体分裂和内质网应激进行干预,分析长时间冷保存导致肝脏损伤过程中的具体调控机制。并通过RNA测序方式检测PP2A的干预对DCD肝脏中损伤通路的调控情况。结果:（1）RNA测序结果显示DCD肝脏组织中凋亡调控通路表达升高,干扰PP2A使肝脏组织内凋亡调控通路及应激反应通路基因表达下降。（2）长时间冷保存加重DCD肝脏损伤,表现为体外灌注液中ALT、AST指标明显升高,肝脏切片病理损伤评分增加,细胞凋亡增加。蛋白检测显示PP2A,Drp1,CHOP表达升高,凋亡标记蛋白caspases,Bax表达升高。线粒体损伤加重,细胞色素c向细胞质释放增加。（3）干扰PP2A表达缓解了DCD肝脏损伤,表现为损伤评分降低,ALT,AST指标降低,细胞凋亡水平降低。蛋白检测显示PP2A表达降低后Drp1、CHOP表达同样下降,同时凋亡相关标记蛋白caspases表达降低。线粒体损伤及细胞色素c释放减轻。（4）抑制线粒体分裂蛋白Drp1减轻内质网应激水平,抑制内质网应激不影响Drp1的表达。结论:在长时间冷保存造成DCD肝脏损伤的过程中PP2A表达增加使线粒体异常分裂增加,在释放包含细胞色素c在内的损伤因子同时诱发内质网应激,导致肝细胞凋亡损伤肝脏功能。
何维阳[4]（2019）在《TXNIP/NLRP3炎性体通路在低温机械灌注优化心脏死亡供肝质量的作用机制》文中研究说明肝移植是治疗终末期肝病的有效手段,供体肝脏的质量是决定肝移植预后的关键因素。然而,随着等待肝移植患者数量的逐年增加,供体肝脏的相对缺乏促使心脏死亡供体（Donation after cardiac death,DCD）肝脏等扩大标准供肝应用于临床[1]。相较脑死亡供体（Donation after brain death,DBD）肝脏而言,由于DCD肝脏在获取前已经存在热缺血损伤,因此这类肝脏的缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）更严重,容易导致移植术后器官原发性无功能（Primary non-function,PNF）、移植术后胆道缺血和急慢性排斥反应等并发症[1,2]。因此,如何减轻DCD肝脏IRI,优化DCD肝脏质量和改善肝移植患者预后,成为肝移植领域亟需解决的热点问题。静态冷保存（Cold storage,CS）目前仍是供体器官保存的最主要手段。但在低温保存期间（0-4℃）,由于有氧呼吸尚未完全停止导致营养物质的耗尽和代谢废物的产生[3],因此CS并不能对DCD肝脏进行有效的维护和修复。相比之下,低温机械灌注（Hypothermic machine perfusion,HMP）作为一种新型的动态器官保存方法,它在低温状态下经门静脉持续低流量地对肝脏进行氧合灌注,能够持续为肝脏提供代谢所需物质和能量并清除累积的毒性代谢产物[4]。动物实验研究和临床试验均表明,HMP较CS能够显着改善DCD肝脏质量,并能缩短术后恢复时间,降低移植术后肝脏PNF和胆道缺血等严重术后并发症的发生率[5,6]。然而,HMP改善DCD肝脏质量的具体分子生物学机制尚不明确。既往研究证实,TXNIP/NLRP3炎性体通路在缺血再灌注损伤中发挥了重要作用,当细胞处于氧化应激状态时,TXNIP会被激活并与NLRP3相结合从而激活下游炎性体通路,导致炎性因子的释放和细胞焦亡。HMP可以显着改善DCD肝脏的氧化应激状况,因此我们推测HMP可能存在抑制TXNIP/NLRP3炎性体通路进而减轻DCD供肝缺血再灌注损伤的机制。因此本课题在建立起大鼠DCD模型,肝脏HMP系统和常温离体复灌系统的基础上,研究TXNIP/NLRP3炎性体通路是否参与了HMP改善DCD肝脏质量的作用机制。研究结果揭示了HMP改善DCD肝脏质量的分子机制,为拓展供体池提供有效的方法和有力的理论依据。第一部分低温机械灌注对于大鼠心脏死亡供肝的保护效果研究目的:为了研究HMP对于DCD肝脏的保护机制,我们需首先建立起稳定的HMP系统并证实其对DCD肝脏的保护效果。方法:将18只SD大鼠随机分为对照组,CS组和HMP组。建立大鼠DCD模型,大鼠肝脏在心脏骤停后历经30分钟的热缺血。然后对肝脏行CS或HMP保存3小时。对照组肝脏不作处理直接获取。三组肝脏行1小时的常温离体再灌注以模拟肝移植手术,然后评估肝脏的损伤。结果:与CS组相比,HMP可明显减轻肝脏损伤并改善肝功能。肝酶释放,肝内阻力指数,组织学表现,细胞凋亡率,氧化应激和炎症反应的结果均可证实。通过对HMP期间肝脏氧耗率的检测证实非主动氧合的低温机械灌注也能为肝脏提供充足的氧气。我们的研究结果还表明,DCD肝脏低温保存结束后（无论是CS还是HMP）损伤并不显着,常温再灌注显着激活CS组的肝脏损伤,HMP组肝脏由于再灌注前获得修复,再灌注损伤并不显着。结论:相比于传统的静态冷保存,低温机械灌注在保护DCD肝脏质量方面具有独特的优势。低温机械灌注为保存期间的肝脏提供充足的氧气并重新补充能量,减少肝窦淤血和DAMPs的释放,从而减轻肝脏在再灌注阶段受到的损伤。然而,低温机械灌注减轻DCD供肝缺血再灌注损伤的具体分子生物学机制仍不清楚,这需要我们进一步探索。第二部分TXNIP/NLRP3炎性体通路在低温机械灌注改善大鼠心脏死亡供肝质量的机制研究目的:在已经证实HMP对大鼠心脏死亡肝脏质量有明确的改善效果之后,我们探究TXNIP/NLRP3炎性体通路是否在HMP改善DCD质量的机制中发挥重要作用。方法:将18只SD大鼠随机分为对照组,CS组和HMP组。建立大鼠DCD模型,大鼠肝脏在心脏骤停后历经30分钟的热缺血。然后对肝脏行CS或HMP保存3小时。对照组肝脏不作处理直接获取。三组肝脏行1小时的常温离体再灌注。在离体再灌注前后获取三组肝脏标本,然后进行免疫蛋白印记（Western blotting）和免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation）以确定TXNIP/NLRP3炎性体通路的激活情况。结果:与对照组相比,免疫蛋白印记结果显示再灌注后CS组TXNIP/NLRP3炎性体通路的蛋白表达显着上升,免疫共沉淀显示再灌注后CS组TXNIP/NLRP3复合物形成也显着增多。与CS组相比,再灌注后HMP组TXNIP/NLRP3炎性体通路的蛋白表达和TXNIP/NLRP3复合物形成均被显着抑制。结论:低温机械灌注可以在肝脏保存期间对其进行修复减轻DCD肝脏的再灌注损伤损伤,其机制与TXNIP/NLRP3炎性体通路相关。再灌注导致的氧化应激促进TXNIP与NLRP3结合,激活下游炎性体通路。HMP通过抑制氧化应激,进而抑制了TXNIP/NLRP3炎性体通路,从而达到减轻供肝再灌注损伤和优化供肝质量的目的。第三部分TXNIP/NLRP3炎性体通路在DCD肝脏中的表达模式研究目的:探讨TXNIP/NLRP3炎性体通路在肝脏中的表达模式,明确HMP调控TXNIP/NLRP3炎性体通路的具体机制。方法:将18只SD大鼠随机分为对照组,CS组和HMP组。建立大鼠DCD模型,大鼠肝脏在心脏骤停后历经30分钟的热缺血。然后对肝脏行CS或HMP保存3小时。对照组肝脏不作处理直接获取。三组肝脏行1小时的常温离体再灌注。获取三组肝脏标本,然后进行免疫荧光标记（Immunofluorescence）以确定TXNIP和NLRP3在肝脏细胞中的分布情况。结果:免疫荧光双标记显示:TXNIP和NLRP3均主要在肝细胞中表达,在内皮细胞中表达较少。免疫荧光单标记结果显示:与对照组相比,CS组TXNIP核转位现象显着,且胞质内NLRP3表达也显着上升;与CS组相比,HMP组TXNIP核转位现象和胞质内NLRP3表达上升被显着抑制。结论:TXNIP/NLRP3炎性体通路主要在肝细胞中发挥作用。HMP调控TXNIP/NLRP3炎性体通路具体机制如下:HMP抑制再灌注导致的氧化应激,进而抑制TXNIP的核转位现象和NLRP3的胞质内表达上升。随后,HMP抑制TXNIP和NLRP3在细胞质内结合导致下游的炎性体通路的抑制。由于TXNIP和NLRP3在内皮细胞中表达较少,我们认为HMP通过提供流体剪切力刺激进而抑制肝脏中TXNIP的表达并不是HMP抑制TXNIP/NLRP3炎性体通路的主要机制。
刘忠忠[5]（2019）在《辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究》文中研究指明第一部分:辛伐他汀预处理在大鼠全肝缺血再灌注损伤中的作用及潜在机制研究目的:全肝缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）包括肝脏和肠道的热缺血损伤,是肝移植过程中一个错综复杂并不可避免的病理过程,可导致肝移植预后不良。然而,目前改善肝脏IRI的手段有限。本研究探讨辛伐他汀预处理大鼠全肝IRI中的作用及机制。方法:建立一个大鼠全肝热缺血30 min的模型模拟全肝IRI;36只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、IRI对照组（IRI-Con组）和辛伐他汀预处理组（IRI-Sim组）。IRI对照组和辛伐他汀预处理组分别为大鼠建立全肝热缺血30min之前予以0.1%DMSO和1mg/kg辛伐他汀腹腔注射预处理;于再灌注6h和24h收集血液和肝脏标本以待下一步检测,每组两个时间点各6只（n=6）。结果:与IRI对照组相比,辛伐他汀预处理组能显着降低血清ALT和AST水平以及改善肝脏组织病理形态损伤;辛伐他汀预处理组增加了Kruppel样因子2（Kruppel-like factor 2,KLF2）及其下游保护分子磷酸化内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）和血栓调节蛋白（thrombomodulin,TM）的表达（p<0.05）;进一步发现辛伐他汀预处理能影响肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和脂质过氧化物（malondialdehyde,MDA）活性（p<0.05）减轻氧化应激损伤,降低肝细胞凋亡水平并能减少高迁移率蛋白b1（high-mobility group box-1,HMGB1）、toll样4受体（toll-like receptor 4,TLR4）、CD68、肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor a,TNF-a）、白介素1β（interleukin-1,IL-1β）和IL-6表达（p<0.05）抑制炎症反应。结论:辛伐他汀预处理能通过KLF2介导的保护机制减轻全肝IRI;辛伐他汀可能作为一种潜在预防治疗的药物拮抗临床肝脏IRI。第二部分:辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝中缺血再灌注损伤中的作用及机制研究目的:严重的肝脏IRI是导致肝移植近远期疗效差的主要原因之一。如何有效优化心脏死亡（donors after circulatory death,DCD）供肝的质量减轻肝脏IRI是移植领域研究的热点。本研究探讨供体辛伐他汀预处理优化大鼠DCD供肝的作用及机制研究。方法:建立大鼠心脏停跳30 min模拟DCD供肝的模型;24只雄性SD大鼠随机分为4组:正常肝脏组（NP组）、正常肝脏冷保存组（CSP组）、DCD对照组DCD-Con组)和DCD肝脏辛伐他汀预处理组（DCD-Sim组）。NP组和CSP组均为无热缺血损伤的供肝;DCD-Con组和DCD-Sim组分别为大鼠建立心脏停跳热缺血30 min之前予以0.1%DMSO和1 mg/kg辛伐他汀腹腔注射预处理;除了NP组,其他三组均在UW液中冷保存24 h;之后四组全部通过常温复灌系统评价肝脏质量;在肝脏体外常温复灌1h内收集灌注液和组织标本用于研究检测,每组各6只（n=6）。结果:与DCD对照组相比,辛伐他汀预处理组能显着降低灌注液ALT和AST水平,增加胆汁和ATP生成以及减轻肝脏组织形态学损伤;辛伐他汀预处理组增加了KLF2及其下游保护分子磷酸化e NOS、TM和血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）表达（p<0.05）;进一步发现辛伐他汀预处理组能改善肝组织SOD和MDA活性（p<0.05）减轻氧化应激损伤,减少HMGB1、TLR4、CD68、TNF-a、IL-1β、IL-6和ICAM-1基因水平表达（p<0.05）抑制炎症反应并且增加抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值减轻肝细胞凋亡水平。结论:供体辛伐他汀预处理能通过KLF2介导的保护机制减轻DCD肝脏的IRI;以上数据表明辛伐他汀可为临床优化DCD肝脏质量提供潜在的保护效应。
张黎[6]（2019）在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中提出第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组（CON组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组（CON-mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组（mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组（CON-shCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组（shCaMKⅡγ组）,应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01）,shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间（热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min）建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.01）。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组（P<0.05）。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加（P<0.05,P<0.01）,同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。（mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组）、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒（shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组）、生理盐水（CON组）转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）,术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组（p<0.01）。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01,P<0.05）,术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。
于杨[7]（2019）在《NLRP3受体阻滞剂MCC950对大鼠肝移植缺血再灌注损伤保护作用及其在猪DCD肝脏低温机械灌注中的应用》文中进行了进一步梳理目的:肝脏移植是各类终末期肝脏疾病唯一有效的治疗手段。然而,供体器官的短缺严重制约着肝移植手术的开展,每年有大量患者在等待供体的过程中死亡。为了解决供体器官短缺的问题,增加供体器官数量,许多肝移植中心开始关注并使用心脏死亡供体（Donation after cardiac death,DCD）。然而与脑死亡供体（Donation after brain death,DBD）相比,DCD在器官获取之前经历了额外的热缺血阶段,移植后会发生更为严重的缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion?injury,IRI）,因此DCD受者术后发生诸如:移植物原发性无功能（primary non-function,PNF）以及缺血相关胆道疾病等严重并发症的风险更高。为了更好的利用DCD,如何对DCD进行保存和修复成为肝移植外科新兴的热点问题,并且有重要的意义。在肝脏移植的过程当中,供体器官难以避免的会经历缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion?injury,IRI）,而严重的IRI被认为是引起移植术后移植物丧失的主要原因。对于肝脏移植而言,IRI的机制十分复杂,尚未被完全揭示,已知的主要机制包括:氧、氮自由基激活,细胞内钙离子超载,酸中毒,能量代谢障碍,炎性反应激活等。近年来有多篇研究表明,在肝脏移植过程中存在着多种炎性小体的激活,并与肝脏损伤的关系密切,但其具体的致伤机制尚不完全清楚。炎性小体是细胞内一种由多种蛋白质组成的复合体,其分类一般根据其包含的受体蛋白的类型进行划分,具有代表性的有:含有NOD样受体蛋白的NLRP家族炎性小体以及含有HIN200蛋白受体的AIM2炎性小体。NLRP3炎性小体是NLRP炎性小体家族中被研究的最为深入和广泛的一员,目前已经证明NLRP3炎性小体在多种自身免疫性疾病以及慢性炎症中都发挥着重要的作用,其已被广泛认可的作用机制是促进白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）的成熟。同时已有研究证实,肝脏各类细胞内,在肝脏移植过程中尤其是移植术后都存在明显的NLRP3炎性小体激活并发挥损伤作用,但是其具体的致伤机制尚无明确完整的报道,有待深入研究。有报道证实,在冠心病动物模型中使用选择性的NLRP3炎性小体抑制剂MCC950治疗,可以明显改善冠心病动物的预后。受该实验结果的启发,NLRP3炎性小体是否可以作为治疗靶点,减轻肝脏IRI,从而改善DCD肝脏移植的预后具有重要的研究意义。低温机械灌注（hypothermic machine perfusion,HMP）,是一种新型的肝脏保存技术,并认为可以部分修复损伤的DCD器官,改善DCD受者预后。因此HMP有取代以往传统冷保存（static cold storage,SCS）成为DCD供肝首选保存方式的趋势。但是HMP具体的保护机制尚不完全明确,HMP所采用的实施条件及参数,保存液的成分以及保存液添加剂的选用尚存在较大争议,需要大量的实验进行探索及验证。结合NLRP3炎性小体在肝脏IRI中的重要作用,为了推动HMP技术的发展,NLRP3炎性小体抑制剂MCC950是否适合作为灌注液添加剂加入到HMP的灌注液当中,从而提高HMP的保存效果具有重要的研究价值。因此,揭示NLRP3炎性小体在肝脏IRI过程中的损伤机制,并且研究NLRP3炎性小体是否可以作为治疗靶点,提高HMP这一新型技术对于DCD供肝的保存效果,是本研究的目的。研究方法:建立大鼠及小型猪原位肝脏移植模型:大鼠采用SD大鼠磁环双袖套法建立原位DCD肝移植模型,小型猪模型采用巴马小型猪DCD肝移植模型,供器官采用HMP进行保存。将SD大鼠随机分成四组:假手术组,肝移植组,MCC950组,IL-1Ra组,大鼠供肝热缺血开始前10min,MCC950组供体静脉注射MCC950,IL-1Ra组应用天然白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）拮抗剂IL-1Ra,MCC950组以及IL-1Ra组在供肝复灌流后分别静脉注射对应药物。术后根据肝脏酶学指标变化、HE染色、各炎性因子的表达情况以及TUNEL染色,评估肝组织IRI情况。并利用Western blot检测各组NLRP3炎性小体通路以及各凋亡相关蛋白及凋亡通路的表达情况。采用猪肝移植模型,结合低温机械灌注和MCC950。手术组分3组（每组6对）,对照组（供肝采用常规HMP保存）,术后组（供肝采用常规HMP保存并在单纯术后应用MCC950）,灌注+术后组（供肝采用加入MCC950的灌注液保存,并在术后应用MCC950）,术后根据肝脏酶学指标变化、HE染色、各炎性因子的表达情况以及TUNEL染色,评估肝组织IRI情况,并用MEAF评分预测受体长期预后。验证MCC950作为灌注液添加剂应用于HMP在大动物模型上的保护作用,判断是否可以转化为临床应用。结果:在大鼠及小型猪肝移植过程中,均有NLRP3炎性小体的激活,发挥损伤作用。大鼠DCD供肝热缺血前及肝脏再灌注后应用MCC950对于肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用,主要表现为MCC950组相比肝移植组肝脏酶学指标降低,IL-1β血清含量下降,HE染色损伤评分降低,凋亡减少。并且,MCC950对于肝脏缺血再灌注损伤的保护作用明显优于IL-1Ra,尤其是在减少肝细胞凋亡方面,表现为MCC950组术后肝细胞凋亡显着少于IL-1Ra组。检测凋亡相关蛋白发现,MCC950组相比IL-1Ra组线粒体凋亡相关蛋白细胞色素C（cytochrome C,Cyt C）以及活化的半胱天冬酶3（Cleaved caspase 3,Cleaved CASP 3）细胞质内含量明显减少。进一步检测线粒体凋亡通路上游蛋白,发现活化Bid蛋白含量明显减少。在小型猪肝移植过程中,在低温机械灌注肝脏保存的灌注液中加入MCC950并在术后重复给药,其减轻IRI的效果优于普通低温机械灌注以及单纯术后应用MCC950。表现为:灌注+术后组相比另外两组肝脏酶学指标降低,IL-1β及TNF-α等促炎因子血清含量下降,HE染色损伤评分降低,凋亡减少。结论:大鼠DCD供肝缺血再灌注过程中,存在着NLRP3炎性小体激活,并发挥重要的损伤作用。其损伤机制除了经典的促进促炎因子IL-1β成熟,促进炎症反应外,还可以通过激活bid/tbid-Cyt C凋亡通路,引起肝细胞凋亡,从而引起一定程度的肝细胞损伤。在大鼠DCD供肝获取前,供体使用MCC950并于再灌注后重复用药可以有效抑制再灌注后NLRP3炎性小体激活,从而保护供肝,减轻IRI。为了更好的进行临床转化,将MCC950加入到机械灌注保存液当中并于术后重复用药,同样可以抑制NLRP3炎性小体激活,其效果优于单独术后用药。灌注液中加入MCC950提高了HMP对于DCD肝脏的修复效果,联合术后使用可以改善DCD受体预后。
邱涛涛[8]（2018）在《卵黄抗体对黄曲霉毒素B1的降毒效应及机制研究》文中研究指明黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是一类由真菌寄生曲霉菌、黄曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,广泛存在食品和饲料中。其中,以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的肝毒性、基因毒性和免疫毒性最强。卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin,IgY）又称卵黄抗体,存在于经特定抗原免疫禽类的蛋黄中,与哺乳动物血清IgG具有相同特性,能与抗原特异性识别结合。已应用于婴幼儿食品和畜禽饲料中,抵抗病毒和细菌性疾病的侵害。另对IgY研究发现,IgY还可以有效识别大分子蛋白毒素如蛇毒、细菌外毒素等,起到降低毒素毒性的作用。目前,卵黄抗体对小分子毒素的降毒效应缺少基础研究。本研究首次探讨IgY对小分子毒素的降毒效应和其机制。以小分子真菌毒素AFB1为研究对象,小分子真菌毒素ZEN设为对照,合成半抗原后偶联成人工全抗原,免疫蛋鸡制备得到高纯度和特异性IgY。建立细胞染毒模型探讨抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用;以及在其它细胞系中对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用;同时建立体内AFB1诱导肝损伤模型和代谢实验,探讨抗AFB1-IgY降低AFB1诱发肝基因毒性和氧化损伤效应机制。本论文的主要研究成果及结论总结如下:⑴制备出高纯度和特异性抗AFB1-IgY采用加成法AFB1与乙醇酸（GA）合成半抗原AFB1-GA,ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）反应合成半抗原ZEN-CMO,再通过活泼酯法将AFB1-GA和ZEN-CMO半抗原与载体蛋白（BSA和OVA）偶联制备AFB1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA人工抗原,免疫蛋鸡,收集鸡蛋。采用酸性条件下水稀释法和微孔过滤提取蛋黄水溶液,结合盐析法和大分子沉淀法纯化IgY,获得高纯度IgY,纯度为94%。实验发现抗原不同,蛋黄中抗体活性随免疫时间的变化情况也不尽相同,用AFB1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA免疫蛋鸡,均能产生IgY,但产生的活性和时间不同,AFB1-GA-BSA免疫蛋鸡产生IgY的抑制率较高,获得高活性IgY的时间相对较短。本实验中制备的抗AFB1-IgY对抗原AFB1的灵敏度较高,最低检测限LOD为0.06ng/mL,IC50为2.4ng/mL,检测线性范围为0.1332.8ng/mL,对AFB2、交叉反应率均低于5%,而AFG1和AFG2交叉反应率均低于0.1%,反应出抗AFB1-IgY对AFB1有很好的特异性、识别和结合能力。制备的抗ZEN-IgY对抗原ZEN的灵敏度表现相对较低,最低检测限LOD为9.27ng/mL,IC50为83.76ng/mL,检测线性范围为13.78508.85ng/mL,对玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应分别小于:85%,20%和20%;而对AFB1和赭曲霉毒素的交叉反应小于2%,反应出ZEN-IgY对ZEN有一定的识别和结合能力,但特异性较差。⑵体外抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用建立人正常肝细胞L-02体外染毒模型,研究抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒,功能紊乱(活性氧化产物和线粒体膜电位和基因毒性的抑制作用。结果显示分别添加0.125μM、0.25μM和0.5μM抗AFB1-IgY与100μM AFB1于培养基中与L-02细胞孵育48h后,细胞的存活率明显升高、凋亡数量下降、周期阻滞和线粒体膜电位变化得到缓解、活性氧化产物降低、DNA损伤改善。并且随着抗AFB1-IgY浓度的增加,相对AFB1处理组抑制凋亡蛋白BCL2和survivin的表达水平随之增加,而促凋亡蛋白caspase-3和BAX的表达水平随之降低,实验结果显示抗AFB1-IgY本身对细胞凋亡蛋白并没有调节作用,细胞的抗氧化蛋白CAT和SOD1的表达水平亦没有随着抗AFB1-IgY的增加活性增加。AFB1进入细胞终产物AFB1-DNA的浓度检测发现随着抗AFB1-IgY的添加,形成的AFB1-DNA加合物浓度逐步降低。综合以上实验结果:随着抗AFB1-IgY的添加,抗AFB1-IgY与AFB1的特异性识别结合后形成蛋白大分子复合物,此复合物不能被细胞所吸收,AFB1进入细胞量减少,随之降低AFB1诱导的细胞毒性、功能紊乱和基因毒性。⑶其它细胞系中抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用基于AFB1主要靶器官肝脏、肠道和生殖系统,选取人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HTC-8和人孕早期滋养层细胞Swan 71作为研究对象,建立三种细胞AFB1的染毒模型,进一步补充、丰富抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用数据。结果显示抗AFB1-IgY能降低AFB1对三种细胞存活率的抑制,及AFB1诱导HTC-8细胞的凋亡,存在明显的剂量效应关系;通过transwell实验发现抗AFB1-IgY能降低AFB1抑制Swan 71细胞的侵袭和迁移功能。以上结果表明,在其它细胞系中抗AFB1-IgY同样具备对AFB1诱导细胞毒性抑制能力,推测机体同时摄入抗AFB1-IgY和AFB1后,能降低AFB1对机体的肝毒性、生殖毒性及肠道损伤。⑷抗AFB1-IgY对AFB1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤的预防作用为探讨抗AFB1-IgY对AFB1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤抑制作用及机制。通过体外实验确定抗AFB1-IgY和AFB1体外结合比例,建立AFB1诱发大鼠肝损伤模型和AFB1代谢实验。实验结果显示抗AFB1-IgY是一种有效的营养保护剂,可以抑制AFB1诱发早期肝脏损伤生化标志物变化,但IgY并不是通过增加抗凋亡蛋白表达和抗氧化酶活性来实现对肝的保护。进一步AFB1在血液、尿液、肝脏和粪便的代谢产物研究发现中高剂量抗AFB1-IgY与AFB1共同处理大鼠后,AFB1-DNA加合物分别减少了43.3%和52.9%;AFB1-alb分别减少了10.5%和21.1%;AFB1-N7-gua分别减少了19.6%和34.4%,粪便中AFB1增加了约2倍,AFB1-DNA、AFB1-alb和FB1-N7-gua是AFB1诱导机体基因毒性的标志产物,结果证实抗AFB1-IgY是通过抑制AFB1的吸收起到基因毒性预防作用。实验结果证实抗AFB1-IgY能够识别并结合小分子毒素AFB1,形成非共价复合物,减少机体对AFB1吸收,降低小分子毒素AFB1对肝脏组织的基因毒性和氧化损伤。本研究首次为口服IgY抑制动物体内小分子毒素的摄取提供了实验依据。综上所述,抗AFB1-IgY对AFB1具有潜在的降毒作用。在体外实验中抗AFB1-IgY通过与AFB1的结合,减少了AFB1进入细胞所诱发的细胞毒性、细胞功能紊乱和基因毒性。在体内实验中抗AFB1-IgY通过与AFB1形成的非共价复合物,减少胃肠道对AFB1的吸收,降低AFB1诱发肝基因毒性和氧化损伤。本研究增加了抗体新的应用途径,为脱除小分子毒素提供了一种新的思路。
胡昭明[9]（2018）在《常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的实验研究》文中提出目的:探究在不同温度下奥拉帕尼对大鼠离体供肝灌注保存的保护作用。方法:选取Wistar系雄性大鼠80只,SPF级。将50只大鼠随机分为5组:G0:对照组（肝脏离体后不灌注保存）10只;G1:低温组（单纯UW液4℃灌注肝脏）10只;G2:低温联合奥拉帕尼组（奥拉帕尼加入UW液4℃灌注肝脏）10只;G3:常温组（单纯UW液37℃灌注肝脏）10只;G4:常温联合奥拉帕尼组（奥拉帕尼加入UW液37℃灌注肝脏）10只;另30只为肝移植受体。术前禁食12h,不禁水,术前用10%水合氯醛以0.3ml/100g经腹腔麻醉,麻醉后取腹部“十”字形切口进入腹腔,分离门静脉,留置针插入门静脉后取出针芯并用4号丝线固定,连接灌注机械泵,以（6.0±1.0）ml/min的流速在室温下泵入PBS液,并剪开下腔静脉放血,持续原位灌洗肝脏,待20min后肝脏变为均匀土黄色,灌注流出液变清澈后完整分离肝脏。G0组离体肝脏直接取肝送检。G1组离体肝脏放入装有200mlUW液的烧杯中,并将烧杯置于碎冰中维持灌注液0-4℃,将机械泵入口置于烧杯中,同理G2组离体肝脏放入装有200ml含奥拉帕尼（浓度50nM）UW液中,烧杯置于碎冰中维持灌注液0-4℃。G3组离体肝脏放入装有200mlUW液的烧杯中,烧杯置于恒温水浴箱中维持灌注液37℃。G4组离体肝脏放入装有200ml含奥拉帕尼（浓度50nM）UW液中,烧杯置于恒温水浴箱中维持灌注液约37℃。以上G1-G4组保持持续回流循环灌注4h后撤走机械泵后烧杯置于碎冰中在0-4℃下继续保存2h。所有组随机选4只大鼠选肝脏固定位置取肝左叶组织行HE和TUNEL染色,并用免疫组化观察caspase-3表达情况。提取肝组织中Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、IL-1β、IL-6、TNF-α反应肝脏凋亡和炎症水平各项细胞因子,并比较各项指标。各组另6只大鼠供肝行原位肝移植,观察受体术后1、3、7日肝功能以评价各组灌注保存效果。结果:1.单纯常温灌注保存较单纯低温灌注保存供肝组织细胞凋亡及炎症水平降低;2.UW液中加入奥拉帕尼灌注后能减轻供肝组织中细胞凋亡和炎症反应;3.常温联合奥拉帕尼灌注保存供肝可以更好的降低细胞凋亡和炎症反应;4.常温联合奥拉帕尼灌注保存供肝行肝移植后肝功能指标更佳。结论:1.常温下灌注保存效果优于低温灌注保存;2.奥拉帕尼有利于供肝灌注保存;3.常温联合奥拉帕尼的灌注保存效果优势更明显;4.常温联合奥拉帕尼灌注保存供肝改善行肝移植术后肝功能效果更佳。
武睿超[10]（2018）在《CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究》文中提出第一部分大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析[目的]探讨大鼠DCD供体原位肝移植模型稳定建立的技巧及其经验总结。[方法]通过改良Kamada“二袖套”法,对三组（A组热缺血0min40对,B组热缺血10min40对,C组热缺血20min40对）SD大鼠施行原位肝移植,术后记录分析大鼠24h,72h,7天生存率和死亡原因。[结果]术后24h生存率A组92.5%,B组90.0%,C组92.5%;术后72h生存率A组 90.0%,B 组 80.0%,C 组 77.5%;术后 7 天生存率 A 组 85.0%,B 组 70.0%,C组57.5%。3组术后24h和术后72h生存率差异均无显着性（p>0.05）。但3组术后7天生存率不全相同（p<0.05）。7天生存率C组比A组显着降低（p=<0.0167）。术后24h内死亡原因多为手术操作不足,术后胆漏、缺血性肝衰竭多在24h-72h死亡,手术3天-7天死亡原因多为胆道并发症,且随着热缺血时间的延长,胆道并发症的发生率增高。[结论]建立了稳定的大鼠DCD原位肝移植模型。大鼠DCD原位肝移植模型的稳定建立关键在于保护肝脏和胆道功能,难点在于肝上下腔静脉的吻合和缩短无肝期。第二部分热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMKⅡ、肝细胞凋亡及线粒体凋亡的关系[目的]研究在大鼠DCD原位肝移植中,供肝不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMK Ⅱ和肝细胞凋亡、线粒体凋亡的关系[方法]建立大鼠DCD肝移植模型,A组（热缺血Omin）、B组（热缺血1Omin）、C组（热缺血20min）,三组分别于肝移植术后1d、3d、7d随机处死6只大鼠,取肝细胞流式细胞技术AnnexinV-FITC/PI标记测肝细胞凋亡率和JC-10标记测肝细胞线粒体膜电位水平,取肝组织标本QRT-PCR测肝组织CaM mRNA、CaMK Ⅱ γmRNA定量,Western blot测肝组织CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝细胞质CytC、AIF定量。[结果]术后3天,7天,肝细胞JC-10标记测得绿色荧光细胞百分比C组较A组、B组升高,（P<0.05）。B组较A组高（P<0.05）。三组术后同一时间点细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死率C组较B组和A组高,B组较A组高（p<0.05）。CaM、CaMKⅡγ、CytC、AIF表达量术后一天各组间差异无显着性,术后3天、7天C组高于B组和A组（P<0.05）,而B组高于A组（P<0.05）。[结论]在大鼠DCD原位肝移植中,随着供肝经历热缺血时间的延长,术后肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡逐渐增加,肝细胞质CytC、AIF表达量,肝组织CaM、CaMKⅡ表达量逐渐上调。提示CaM、CaMKⅡ与大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡相关,并在大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡途径的细胞凋亡中起着十分关键的作用。第三部分CaMK Ⅱ表达在大鼠DCD肝移植术后细胞和线粒体凋亡中的初步研究[目的]探究CaMK Ⅱ在大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡中的作用。[方法]通过建立热缺血10min的大鼠DCD原位肝移植模型,注射靶向CaMK Ⅱγ基因、CaMKⅡγ-shRNA慢病毒转染,上调和下调模型肝细胞CaMKⅡ表达量。1B组（生理盐水空白组）,2B组（CaMK Ⅱγ过表达空载体组）,3B组（CaMK Ⅱγ过表达组）,4B组（CaMK Ⅱγ干扰表达空载体组）,5B组（CaMK Ⅱγ干扰表达组）,于术后1天、3天、7天、30天随机处死3只大鼠,流式细胞技术测肝细胞凋亡率和肝细胞线粒体膜电位水平,取肝组织标本QRT-PCR测肝组织CaMmRNA、CaMK ⅡγmRNA定量,Western blot检测肝组织CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝细胞质CytC、AIF定量。[结果]五组术后同一时间点肝细胞JC-10标记测得绿色荧光细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死细胞率3B组明显高于1B和2B组（P<0.05）,5B组明显低于1B组和4B组（P<0.05）,而1B、2B、4B差异无显着性（P>0.05）。CaM、CaMK Ⅱγ、CytC、AIF表达量术后一天各组间差异无显着性,术后3天、7天、30天3B组明显高于1B和2B组（P<0.05）,5B组明显低于1B组和4B组（P<0.05）,而1B、2B、4B差异无显着性（P>0.05）。[结论]大鼠DCD原位肝移植术后自大鼠阴茎背静脉注入慢病毒进行转染,此方法简单、安全、有效。在大鼠DCD原位肝移植中,上调肝细胞CaMKⅡγ表达量后,移植肝肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡率升高。反之,干扰下调肝细胞CaMKⅡ表达后,移植肝肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡率降低。反应了CaMKⅡ参与大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡及细胞凋亡过程的调控。由此推断,在DCD肝移植术后,若能特异性阻断CaMK Ⅱ信号通路,则可达到减少肝细胞凋亡的目的。
二、大鼠肝脏保存中不同器官保存液对肝细胞凋亡的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠肝脏保存中不同器官保存液对肝细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
（1）HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 大鼠HO-1和HO-1 shRNA腺相关病毒载体的构建及转染效果验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 大鼠心脏死亡供体原位肝移植缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 微小RNA在肝脏缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）基于高内涵分析技术的绒毛诃子肝毒性及毒性物质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 诃子的化学成分及其现代药理学研究 |
| 1.1 诃子中的化学成分 |
| 1.2 诃子的现代药理学研究 |
| 2 中药致肝损伤的研究进展 |
| 2.1 肝损伤的分类 |
| 2.2 中药的肝毒性物质分类 |
| 2.3 中药致肝毒性的机制研究 |
| 2.4 高内涵技术在药物肝毒性筛选的应用 |
| 前言 |
| 第一章 绒毛诃子水煎液的肝毒性研究 |
| 第一节 绒毛诃子的小鼠急性毒性实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 绒毛诃子的小鼠蓄积毒性实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 绒毛诃子的小鼠28天重复给药毒性实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 绒毛诃子的大鼠28天重复给药毒性实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第一章 小结 |
| 第二章 绒毛诃子致肝毒性的物质基础研究 |
| 第一节 绒毛诃子中化合物对HepG2和L02细胞增殖抑制率的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 用HCS技术筛选绒毛诃子对HepG2细胞的毒性作用成分 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 用HCS技术筛选绒毛诃子对L02肝细胞的毒性作用成分 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 用HPLC法检测绒毛诃子中毒性成分含量 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 小结 |
| 结语与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）PP2A在长时间冷保存导致DCD肝脏损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 肝移植发展现状 |
| 1.2 冷缺血时间对肝移植预后的影响 |
| 1.3 线粒体-内质网结构耦联及其功能简述 |
| 1.4 线粒体活动的磷酸化调控 |
| 1.5 PP2A与内质网应激的关系 |
| 2 长时间低温保存对DCD肝脏的损伤作用探讨 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 检测指标 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 扩大标准供肝的损伤因素分析 |
| 参考文献 |
| 综述二 线粒体自噬的调控机制及在疾病中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（4）TXNIP/NLRP3炎性体通路在低温机械灌注优化心脏死亡供肝质量的作用机制（论文提纲范文）
| 本论文的创新点 |
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 低温机械灌注对于大鼠心脏死亡供肝的保护效果研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料和方法 |
| 1.3 统计分析方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 TXNIP/NLRP3 炎性体通路在低温机械灌注改善大鼠心脏死亡供肝质量的机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 统计分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三部分 TXNIP/NLRP3 炎性体通路在肝脏中的表达模式研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 统计分析方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（5）辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词简表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 国内外肝移植现状 |
| 1.2 DCD肝脏存在的问题 |
| 1.3 KLF2 |
| 1.4 KLF2 与缺血再灌注损伤 |
| 1.5 研究假设 |
| 2 第一部分辛伐他汀预处理在大鼠全肝缺血再灌注损伤中的作用及潜在机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 第二部分辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝中缺血再灌注损伤中的作用及机制究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（6）CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 建立SD大鼠DCD原位肝移植模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）NLRP3受体阻滞剂MCC950对大鼠肝移植缺血再灌注损伤保护作用及其在猪DCD肝脏低温机械灌注中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :NLRP3 炎性小体在肝脏缺血再灌注中的损伤作用及机制以及MCC950对于肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 NLRP3 炎性小体在DCD供肝获取及保存过程中的激活情况 |
| 2.2.2 大鼠肝移植中DCD供体肝脏再灌注后NLRP3 炎性小体激活情况 |
| 2.2.3 MCC950 对于DCD肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠肝移植模型的建立 |
| 2.3.2 研究指标及方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠供肝获取及保存过程中及再灌注后NLRP3 炎性小体的激活情况 |
| 3.2 MCC950 对于大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 3.2.1 各组手术基本情况 |
| 3.2.2 各手术组NLRP3 炎性小体激活情况 |
| 3.3 肝功能ALT,AST测定 |
| 3.4 血清炎症因子IL-1β以及TNF-α检测 |
| 3.5 HE染色组织学观察 |
| 3.6 TUNEL染色检查肝细胞凋亡情况 |
| 3.7 凋亡相关蛋白Cleaved CASP-3,Cleaved CASP-8,细胞色素C,AIF水平 |
| 3.8 线粒体凋亡通路Cyt C上游通路的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 :NLRP3炎性小体选择性抑制剂在小型猪肝移植供肝机械灌注保存中的应用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 MCC950 加入到低温机械灌注灌注液中对于供肝IRI的保护作用 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 猪DCD肝移植模型的建立 |
| 2.3.2 手术基本情况 |
| 2.3.3 HE染色组织学观察 |
| 2.3.4 肝功能酶学、胆红素以及INR测定 |
| 2.3.5 TNUEL法检测肝细胞凋亡 |
| 2.3.6 Western blot测定蛋白表达 |
| 2.3.7 ELISA法检测血清中IL-1β、TNFα |
| 2.3.8 MEAF评分评估长期预后 |
| 2.3.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组手术基本情况 |
| 3.2 各手术组NLRP3 炎性小体激活情况 |
| 3.3 肝功能ALT,AST,总胆红素以及INR测定 |
| 3.4 血清炎症因子IL-1β、TNFα、IL-10 水平ELISA检测 |
| 3.5 HE染色组织学观察 |
| 3.6 TUNEL染色检查肝细胞凋亡情况 |
| 3.7 MEAF评分预测长期预后 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）卵黄抗体对黄曲霉毒素B1的降毒效应及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略对照表（Abbreviations） |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 AFB_1毒性机理及危害 |
| 1.1.1 AFB_1污染情况及限量标准 |
| 1.1.2 AFB_1毒性机理 |
| 1.1.3 AFB_1对动物危害 |
| 1.2 AFB_1脱除法 |
| 1.2.1 物理脱除法 |
| 1.2.2 化学脱除法 |
| 1.2.3 生物方法脱除法 |
| 1.3 卵黄抗体中和毒素研究 |
| 1.3.1 IgY的形成和结构 |
| 1.3.2 IgY提取与纯化 |
| 1.3.3 IgY生物学优势 |
| 1.3.4 IgY体内代谢活性 |
| 1.3.5 IgY中和蛋白毒素研究 |
| 1.4 口服卵黄抗体的应用 |
| 1.4.1 促生长发育应用 |
| 1.4.2 动物疾病控制应用 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的与研究内容 |
| 1.5.2 研究方法 |
| 1.6 主要技术路线图 |
| 第2章 抗AFB_1和ZEN卵黄抗体的制备及鉴定 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 2.1.2 常用试剂配制 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 饲料配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 AFB_1半抗原的衍生 |
| 2.2.2 ZEN半抗原的衍生 |
| 2.2.3 AFB_1人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.4 ZEN人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.5 免疫蛋鸡 |
| 2.2.6 卵黄抗体的初步纯化 |
| 2.2.7 冷冻干燥制备卵黄抗体粉 |
| 2.2.8 卵黄抗体纯度鉴定 |
| 2.2.9 间接竞争酶联免疫分析方法 |
| 2.2.10 建立标准曲线 |
| 2.2.11 不同免疫期IgY结合抗原能力 |
| 2.2.12 特异性检测 |
| 2.2.13 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 半抗原的鉴定 |
| 2.3.2 人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.3.3 抗体纯度鉴定 |
| 2.3.4 ELISA标准曲线的建立 |
| 2.3.5 不同免疫时期IgY抑制率 |
| 2.3.6 特异性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 3.1.2 常用试剂配制 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 细胞株 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 L-02细胞培养 |
| 3.2.2 MTT法检测AFB_1或抗AFB_1-IgY对L-02细胞的毒性 |
| 3.2.3 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制L-02细胞存活影响检测 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 细胞内活性氧含量的测定 |
| 3.2.6 细胞线粒体膜电位变化检测 |
| 3.2.7 细胞周期检测 |
| 3.2.8 Hoechst染色检测细胞核形态变化 |
| 3.2.9 细胞DNA损伤检测 |
| 3.2.10 AFB_1-DNA加合物测定 |
| 3.2.11 Western blot测定氧化蛋白和凋亡蛋白表达水平 |
| 3.2.12 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 抗AFB_1-IgY或AFB_1对L-02细胞的毒性作用 |
| 3.3.2 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性影响 |
| 3.3.3 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞功能紊乱影响 |
| 3.3.4 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞基因毒性影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 其它细胞模型抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性的抑制作用 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 4.1.2 常用试剂配制 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 细胞株 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HepG2人肝癌细胞培养 |
| 4.2.2 HTC-8人结肠癌细胞培养 |
| 4.2.3 Swan71人滋养层细胞培养 |
| 4.2.4 MTT法检测抗AFB_1-IgY或AFB_1对三种细胞的毒性 |
| 4.2.5 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制HepG2、HTC-8和Swan71细胞存活影响 |
| 4.2.6 HTC-8细胞凋亡检测 |
| 4.2.7 Transwell实验检测Swan71细胞侵袭和迁移能力 |
| 4.2.8 数据处理与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抗AFB_1-IgY或AFB_1对HepG2细胞毒性 |
| 4.3.2 抗AFB_1-IgY或AFB_1对HTC-8细胞毒性 |
| 4.3.3 抗AFB_1-IgY或AFB_1对Swan71细胞毒性 |
| 4.3.4 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制HepG2细胞存活率影响 |
| 4.3.5 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制HTC-8细胞存活率影响 |
| 4.3.6 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制Swan71细胞存活率影响 |
| 4.3.7 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导HTC-8细胞凋亡影响 |
| 4.3.8 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导Swan71细胞侵袭和迁移能力降低的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤抑制作用 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 5.1.2 常用试剂配制 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 卵黄抗体制备 |
| 5.2.2 抗AFB_1-IgY与AFB_1体外结合反应 |
| 5.2.3 肝损伤干预实验动物分组及处理 |
| 5.2.4 肝组织病理学检验 |
| 5.2.5 血清肝功能指标的测定 |
| 5.2.6 肝组织一氧化氮的测定 |
| 5.2.7 肝组织脂质过氧化产物丙二醛的测定 |
| 5.2.8 Western blot测定抗氧化蛋白和凋亡相关蛋白表达水平 |
| 5.2.9 抗AFB_1-IgY干预AFB_1代谢实验动物分组及处理 |
| 5.2.10 粪便中AFB_1的定量测定 |
| 5.2.11 AFB_1-N7-Gua,AFB_1-DNA和AFB_1-alb的定量测定 |
| 5.2.12 数据处理与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 体外抗AFB_1-IgY与AFB_1结合作用 |
| 5.3.2 大鼠存活及体重变化状况 |
| 5.3.3 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导大鼠血清肝功能异常影响 |
| 5.3.4 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱发大鼠肝脂质氧化影响 |
| 5.3.5 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱发大鼠肝组织病理学变化影响 |
| 5.3.6 抗AFB_1-IgY抑制AFB_1诱导大鼠肝细胞凋亡和抗氧化蛋白变化 |
| 5.3.7 抗AFB_1-IgY共同处理对大鼠粪便中AFB_1含量影响 |
| 5.3.8 抗AFB_1-IgY共同处理对大鼠尿液中AFB_1代谢物含量影响 |
| 5.3.9 抗AFB_1-IgY共同处理对大鼠血液中AFB_1-alb含量影响 |
| 5.3.10 抗AFB_1-IgY共同处理对肝组织中AFB_1-DNA含量影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新性 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A：AFB_1和ZEN半抗原鉴定图谱 |
| 附录B：攻读博士学位期间发表论文 |
（9）常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 :大鼠离体肝脏持续灌注模型的建立 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 :常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的保护作用 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMK Ⅱ、肝细胞凋亡及线粒体凋亡的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMK Ⅱ表达在大鼠DCD肝移植术后细胞和线粒体凋亡中的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
四、大鼠肝脏保存中不同器官保存液对肝细胞凋亡的影响（论文参考文献）
- [1]HO-1通过抑制p38 MAPK激活减轻大鼠DCD肝移植缺血再灌注损伤[D]. 严启航. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]基于高内涵分析技术的绒毛诃子肝毒性及毒性物质研究[D]. 王晨晓. 北京中医药大学, 2020(04)
- [3]PP2A在长时间冷保存导致DCD肝脏损伤中的作用及机制研究[D]. 兰佳男. 武汉大学, 2020(06)
- [4]TXNIP/NLRP3炎性体通路在低温机械灌注优化心脏死亡供肝质量的作用机制[D]. 何维阳. 武汉大学, 2019(07)
- [5]辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究[D]. 刘忠忠. 武汉大学, 2019(08)
- [6]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
- [7]NLRP3受体阻滞剂MCC950对大鼠肝移植缺血再灌注损伤保护作用及其在猪DCD肝脏低温机械灌注中的应用[D]. 于杨. 中国医科大学, 2019(01)
- [8]卵黄抗体对黄曲霉毒素B1的降毒效应及机制研究[D]. 邱涛涛. 华南农业大学, 2018(08)
- [9]常温下奥拉帕尼对大鼠体外供肝灌注保存的实验研究[D]. 胡昭明. 南京医科大学, 2018(01)
- [10]CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究[D]. 武睿超. 昆明医科大学, 2018(01)