一、Construction of Mutant Populations by T-DNA Insertion for Functional Genomic Study in Cotton（论文文献综述）
郝梦媛,杭琦,师恭曜[1]（2022）在《VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望》文中研究说明随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点,被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程,系统归纳了VIGS在不同作物中的应用,总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素,并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望,以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。
郝亚琦,宗秀梅,任潘,付爱根[2]（2021）在《拟南芥黄心突变体yh基因的图位克隆及分析》文中指出在研究光合作用相关基因的过程中,获得了一个叶片为黄心（yellow heart,yh）的突变株,与野生型拟南芥（Col-0）相比,其新生叶片发黄,突变表型由隐性单基因控制。采用图位克隆及其精细定位技术,将yh突变基因定位在1号染色体的INS155342与INS15634区间,物理距离约为676 kb。通过测序得知yh在At1g64790第44个内含子剪接处有4个碱基的缺失,导致内含子剪切位点的变化。RT-PCR分析显示,该基因表达降低,是At1g64790基因的一个新等位突变。研究表明,yh突变体与叶绿体的发育相关,可为进一步探究植物叶绿体和叶片发育机制提供新的遗传材料。
刘叶,顾爱星,朱琦[3]（2022）在《棉花枯萎病菌突变体库的构建及分析》文中研究说明【背景】棉花枯萎病逐渐成为威胁新疆海岛棉产业发展的主要病害,但关于棉花枯萎病菌的致病力、产孢量、生长速度及颜色变化等相关功能基因目前还不是十分明确。【目的】通过构建绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）标记棉花枯萎病菌突变体库,筛选出由于T-DNA的随机插入而导致性状发生变异的突变体,为棉花枯萎病菌功能基因筛选和研究提供材料。【方法】通过Agrobacterium tumefaciens mediated transformation （ATMT）构建了GFP标记的棉花枯萎病菌的突变体库,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性,对随机选取的突变体菌落形态、生长速率、产孢量、萌发率、T-DNA插入拷贝数及致病力进行分析,从而筛选获得变异明显且稳定的突变体。【结果】利用优化后的ATMT介导体系转化获得了1 600株GFP标记的棉花枯萎病菌转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接7代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明潮霉素Hyg基因成功插入野生型基因组且稳定遗传。最终筛选出17株菌落表型与野生型有差异的突变体,其中包括生长缓慢型、菌丝深紫色型、菌丝淡紫色型、菌丝浅黄色型;突变体A-1致病力相较于野生型增加了21.98%,A-1产孢量相较于野生型增加了103.54%,C-6、C-7产孢量相较于野生型降低61.90%。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的棉花枯萎病菌突变体库,筛选分析获得了菌落形态、生长速率、产孢量和致病力发生变化的突变体,为进一步研究棉花枯萎病菌相关功能基因筛选奠定了基础。
王昊一[4]（2021）在《油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘》文中研究表明甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是中国最重要的油料作物之一。国产油菜的主要问题之一是其种子含油量偏低。因此,提高种子含油量是国产油菜育种的重要目标之一。以往针对提高油菜种子含油量的研究大都着眼于增加油脂的合成,但是,有关通过抑制引起种子油脂消减基因的表达进而提高种子含油量的研究相对较少,而这同样不失为提高种子含油量的有效策略。GDSL脂酶参与种子油脂消减过程,前人研究发现,拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在5个GDSL类种子脂肪酸消减基因（Seed fatty acid reducers,SFARs）,过表达每个SFAR基因都能够显着降低拟南芥种子含油量,相反,敲除每个SFAR基因则能显着提高拟南芥种子含油量。因此,我们推测在油菜中敲除SFARs的同源基因极有可能提高油菜种子含油量。然而,甘蓝型油菜是复杂的异源四倍体植物,油菜BnSFAR家族的组成比拟南芥复杂得多,不同亚基因组的SFAR可能具有不同的表达模式与功能。此外,油菜种子含油量是受到多基因调控的复杂数量性状。以往大多数与含油量相关的QTLs的鉴定是基于两个亲本后代遗传群体含油量性状的变异,即,QTLs的发现局限于双亲之间相关基因的等位变化的有无。近年来,我们对大规模油菜种质资源群体进行了基因组重测序,为在具有丰富多态性的遗传群体中进一步发掘含油量相关QTL及基因打下基础。围绕上述问题,我们开展了以下工作:（1）利用定向诱导基因组局部突变（Targeting induced local lesions in genomes,TILLING）和CRISPR/Cas9技术创制了bnsfars突变体,并验证BnSFARs对油菜种子含油量的影响;（2）通过对290份油菜核心种质资源的种子含油量进行全基因组关联分析（Genome-wide association study,GWAS）,进一步发掘了调控油菜种子含油量的相关基因。主要结果如下:（1）鉴定到了甘蓝型油菜基因组上的222个BnGDSLs,平均分布于A和C亚基因组上,分别有6和4个亚家族,且这些BnGDSLs与拟南芥GDSL脂酶基因（AtGDSLs）存在着明显的共线性关系。通过序列比对,与AtSFARs（AtSFAR1至AtSFAR5）高度同源的12个BnGDSLs被挑选为候选的BnSFARs。不同BnSFAR亚家族之间的相对表达水平差异巨大,但同一BnSFAR亚家族内的同源拷贝之间的表达模式则大体相似。对870份油菜种质资源群体中分布在BnSFARs编码区域的SNPs与种子含油量进行相关性分析表明,BnSFAR1与BnSFAR4基因上的SNPs与种子含油量显着相关（P<0.05）,BnSFAR1、BnSFAR4和BnSFAR5基因上的SNPs与种子油酸含量显着相关（P<0.05）。（2）采用基于甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate,EMS）诱变的TILLING技术,筛选到bnsfar1和bnsfar4的纯合单突变体、纯合双突变体。在相同遗传背景下,bnsfar4的纯合单突变体（包括bnsfar4.C03a、bnsfar4.A06a、bnsfar4.A06b、bnsfar4.Cnnb）的种子含油量与相应位点没有突变的EMS处理植株没有明显区别,但其双突变体（包括bnsfar4.A06a bnsfar4.C03a和bnsfar4.A06b bnsfar4.Cnnb）的种子含油量比相应位点没有突变的EMS处理植株显着提高了8.7%-12.1%。与bnsfar4不同,bnsfar1的纯合双突变体（bnsfar1.Ann bnsfar1.C04）种子含油量与相应位点没有突变的EMS处理植株相比没有明显区别。由于EMS会导致全基因组范围的大量随机突变,因此TILLING创制的突变体种子含油量基本上都显着低于未经EMS诱变处理的对照植株。（3）利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了BnSFAR4的四个同源拷贝和BnSFAR5的两个同源拷贝,创制了bnsfar4四突变体（bnsfar4.A06a bnsfar4.C03a bnsfar4.A06b bnsfar4.Cnnb）和bnsfar5双突变体（bnsfar5.A03 bnsfar5.C07）。bnsfar4突变体的T3代种子和T4代种子的含油量分别比野生型种子提高9.7%-14.5%和12.9%,而bnsfar5突变体植株的T3代种子和T4代种子的含油量分别比野生型提高了10.4%和11.2%。除了bnsfar4突变体的T4代种子外,其它突变体种子的千粒重与野生型相比都没有明显变化,且突变体种子萌发率以及萌发初期的根长和芽长与野生型相比也没有明显变化。此外,bnsfar4突变体种子细胞内的油体尺寸显着大于野生型,且突变体种子含油量在种子发育后期和萌发初期的下降速率明显慢于野生型。（4）测定了290份油菜核心种质材料在两个试验点的种子含油量,并进行了GWAS分析,鉴定到C07染色体上35.25-35.79 Mb区域内的SNPs与种子含油量存在显着的关联性(-logp10>5)。其中SNP位点Chr C07＿35249208与Bna C07g30920D（Bna.PTL.C07）紧密连锁（决定系数R2=0.68）。Bna.PTL.C07是Patatin-like lipase（PTL）脂酶基因家族的一员,分布于其5’端调控区的6个SNPs与种子含油量显着相关（P<0.05）,其中2个SNP位点位于CAAT-box中。总之,本研究分析了油菜BnGDSL基因家族并创制了BnSFARs的功能受到有效阻控的高含油量育种基础材料;展示了CRISPR/Cas9相较TILLING在异源多倍体作物突变体创制上的优势;发掘了可能与油菜种子含油量相关的基因位点。这项研究在采用精准设计育种的手段提高油菜种子含油量方面作了有益尝试。
孙琳[5]（2021）在《CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建》文中研究说明棉花既是一种重要的纤维作物,也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长,从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响,因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一,Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响,但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫,迫使杀虫剂大量喷施,造成多种害虫对农药的抗性随之进化,这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长,害虫对Bt棉的抗性也随之增强,其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种,可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法,为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果:1.sgRNA设计与载体文库构建本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因,通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆,只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程,共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织,获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列,共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列,已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。3.高效的编辑率和遗传率通过高通量测序,软件分析和人工筛选,共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%,其中,75.61%材料表现出高效的突变率,编辑率超过80%,编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。4.低脱靶风险通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测,结果中没有发现有任何脱靶效应产生,进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低,具有很高的特异性。5.高效的表型鉴定率在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。6.抗虫相关候选基因通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库,并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库,并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物,对其他作物研究具有一定的参考价值。
王权[6]（2020）在《应用“侧翼序列标记测序”在转基因农作物基因组中分离侧翼序列》文中研究表明利用转座子或T-DNA等标签构建的植物突变体研究基因功能时,需要明确标签在基因组中的插入位点,即获得标签序列的侧翼序列。目前已开发的侧翼序列分离方法均有其优势与不足之处,随着测序技术的不断进步与发展,分离侧翼序列的方法也应推陈出新。本实验室以下一代测序技术（Next-generation Sequencing,NGS）为基础,开发出了一种高效的分离标签序列的侧翼序列方法“侧翼序列标记测序”（Flanking sequence tagging-sequencing,FST-seq）,此方法可以从一个样品中一次性分离多个标签的侧翼序列。FST-seq方法首先以Tn5转座酶复合体对基因组DNA进行打断的同时为DNA片段两端连上接头,再通过三轮PCR扩增富集包含标签序列的DNA片段并为其连接上NGS测序所需的完整Illumina接头,PCR产物经片段分选后可直接进行上机测序,无需额外的建库操作。测序数据下机后,通过我们的生物信息学分析流程即可获得标签序列的侧翼序列信息。本研究应用FST-seq在转基因小麦、水稻与玉米中分离T-DNA标签的侧翼序列从而确认T-DNA的插入位点,并对每个插入位点一一进行验证。具体来说,共分析了4种转基因植物材料,分别是河南大学转基因小麦植株、山东农业大学转基因小麦植株、韩国转基因水稻植株和河南农业大学转基因玉米植株。挑选其中基因组质量优良的转基因阳性材料,通过FST-seq方法在河南大学转基因小麦材料p2c-3中,从T-DNA的右边界分析得到了4个标签序列的插入位点,并通过PCR扩增成功验证了其中的3个位点;在韩国转基因水稻HT中找到了2个标签序列插入位点,在河南农业大学转基因玉米材料752-5和752-24中找到了相同的1个标签序列插入位点,均通过在标签序列和参考基因组中设计引物验证成功。不仅如此,本研究还通过FST-seq方法确认了T-DNA标签在基因组中的插入结构。对于河南大学转基因小麦材料,对T-DNA左边界可能的插入结构进行了分析,发现3个插入位点的T-DNA都存在正向串联重复现象且有2种串联重复方式,并通过PCR与Sanger测序确认了该结果。对于山东农业大学转基因小麦材料,共分析了6个样品,编号分别为A1、A2、A3、A4、B10、B11,但最终并没有分析到标签序列在小麦基因组中的插入位点。为了分析这一原因,利用NGS测序数据从T-DNA右边界的reads中发现2个插入位点的T-DNA存在正向串联重复现象,同样利用PCR与Sanger测序对此结果进行了验证。本研究应用FST-seq方法从基因组庞大且复杂的小麦及基因组较小的水稻和玉米中成功的分离到侧翼序列,并通过PCR等其他实验证明了此方法的准确性与实用性。
韩锐[7]（2020）在《白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究》文中认为植物T-DNA插入突变体是遗传学研究中珍贵的实验材料。白桦（Betula platyphylla Suk.）的全基因组测序已经完成,为开展白桦T-DNA插入突变体的研究及后续的基因鉴定提供了可能。本研究以白桦T-DNA插入突变体br为研究对象,鉴定其突变性状,分离T-DNA插入位点的侧翼序列,确定突变基因,并开展突变基因功能的研究。研究结果如下:（1）以白桦br突变体为试材,以野生型白桦WT为对照,以转BpCCR1过表达白桦OE2为转基因对照,从生长特性、株型特征、光合能力、感病能力和内源激素含量等方面展开研究。生长特性及株型观察结果显示,br株系树高、地径显着低于2个对照株系,但表现出侧枝细,二级侧枝多,节间距小,分枝角小的株型特征。相对叶绿素含量、光合参数及叶绿素荧光参数分析显示,与对照株系相比,br的相对叶绿素含量低,非光化学猝灭系数小,但气孔导度和蒸腾速率大。感病性分析显示,br株系比对照株系更易感链格孢菌（Alternaria alternata）。内源激素含量测定结果显示,br主枝茎尖与侧枝茎尖中IAA和Zeatin激素含量相近,但细胞分裂素与生长素含量的比值较大。同时,br侧枝茎尖中茉莉酸含量低,水杨酸含量高。（2）对WT、OE2和br主枝茎尖和侧枝茎尖进行转录组测序,结果表明,与WT和OE2相比,br主枝茎尖中的差异基因有406条,包括149条上调表达基因和257条下调表达基因;br侧枝茎尖中的差异基因有396条,包括125条上调表达基因和271条下调表达基因。这些差异基因影响了花发育、植物育性、植物生长发育、器官形态建成、顶端分生区活性、激素的生物合成和信号转导等生物学进程。（3）以br突变体为试材,采用TAIL-PCR、基因组二代和三代重测序技术鉴定T-DNA插入位点,结果发现br基因组中存在2个T-DNA插入位点,其中,一个位点位于Chr 5（1729009～1729377 bp）上,引起369 bp不纯合缺失,缺失区域包含了BpCOI1（Bpev01.c0817.g0010.m0001）基因的122 bp 5’UTR和 247 by第一段外显子序列。qRT-PCR结果显示,br中BpCOI1基因表达量显着低于WT和OE2,且br突变体对外源MeJA应答能力降低。（4）通过农杆菌介导法将BpCOI1启动子融合GUS的表达载体转入到白桦合子胚中,共得到4个ProBpCOI1::GUS转基因株系。GUS染色和GUS基因表达量分析显示,在转基因白桦的根、茎、叶和芽中均能检测到BpCOI1转录活性,且GUS基因在茎和芽中表达量较高。跟据BpCOI1启动子序列上顺式作用元件预测结果,对ProBpCOI1::GUS转基因株系进行IAA、ABA、GA、SA、MeJA、ET和光周期处理,GUS活性和GUS基因表达量分析显示,BpCOI1启动子对上述激素均有不同程度的应答,且对MeJA的响应最为明显;不同光周期也会影响BpCOI1启动子活性,其中,长光照促进BpCOI1启动子活性,短光照抑制其活性。（5）BpCOI1定位在细胞核上。与基因组序列相比,白桦中BpCOI1基因第150位碱基发生同义突变。对白桦、拟南芥、水稻和毛果杨中的COI1蛋白进行多序列比对,发现不同物种的COI1序列1～40位氨基酸不保守,这段序列包含了部分F-box结构域;酵母双杂交和双分子荧光互补实验显示这种序列不保守性并未影响BpCOI1蛋白与SKP1家族蛋白的相互作用。（6）采用农杆菌介导法获得8个35S::BpCOI1过表达白桦株系;采用RNAi技术干扰了 2个片段,分别位于BpCOI1的第三段外显子上和第一段外显子上（包含了突变体中部分缺失的序列）,各获得了 5个35S-BpCOI1-RNAi抑制表达株系。生长性状观察结果显示,1年生和2年生转基因株系的树高、地径和侧枝数与野生型白桦相比无明显差别。MeJA诱导实验表明高浓度MeJA抑制了野生型和BpCOI1过表达株系的根生长,但对抑制表达株系的根生长抑制作用不明显。感病性分析显示,链格孢菌侵染7d后,BpCOI1抑制表达株系感病率在83.33%以上,病害指数在10.51%～22.95%之间,而BpCOI1过表达及野生型白桦的叶片均未出现病斑。qRT-PCR结果显示,链格孢菌侵染后,与野生型白桦相比,过表达株系中BpCOI1和BpMYC2表达量均上调,而抑制表达株系中BpCOI1和BpMYC2不上调或上调不明显。（7）对野生型白桦及转BpCOI1基因过表达和抑制表达白桦及进行转录组测序,发现与野生型白桦相比,BpCOI1过表达株系中有1385条基因上调表达,1137条下调表达;抑制表达株系中有1446条基因上调表达,921条下调表达。在抑制表达株系中,多数参与萜类化合物和次生代谢产物合成的基因、4条参与JA信号转导的基因下调表达;6条参与SA信号转导的基因、多数参与调控植物与病原菌相互作用和植物衰老进程的基因、WRKY类的基因均上调表达。此外,参与其他植物激素的生物合成及转导、调控植物防御、激素响应、逆境响应、细菌和真菌响应的基因在BpCOI1转基因株系中也差异表达。综上所述,本研究对易感病、多分枝、矮化等多性状变异的T-DNA插入突变体br进行鉴定,确定了突变体中T-DNA插入位点,分离了突变基因,并对突变基因BpCOI1的启动子和基因功能展开研究。研究结果证明,COI1蛋白在JA信号感知方面至关重要,BpCOI1基因低量表达可以导致白桦对JAs信号不敏感,且易感病,研究结果可为白桦抗病性育种提供参考。
唐珊[8]（2020）在《甘蓝型油菜油脂合成遗传机制解析和EMS突变体库构建》文中进行了进一步梳理油菜是我国重要的油料作物,是继大豆和棕榈后的世界第三大植物油的来源。提高种子含油量（Seed Oil Content,SOC）是油菜育种的重要目标之一,我国的甘蓝型冬油菜主要品种种子含油量在40%左右,比国外的优良品种低3-5个百分点。育种家手中已经收集到大量含油量超过50%,甚至达到60%的种质资源,因此,培育高含油量、适合推广种植的优良油菜品种有巨大的潜力。植物种子中的油脂合成和积累是一个复杂代谢调控网络,涉及多条代谢途径和数百个基因。但是,油菜的油脂生物合成机制仍然不清楚,这大大阻碍了油菜含油量的遗传改良。本研究通过多组学关联分析来解析甘蓝型油菜油脂生物合成的遗传和分子机制。通过构建油菜EMS突变体库筛选含油量和脂肪酸组成相关突变体,为研究油菜油脂合成和油菜育种提供材料。主要研究结果如下:构建505份甘蓝型油菜自交系组成的自然群体,利用重测序技术获取自然群体的变异图谱,并采集自然群体多年多点的含油量表型数据,利用线性混合模型（Linear Mixed Model,LMM）对不同环境的表型进行全基因组关联分析（GenomeWide Association Study,GWAS）。经统计,27个显着信号位点至少在两个重复中检测到（不同的年份、地点、亚群）。显着QTL（Quantitative Trait Locus,数量性状位点）的效应检测表明只有极少数材料在这些位点上全为增效等位基因,大部分增效位点尚未在育种中得到很好的利用;不同亚群中增效等位基因频率不同,但基本上都是衍生基因型,意味着都是育种过程中选择而来。27个含油量QTL的受选择分析结果表明,在育种过程中,许多含油量相关位点都是人工选择的结果,但一些含油量增效QTL没有得到很好的利用。对自然群体中309份开花后20天（20 Days After Flowering,20 DAF）和274份开花后40天（40 Days After Flowering,40 DAF）种子进行转录组测序,并进行含油量的全转录组关联分析（Transcriptome-Wide Association Study,TWAS）,关联分析分别检测到605和148个显着相关的基因。基因富集显示20 DAF基因主要富集到逆境代谢,40 DAF基因主要富集到类黄酮及次级代谢物的生物合成。转录组的独立成分分析（Independent Component Analysis,ICA）显示20 DAF和40 DAF中分别鉴定出146和141个独立模块,其中20 DAF中鉴定到模块M65与含油量显着相关,该模块富集逆境和激素响应代谢途径。40 DAF中鉴定到模块M79、M103和M139与含油量显着相关,其中M139模块富集逆境和类黄酮相关通路,M103模块富集细胞增殖以及植物器官发育。表达模块与含油量QTL相关性显示M65和M139与QTL q OC.A09.5显着相关联,M79与q OC.A05.3、q OC.C05.2和q OC.C05.3显着相关,结果表明,这些QTL可能通过控制多基因的表达从而最终影响油菜种子含油量。基于在油菜中建立的关联分析候选基因筛选平台,对含油量相关候选基因打分排序。确定q OC.A05.3和q OC.C05.3候选基因为PMT6。基于拟南芥和油菜的突变体材料和转基因超表达材料,初步确定基因PMT6负调控含油量积累。以中双11为亲本,构建了M2群体大小大约为100,000的EMS（Ethyl Methanesulfonate,甲磺酸乙酯）突变体库。评估EMS诱导的M2-M4单株的全基因组水平变异,结果显示在M2-M4中包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）和插入/缺失（Insertion-Deletion,In Del）在内的平均变异分别为24,576、33,507和29,266,另外还预测了M2-M4中变异对基因功能影响。从98,113份M2株系的种子筛选出9,415份含油量与脂肪酸突变体,加代后进一步确认其中的686份突变体是稳定的。对M4世代的7份代表性的油酸升高突变体进行重测序,并分析FAD2和ROD1基因存在的变异,确定与油酸表型的关系。本研究通过含油量显着差异的油菜资源的多组学关联分析,获得了27个调控含油量的QTL/基因,还通过构建大型甘蓝型油菜EMS突变体库筛选出686份种子含油量和脂肪酸突变体。这不但会促进甘蓝型油菜脂质代谢的功能基因组学,还为油菜含油量的遗传改良提供了新思路。
郑雷[9]（2020）在《GhPRE1基因在陆地棉株型调控中的功能分析及作用机制研究》文中进行了进一步梳理棉花是世界上最重要的纤维作物,是我国重要的战略物资。株型是棉花的重要农艺性状,不仅影响产量,还是影响机械化采收的关键指标。油菜素甾体类化合物（Brassinosteroids,BRs）参与调控包括植株营养生长、生殖生长等广泛的生命过程,对株型构建发挥关键作用。本研究通过FOX-hunting（Full-length c DNA over-expressing gene hunting system）系统发掘棉花BR信号途径株型调控基因,获得了可以显着促进油菜素内酯受体突变体bri1-5株型变化的Gh PRE1基因,证明Gh PRE1基因参与油菜素内酯信号受体蛋白BRI1（Brassinosteroid insensitive 1）下游的信号转导途径并对植株生长有调控作用。利用PRE基因隐马尔可夫模型在陆地棉全基因组中鉴定到26个Gh PRE基因,分入PRE-a至PRE-d四个亚群中。结合陆地棉RNA-seq数据分析发现Gh PRE1基因所属的PRE-a亚群在棉花各组织中有最高的表达水平。通过Gh PRE1启动子驱动GUS基因(ProGh PRE1::Gus)检测显示Gh PRE1基因在根尖区域有优势表达,而在根尖上部细胞增殖区内表达量下降,根据植物根部各组织细胞生长状态推测Gh PRE1基因表达与细胞分裂调控可能存在关联。同时,使用油菜素内酯（BL）和油菜素内酯抑制剂芸苔素唑（BRZ）处理ProGh PRE1::Gus转基因拟南芥,证明Gh PRE1基因的表达受到BR信号诱导。在拟南芥中,过量表达Gh PRE1基因植株各组织均表现显着的增长趋势,结合扫描电镜观察发现过量表达Gh PRE1基因的拟南芥下胚轴伸长源自Gh PRE1基因对细胞的伸长生长的促进作用。病毒诱导Gh PRE1基因沉默（VIGS）试验发现沉默Gh PRE1基因促使棉花株高及各组织显着缩小,并且同时沉默PRE-a亚群多个同源基因植株矮化效果更加明显,证明Gh PRE1基因具有促进棉花组织生长作用,并且PRE-a亚群基因间存在功能冗余性。另一方面,沉默Gh PRE1基因植株促进叶片和茎节数量显着增加,表明Gh PRE1基因在调控细胞伸长生长的同时可能对细胞分裂和组织分化存在抑制效果。GhPRE1转录因子缺失典型b HLH（Basic helix-loop-helix）转录因子的DNA结合域,因此需要借助与其他转录因子结合形成二聚体结构来实现转录调控功能。通过酵母双杂交筛库获得与Gh PRE1蛋白互作的ERF转录因子Gh＿A12G0216和Gh＿D02G2086。进化分析发现Gh＿A12G0216和Gh＿D02G2086及其亲缘关系最近Gh ERF转录因子同属于B4和B2亚群,包含41个家族成员。从其成员各分支中选择4个基因（Gh＿D12G1915、Gh＿A12G1761、Gh＿A10G0471和Gh＿D12G0658）,并通过酵母双杂交试验和双分子荧光互补试验证明其编码蛋白均与Gh PRE1蛋白存在互作关系。加权共表达网络分析发现41个Gh ERF转录因子与Gh PRE1（Gh＿A09G0192、Gh＿D09G0182）基因存在表达关联关系,并且在共表达网络中与Gh PRE1基因存在相同和相反两个方向的共表达基因,说明Gh PRE1基因与41个Gh ERF转录因子成员的互作可能存在促进和抑制两种互作模式。选择酵母双杂交互作效果明显且与Gh PRE1基因具有相同和相反两个方向共表达基因的Gh ERF基因（Gh＿D02G2086和Gh＿A12G1761）构建过表达转基因拟南芥。表型观察发现过表达Gh＿D02G2086基因拟南芥显着增加莲座叶和分枝数量。过表达Gh＿A12G1761基因拟南芥植株却表现株高显着增加,茎秆增粗,茎部切片发现过表达Gh＿A12G1761基因拟南芥细胞有变小的趋势,说明转基因拟南芥茎部变粗源自细胞数量的增加。两种转基因材料不同的表型变化预示与Gh PRE1具有相同和相反共表达基因的Gh ERF转录因子对植株的生长调控分为细胞增殖和细胞分化两个相反的方向。拟南芥B4亚群中ERF109和ERF114、ERF115转录因子被证明共同参与调控植物磺肽素（Phytosulfokine,PSKs）基因的表达,从而影响拟南芥根部细胞分裂。通过荧光素酶基因瞬时表达检测和VIGS沉默植株的PSKs基因表达检测证明棉花中Gh PRE1蛋白与Gh＿A12G1761（Gh ERF115）转录因子互作并参与调控PSKs基因的表达从而影响细胞分裂。果胶是细胞壁重要组成成分,对植物细胞的生长和分裂发挥重要作用。Gh PRE1基因沉默棉花植株中果胶含量显着上调。在Gh PRE1和其互作的Gh ERF转录因子相反共表达基因中包含多个与果胶合成相关的半乳糖醛酸转移酶Gh GATL基因。过表达Gh GATL基因拟南芥和沉默Gh GATL基因棉花的株型观察和果胶检测试验证明Gh GATL基因可以通过增加果胶含量,促进植株的生长。同时,过表达Gh GATL基因拟南芥植株茎粗显着增加,而切片观察发现茎内细胞存在缩小趋势。结合Gh GATL基因启动区包含大量的ERF转录因子结合位点,证明Gh GATL基因可能是Gh PRE1蛋白与Gh ERF转录因子互作对细胞分裂调控的关键下游基因。
薛晓东[10]（2020）在《Ac/DS转座系统在二穗短柄草及小麦中的应用和分析》文中研究表明小麦（Triticum aestivum）作为全球最重要的粮食作物之一,在全世界粮食消费中,以及我国粮食安全体系中都具有举足轻重的地位。长期以来,由于小麦基因组的庞大及复杂性,同时又缺乏高质量的参考序列等诸多问题,严重制约了小麦功能基因组学的发展。因此,获取合适的研究材料,发掘优异基因并对其基因功能进行深入研究,成了育种工作者的当务之急。而育种改良材料的获取及基因功能的研究和分析,最直接有效的方式便是从研究突变体着手。因此构建丰富的突变体库,就成了研究基因功能以及筛选育种好材料的重要环节。目前常用的突变体库构建技术,主要是T-DNA插入法和Ac/Ds转座系统。T-DNA插入法操作简单,但在整合的过程中会产生序列缺失及串联重复等现象,且需要大量的组培工作,影响了后续的分子分析工作。Ac/Ds转座系统由于组培工作量小,随机插入及表型稳定遗传等优势,已经成为了构建突变体库的首选方法,在众多的植物中得到应用。鉴于小麦基因组的复杂性,而模式植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon）与小麦亲缘关系比较近,同时又有拟南芥（Arabidopsis thaliana）的诸多优点（基因组小、生长周期短及生长条件简单等）。因此,本文首先将异源的Ac/Ds转座体系导入二穗短柄草中进行了较为深入的研究,随后又将该转座体系稍加改造,应用到了小麦中进行了初步研究。以期获得小麦与二穗短柄草的插入突变体库,主要结果如下:（1）将异源Ac/Ds转座系统pSQ5通过农杆菌介导法导入二穗短柄草中,经过连续4代的循环筛选,共获得仅含Ds元件的稳定植株3185株。另外,将该转座体系稍加改造后导入小麦中,获得了稳定的仅含Ds元件的植株226株。通过Multiple-PCR及GUS染色等技术,证明了异源转座体系可以在二穗短柄草和小麦中工作。（2）转座频率及分布特点。Ds转座子在二穗短柄草中的平均转座频率为6.7%,在小麦中为7.7%。经过Inverse-PCR对Ds元件的侧翼序列定位后,共获得了3057条有效序列,特异插入位点共有2301个,其中507个插入到外显子中,241个插入到内含子中,152个插入到5′UTR中,127个插入到3′UTR中,基因临近区域603条,671个插入到基因间隔区,插入到基因内部或者临近基因区的占总数的71%。说明Ds元件倾向于插入到基因内部或基因邻近区域,这对于构建插入突变体库大有裨益。由于小麦全基因组测序尚未完成,所以本文经过同样的技术获得的侧翼序列,进行网上在线BLAST后,发现仅有不足50%能够成功比对上（Mapping成功）。比对不上的序列设计了相关引物,分多批进行再次扩增后验证,证实比对不成功的序列,90%多是真实有效的。最终仅有7%的序列扩增不到,说明小麦序列gap仍很多。（3）转座子插入特点。通过对2301个特异位点分析,发现在全基因组水平上,Ds转座子倾向于插入到染色体两端,而着丝粒区分布较少,另外,插入位点的数量与染色体大小呈正相关,并且Ds转座子的密集程度与染色体自身的基因密度成正相关。（4）转座子倾向于连锁转座。随机抽取子代较多的4个系进行研究,其中#E81有227个子代,#F84有134个子代,#B54有103个子代,#H87有46个子代,另外,#E81,#F84及#B54株系的初始插入位点（供体位点）在1号染色体上,#H87在2号染色体上。经过NCBI及JGI在线BLAST以后,发现:除#F84子代分布稍有偏差外,其他系别的子代中,全部倾向于插入到与供体位点相同的染色体上,插入比例分别是#B54株系为44.7%,#E81株系为47.6%,#H87株系为43.5%,而#F84株系为29.1%（插入位点最多为3号染色体,占比35.%）。进一步对初始插入点在1号染色体的3个株系进行分析,发现在30M长度处,有插入热点。（5）转座发生的时间。通过GUS染色（按发育时间:4-5叶期,抽穗期,灌浆期随机取样,共5批,每批至少10株,含根、茎、叶及幼种各部分）、普通PCR及多重PCR的验证,证实在二穗短柄草和小麦中,Ds转座发生的时间,主要是在植株发育的后期,集中在开花到种子灌浆这一时期。（6）小麦中的转座。为了研究异源转座体系在小麦中具体的工作情况,将Ac和Ds构建在不同T-DNA上的双元转座系统分别导入到小麦Fielder品种中,29个杂交组合共产生同时含有Ac和Ds元件的F1株系139个。随机取F1后代,总共研究了142个F2株系,发生转座的株系共计49个,占34.5%。研究的F2代植株共计2283棵,获得仅含Ds植株175棵,占总数的7.7%。在已发生转座的株系中,同一杂交亲本下不同F2代的转座频率存在较大的差异,该差异可能由Ds元件转座的时期不同所致。同一Ac,不同Ds的亲本组合,子代的转座频率差异较大,证明Ds的初始位置对转座频率有较大影响。同一Ds,不同Ac的亲本组合,其子代的转座频率仅有个别株系差异较大,经过不同的检验方法证明,不同表达量的AcTPase基因,其子代的转座频率差异不大,再次表明,对转座频率有较大影响的是Ds元件的初始位置。（7）特异启动子控制Ac/Ds转座体系的构建。由于体细胞转座不能稳定遗传,加大了不必要的工作量。因此,为了减少该过程带来的困扰,提高工作效率,构建了生殖细胞特异启动子控制的Ac/Ds转座系统。花粉特异启动子选用的是番茄LAT52基因的启动子,构建成功的载体名称为pHAD1;卵细胞特异启动子选用的是拟南芥Ec1.2的启动子,载体名称为pOXQ1。并同时构建了对应特异启动子控制GUS的载体,分别命名为pHG（花粉特异）和pLG（卵细胞特异）。通过农杆菌介导的遗传转化方法,将构建成功的载体分别导入二穗短柄草中,共计获得组培苗136棵,其中pHG为65棵,pLG为21棵,pHAD1为22棵,pOXQ1为28棵。通过GUS染色,多重PCR及EDS-PCR证实,特异启动子控制的Ac/Ds转座系统能够在二穗短柄草中成功转座。（8）二穗短柄草的杂交。为了诱导特定的目的基因,同时也为了解Ds转座子与目的基因的关系,验证其连锁转座的特点,本文随机挑选了部分仅含Ac元件的株系,并挑选了部分已知具体插入位点的仅含Ds元件的株系,进行了二穗短柄草的杂交（相关工作未见报道）,总结了该方法的操作要领,其中,授粉时期的选择,去雄和授粉的操作方法,以及杂交后种子发育过程中的保湿是整个杂交过程的关键。本文对各个操作过程进行了较为详细的描述。
二、Construction of Mutant Populations by T-DNA Insertion for Functional Genomic Study in Cotton（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Construction of Mutant Populations by T-DNA Insertion for Functional Genomic Study in Cotton（论文提纲范文）
（1）VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望（论文提纲范文）
| 1 VIGS技术原理 |
| 2 VIGS的发展 |
| 2.1 病毒沉默载体的发展 |
| 2.2 VIGS技术的拓展 |
| 2.2.1 小RNA介导的VIGS |
| 2.2.2 寄主诱导的基因沉默 |
| 2.3 VIGS接种方式的发展 |
| 3 VIGS在作物中的应用 |
| 3.1 VIGS在单子叶作物中的应用 |
| 3.2 VIGS在棉花中的应用 |
| 3.3 VIGS在蔬菜中的应用 |
| 3.4 VIGS在果树中的应用 |
| 3.5 VIGS在药用植物中的应用 |
| 4 影响VIGS效率的因素 |
| 4.1 环境因素 |
| 4.2 病毒载体 |
| 4.3 插入基因片段 |
| 4.4 侵染方式 |
| 5 VIGS的检测 |
| 6 VIGS存在的问题及解决方法 |
| 7 展望 |
（2）拟南芥黄心突变体yh基因的图位克隆及分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料及种植条件 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 DNA的提取 |
| 1.2.2 遗传学分析与作图群体构建 |
| 1.2.3 图位克隆 |
| 1.2.4 测序及筛选候选基因 |
| 1.2.5 表型鉴定及叶绿素含量的检测 |
| 1.2.6 RNA的提取方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 突变体的分离及表型分析 |
| 2.2 突变体的基因定位与序列分析 |
| 2.2.1 突变体的遗传学分析 |
| 2.2.2 突变位点的粗定位 |
| 2.2.3 突变位点的精细定位 |
| 2.2.4 候选基因的筛选 |
| 2.3 叶绿素含量的检测 |
| 3 讨 论 |
（3）棉花枯萎病菌突变体库的构建及分析（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.1.1供试菌株和质粒 |
| 1.1.2主要试剂和仪器 |
| 1.1.3培养基 |
| 1.2方法 |
| 1.2.1棉花枯萎病突变体库的构建 |
| 1.2.2转化子的PCR检测和荧光观察 |
| 1.2.3阳性转化子潮霉素B抗性稳定性检测 |
| 1.2.4突变体形态观察 |
| 1.2.5突变体生长速度和产孢量的测定 |
| 1.2.6 p H对突变体生长速度的影响 |
| 1.2.7突变体致病性测定 |
| 1.2.8 T-DNA插入拷贝数分析 |
| 2结果与分析 |
| 2.1优化后获得转化子的分子鉴定 |
| 2.2转化子遗传稳定性分析及荧光观察 |
| 2.3突变体的形态观察 |
| 2.4突变体生长速度的测定 |
| 2.5不同表型的突变体生长速度对比 |
| 2.6突变体产孢量测定 |
| 2.7不同p H对转化子生长的影响 |
| 2.8突变体致病性测定 |
| 2.9 T-DNA插入拷贝数分析 |
| 3讨论与结论 |
（4）油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略术语词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 导言 |
| 1.2 高含油量育种的策略 |
| 1.3 种胚脂肪酸合成 |
| 1.4 脂肪酸降解 |
| 1.4.1 脂肪酸降解的基本途径 |
| 1.4.2 GDSL脂酶以及种子脂肪酸消减基因(Seed fatty acid reducer,SFAR) |
| 1.4.3 Patatin-like lipase脂酶 |
| 1.5 TILLING-定向诱导基因组局部突变技术 |
| 1.5.1 TILLING的基本原理 |
| 1.5.2 TILLING技术在植物研究中的应用和前景 |
| 1.6 CRISPR/Cas介导的基因编辑技术 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas系统的基本原理 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas系统在作物改良领域的应用和前景 |
| 1.7 调控作物复杂数量性状相关基因的发掘 |
| 1.8 全基因组关联分析在油菜功能基因发掘中的应用 |
| 1.9 本研究的目的、意义以及技术路线 |
| 第二章 甘蓝型油菜GDSL脂酶基因的全基因组分布及Seed Fatty Acid Reducer基因的鉴定 |
| 2.1 导言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 BnGDSLs在甘蓝型油菜基因组上的鉴定 |
| 2.2.2 BnGDSLs的系统进化分析和共线性分析 |
| 2.2.3 转录组数据分析 |
| 2.2.4 候选BnSFARs的获取 |
| 2.2.5 BnSFARs在种子发育过程中的表达分析 |
| 2.2.5.1 种子材料和发育时期选定 |
| 2.2.5.2 BnSFARs的特异引物设计 |
| 2.2.5.3 RT-qPCR实验步骤 |
| 2.2.5.4 表达数据分析 |
| 2.2.6 油菜种子含油量和油酸含量的测定 |
| 2.2.7 分布于BnSFARs的SNPs鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BnGDSLs的全基因组鉴定分析 |
| 2.3.2 种子发育时期的BnGDSLs表达分析 |
| 2.3.3 BnSFARs的筛选 |
| 2.3.4 种子中BnSFARs的表达模式分析 |
| 2.3.5 BnSFARs的序列变异对种子含油量以及脂肪酸组分的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Seed Fatty Acid Reducer基因的TILLING分析及多突变位点的聚合效应 |
| 3.1 导言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 目的基因的选择 |
| 3.2.2 M_2代EMS突变体的TILLING筛选 |
| 3.2.3 EMS单突变体和双突变体的选育 |
| 3.2.4 油菜生长条件 |
| 3.2.5 种子含油量测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BnSFAR1和BnSFAR4 的诱变分析 |
| 3.3.2 EMS突变体的种子含油量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 CRISPR/Cas9系统介导的甘蓝型油菜Seed Fatty Acid Reducer基因突变对种子含油量的影响 |
| 4.1 导言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 CRISPR/Cas9 载体构建 |
| 4.2.1.1 靶位点选择和引导RNA合成 |
| 4.2.1.2 pChimera重组载体的构建 |
| 4.2.1.3 pCas9-TPC重组载体的构建 |
| 4.2.2 油菜的转化 |
| 4.2.3 突变体鉴定 |
| 4.2.4 转基因植株材料和生长环境 |
| 4.2.5 突变体植株种子含油量测定 |
| 4.2.6 种子萌发和幼苗活力检测 |
| 4.2.7 油脂积累以及调动模式分析 |
| 4.2.8 油体鉴定分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 BnSFARs靶位点确定及相应sgRNA设计 |
| 4.3.2 转基因植株的鉴定 |
| 4.3.3 转基因植株突变位点的鉴定 |
| 4.3.4 bnsfars突变体植株的种子含油量和千粒重分析 |
| 4.3.5 bnsfars突变体植株种子的油体鉴定和分析 |
| 4.3.6 bnsfars突变体的种子油脂积累分析 |
| 4.3.7 bnsfars突变体种子的活力分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全基因组关联分析进一步发掘调控种子含油量的相关基因 |
| 5.1 导言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 油菜种质材料和种植条件 |
| 5.2.2 油菜种子含油量测定和表型分析 |
| 5.2.3SNPs鉴定和全基因组关联分析 |
| 5.2.4 顺式作用元件预测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 种子含油量的表型变异分析 |
| 5.3.2 种子含油量的全基因组关联分析 |
| 5.3.3 候选基因的筛选 |
| 5.3.4 Bna.PTL.C07对种子含油量的影响分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:文献综述 |
| 1.1 中国棉花生产概况 |
| 1.2 棉花基因组研究进展 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究 |
| 1.4 植物应对草食性昆虫的内源防御系统 |
| 1.5 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.5.1 形态抗虫育种阶段 |
| 1.5.2 生化抗虫育种阶段 |
| 1.5.3 棉花抗虫基因工程育种阶段 |
| 1.5.3.1 Bt毒蛋白的发现以及作用机理 |
| 1.5.3.2 Bt转基因棉花研究进展 |
| 1.6 植物突变体创建方法 |
| 1.6.1 自发变异 |
| 1.6.2 物理诱变 |
| 1.6.3 化学诱变 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.7 基因编辑技术研究进展 |
| 1.7.1 ZFN基因编辑系统 |
| 1.7.2 TALEN基因编辑系统 |
| 1.7.3 CRISPR基因组编辑系统 |
| 1.7.3.1 CRISPR/Cas9 技术原理 |
| 1.7.3.2 CRISPR/Cas9 脱靶效应研究 |
| 1.8 CRISPR/Cas9 系统在作物育种中的应用 |
| 1.8.1 高产育种研究 |
| 1.8.2 品质育种研究 |
| 1.8.3 抗性育种研究 |
| 1.8.4 不育系研究 |
| 1.9 基因编辑检测方法 |
| 1.10 CRISPR/Cas9 技术的局限性 |
| 1.11 植物变体库研究进展 |
| 1.11.1 理化诱变突变体库 |
| 1.11.2 插入突变体库 |
| 1.11.3 基因编辑突变体库 |
| 1.12 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.12.1 本研究的目的与意义 |
| 1.12.2 本研究的技术路线 |
| 第二章:实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 基因编辑载体 |
| 2.1.3 供试的昆虫材料 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 2.2.2 GO靶基因功能富集分析 |
| 2.2.3 混合基因组编辑载体文库构建 |
| 2.2.3.1 载体充分酶切控制空载率 |
| 2.2.3.2 混合载体文库构建 |
| 2.2.4 棉花DNA提取 |
| 2.2.5 棉花遗传转化 |
| 2.2.6 Barcode设计和高通量测序检测分析基因编辑目标序列 |
| 2.2.7 基因组编辑检测 |
| 2.2.8 抗虫鉴定 |
| 2.2.8.1 蚜虫及棉铃虫繁殖培养 |
| 2.2.8.2 武汉温室蚜虫抗性表型筛选 |
| 2.2.8.3 海南温室咀嚼式害虫极端表型筛选 |
| 2.2.8.4 室内棉铃虫抗虫验证 |
| 第三章:结果与分析 |
| 3.1 目的基因sgRNA设计及GO富集分析 |
| 3.2 sgRNAs混合载体文库的构建与评估 |
| 3.3 棉花基因编辑突变体材料的获取 |
| 3.4 基于条形码的高通量测序技术检测T0 植株sgRNA信息 |
| 3.5 利用高通量测序方法检测基因组编辑效率 |
| 3.6 高效的棉花T0 代突变体基因组编辑效率 |
| 3.7 棉花T0 单株的编辑概况 |
| 3.8 棉花基因组编辑在后代中的遗传率 |
| 3.9 棉花基因编辑后代材料抗虫表型鉴定 |
| 3.9.1 温室蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.2 T2 代材料蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.3 海南温室咀嚼时害虫危害表型鉴定 |
| 3.10 GhMLP423 基因虫害表型验证 |
| 3.10.1 超表达和基因编辑材料筛选 |
| 3.10.2 棉铃虫饲喂实验 |
| 3.10.3 棉铃虫取食偏好性验证 |
| 3.10.4 JA-Ile相关检测 |
| 3.11 脱靶分析 |
| 第四章:讨论 |
| 4.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建陆地棉突变体库的必要性 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组中高效的编辑及遗传规律 |
| 4.3 CRISPR/Cas9 在陆地棉基因组编辑系统的高特异性 |
| 4.4 棉花基因编辑工具的优化与展望 |
| 4.5 植物在非生物和生物胁迫的响应中可能涉及复杂而重叠的信号网络 |
| 4.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑植物相比于转基因植物在育种上的优越性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 混合载体文库构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 棉花RNA提取(天根试剂盒法) |
| 附录5 RNA反转录 |
| 附录6 Real-time |
| 附录7 棉铃虫饲喂 |
| 附表 |
| 附表1 502 个目的基因ID |
| 附表2 968个sgRNA靶标序列 |
| 附表3 barcoded引物序列 |
| 附表4 潜在脱靶位点检测引物序列 |
| 已发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（6）应用“侧翼序列标记测序”在转基因农作物基因组中分离侧翼序列（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物功能基因组研究策略 |
| 1.2 植物突变体库的构建 |
| 1.2.1 基于理化诱变构建突变体库 |
| 1.2.2 基于转座子构建突变体库 |
| 1.2.3 基于T-DNA插入构建突变体库 |
| 1.3 侧翼序列分离方法 |
| 1.3.1 基于PCR的侧翼序列分离方法 |
| 1.3.2 基于NGS的侧翼序列分离方法 |
| 1.4 T-DNA在植物基因组中整合与分布特征 |
| 1.5 FST-SEQ方法的研究意义及实验原理 |
| 1.5.1 FST-seq方法研究意义 |
| 1.5.2 FST-seq实验原理 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设备与主要试剂 |
| 2.2.1 主要实验设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 植物基因组DNA的质量控制 |
| 2.3.3 转基因植株的阳性检测 |
| 2.3.4 应用FST-seq方法分离侧翼序列 |
| 2.3.5 鉴定并验证标签序列的插入位点与结构 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 植物基因组DNA中标签序列的检测 |
| 3.2 FST-SEQ文库构建 |
| 3.2.1 Tn5 转座酶复合体打断基因组DNA |
| 3.2.2 FST-seq第一轮PCR反应 |
| 3.2.3 FST-seq第二轮PCR反应 |
| 3.2.4 FST-seq第三轮PCR反应 |
| 3.2.5 FST-seq文库分选 |
| 3.3 分析侧翼序列并进行PCR验证 |
| 3.3.1 河南大学转基因小麦 |
| 3.3.2 山东农业大学转基因小麦材料 |
| 3.3.3 韩国转基因水稻材料 |
| 3.3.4 河南农业大学转基因玉米材料 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 插入突变 |
| 1.2.1 转座子插入突变 |
| 1.2.2 T-DNA插入突变 |
| 1.3 植物T-DNA插入突变体的研究方法 |
| 1.3.1 T-DNA插入拷贝数的确定 |
| 1.3.2 T-DNA侧翼序列的分离 |
| 1.3.3 突变基因的验证 |
| 1.4 COI1基因与茉莉素信号转导 |
| 1.4.1 COI1基因的研究概况 |
| 1.4.2 茉莉素的发现 |
| 1.4.3 茉莉素的化学结构及生物合成 |
| 1.4.4 茉莉素的信号转导 |
| 1.4.5 茉莉素的生物学功能 |
| 1.5 目的意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 白桦突变体的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 感病分析所用菌株 |
| 2.1.3 主要试剂和培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苗期生长量的测定 |
| 2.2.2 生长特性的测定 |
| 2.2.3 叶片和芽的解剖结构的观察 |
| 2.2.4 相对叶绿素含量、光合特性参数及叶绿素荧光参数的测定 |
| 2.2.5 木材特性的测定 |
| 2.2.6 感病性分析 |
| 2.2.7 内源激素含量的测定 |
| 2.2.8 生长素和细胞分裂素的免疫组织化学定位 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 突变体苗期生长量的变异 |
| 2.3.2 突变体生长参数的变异 |
| 2.3.3 突变体株型的变异 |
| 2.3.4 突变体芽形态及解剖结构特征 |
| 2.3.5 突变体叶片形态、解剖结构及光合特性变异 |
| 2.3.6 突变体材质特性的变异 |
| 2.3.7 突变体感病性分析 |
| 2.3.8 突变体内源激素含量变化 |
| 2.3.9 突变体生长素和细胞分裂素的分布 |
| 2.3.10 突变体展叶时间和结实情况的调查 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 基于转录组测序的白桦突变体差异基因分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备和实验耗材 |
| 3.1.4 主要数据库和软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转录组的取材及测序 |
| 3.2.2 转录组数据分析 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转录组数据的评估及qRT-PCR验证 |
| 3.3.2 突变体主枝茎尖的转录组分析 |
| 3.3.3 突变体侧枝茎尖的转录组分析 |
| 3.3.4 突变体茎尖的转录组分析 |
| 3.3.5 突变体中差异基因的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 白桦突变体T-DNA插入位点的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体和菌株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 4.1.5 主要软件和网站 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转基因株系的分子检测 |
| 4.2.2 Southern杂交 |
| 4.2.3 TAIL-PCR确定T-DNA的插入位点 |
| 4.2.4 基因组重测序确定T-DNA的插入位点 |
| 4.2.5 突变体中突变基因BpCOI1的时空表达特异性分析 |
| 4.2.6 突变体对MeJA应答分析 |
| 4.2.7 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 突变体的分子检测 |
| 4.3.2 br株系中T-DNA插入位点数目鉴定 |
| 4.3.3 br株系中T-DNA插入位点侧翼序列的分离及验证 |
| 4.3.4 突变体中BpCOI1的时空表达特异性及MeJA应答 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 白桦BpCOI1启动子功能研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂及培养基 |
| 5.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 5.1.5 主要网站和软件 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 突变基因BpCOI1启动子的克隆及序列分析 |
| 5.2.2 BpCOI1启动子融合GUS的载体构建 |
| 5.2.3 工程菌的制备 |
| 5.2.4 白桦遗传转化 |
| 5.2.5 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的分子检测 |
| 5.2.6 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的GUS染色 |
| 5.2.7 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的组织表达特异性分析 |
| 5.2.8 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同激素的响应分析 |
| 5.2.9 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同光周期的响应分析 |
| 5.2.10 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BpCOI1启动子顺式作用元件预测 |
| 5.3.2 ProBpCOI1::GUS载体构建及工程菌的获得 |
| 5.3.3 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的获得 |
| 5.3.4 转ProBpCOI1::GUS白桦株系的组织定位及表达特性 |
| 5.3.5 转ProBpCOI1::GUS白桦株系对不同激素和光周期的响应特性 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 BpCOI1与SKP1家族互作关系验证 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体和菌株 |
| 6.1.3 主要试剂和培养基 |
| 6.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 6.1.5 主要网站和软件 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 BpCOI1基因的克隆及亚细胞定位 |
| 6.2.2 BpCOI1基因的生物信息学分析 |
| 6.2.3 酵母双杂交 |
| 6.2.4 双分子荧光互补 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 BpCOI1基因的克隆及定位 |
| 6.3.2 BpCOI1基因的生物信息学分析及系统发育进化分析 |
| 6.3.3 BpCOI1互作蛋白的验证 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 白桦BpCOI1基因功能研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 载体和菌株 |
| 7.1.3 主要试剂和培养基 |
| 7.1.4 主要仪器设备和实验耗材 |
| 7.1.5 主要网站和软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 超表达和抑制表达载体的构建 |
| 7.2.2 工程菌的制备及白桦的遗传转化 |
| 7.2.3 BpCOI1转基因白桦的分子检测 |
| 7.2.4 BpCOI1转基因白桦的生长性状测定 |
| 7.2.5 BpCOI1转基因白桦的MeJA应答 |
| 7.2.6 BpCOI1转基因白桦的感病性分析 |
| 7.2.7 BpCOI1转基因白桦的转录组测序及qRT-PCR验证 |
| 7.2.8 数据分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 BpCOI1基因植物表达载体的构建及工程菌的获得 |
| 7.3.2 BpCOI1转基因白桦的获得 |
| 7.3.3 BpCOI1转基因白桦生长性状分析 |
| 7.3.4 BpCOI1转基因白桦MeJA应答分析 |
| 7.3.5 BpCOI1转基因白桦感病性分析 |
| 7.3.6 BpCOI1转基因白桦转录组分析 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 讨论 |
| 8.1 T-DNA插入突变体是研究基因功能的珍贵材料 |
| 8.2 基因表达差异影响br突变体的突变表型 |
| 8.3 激素调控植物分枝发育 |
| 8.4 F-box在植物激素信号转导中发挥重要作用 |
| 8.5 BpCOI1基因对外界环境因子有不同的应答模式 |
| 8.6 br突变体和BpCOI1抑制表达株系含有相同的差异基因 |
| 8.7 COI1参与调控植物的生长发育及逆境应答 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（8）甘蓝型油菜油脂合成遗传机制解析和EMS突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 甘蓝型油菜油脂合成遗传机制解析 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物油脂的生物合成 |
| 1.2 含油量的遗传调控模式 |
| 1.3 含油量的分子机制研究进展 |
| 1.3.1 利用反向遗传学的含油量研究进展 |
| 1.3.2 利用正向遗传学的含油量研究进展 |
| 1.4 全基因组关联分析 |
| 1.4.1 全基因组关联分析原理 |
| 1.4.2 全基因组关联分析在作物中的应用 |
| 1.4.3 甘蓝型油菜的全基因组关联分析研究进展 |
| 1.5 全转录组关联分析 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 质粒载体和菌株 |
| 2.3 田间试验和表型数据采集 |
| 2.4 基因组重测序数据分析 |
| 2.5 含油量的全基因组关联分析(GWAS) |
| 2.6 祖先等位基因的确定 |
| 2.7 转录组测序和含油量的转录组关联分析(TWAS) |
| 2.8 表达量数据的独立成分分析(ICA) |
| 2.9 含油量候选基因的综合打分 |
| 2.10 含油量候选基因PMT6的功能验证 |
| 2.10.1 总RNA的提取、检测及浓度测定 |
| 2.10.2 反转录 |
| 2.10.3 载体的构建 |
| 2.10.4 拟南芥的遗传转化与除草剂筛选 |
| 2.10.5 油菜的遗传转化 |
| 2.10.6 转基因苗的DNA提取 |
| 2.10.7 转基因苗的PCR鉴定 |
| 2.10.8 转基因苗的q RT-PCR |
| 2.10.9 CRISPR材料的测序鉴定 |
| 2.10.10 拟南芥突变体的种植和鉴定 |
| 2.10.11 种子脂肪酸酸的气相色谱分析 |
| 2.10.12 含油量的近红外分析 |
| 2.10.13 油菜PMT6OE材料的基因富集分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组变异图谱、群体结构和连锁不平衡 |
| 3.2 遗传多样性分析 |
| 3.3 油菜含油量的全基因组关联分析 |
| 3.4 QTL效应检测 |
| 3.5 含油量QTL选择分析 |
| 3.6 全转录组关联分析解析油菜油脂合成的机制 |
| 3.6.1 含油量的转录组关联分析 |
| 3.6.2 转录组表达模块分析 |
| 3.7 基因富集分析解析油菜油脂合成机制 |
| 3.8 qOC.A05.3和qOC.C05.3 位点候选基因的确定 |
| 3.9 含油量关键因子调控PMT6 |
| 3.10 PMT6的功能初步解析 |
| 3.10.1 pmt6突变体鉴定 |
| 3.10.2 PMT6超表达载体的构建 |
| 3.10.3 PMT6的CRISPR载体构建 |
| 3.10.4 含油量表型确定 |
| 3.10.5 PMT6超表达系的转录组分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 甘蓝型油菜含油量QTL检测 |
| 4.2 利用QTL加快油菜含油量的遗传育种 |
| 4.3 TWAS在油菜油脂合成机制解析的应用 |
| 4.4 借助多组学助力候选基因验证 |
| 第二章 甘蓝型油菜EMS突变体库构建 |
| 1 前言 |
| 1.1 突变体简介 |
| 1.2 植物突变体库的构建方法 |
| 1.2.1 物理和化学方法创建突变体库 |
| 1.2.2 利用T-DNA插入创建突变体库 |
| 1.2.3 转座子标签法创建突变体库 |
| 1.3 EMS突变体库在油菜的应用 |
| 1.4 全基因组测序在作物EMS突变库中的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料和来源 |
| 2.2 不同浓度EMS处理种子 |
| 2.3 种子诱变处理及突变体库的构建 |
| 2.4 田间生长表型的调查 |
| 2.5 基因组DNA提取 |
| 2.6 重测序文库构建 |
| 2.6.1 DNA片段化 |
| 2.6.2 PCR富集 |
| 2.7 SNPs/Indels的检测与注释 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同浓度EMS诱变对种子发芽影响 |
| 3.2 EMS突变体库的构建 |
| 3.3 田间生长表型变异调查 |
| 3.4 基因组水平的变异评估 |
| 3.4.1 基因组重测序、单核苷酸(SNP)多态性和Indels的鉴定 |
| 3.4.2 SNP和 Indel对基因功能的评价 |
| 3.5 含油量及脂肪酸突变体的筛选 |
| 3.6 稳定突变体材料的获得 |
| 3.7 极端含油量和脂肪酸突变体的获得 |
| 3.8 高油高油酸突变体的获得 |
| 3.9 高油酸突变体的候选基因突变检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EMS诱变效率的影响因素 |
| 4.2 群体突变效率的评价 |
| 4.3 EMS突变体的筛选与利用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 自然群体505份甘蓝型油菜自交系详单 |
| 附录2 不同环境下种子含油量的全基因组关联分析 |
| 附录3 191 份用于选择分析的材料 |
| 附录4 GWAS结果的lead SNP的核酸多样性分析 |
| 附录5 用于开花后20天和开花后40天种子的转录组测序材料 |
| 附录6 20 天TWAS显着相关的605个基因 |
| 附录7 40 天TWAS显着相关的148个基因 |
| 附录8 本研究中用到的引物 |
| 附录9 作者简介以及研究生阶段发表的成果 |
| 致谢 |
（9）GhPRE1基因在陆地棉株型调控中的功能分析及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花株型 |
| 1.1.1 棉花株型结构研究 |
| 1.1.2 棉花株型调控分子机制研究进展 |
| 1.2 植物激素对株型的影响 |
| 1.2.1 油菜素内酯 |
| 1.2.2 赤霉素 |
| 1.2.3 乙烯 |
| 1.2.4 激素信号互作参与植物株型调控 |
| 1.3 棉花突变体在棉花基因研究中的应用 |
| 1.3.1 功能缺失型突变体 |
| 1.3.2 功能获得型突变体 |
| 1.4 PRE转录因子研究 |
| 1.4.1 bHLH转录因子 |
| 1.4.2 PRE基因研究进展 |
| 1.4.3 PRE基因家族结构特点及作用模式 |
| 1.5 半乳糖醛酸转移酶(GATL)基因 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 GhPRE1基因功能分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料和处理 |
| 2.1.2 FOX-hunting体系筛选棉花BR途径调控基因 |
| 2.1.3 无缝克隆 |
| 2.1.4 过表达GhPRE1基因载体构建及浸花法拟南芥转化 |
| 2.1.5 棉花全基因组PRE基因鉴定及进化分析 |
| 2.1.6 转录组数据分析和GhPRE基因表达图谱构建 |
| 2.1.7 基因表达水平检验 |
| 2.1.8 GhPRE1基因启动子驱动GUS基因载体构建及GUS化学染色 |
| 2.1.9 GUS活性定量检测 |
| 2.1.10 病毒介导GhPRE1基因沉默 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 FOX-hunting系统发掘BR途径植物株型调控基因 |
| 2.2.2 全基因组PRE基因鉴定及进化分析 |
| 2.2.3 陆地棉GhPRE基因表达模式分析 |
| 2.2.4 GhPRE1基因表达分析 |
| 2.2.5 GhPRE1基因功能分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 FOX-hunting系统发掘棉花BR途径调控基因 |
| 2.3.2 GhPRE1基因在各组织优势表达 |
| 2.3.3 GhPRE1基因在生长调控中的复杂作用效果 |
| 第三章 GhPRE1基因作用机制解析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料和处理 |
| 3.1.2 酵母感受态细胞的制备 |
| 3.1.3 酵母感受态转化 |
| 3.1.4 酵母双杂交诱饵载体毒性和自激活检测 |
| 3.1.5 酵母双杂交筛库(Clontech系统) |
| 3.1.6 酵母双杂交点对点互作验证 |
| 3.1.7 双分子荧光互补实验(BIFC) |
| 3.1.8 陆地棉全基因组ERF转录因子鉴定 |
| 3.1.9 棉花转录因子加权基因共表达网络分析 |
| 3.1.10 荧光素酶报告基因瞬时表达检测 |
| 3.1.11 转录组数据分析和GhERF基因表达图谱构建 |
| 3.1.12 浸种法病毒诱导基因沉默 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
| 3.2.2 GhPRE1互作蛋白验证 |
| 3.2.3 陆地棉全基因组GhERF转录因子鉴定及分析 |
| 3.2.4 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子成员互作验证 |
| 3.2.5 陆地棉GhPRE基因与GhERF转录因子共表达网络分析 |
| 3.2.6 乙烯合成前体ACC处理过表达GhPRE1基因拟南芥 |
| 3.2.7 陆地棉GhERF基因表达模式分析 |
| 3.2.8 GhERF基因功能分析 |
| 3.2.9 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作调控PSKs基因验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作并参与共同调控途径 |
| 3.3.2 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作并参与细胞增殖和分化 |
| 3.3.3 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作参与BR对细胞分裂调控 |
| 第四章 GhPRE1基因下游调控GhGATL基因分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料和处理 |
| 4.1.2 棉花全基因组GATL基因鉴定及进化分析 |
| 4.1.3 陆地棉GhGATL基因染色体定位及线性化分析 |
| 4.1.4 棉花GhGATL基因选择压力分析 |
| 4.1.5 棉花GhGATL基因结构分析和蛋白基序分析 |
| 4.1.6 GhGATL基因转录组数据分析和基因表达图谱构建 |
| 4.1.7 陆地棉基因启动区分析 |
| 4.1.8 石蜡切片和果胶染色 |
| 4.1.9 果胶含量测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 GATL基因的鉴定分析 |
| 4.2.2 GATL基因系统发育树分析 |
| 4.2.3 陆地棉GhGATL基因分布和进化分析 |
| 4.2.4 GhGATL基因结构和基因基序分析 |
| 4.2.5 GhGATL基因在不同组织和不同胁迫下的表达模式分析 |
| 4.2.6 陆地棉GhGATL基因启动区分析 |
| 4.2.7 过表达GhGATL基因拟南芥基因功能分析 |
| 4.2.8 病毒诱导陆地棉GhGATL15基因沉默 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 棉花GhGATL基因家族在进化过程中不断扩大 |
| 4.3.2 棉花GhGATL基因在进化过程中高度保守 |
| 4.3.3 陆地棉GhGATL基因通过控制果胶含量影响植株生长 |
| 4.3.4 陆地棉GhPRE1基因与GhERF转录因子参与GhGATL基因的调控 |
| 第五章 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 A 所用引物序列 |
| 附录 B 棉花PRE基因鉴定 |
| 附录 C 陆地棉GhERF基因的系统发生树 |
| 附录 D Gh_A09G0192与GhERF转录因子相反正共表达基因注释 |
| 附录 E Gh_A09G0192与GhERF转录因子相反负共表达基因注释 |
| 附录 F Gh_D08G0182与GhERF转录因子相反正共表达基因注释 |
| 附录 G Gh_D08G0182与GhERF转录因子相反负共表达基因注释 |
| 附录 H GhPRE1与GhERF转录因子相同共表达基因GO和KEGG富集分析 |
| 附录 I 陆地棉NAU和HAU数据库鉴定GhGATL基因 |
| 附录 J 雷蒙德氏棉和亚洲棉数据库鉴定GATL基因 |
| 附录 K MEME网站预测GhGATL基因基序 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）Ac/DS转座系统在二穗短柄草及小麦中的应用和分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 二穗短柄草研究现状 |
| 1.1.1 二穗短柄草的生物学特征 |
| 1.1.2 二穗短柄草作为禾本科模式植物的依据 |
| 1.1.3 二穗短柄草功能基因组学研究进展 |
| 1.2 小麦分子生物学研究现状 |
| 1.2.1 小麦功能基因组学研究 |
| 1.2.2 小麦与二穗短柄草相关的研究 |
| 1.2.3 小麦转基因方法及应用现状 |
| 1.2.3.1 基因枪法 |
| 1.2.3.2 花粉管通道法 |
| 1.2.3.3 农杆菌介导法 |
| 1.2.3.4 低能离子束介导法 |
| 1.2.4 小麦转座子研究进展 |
| 1.2.5 小麦反转录转座子研究 |
| 1.3 植物突变体库的构建方法 |
| 1.3.1 理化诱变构建突变体库 |
| 1.3.2 T-DNA插入构建突变体库 |
| 1.3.3 Ac/Ds系统构建突变体库 |
| 1.3.4 逆转录转座子构建突变体库 |
| 1.4 Ac/Ds转座系统研究进展 |
| 1.4.1 Ac/Ds转座系统概述 |
| 1.4.2 Ac/Ds系统中的转座特点 |
| 1.4.2.1 转座距离 |
| 1.4.2.2 插入位点的偏好性 |
| 1.4.2.3 转座频率 |
| 1.4.3 Ac/Ds系统常见构建方式 |
| 1.4.3.1 一元转座系统 |
| 1.4.3.2 二元转座系统 |
| 1.5 染色体步移及突变体筛选 |
| 1.5.1 染色体步移概括 |
| 1.5.2 常见染色体步移方法 |
| 1.5.2.1 反向PCR |
| 1.5.2.2 接头PCR |
| 1.5.2.3 Tail-PCR |
| 1.5.3 突变体筛选方法 |
| 1.5.3.1 形态学观察 |
| 1.5.3.2 载体特征筛选 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料与生长条件 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 酶与生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 表达载体构建 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.1.2 大肠杆菌的转化 |
| 2.2.1.3 质粒提取 |
| 2.2.1.4 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.1.5 农杆菌的转化 |
| 2.2.1.6 高保真酶PCR扩增 |
| 2.2.1.7 TA克隆 |
| 2.2.1.8 测序、连接及PCR筛选阳性菌落 |
| 2.2.2 二穗短柄草的遗传转化 |
| 2.2.2.1 愈伤组织的诱导 |
| 2.2.2.2 侵染 |
| 2.2.2.3 共培养 |
| 2.2.2.4 筛选 |
| 2.2.2.5 分化 |
| 2.2.2.6 生根 |
| 2.2.2.7 组培苗移栽 |
| 2.2.3 转基因苗的鉴定 |
| 2.2.3.1 CTAB法提取植物总DNA |
| 2.2.3.2 植物总RNA的提取 |
| 2.2.3.3 反转录 |
| 2.2.3.4 荧光定量PCR |
| 2.2.3.5 普通鉴定PCR |
| 2.2.3.6 GUS表达分析 |
| 2.2.4 插入系的侧翼序列扩增 |
| 2.2.4.1 反向PCR(Inverse-PCR) |
| 2.2.4.2 热不对称交错PCR(Tail-PCR) |
| 2.2.5 序列比对工具和软件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ac/Ds双荧光转座系统在二穗短柄草中的应用 |
| 3.1.1 T_0 代转基因苗的鉴定 |
| 3.1.2 Ds发生切离的PCR检测 |
| 3.1.3 T_1 代转基因苗鉴定 |
| 3.1.4 拷贝数分析 |
| 3.1.5 转座频率统计 |
| 3.1.6 筛选流程 |
| 3.1.7 插入位点分析 |
| 3.1.8 同一T_0 系不同子代的插入位点分析 |
| 3.1.9 不同系间分析 |
| 3.1.10 部分株系的插入位点基因功能注释 |
| 3.1.11 突变体筛选 |
| 3.1.12 二穗短柄草的杂交 |
| 3.1.12.1 选择合适的小花 |
| 3.1.12.2 花药的选择 |
| 3.1.12.3 去雄 |
| 3.1.12.4 验证杂交是否成功 |
| 3.1.12.5 防止小花干枯的方法 |
| 3.2 Ac/Ds双元转座系统在小麦中的应用 |
| 3.2.1 载体特征及T_0 代植株抗性检测 |
| 3.2.2 对T_1 代植株进行荧光和PCR鉴定 |
| 3.2.3 小麦杂交群体的构建 |
| 3.2.4 杂交F1代Ds转座分析 |
| 3.2.5 杂交F2代Ds插入群体的产生及不同组合的转座频率分析 |
| 3.2.6 分析Ac表达量与转座频率的关系 |
| 3.2.7 小麦突变体库构建流程 |
| 3.2.8 小麦初始系Ds侧翼序列(Flanking sequence tags,FSTs)的定位与分析 |
| 3.2.9 转座后新插入的仅Ds株系侧翼序列验证 |
| 3.2.10 小麦全基因组分布 |
| 3.3 花粉、卵细胞特异启动子载体的构建及转化验证 |
| 3.3.1 表达载体的构建及农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.3.1.1 高保真酶扩增花粉、卵细胞启动子 |
| 3.3.1.2 片段双酶切 |
| 3.3.1.3 重组质粒的大肠杆菌菌落PCR鉴定 |
| 3.3.1.4 构建完成的表达载体T-DNA示意图 |
| 3.3.1.5 农杆菌介导的二穗短柄草遗传转化 |
| 3.3.2 T_0 代转基因苗的鉴定与分析 |
| 3.3.2.1 PCR检测 |
| 3.3.2.2 阳性植株T_1的GUS染色分析 |
| 3.3.2.3 转座发生的检测 |
| 3.3.2.4 阳性苗统计 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、Construction of Mutant Populations by T-DNA Insertion for Functional Genomic Study in Cotton（论文参考文献）
- [1]VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望[J]. 郝梦媛,杭琦,师恭曜. 中国农业科技导报, 2022(01)
- [2]拟南芥黄心突变体yh基因的图位克隆及分析[J]. 郝亚琦,宗秀梅,任潘,付爱根. 西北植物学报, 2021(10)
- [3]棉花枯萎病菌突变体库的构建及分析[J]. 刘叶,顾爱星,朱琦. 微生物学通报, 2022
- [4]油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘[D]. 王昊一. 浙江大学, 2021
- [5]CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建[D]. 孙琳. 华中农业大学, 2021
- [6]应用“侧翼序列标记测序”在转基因农作物基因组中分离侧翼序列[D]. 王权. 广西大学, 2020(07)
- [7]白桦T-DNA插入突变体的鉴定及突变基因BpCOI1功能研究[D]. 韩锐. 东北林业大学, 2020
- [8]甘蓝型油菜油脂合成遗传机制解析和EMS突变体库构建[D]. 唐珊. 华中农业大学, 2020(01)
- [9]GhPRE1基因在陆地棉株型调控中的功能分析及作用机制研究[D]. 郑雷. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [10]Ac/DS转座系统在二穗短柄草及小麦中的应用和分析[D]. 薛晓东. 山东农业大学, 2020(08)