一、氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞中HBVDNA表达量的影响（论文文献综述）
周武元[1]（2017）在《苦参碱对肝细胞肝癌的抑制作用及其作用机制研究》文中研究指明肝癌的80%～90%病因是肝细胞肝癌（HCC）,并且这也是世界上最流行的癌症之一。传统的化疗在肝细胞肝癌患者中常常发展出化学抗性。苦参碱是一个传统中药的一个有效成分,也是一个被承认的可用的肝细胞肝癌药物。在本研究中,主要考察了苦参碱对于人肝细胞肝癌细胞株HepG2的治疗效果及潜在的分子机制。高剂量的苦参碱（1.0mg/mL）能够显着性（P<0.05）抑制细胞增殖达48.39±3.32%,在这种情况下可观察到细胞收缩和破坏。苦参碱处理48小时后,流式细胞学分析表明G1/G0期细胞的比例显着性增加,而S和G2/M期细胞显着性降低。上述结果表明苦参碱的加入致细胞停滞。低浓度的苦参碱（0.2mg/mL）处理后,使用流式细胞术,定量实时PCR,免疫组织化学（IHC）和western blot分析可检测到肝特异性miR-122的上调,随后是miR-122的目标基因周期蛋白cyclin G1（CG1）,以及凋亡抑制蛋白Livin和Survivin的下调。综上所述,苦参碱通过在人肝细胞肝癌HepG2细胞株中恢复肝特异性miR-122的表达诱导细胞停滞和凋亡。背景与目的肝癌是一类严重的健康问题,世界卫生组织（WHO）认为它是第四大癌症死亡的最普遍原因[1]。在2009年美国有22,620起新病例及18,160起死亡与肝癌相关。中国占全世界肝癌死亡的53%。在中国超过90%的原发肝癌为肝细胞肝癌（HCC）。它是第二大重要的癌症杀手,主要是影响到在最有生产力的全盛时期的中年人群[2]。肝癌在中国发病率高,死亡率在各种肿瘤死亡人数中排第二位,是影响我国人民生命健康的主要杀手[2]。当今世界治疗肝癌的方法,临床疗效不甚理想,开发新的抗肝癌药物是我国的重要抗癌任务之一。虽然肝脏切除手术是一种合适的HCC治疗选择,但它仅仅适用于处于肝细胞肝癌早期的一小部分患者[3]。传统的化疗仍然是人类癌症的一个重要治疗策略。但是,治疗肝细胞肝癌的大部分化疗药物是有高风险副作用的细胞毒性试剂,例如阿霉素（ADM）,顺铂（cisplatin）,5-氟尿嘧啶（5-FU）和多柔比星（doxorubicin）[4,5]。更多地是,化学抗性在肝细胞肝癌患者中产生,在化疗治疗的长期效用上表现为一种主要的障碍[6]。作为我国的特有的药物—中药,其对肿瘤的治疗作用近年来也开始受到世界各国的重视。因此,必须发展替代性治疗方法以改进肝细胞肝癌治疗效果。目前,大量的研究证据表明细胞增殖、分化、凋亡之间的平衡或失调与肿瘤的发病相关,那么利用药物诱导肿瘤细胞凋亡可以成为肿瘤治疗的一条新路,这样就产生了一个全新的途径,可以将包括肝癌在内的肿瘤治愈。传统中药（TCM）因其5000年历史,以及在中国初级卫生保健中仍然占有重要地位而被重视。传统中药通过使用现代技术可补充西药,因而,可看到西方世界对传统中药的兴趣越来越大。豆科槐属植物苦参（SF）在中国是一种广泛使用的传统中药,用于包括病毒性肝炎,心因性心率不齐和皮肤炎症等一系列疾病中。豆科槐属植物苦参的活性成分是各种不同的生物碱,其中苦参碱已经被表征为主要的生物活性成分[8,9]。苦参碱是中药苦参的提取物,它属于苦参类生物碱,其在抗心律失常、抗肿瘤、保肝和调节免疫的作用已经得到业内认可。其抗病毒活性使其可以用于慢性乙型肝炎的治疗[10]。有报道称肌肉注射苦参碱可改善慢性乙型肝炎患者的临床症状,修复肝脏功能并使血清从HBVDNA阳性转化成阴性[11]。还有表明苦参碱具有抗纤维化活性,抑制肝星形细胞中血小板驱动的生长因子和转换生长因子β（TGF-β）作用[12]。研究表明苦参碱在抑制细胞生长和促进人白血病细胞K562分化中有效[9,13,14]。苦参碱也是SMMC-7721细胞的分化诱导因子[15]。在人类多发性骨髓瘤细胞核胃癌MKN45细胞中,苦参碱能通过扰乱细胞-细胞粘附诱导肿瘤细胞凋亡并抑制癌症转移[16,17]。另外,也有报道指出,氧化苦参碱可以抑制体外培养的人肝癌细胞增殖。从而,表明氧化苦参碱可能的作用就是抗肝细胞肿瘤,其机制可能是诱导肝癌细胞凋亡。苦参碱可能会阻止肿瘤侵袭[18,19]。因此,苦参碱能成为一种用于肝细胞肝癌治疗的有希望的替代性抗癌药物。目前,苦参碱已被用于小鼠的肝细胞肝癌治疗[7],但是,苦参碱抗肿瘤治疗的效力和潜在的分子机制,以及与人类肝细胞肝癌相关的生理学和药理学效果还没有很好地表征出来。MicroRNA（miRNA）是由18-23个核昔酸组成的非编码小RNA分子,它由长约70～80nt的单链RNA形成的茎环结构经Dicer酶加工后生成,序列高度保守,以部分或完全互补的方式结合靶mRNA分子的3’ UTR（非编码区）。miR-122a定位于人染色体的18q21.31,是特异性表达于肝脏的一种miRNA,并在肝脏总microRNA中有很高丰度,约占成年人肝脏总表达miRNAs的70%,在每个肝细胞表达在66000拷贝数以上,参与肝细胞分化、增殖、凋亡等一系列细胞内的生物学过程,有研究[20]发现在70%肝癌组织和肝癌来源的细胞系中miR-122表达下调,并且miR-122与肝癌的发生相关已经得到证实。相关研究显示,在肝癌细胞Hep3B和正常肝上皮细胞L02中利用miRNA芯片技术筛选miRNAs的表达差异,发现在Hep3B细胞中miR-122表达较低,另外,有研究表明miR-122表达水平的改变与肝癌细胞株对化疗药物的敏感性相关,而miR-122a的表达与肝癌细胞的细胞周期和凋亡的关系国内外尚没有相关研究。有研究显示[21],提高肝癌细胞系中miR-122的表达量,可显着抑制肝癌细胞的增殖并对凋亡有促进作用,然而抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡的具体作用机制,及其作用靶点目前还不得而知,需要继续研究。本研究中,苦参碱关于人类肝细胞肝癌细胞株HepG2的治疗效果和潜在的分子机制得到研究,我们设计实验以HepG2肝癌细胞株作研究对象,利用分子生物学和生物化学的研究方法,主要对苦参碱对肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响作研究,并研究了苦参碱对肝特异性miR-122在HepG2细胞系的作用,包括考虑到细胞增殖的抑制效果,细胞形态学的变化,细胞凋亡的诱导,以及肝特异性miR-122和其目标基因周期蛋白G1（CG1）、凋亡抑制蛋白Livin和Survivin的表达。进而探讨苦参碱诱导肝癌细胞凋亡的作用机理,为苦参碱在临床的应用提供实验依据和联合用药。方法细胞株和苦参碱处理人肝细胞肝癌细胞株HepG2（美国模式培养物保藏所（ATCC）编号HB-8064）购自中国医科大学癌症研究所（中国沈阳）。细胞用IMDM培养基（Iscove’ s modified Dulbecco’s medium）加10%胎牛血清和庆大霉素培养。苦参碱获自西安Botany Garden（中国陕西）,HPLC检测纯度>99%。苦参碱储液为溶于ddH20制备为10mg/mL。对数期生长细胞以1×105细胞/mL接种,并在浓度范围从0.0（阴性对照）至1.0mg/mL的苦参碱中处理48小时。MTT试验苦参碱对细胞活力的影响通过参考文献描述的MTT试验[22]评估。简短地说,细胞以3000个细胞每孔密度铺板至96孔板中。处理结束时,去除上清,加入20μL四唑混合物,MTT,和270mL新鲜的IMDM培养基。在37℃C孵化4小时后,每孔加入120μLDMSO溶解四唑结晶。最后,使用多孔板酶标仪（Tecan,Manennedorf,Switzerland）。每个实验重复四次。结果表示为相对于未处理细胞的生长抑制百分比。显微观察消化细胞培养物（3×105细胞/mL）加入24孔板中（0.9mL每孔）并孵育12小时。然后每孔加入0.1mL苦参碱（低浓度0.2mg/mL或高浓度1.0mg/mL）。观察前细胞孵育48小时。检查细胞使用OlympusIX70倒置显微镜。流式细胞学（FCM）分析收集处于对数期的HepG2细胞至终浓度为2×105细胞/mL,并在6孔板中孵育12小时（2.7mL/孔）。然后每孔加入0.3mL苦参碱（低浓度0.2mg/mL或高浓度1.0mg/mL）用于诱导细胞,孵育48小时。同时,取0.3mL细胞培养物作为阴性对照,培养48小时,收集,用PBS洗涤,随后用70%乙醇固定。细胞离心以去除乙醇,PBS洗涤并使用碘化吡啶（PI）在暗处染色30分钟后进行流式细胞仪分析。最后,使用BD FACSCalibur（BD,USA）检测细胞周期。每个实验重复三次。凋亡检测1×106个细胞用不同浓度的苦参碱处理48小时,然后离心收集。细胞沉淀通过 DNA 降解缓冲液进行降解（10mM Tris,pH7.5,400mM EDTA,和 1%Triton X-100）,再离心。得到的上清在37℃加蛋白酶K（0.1mg/mL）过夜孵育,然后用RNA酶（0.2mg/mL）孵育2小时。用酚氯仿（1:1）提取后,DNA通过2%琼脂糖凝胶电泳分离并用溴化乙锭染色后在紫外光下观察。凋亡细胞的定量评估通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶三磷酸缺口末端标记（TUNEL）法进行,该方法通过使用BD ApoAlert DNA片段试验试剂盒检查凋亡期间的DNA链的断裂。免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用高度特异亲和力纯化的多克隆抗CG1抗体进行实验。阴性对照则采用未免疫血清代替第一抗体。简而言之,部件在保湿室中与磷酸缓冲液稀释至1.5%正常羊血清中室温孵育4小时后用磷酸缓冲盐溶液中洗涤。这些部件在用终浓度为2μg/mL的抗CG1抗体孵育过夜。用含0.02%Triton X-100的磷酸盐缓冲液洗6次,每次不少于15分钟后,切片用抗生物素蛋白-生物素化的过氧化物酶复合物法（Vector Laboratories,Burlingame,CA）按照使用者指南进行免疫染色处理。组织部件在装片前用迈尔的苏木精简短地复染。培养的细胞在组织培养皿的无菌盖玻片中生长过夜,用45%丙酮/10%甲醛（溶于0.1M磷酸缓冲液）固定5分钟,然后按照上述方法进行免疫组织化学试验处理。定量实时PCR试验成熟has-miR-122（P/N:4373151）在HepG2细胞中的表达由Taqman MicroRNAAssays（Applied biosystems）按照Gramantieri等[24]作一些修正后进行分析。每个样品分析三次。逆转录反应从10ng全RNA开始,并使用环状引物。定量实时PCR在7500实时PCR系统（Applied biosystmes,USA）上使用标准Taqman MicroRNAAssays实验方案进行。20μLPCR混合物包括1.4μL逆转录产物,10μL2×taqmanUniveralPCRMaster混合液,5μL0.2μmol/LTaqman探针,1.8μL1.5μmol/L正向引物,和1.8μL0.7μmol/L反向引物。反应条件:96孔板,95oC孵育10分钟,然后以95oC孵育15秒和60oC孵育1分钟进行40个循环。基因表达相对定量的△△Ct法被用于检测miRNA表达水平。△Ct的计算为从待测miRNA的Ct减去U6RNA的Ct。△△Ct的计算为从每个样品的△Ct减去参照样品（未处理的HepG2）的△Ct。用方程2-△△Ct生成倍数变化。三种参照样品的集合用于标准曲线计算和作为参照样品的△ACt。U6RNA的Taqman MicroRNAAssays（RNU6B,P/N:4373381;Applied Biosystems）。Western blot 分析细胞裂解物用RIPAbuffer（50mmol/LTris-HCl缓冲液,pH7.4,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,1%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠）添加1Xhalt蛋白酶抑制剂混合物和1Xhalt磷酸酶抑制剂混合物（Pierce,Rockford,IL）制备。Bio-Rad蛋白分析用于确定蛋白浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜（Whatman,Boston,MA）。第一次杂交的膜用特异的第一抗体,然后用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（Cell SignalingTechnology）。蛋白条带用商业化的Immobilon Western化学发光辣根过氧化物酶底物检测试剂（Millipore,Billerica,MA）显示。转移到PVDF膜的化学发光的蛋白用ECL Plus（GE Healthcare Amersham,Piscataway,NJ）检测。相对蛋白表达值通过ImageJ软件灰度测量进行定量检定。数据分析所有的数据用软件包SPSS19.0进行分析。结果用平均值±标准差。研究的统计学显着性由参变量的非配对Student’s t检验确定。P<0.05的差异性可认为是显着的,P<0.01认为高度显着。结果苦参碱对HepG2细胞的生长抑制为检验苦参碱对HepG2细胞生长调节的效应,使用了一个苦参碱浓度范围为:0.2,,0.5,0.8和1.0mg/mL。苦参碱处理后48小时,与对照组相比,0.8和1.0mg/mL高浓度组观察到明显的细胞生长抑制,平均生长抑制率分别为44.03±4.18和48.39±3.32%。但是,低浓度苦参碱（0.2和0.5mg/mL）与对照组相比,对细胞生长没有明显影响。这些结果表明苦参碱对HepG2细胞的生长抑制效应具有浓度依赖性。细胞的形态变化苦参碱处理48小时后,用FIMS观察细胞形态。在低浓度苦参碱（0.2mg/mL）下处理的细胞与对照组相比没有表现出明显的不同;而相比对照组而言,清晰的形态变化,包括细胞收缩,破裂和破坏,均在高浓度苦参碱（1.0mg/mL）处理的细胞中观察到。高浓度苦参碱能够导致细胞群落减少,这可以从细胞屈光度下降中反映出来。通过苦参碱诱导细胞凋亡为检测苦参碱介导的细胞增殖抑制相关机制,利用流式细胞学分析评估细胞周期分布。与对照组相比,可以看到,G1/G0期细胞比例显着增加,而S和G2/M期细胞比例显着减少;用低和高浓度（0.2和1.0mg/mL）苦参碱处理后大部分细胞停留在G1期。二倍体比例略有增加而单倍体减少;另外,与对照组相比,细胞碎片大幅度增加。苦参碱对HepG2细胞凋亡的诱导作用也通过DNA碎片试验进行检验。在48小时,琼脂糖凝胶电泳表明苦参碱的处理导致HepG2细胞里DNA碎片的形成。通过TUNEL做出一个定量评估以检测DNA链断裂。与对照组细胞相比,在48小时1.0mg/mL苦参碱诱导33.1%的HepG2细胞凋亡。该结果表明,细胞用苦参碱处理引起HepG2细胞周期进程的显着性抑制,导致与对照组相比在G1期细胞百分比明显上升。苦参碱处理的细胞中肝特异性miR-122的上调为研究苦参碱处理和肝特异性miR-122表达量之间的相关性,不同样品的miR-122的相对表达量被检测。通过定量实时PCR分析确定苦参碱处理的HepG2细胞中miR-122表达量明显上调。这个上调通过提高苦参碱浓度被进一步增强,并达到峰值,约4.39倍,此时苦参碱浓度增至1.0mg/mL。苦参碱处理细胞中miR-122靶向的CG1下调免疫组织化学染色表明在低浓度（0.2mg/mL）苦参碱处理48小时后几乎所有细胞核和褐色细胞质颗粒是棕褐色。每一组的平均OD值表示CG1基因的表达水平。对照组的平均OD值是0.5367±0.0235;苦参碱处理组的值是0.3888±0.0826.苦参碱处理组的平均OD值是高显着性的,高于对照组的值,证明低浓度苦参碱足以抑制CG1基因表达。这些结果也被Westernblot实验所确认。对照组的条带比苦参碱处理细胞的要更为清晰明亮（约1.5倍）。苦参碱处理细胞中凋亡抑制基因Livin、Survivin表达下调不同浓度苦参碱作用于HepG2细胞后,随药物浓度越高,Livin、Survivin的mRNA和蛋白表达水平均越低,当苦参碱浓度为1.5mg/mL时,Livin、Survivin蛋白表达的抑制作用更显着（P<0.05）。讨论虽然传统化疗仍然是一个癌症治疗的主要方法,但癌细胞经常发展抗药性以显着降低化疗处理的效力。此外,考虑到与一些肝癌相关的贫乏的预后以及除手术之外的有限的治疗选择,患者可能会寻找替代治疗,包括传统中药产品,单独或与标准护理组合使用[1]。近几年,来自用于传统中药的药用植物的天然产物的潜力已被西方世界的科学团队所认识。许多天然产物及派生物因此列于癌症化疗的标准清单上[25]。新的传统中药获取的抗癌药物包括三氧化二砷,喜树碱,斑蝥素,高三尖杉酯碱,足叶草毒素,长春碱和长春新碱（见参考文献[25]）。证据表明这些抗癌传统中药功能有1)凋亡诱导剂,通过与调节细胞增殖,血管再生或凋亡相关基因抑制细胞生长[26,27];2)免疫增强剂,促进免疫学功能或者加强对肿瘤和病毒的抵抗力[28]。本研究的结果证明苦参碱在抑制人的肝细胞癌细胞株HepG2的肿瘤细胞生长中起重要作用。苦参碱以剂量依赖性的方式降低HepG2细胞的生存。我们发现低浓度（0.2mg/mL）苦参碱足够抑制HepG2细胞生长;该细胞生长停滞为浓度依赖性,例如,当剂量增加时可观察到抑制作用提升。但是,细胞形态在低浓度（0.2mg/mL）下没有明显变化,除非剂量增加到1.0mg/mL（高浓度）。通过FCM分析检测相应的细胞周期,与未处理对照相比,时期的变化表明,随着细胞生长停滞,在苦参碱处理后48小时HepG2细胞被诱导凋亡。用MTT分析可得在低和高浓度（0.2和1.0mg/mL）苦参碱处理后,S和G2/M期部分显着性（P<0.05）降低,随后G1/G0其细胞比例增加。这些结果与苦参碱对鼠H22细胞增殖的抑制作用类似[7]。在苦参碱对鼠H22细胞的剂量作用中,使用0.5mg/mL苦参碱处理48小时发生明显的抑制,与此不同的是,在我们的研究中,在人HepG2细胞中低浓度（0.2mg/mL）作用48小时足以诱导细胞凋亡。这些结果表明低浓度苦参碱通过阻滞细胞生长以延长细胞周期来抑制HepG2细胞增殖。在本研究中细胞凋亡比例略微偏低,表明苦参碱对HepG2细胞的抑制作用主要通过细胞周期延迟（细胞生长延长和增殖减缓）而不是细胞凋亡来获得。G1/G0期细胞的明显增加和G2/M期细胞的减少暗示苦参碱对HepG2增殖的抑制作用可能主要是由于细胞在G1期停滞。但是,需要进一步的研究以确定这些结果并调查潜在的机制。肝细胞特异性miR-122通常被发现在所有肝细胞癌来源的细胞株中下调[24]。使用qPCR计数,在现在的研究中可以测定肝细胞特异性miR-122的表达量。与无苦参碱处理的HepG2细胞（对照组）相比,在所有苦参碱处理组miR-122的剂量依赖性上调证明了在人的HepG2中苦参碱和miR-122的相关性。这些线索通过Western blot分析CG1,肝细胞特异性miR-122的一个靶点,的下调进一步得到增强。低浓度的苦参碱（0.2mg/mL）抑制CG1,比对照组低1.5倍,而负相关的是miR-122的表达量提高了 1.861倍。这些结果表明抗肿瘤的传统中药苦参碱能够诱导细胞细胞停滞和凋亡,并伴随恢复人肝细胞癌HepG2细胞株中的肝特异性miR-122的表达。
陈佳欣[2]（2016）在《苦参碱类生物碱抗乙型肝炎病毒作用及其机制研究》文中指出目的：研究比较氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱四种苦参碱类成分抗HBV作用,以及其联合恩替卡韦抗耐药HBV作用,并进一步探讨氧化苦参碱与恩替卡韦联用抗耐药HBV作用机制,为苦参碱类生物碱抗HBV及抗耐药HBV临床应用提供药理学依据。方法：（1）氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱抗HBV作用：采用HepG2.2.15乙肝病毒细胞模型,考察氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱的细胞毒性；采用酶联免疫法检测给药24h、72h细胞上清中乙肝表面抗原（HBsAg）、抗原（HBeAg）的分泌量：采用实时定量PCR检测细胞上清和胞内乙型肝炎病毒拷贝数；（2）槐定碱抗HBV代谢组学研究：采用HepG2.2.15乙肝病毒细胞模型,运用超高效液相色谱仪与四极杆飞行时间串联质谱仪联用技术（UHPLC-Q-TOF MS/MS）检测给药后（槐定碱、拉米夫定）细胞内的内源性代谢产物,采用主成分分析、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）多元统计分析和单因素方差分析法,通过分析与抗病毒作用密切相关的内源性代谢产物特征性变化,从中筛选特异性的生物标志物；（3）氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用：采用解放军三零二医院自行构建的恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒复制细胞株HepG2.A64作为模型,采用CPE观察法、CCK-8分别考察苦参碱类生物碱氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱和核苷类药物恩替卡韦单独用药及两者联用的细胞毒性；采用酶联免疫法（ELISA）、实时定量PCR法分别观察联合用药对HepG2.A64细胞HBsAg分泌、HBV DNA复制的作用；（4）氧化苦参碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用机制研究：采用HepG2.A64作为细胞模型,采用实时定量PCR法观察联合用药对HepG2.A64细胞P38和Na+-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP） mRNA表达的影响,采用免疫印迹法（Western blot）观察联合用药对HepG2.A64细胞中P38、p-P38和NTCP蛋白表达水平的影响。结果：（1）氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱抗HBV作用：根据细胞毒性实验结果,苦参碱类生物碱(100μg·mL-1,200μg·mL-1,400μg·mL-1)和拉米夫定(100μg·mL-1,200μg·mL-1)对HepG2.2.15细胞系不具有细胞毒性。给药72h,槐定碱(100μg·mL-1,200nμg·mL-1)对HBsAg和胞内HBV DNA的抑制效果优于拉米夫定（P<0.05）。槐定碱抗HBV作用优于氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱；（2）槐定碱抗HBV代谢组学研究：通过分析给药后HepG2.2.15细胞内代谢产物的变化,筛选出C16 Sphinganine（C16鞘氨醇）、Phytosphingosine（植物鞘氨醇）、Jervine（蒜藜芦碱）、Cycloleucine（环亮氨酸）等34个特异性的生物标志物,其中12种特异性生物标志物含量降低,22种含量升高。与对照组相比,槐定碱组的植物鞘氨醇含量降低,且植物鞘氨醇可诱导P38的磷酸化,推测P38磷酸化蛋白的降低和抗HBV作用相关；（3）氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用：氧化苦参碱(100μg·mL-1,200nμg·mL-1)联合恩替卡韦给药组对HBsAg的抑制率分别可以达到27.58%和57.23%,显着优于两种药物单独效果；氧化苦参碱联合恩替卡韦对HBV DNA的抑制率最高达到76.35%（P<0.05）；（4）氧化苦参碱联合恩替卡韦作用抗耐药HBV作用机制研究：与对照组和单独给药组相比,联合给药组的P38 mRNA和蛋白表达水平升高,同时p-P38蛋白表达水平显着下降,NTCP mRNA和蛋白表达水平下降（P<0.01）,进一步验证代谢组学结果。结论：四种苦参碱类生物碱相互比较,槐定碱具有良好的抗HBV作用；氧化苦参碱与恩替卡韦联用后显着改善恩替卡韦抗耐药HBV的效果,其作用机理与其降低NTCP的mRNA和蛋白表达以及降低P38蛋白磷酸化有关。
徐广灿[3]（2016）在《肝靶向马蹄金素衍生物的设计、合成及其抗乙肝病毒活性研究》文中认为马蹄金素[N-（N-苯甲酰基-L-苯丙氨酰基）-O-乙酰基-L-苯丙氨醇,MTS]是本课题组从民族药马蹄金（Dichondra repens Forst.）中分离得到的苯丙氨酸二肽类化合物,具有抗乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）活性。前期研究中,通过以其为先导化合物设计并合成了系列具有抗HBV活性的MTS衍生物。并将其中一个衍生物替芬泰（Y101）完成了临床前研究,获得国家食品药品监督管理总局颁发的化药1.1类新药的临床批件（原料药及其制剂批件号:2013L02491,2014L00070）,目前Y101的I期临床试验正在进行中。Y101的初步药代实验结果表明,其在组织中分布广泛,药物不能高效聚集于肝脏组织。据此,为提高该类化合物的肝脏药物浓度,以增强其抗HBV活性,减少不良反应等。本课题将对MTS衍生物进行半乳糖糖基化修饰,设计并合成一系列肝靶向MTS衍生物。本课题设计了 2种类型的肝靶向MTS衍生物:（1）D-半乳糖通过乙二醇、二缩三乙二醇、三缩四乙二醇为连接臂与MTS衍生物的游离羧基进行间接连接的衍生物；（2）通过以三羟甲基氨基甲烷、4-氨基丁酸所组建的连接臂将三个D-半乳糖与MTS衍生物游离羧基进行间接连接的衍生物。本课题共合成了以上2种类型肝靶向MTS衍生物23个,并全部通过1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HMQC和ESI-MS等波谱进行了结构表征。通过对合成的肝靶向MTS衍生物进行了体外抗HBV活性测试。以HBV基因转染的人肝癌细胞（HepG22.2.15细胞）为HBV载体,测定了 23个目标化合物抑制HBVDNA复制能力。活性筛选结果表明,所有目标化合物对2.2.15细胞的HBVDNA的复制均有一定的抑制作用,其中化合物57、69、79的效果较为明显,在药物浓度均为50μg·mL-时,抑制率分别为59.50%、72.44%、65.34%。该结果可为肝靶向MTS衍生物的进一步研究提供一定的理论研究依据。为评价半乳糖糖基化能否提高肝靶向MTS衍生物的肝靶向性,本课题选取了体外抗HBV活性最好的化合物69进行小鼠体内组织分布实验,通过与原型化合物40和Y101体内组织分布情况比较研究发现,肝靶向MTS衍生物69能有效聚集于肝脏组织,并具有一定的吸收分布趋势。该结果表明MTS衍生物进行半乳糖糖基化修饰后有望提高其肝靶向性。
刘舒凌[4]（2015）在《饿蚂蝗总黄酮抗乙型病毒性肝炎的作用及其机制研究》文中指出饿蚂蝗（Desmodium multiflorum DC.）,又名山蚂蝗、粘身草、红掌草、胃痛草等,为豆科山蚂蝗属植物饿蚂蝗的全株,分布于广西、广东、江西、福建、云南等地,具有清热解毒,健胃消食,止痛之功效。现代药理和中药化学研究表明,饿蚂蝗具有良好的生物活性,其化学成分主要为有机酸、甾体、萜类、黄酮类及酚类。在广西民间,饿蚂蝗用于治疗肝炎和肝腹水,具有较好的临床疗效。本研究的前期工作采用系统溶剂提取法对饿蚂蝗进行提取分离,同时进行了抗HBV的药效筛选工作。前期的研究表明饿蚂蝗乙醇提取物体外抗HBV的作用主要体现在乙酸乙酯部位;化学成分预试显示,乙酸乙酯部位可能含有较多的黄酮类成分。目前关于饿蚂蝗总黄酮的实验研究资料不多,对其抗HBV作用研究尚无文献报道。因此本文拟对饿蚂蝗总黄酮进行提取纯化,对其体内外抗HBV作用和保肝作用进行研究。本研究将为广西民间药材饿蚂蝗的进一步开发利用提供科学的理论基础,为新型抗HBV药物的研究和开发提供实验依据。第一章饿蚂蝗总黄酮的提取纯化及抗HBV活性确认实验一 饿蚂蝗总黄酮的提取纯化目的:采用乙醇提取法和AB-8大孔树脂吸附法,研究饿蚂蝗总黄酮的提取和纯化工艺。方法:以芦丁为对照品,乙醇为浸提溶剂,利用紫外分光光度法对饿蚂蝗总黄酮的提取率进行测定,通过对乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数进行正交试验,优选饿蚂蝗总黄酮的提取工艺。采用AB-8大孔树脂为吸附材料,以洗脱液中总黄酮量和总黄酮纯度为指标,考察上样液质量浓度、上样体积、洗脱剂浓度、洗脱流速和洗脱液用量,优化饿蚂蝗总黄酮的纯化工艺。结果:最佳提取纯化工艺为:60%乙醇提取,液料比12:1,提取3次,每次1h;提取后经AB-8大孔吸附树脂进一步纯化,上柱药液浓度以生药计为0.4g/mL,上样量为1.5倍柱床体积,以4倍柱床体积的70%乙醇洗脱,洗脱流速为2mL/min;纯化后总黄酮纯度为61.47%。结论:该工艺操作简单、稳定可行,适合饿蚂蝗总黄酮的提取纯化。关键词总黄酮,饿蚂蝗,大孔树脂,纯化实验二 饿蚂蝗体外抑制HBV的活性部位确认目的:比较饿蚂蝗醇提物（AEDM）和饿蚂蝗总黄酮（TFDM）体外对HBV的抑制作用。方法:通过CCK-8法观察AEDM和TFDM对HepG2.2.15细胞的影响,采用ELISA法检测分析AEDM和TFDM对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。结果:AEDM和TFDM的半数中毒浓度（TC50）分别为621.83μg/mL和310.91μg/mL,对细胞的毒性均较小。AEDM对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度（IC50）分别为179.60μg/mL和168.59μg/mL,治疗指数（TI）分别为3.46和3.69;TFDM对HBsAg和HBeAg的IC50分别为56.25μg/mL和39.70μg/mL,TI分别为5.53和7.83。结论:饿蚂蝗总黄酮在体外具有抗HBV抗原的作用;饿蚂蝗体外抗HBV的作用与总黄酮含量呈正相关。第二章饿蚂蝗总黄酮体外抑制HBV DNA和cccDNA的作用研究目的:研究饿蚂蝗总黄酮（TFDM）对HepG2.2.15细胞HBVDNA复制及HBV cccDNA水平的影响。方法:将HepG2.2.15分为空白对照组、拉米夫定组（100μg/mL）、不同浓度 TFDM 组（1 00μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）,分别给予相应的培养液,每2天换液一次,在6天时,收集上清液及细胞,采用荧光定量PCR法检测细胞内、外HBV DNA以及细胞内HBV cccDNA的拷贝数。结果:TFDM各剂量组能明显抑制细胞内、外HBV DNA的含量（P<0.01）以及细胞内HBV cccDNA的水平（P<0.05或P<0.01）,且抑制作用呈现明显的量效关系。结论:TFDM能够明显抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA复制水平,对HBV cccDNA也具有抑制作用。第三章饿蚂蝗总黄酮对鸭乙型病毒性肝炎的作用研究目的:研究饿蚂蝗总黄酮（TFDM）对鸭乙型病毒性肝炎的作用。方法:采用鸭乙型肝炎病毒血清感染1日龄广西麻鸭。感染7d后采用PCR法筛选出DHBV DNA强阳性鸭,随机分为5组:模型组、3TC 阳性对照组（50mg/kg）、TFDM高、中、低剂量组（300、150、75mg/kg）,每组10只。另设正常对照组（经PCR筛选出的未造模DHBV阴性鸭）10只。各组从造模后第14d开始给药,每天灌胃给药1次,持续给药14d。每组动物分别于给药前0天（T0）、给药后7天（T7）、给药后14天（T14）、停药后3天（P3）自颈静脉采血,检测血清中DHBVDNA、DHBsAg和DHBeAg的水平、转氨酶（ALT,AST）的活性以及细胞因子IL-2和IFN-γ的含量变化。结果:TFDM能够降低T14和P3时鸭血清DHBV DNA载量以及DHBsAg、DHBeAg含量,停药后未见病毒反弹;降低T7、T14、P3时血清ALT和AST含量;升高T14时血清IL-2和IFN-γ水平。结论:TFDM具有抗鸭乙型病毒性肝炎作用,其作用机制与抑制DHBV病毒复制、保肝降酶、调节免疫功能有关。第四章饿蚂蝗总黄酮对刀豆蛋白A（ConA）所致小鼠免疫肝损伤的作用研究实验一饿蚂蝗总黄酮对ConA诱导的小鼠免疫肝损伤的影响目的:研究饿蚂蝗总黄酮（TFDM）对小鼠免疫性肝损伤的作用及其机制。方法:72只小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药联苯双酯组（200mg/kg）、TFDM 高、中、低剂量组（800、400、200mg/kg）,各组预防性灌胃给药10 d。第10 d,除正常对照组外,其余各组小鼠尾静脉注射刀豆蛋白A（Con A）20 mg/kg诱导免疫性肝损伤,8 h后测定小鼠肝、脾、胸腺指数（mg/g）,检测小鼠肝匀浆中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的活性变化,流式细胞术测定全血中CD4+、CD8+T细胞亚群比率,ELISA法测定血清白介素-2（IL-2）、Y干扰素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-4）的水平。结果:与模型组相比,TFDM能明显降低肝、脾指数,增大胸腺指数,显着降低小鼠肝匀浆中ALT、AST、MDA、NO含量和升高SOD活性,显着提高外周血CD4+、CD8+比率,降低血清中炎性细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平。结论:TFDM对免疫性肝损伤有保护作用,其机制可能与抗氧化损伤、调整T细胞亚群的活性和减少炎性细胞因子的释放有关。实验二急性毒性试验目的:评价TFDM的安全性,测定最大给药量。方法:SPF级小鼠20只随机分成2组:空白对照组和TFDM组。TFDM组以最大浓度和最大体积灌胃给药,空白对照组给予等容量蒸馏水。给药后连续14天观察动物的行为、外观、体重、进食、排泄等情况,以及主要脏器的大体改变及死亡情况。计算小鼠经口的最大给药量。结果:小鼠灌胃给药后,其饮食、活动、精神状态等体征均无异常变化,未见毒性反应及死亡发生。给药后小鼠体重增长正常。TFDM小鼠经口的最大给药量为12.5g/kg,相当于饿蚂蝗原生药578.0g/（kg·d）,是临床人用量（成人60kg体重,日用量30g药材）的1157倍。结论:TFDM经口给药的毒性很低。第五章饿蚂蝗总黄酮对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白的基因表达和蛋白表达的影响目的:研究TFDM对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白的基因表达和蛋白表达的影响,探讨TFDM抑制HBV在细胞内复制的可能机制。方法:HepG2.2.15分为空白对照组、不同浓度TFDM组（100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）,分别给予相应的培养液,每2天换液一次,第6天收集细胞。选取JAK-STAT信号通路中的部分抗病毒蛋白如:信号转导与转录活化因子1（STAT1）、信号转导与转录活化因子2（STAT2）、2’,5’-寡腺苷酸合成酶1（OAS1）、RAN依赖蛋白激酶（PKR）和粘病毒抗性蛋白A（MxA）。采用RT-PCR法检测TFDM作用后细胞内STAT1、STAT2、OAS1、PKR和MxA转录产物mRNA水平的变化,免疫组化法和Western blot法检测STAT1、STAT2、OAS1、PKR和MxA蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组比较,TFDM可以明显上调细胞内STAT2、PKR和MxA的mRNA水平（P<0.05）,明显增强PKR和MxA的蛋白表达水平（P<0.01）。结论:TFDM可以诱导HepG2.2.15细胞内JAK-STAT信号通路中PKR和MxA的基因转录和蛋白表达。提示此通路可能是TFDM抑制HBV在肝细胞内复制的机制之一。
阎龙[5]（2015）在《苦参碱衍生物WM-108抑制肝癌细胞系Hep3B增殖及侵袭能力的作用及其机制的研究》文中研究说明研究背景和目的慢性乙型肝炎是广泛在我国流行的一种疾病,由此引起肝脏慢性疾病在中国的发病率非常高,很大程度上损害了居民的生活质量和生命健康。其中,最严重也是特别引起人们重视的是肝细胞癌。随着根治性切除手术、肝移植及局部射频消融等技术的发展,肝细胞癌患者5年生存率已有了很大提高,但扩散转移及术后复发仍是制约预后的重要因素,所以全身药物的辅助治疗作用也逐渐凸显其价值,比如多靶向抗肿瘤药物索拉非尼在肝细胞癌临床实际治疗中的应用。苦参碱（MT）和氧化苦参碱（OMT）是临床中常见的两种来源自中草药的药物,他们是存在于中药材苦参中的主要生物碱,也是该味中药的主要药理成分,目前,除广泛应用于肠炎、妇科疾病外,在肝脏疾病方面已应用于抗肝炎、抗肝纤维化等治疗,临床研究和基础实验均发现,其具有治疗慢性肝炎,并预防肝脏纤维化发生等作用。同时,体外细胞及动物实验已经证实其对多种肿瘤疾病有一定的治疗作用,如肺癌,黑色素瘤,白血病,淋巴瘤,胃肠道癌,胰腺癌,肝细胞癌,胆囊癌等。在体外及动物实验中发现,二者可以采取调节肝细胞癌细胞内信号通路,调控细胞内相关蛋白转录表达水平的方式,发挥抑制肝癌细胞增殖、侵袭及转移,促进其凋亡等作用。但是,MT和OMT抗肿瘤的药理作用不强,所以为了提高药效,研究人员进行了结构设计和改造,得到了13-甲氨基-18-硫代苦参碱（M19）,并以此为蓝本,经历多步骤的加成化合等反应,合成了WM-1系列苦参碱衍生物。前期研究已经发现,M19可以显着抑制小鼠巨噬细胞内Akt磷酸化的水平,在细胞和动物实验中初步发现其在预防肝纤维化发生等方面的效果比MT和OMT这两个原型明显,同时在也发现了它可能具有抑制肿瘤增殖的作用。表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是存在于胞膜上的一种分子量为170kD的跨膜糖蛋白,胞内成分具有酪氨酸激酶活性,是常见的几种生长因子配体的主要结合受体,包括EGF, HB-EGF, TGF-β等。EGFR表达升高或者活性增强通常对肿瘤的发生、恶性细胞的失控性增殖、肿瘤细胞分化不良等事件发生有促进作用。研究已发现多种恶性肿瘤组织中EGFR高表达或者活性增强,譬如乳腺癌,肺癌等等,多项研究对肝细胞癌行病理分析时也发现了其可高表达EGFR,而且人们发现它的表达量和肝细胞癌的临床分期和预后情况相关程度较高。EGFR可以通过对下游信号通路的调节,主要是MAPK/ERK信号通路,发挥调节细胞内基质金属蛋白酶（MMPs）的转录和表达的作用。现在,基质金属蛋白酶（MMPs）在多种恶性肿瘤发生转移和侵袭行为中的重要作用已经得到了一致认同,在众多MMPs中人们最关注的莫过于基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）,有报道在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤实验模型和人体病理组织标本中发现二者表达水平升高。在肿瘤组织细胞中,细胞内合成的是MMPs的前体蛋白,所以分泌到细胞外后,MMPs还需要特定的酶原激活物质来将它激活,才会具有水解细胞外基质和协助肿瘤细胞穿透和转移的能力,所以机体可以通过调控转录表达水平和调节胞外MMPs活化两种手段来调节MMPs的功能。本研究拟通过体外细胞实验及动物实验,探寻新型苦参碱衍生物对肝细胞癌（HCC）细胞增殖和侵袭能力等细胞行为方面的影响,并通过研究其对肝癌细胞内相关信号通路及蛋白表达的影响,探讨该类型苦参碱衍生物抗肝细胞癌（HCC）的作用及其可能的分子机制。研究方法1.通过细胞增殖实验MTT方法筛选出WM-1系列苦参碱衍生物中对肝癌细胞作用较强及作用稳定者,在较敏感的细胞系中进行下一步实验；2.将不同浓度梯度苦参碱衍生物WM-108作用于不同肝癌细胞系,检测其抑制肝癌细胞增殖能力,及增殖抑制作用与浓度和时间的关系；3.Annexin V/PI双染色流式细胞术检测经苦参碱衍生物WM-108干预后,Hep3B细胞凋亡的变化情况；4.采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测WM-108的干预对侵袭和转移能力不同的两种肝癌细胞（LM3和Hep3B）侵袭转移能力的影响；5. Western blot和荧光定量RT-PCR方法检测各浓度WM-108作用下Hep3B细胞内与增殖和侵袭转移密切相关的蛋白转录和表达水平的变化；6.用明胶酶谱方法检测经干预后Hep3B分泌至细胞培养上清液中MMPs的活性变化；7.建立Hep3B皮下成瘤和肝脏原位裸鼠肝癌模型,并给予药物干预,观察WM-108对肿瘤的生长和裸鼠模型一般情况的影响,干预结束后取肿瘤标本行病理组织HE染色检测等病理检查。结果（一）苦参碱衍生物WM-108能明显的抑制肝细胞癌细胞的增殖能力1.WM-1系列苦参碱衍生物对人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、 HCCC-9810等细胞增殖都具有一定的抑制作用,其中WM-108作用比较显着且稳定;2.苦参碱衍生物WM-108对Hep3B的增殖有抑制作用,且强于同浓度苦参碱衍生物,其24h半数抑制浓度（IC50）为127.3+18.49mg/L；3.在低浓度（150mg/L浓度）下,WM-108对人肝细胞系干预24h后未表现出显着的增殖抑制作用,药物浓度过高时（>150mg/L）,可以表现出一定增殖抑制作用（约20%）；（二）苦参碱衍生物WM-108对肝癌细胞凋亡和迁移侵袭能力的影响1.给予一系列浓度梯度的WM-108干预后,明显地促进了Hep3B细胞凋亡率的升高,但随着药物浓度的增高,其导致细胞坏死的作用表现越明显,200mg/L时可导致约30%以上细胞坏死；2.WM-108在低浓度（10mg/L,20mg/L,30mg/L）就可表现出降低肝癌细胞系Hep3B和LM3迁移能力的作用；3. Transwell证实Hep3B和LM3在WM-108作用下穿透Transwell小室基质胶能力下降。（三）苦参碱衍生物WM108可以调节Hep3B细胞信号通路和相关蛋白表达,发挥抑制细胞增殖和侵袭能力的作用1.经苦参碱衍生物作用后,Hep3B细胞内EGFR磷酸化水平下降,其下游信号通路中的AKT和ERK磷酸化水平随之下降；2. RT-PCR和Western Blot方法证实药物干预后,Hep3B细胞内MMP-2和MMP-9转录和表达水平下降,且其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达量并未有明显的变化；3.明胶酶谱实验检测发现,在WM-108的作用下,肝细胞癌Hep3B培养24h后的细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9的活性下降。（四）皮下和原位成瘤的肝癌裸鼠模型证实了苦参碱衍生物WM-108在活体动物模型中也表现出一定的抗肿瘤作用1.与对照组比较,WM-108在50mg/kg剂量下能延缓裸鼠皮下和肝脏原位肿瘤的生长速度,但抑瘤作用不如30mg/kg剂量下的5-氟尿嘧啶明显；2.WM-108腹腔注射对裸鼠模型一般情况影响比5-Fu小,特别是对体重影响与空白对照组无明显差别,5-Fu影响裸鼠模型体重明显；3.病理组织切片的HE染色发现,和对照组肝癌瘤体组织相比,使用WM-108后肝癌肿瘤组织中心坏死区域扩大,周围出现小的坏死灶,和5-Fu作用后肿瘤组织的病理表现类似。结论本课题在细胞和动物水平上研究了苦参碱衍生物WM-108对肝细胞癌的作用,并结合药物对细胞内相关信号通路传导和蛋白表达的影响研究讨论了其作用机制。实验发现,较之普通苦参碱,苦参碱衍生物WM-108具有明显抑制肝癌细胞增殖的能力,在合适的浓度下,药物还能促进细胞凋亡的发生,浓度过高时,其直接导致肿瘤细胞坏死的作用明显。WM-108药物能引起肝癌细胞Hep3B内EGFR磷酸化水平下降,进而导致下游与细胞增殖生存密切相关的信号通路中的某些蛋白（AKT和ERK）磷酸化水平降低,起到抑制细胞增殖和促进其凋亡的作用。WM-108还可引起肝癌细胞侵袭能力下降,其原理可能是药物下调下游信号通路PI3K/AKT, MAPK/ERK中相关蛋白磷酸化,导致基质金属蛋白酶2和9（MMP-2, MMP-9）表达下调,水解细胞外基质（ECM）功能降低。裸鼠皮下及肝脏原位成瘤肝癌模型在腹腔给予WM-108一定剂量和一定时间后（50mg/kg,5次,2天1次）,与对照组相比能延缓肿瘤的生长,且对裸鼠体重等一般情况的影响比5-氟尿嘧啶小。
朱振红[6]（2014）在《苦参乌梅汤体内抑制转基因小鼠S抗原和体外抑制HepG2.2.15细胞HBVDNA的实验研究》文中研究指明HBV感染的持续造成的乙型肝炎的慢性化,致病机制很复杂,既包括病毒本身的变异,也包括宿主的因素。当下抗病毒的药物多停留在对病毒的暂时抑制阶段,并不能彻底清除HBV病毒。这就更为凸显了解HBV持续感染的具体致病机制的重要性。S抗原是衡量HBV现症感染的重要指标,HBVDNA是反映HBV聚合酶的重要标志物,两者在HBV持续感染过程中均发挥重要作用。因此对于HBV病毒的实验研究显得尤为重要。目的：我们通过对HBV转基因小鼠进行正交试验设计筛选苦参乌梅汤最佳处方配比,并通过探索不同浓度苦参乌梅汤对HepG2.2.15细胞模型毒性对照研究评价其药效学价值,进一步探讨其体外抗HBV活性。方法：我们选用HBV转基因小鼠的HBsAg抑制率为指标,通过正交试验设计方法查找苦参乌梅汤最佳处方配比。并采用HepG2.2.15细胞模型进行体外培养,分别给予不同浓度的苦参乌梅汤和恩替卡韦,药物作用48h后,采用MTT法检测药物对HepG2.2.15细胞的生长影响,并用荧光定量PCR技术定量分析细胞内和细胞外HBV DNA的复制浓度,从而评价药物的抗HBV作用。结果：1.苦参乌梅汤的最佳配比为1：1,其体内抗HBV效果显着,能明显抑制HBV转基因小鼠HBsAg的表达。2.苦参乌梅汤的细胞毒性与浓度相关性不明显,且在半数毒性浓度（TC50）处出现拐点,苦参乌梅汤的半数毒性浓度（TCso）为4.816mg/ml,等比稀释小于半数毒性浓度的5个浓度进行药效学实验研究。恩替卡韦浓度在0.20mg/ml时,细胞存活率大于85%,表明其小于0.20mg/ml时无细胞毒性；大于0.20mg/ml时,有一定细胞毒性,且细胞毒性随着浓度的增高也逐渐增强。选择次浓度进行恩替卡韦药效学实验研究。3.药效学实验研究结果表明,苦参乌梅汤对HepG2.2.15细胞胞外HBV DNA复制的抑制作用较恩替卡韦显着,且随浓度升高抑制作用逐渐增强,但对细胞内HBV DNA复制的抑制作用而言,仅在其浓度为2.50mg/ml时与恩替卡韦0.20mg/ml药效相当。结论：1.苦参乌梅汤最佳组方（1：1）体内抗HBV作用显着,能明显抑制HBV转基因小鼠血清中HBsAg的表达。2.苦参乌梅汤属于低毒型抗HBV的中药,且苦参乌梅汤对细胞的毒性与其浓度相关性不明显,且在半数毒性浓度（TC50）处出现拐点,次浓度与恩替卡韦药效学具有等效性,也为本次实验研究提供基础与前提。3.苦参乌梅汤在胞外与胞内对HBVDNA复制抑制作用的差异性显示,苦参乌梅汤可能是通过多种作用机制抑制病毒复制,且其胞外对HBVDNA抑制作用的优效性为临床推广提供理论及实验支持。
欧秀元[7]（2014）在《苦参碱引起内质网应激的机制及相关药效的研究》文中指出苦参碱（matrine, MAT）是从中药苦参（Sophora flavescens A it）根中提取的种重要活性成分。在中国MAT已经被广泛地应用于病毒性肝炎、肝纤维化、癌症、心律失常以及皮肤炎症等疾病的治疗。目前虽然已经对MAT的药理作用机制进行了大量的研究,但仍然有不少关键性的问题缺乏深入的探索。因此,本研究对MAT的药理作用机制进行了深入的研究,为指导MAT的临床合理应用和提高治疗效果提供实验依据。首先利用MTT法检测了MAT对不同细胞的增殖抑制作用,发现MAT对人肝癌细胞HepG2较敏感,而对人肝正常细胞L02不敏感。我们选用HepG2和MCF-7两株细胞株进一步探讨了MAT的药理作用机制。MAT通过激活caspase-3和caspase-9,诱导活性氧自由基产生以及破坏线粒体膜电位方式诱导细胞凋亡。在HepG2和MCF-7细胞中,我们进一步证实了尽管MAT诱导自噬早期的特征,但是MAT最终通过抑制溶酶体蛋白酶cathepsin D的成熟而抑制自噬晚期过程。这种作用特点同自噬晚期抑制剂氯喹相似。通过自噬早期抑制剂3-甲基腺嘌呤或者RNA干扰敲低ATG7抑制自噬发生,我们首次证明了MAT诱导的膜泡区别于典型的自噬泡；质子泵阻断剂巴弗洛霉素Al能够抑制MAT诱导的膜泡,说明了MAT诱导的膜泡形成与质子泵有关。我们首次报道了MAT激活内质网应激。通过Western blot检测内质网应激标志蛋白GRP78和CHOP,我们发现MAT能够上调GRP78和CHOP的表达,因此MAT激活了内质网应激。此外,内质网应激信号通路激酶PERK,IRE1和ATF-6均被MAT激活。内质网应激抑制剂4-苯基丁酸抑制MAT诱导的内质网应激。利用4-苯基丁酸抑制MAT诱导的内质网应激,发现MAT的细胞毒性被显着增强。利用Annexin V/PI双染技术检测敲低CHOP表达对MAT的凋亡诱导作用的影响,发现MAT的凋亡诱导作用被明显增强,表明了MAT激活内质网应激介导的细胞凋亡作用。根据目前对MAT的研究资料,未见报道细胞中有哪些分子能影响MAT的敏感性。在临床上,MAT主要被用于治疗肝器官方面的疾病,如：病毒性肝炎、肝纤维化等。利用Western blot技术检测不同细胞中GRP78的表达,我们发现在肝脏相关细胞中GRP78的表达最低,因此MAT的作用药效可能与组织细胞中GRP78的表达有关。通过对比不同细胞IC5o值与细胞中GRP78和p53表达量的关系,发现GRP78和p53表达量较低的细胞对MAT比较敏感,而GRP78和p53表达量较高的细胞对MAT不敏感。通过检测MAT的凋亡诱导作用和增殖抑制作用,我们证明了敲低细胞中GRP78或者p53的表达能明显增强细胞对MAT的敏感性,进一步说明了细胞内GRP78和p53的表达水平影响细胞对MAT的敏感性。初步研究了MAT诱导G1期周期阻滞的机制及其与细胞衰老的关系。MAT处理HepG2和MCF-7细胞引起G1期周期阻滞,这与MAT上调p21、p27表达和上调Cyclin D1的表达有关,而与p53的表达无关,MAT诱导p53表达的降低。此外,衰老相关的半乳糖苷酶染色法表明MAT诱导的G1周期阻滞不引起细胞衰老。通过上述研究表明：MAT诱导内质网应激,且细胞内GRP78和p53的表达影响MAT的敏感性；MAT抑制自噬晚期过程的完成,且其诱导的膜泡区别于典型的自噬泡。本研究为MAT相关的衍生物合成和新药研发提供实验基础；也为MAT的临床合理应用、提高疗效提供理论依据。
郑丁,朱晓宁,彭昭宣,汪静[8]（2014）在《中药抗乙型肝炎病毒研究进展》文中认为慢性乙型肝炎是一种很常见并且具有传染性的疾病,其进一步发展会导致肝硬化、肝癌,严重影响人们的身心健康,给个人和社会带来巨大的经济负担。目前针对慢性乙肝没有特效药,西医抗病毒治疗在一定程度上减缓了病情的发展,但抗病毒药价格昂贵、易耐药,停药后易复发及副作用等,也给临床治疗带来较大的难度,给患者背上了沉重的经济和精神负担。实践证明中药具有一定抗病毒
王洋[9]（2014）在《氧化苦参碱调控ADMA/一氧化氮通路抑制大鼠慢性心力衰竭的作用》文中研究说明目的研究氧化苦参碱抑制异丙肾上腺素（Isoproterenol, ISO）诱导的大鼠慢性心力衰竭，并探讨其对心肌组织非对称二甲基精氨酸（ADMA）代谢通路和一氧化氮（NO）信号通路的影响。方法♂Sprague-Dawley大鼠皮下注射异丙肾上腺素（ISO，5mg·kg-1，连续给药7天）建立慢性心力衰竭模型。氧化苦参碱（100mg·kg-1、50mg·kg-1和25mg·kg-1）于ISO注射前7天灌胃给药，共14天，灌胃给药于皮下注射1h后进行。观察氧化苦参碱不同剂量对模型大鼠血清心肌损伤标志酶（cTn I），心功能（+LVdp/dtmax、LVSP、-LVdp/dtmax、动脉收缩压、平均动脉压、心率等）以及心肌组织病理学的影响。检测血清ADMA、NO、ET-1水平和心肌组织一氧化氮（NO）含量，采用Western blot方法测定大鼠心室肌蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）、二甲基精氨酸二甲胺水解酶2（DDAH2）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白的表达。结果氧化苦参碱（100mg·kg-1和50mg·kg-1）可减少血清心肌损伤标志酶：心肌肌钙蛋白I（cTn I）的含量（P<0.01）；降低全心质量/体重的比值（P<0.01）和左心室质量/体重的比值（P<0.01）；可显着改善大鼠左心室收缩功能（升高LVSP和+LVdp/dtmax）和舒张功能（降低-LVdp/dtmax）。心肌组织病理学结果显示，氧化苦参碱（100mg·kg-1和50mg·kg-1）可显着减轻ISO诱导大鼠心肌组织病理学结构的异常改变。ISO组与正常对照组相比，血清ADMA、NO、ET-1水平显着升高，心肌组织NO含量降低，心肌组织内PRMT1蛋白含量显着升高，DDAH2和eNOS蛋白含量显着减少。氧化苦参碱（100mg·kg-1和50mg·kg-1）可降低ISO诱导心力衰竭大鼠血清ADMA和ET-1含量（P<0.01），增加心肌组织NO含量（P<0.01），增加心室肌组织中DDAH2和eNOS蛋白的表达（P<0.01），但对ISO诱导升高的血清NO水平和心肌组织PRMT1的表达无影响（P>0.05）。结论氧化苦参碱对ISO致大鼠慢性心力衰竭具有抑制作用，氧化苦参碱可通过调控心肌ADMA代谢通路和NO信号通路发挥抑制慢性心力衰竭的作用。
黄海[10]（2013）在《GM-CSF抗流感病毒机制及恩替卡韦黄芩苷组合物抗乙肝病毒药效研究》文中研究说明第一部分 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗流感病毒机制研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）最初是从小鼠肺条件培养液中发现的一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的因子。随着对其研究的深入,发现除了促进造血祖细胞的增殖和分化,GM-CSF对成熟白细胞的功能也有激活作用,有助于增强机体的抗感染免疫。本研究在前期的工作中首次证实GM-CSF对FM1流感模型小鼠有显着的保护作用,经(GM-CSF预防治疗后,能明显降低流感模型小鼠肺流感病毒滴度,减轻肺组织病变,提高模型小鼠的生存率,该研究结果已于2010年发表于《Cytokine》杂志上。为了在已有的药效学研究基础上进一步阐明(GM-CS F抗流感病毒的确切机制,本论文第一部分从炎症和细胞凋亡两方面对此进行了较为系统的实验探索。沿用之前的预防治疗方式,经滴鼻途径给予BALB/C小鼠GM-CSF7天,剂量为1.34mg/kg/day,然后再对小鼠感染致死量的A型流感病毒FM1,并于感染病毒的第0天、第2天和第4天各选取一定数量的小鼠进行解剖,收获肺标本,分别用ELISA法检测肺匀浆中的细胞因子,流式细胞术检测肺组织内免疫细胞的占比,real-time RT PCR技术检测肺组织内A型流感病毒M基因、NF-κB、caspase 3、bax 和 bcl-2 mRNA表达水平,Western bl ot检测NF-κ κB、磷酸化NF-κB、IκB、caspase 3、cleaved caspase 3、bax 和 bcl-2蛋白表达水平,免疫组化检测肺组织石蜡切片中磷酸化NF-κB和cleaved caspase 3的定位表达。数据显示,经GM-CSF预防治疗后的小鼠肺TNF-α和FNα/β生成量显着增加,在病毒感染早期肺组织内的天然免疫细胞的数量占比也高于模型对照组,而之后这些细胞因子浓度和粒细胞、单核/巨噬细胞数量占比下降,均低于模型对照组,该结果表明GM-CSF预防治疗可以在病毒感染初期显着上调机体的抗感染免疫水平并在之后控制机体的免疫应答强度。感染第2天和第4天的A型流感病毒M基因定量分析显示GM-CSF治疗组均显着低于模型对照组,该结果提示GM-CSF对肺流感病毒载量的有效抑制作用,这可能与GM-CSF及早启动抗病毒免疫应答,控制了病毒的复制和扩散有关。NF-κB是调控炎症因子和干扰素表达的重要因子,检测表明小鼠经GM-CSF预防干预后,肺NF-κB mRNA和磷酸化NF-κB蛋白表达增加,并且在感染流感病毒后也稳定在相当水平,而模型组小鼠肺NF-κB mRNA和磷酸化NF-κB蛋白水平在感染病毒后大幅上升,显着高于GM-CSF干预组。对细胞凋亡相关因子的检测表明,GM-CSF可以增加抑凋亡因子bcl-2的表达,抑制促凋亡因子bax、caspase 3 和 cleaved caspase 3的表达,提示(GM-CSF对流感病毒诱导的细胞凋亡具有抑制作用。根据上述实验结果我们推测(M-CSF对流感模型小鼠的保护机制：（1）GM-CSF通过激活NF-κB信号途径,促进肺抗病毒细胞因子TNF-α和Ⅰ型IFN生成,并且在感染早期有效募集天然免疫细胞,从而控制了病毒的复制和扩散。由于病毒载量的显着抑制,使得炎症反应和免疫应答一直控制在适度水平,从而避免了炎症性病理损伤的发生；（2）GM-CSF上调抑凋亡因子bcl-2和下调促凋亡因子bax的表达,抑制caspas e信号途径的激活,显着减少了流感病毒诱导的肺细胞的凋亡和由此导致的严重肺损伤。简言之,(GM-CSF的预防干预使机体抗感染免疫水平在感染之初即显着上调,及早启动的抗病毒免疫应答,有效控制了流感病毒的复制和扩散,避免了因高病毒载量导致的过度炎症反应和凋亡的发生,从而有效保护了流感病毒感染小鼠。该研究结果为GM-CSF应用于流感的预治提供了理论基础。第二部分 恩替卡韦与黄芩苷组合物抗乙肝病毒药效学研究黄芩苷（baicalin,BA）是从唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georigi）的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,药理作用广泛,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、解热、镇静、降压等功效。体外实验表明,黄芩苷对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制有一定抑制作用,而黄芩苷药物作为乙肝治疗的辅助用药在临床上亦有不错的疗效,但是有关黄芩苷抗乙型肝炎病毒的机制尚未见文献报道。本论文首次对黄芩苷抗乙肝病毒的作用机制进行了探索。分别以黄芩苷50μM、25μM和12.5μM作用于HepG2 2.2.15细胞模型,采用ELISA和real time PCR方法分别检测细胞上清中HBV抗原和HBV DNA水平,结果显示黄芩苷对HBsAg.HBeAg和HBV DNA均有一定抑制作用。Northern blot和real time RT PC R检测表明黄芩苷显着减少HepG2 2.2.15细胞内的HBV 2.1/2.4kb和 3.5kb RNA表达水平,同时发现黄芩苷显着下调宿主细胞的肝细胞核因子HNF1α和HNF4α的表达,而HNF 1α和HNF4α都是HBV RNA转录的正调控因子,由此推测黄芩苷可能通过下调HNF 1α和HNF4α的表达,抑制HBV RNA的转录生成,继而影响病毒蛋白的表达和HBV DNA的合成,从而抑制HBV的复制。本研究又将恩替卡韦（entecavir,ETV）与黄芩苷配伍,分别在HepG2 2.2.15细胞模型和通过对HBV进行rtM204V+rtL180M突变（YMDD主要突变类型之一）并建立的拉米夫定耐药细胞模型中考察了恩替卡韦黄芩苷组合物（ETV+BA）对野生型HBV及拉米夫定耐药突变HBV的抑制效果。结果表明,在HepG2 2.2.15细胞模型中,组合物ETV3nM+BA50μM、ETV0.75nM +BA50μM和ETV0.19nM+BA50μM对野生型HBV的HBsAg.HBeAg和HBVDNA的合成均显示显着的抑制作用,较之单独使用ETV干预,对HBsAg抑制率分别提高35.05%、35.67%和39.44%,对HBeAg抑制率分别提高10.99%、12.45%和12.46%,对HBV DNA抑制率分别提高10.66%、13.19%和12.17%。而在HBV拉米夫定耐药细胞模型中,组合物ETV 48nM+BA 50μM、ETV 16nM+BA 50μM、ETV 3nM+BA50μM和ETV 0.75nM+BA50μM也显示对HBV rtM204V+rtL180M突变株的显着抑制作用,较之单独使用ETV干预,对HBsAg抑制率分别提高30.00%、30.00%、29.58%和32.92%；对HBeAg抑制率分别提高28.88%、31.08%、32.67%和30.94%；对HBV DNA抑制率分别提高37.60%、41.00%、35.80%和33.88%。以上数据表明,相比单独使用ETV干预,ETV+BA组合物可以提高对野生型HBV和拉米夫定耐药突变HBV抑制效果,这可能与ETV和BA具有不同抗病毒机制有关,两个药物同时作用可以从多靶点抑制HBV的复制,ETV主要通过影响病毒聚酶活性抑制HBV DNA的复制,而BA则通过下调HNF 1α和HNF4a表达影响HBV RNA的合成,两者配伍组合后,作用机制上的互补使得抗HBV效果得以提升。另外,由于HBV YMDD变异株对ETV敏感性减弱,而BA的作用靶点是宿主的肝细胞核因子,抗HBV效果不受病毒变异影响,使得ETV+BA组合物对HBV YMDD突变株的抑制效果提升更为显着,提示ETV+BA组合物在治疗HBV拉米夫定耐药株感染方面可能更具优势。本研究还采用口服给药方式在鸭乙肝动物模型中进一步检测了该配伍组合在体内的抗HBV疗效。通过斑点印迹杂交和Southern印迹杂交检测治疗后的鸭血清和肝脏DHBV DNA水平。结果显示,组合物ETV O.lmg/kg/d+BA 250 mg/kg/d 和 ETV 0.025mg/kg/d+BA 250mg/kg/d治疗13天后,鸭血清DHBVDNA水平分别53.61%和46.96%,比单独使用ETV治疗的抑制效果分别提高14.74%和15.03%；鸭肝DHBV DNA水平分别下降72.6%和62.83%,比单独使用ETV治疗的抑制效果分别提高8.60%和19.24%,表明ETV+BA组合物在体内同样抗HBV作用显着,并且比单独ETV治疗具有更好的抗病毒疗效。这些发现对提高抗乙肝病毒疗效和克服核苷类药物的耐药等具有重要意义,并且为开发核苷类药物与天然产物的组合新药奠定了实验室研究基础。
二、氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞中HBVDNA表达量的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞中HBVDNA表达量的影响（论文提纲范文）
（1）苦参碱对肝细胞肝癌的抑制作用及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号及中英文说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 苦参碱在治疗肝细胞肝癌上的研究进展 |
| 1.2 miRNA-22与肝细胞肝癌关系的研究进展 |
| 第二章 苦参碱对细胞增殖的影响 |
| 2.1 背景及目的 |
| 2.2 实验药物及试剂 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.7 讨论 |
| 2.8 结论 |
| 第三章 苦参碱治疗肝癌分子机制的研究 |
| 3.1 背景及目的 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 结论与展望 |
| 第四章 苦参碱对肝癌细胞株HepG2的影响及机制研究 |
| 4.1 背景及目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（2）苦参碱类生物碱抗乙型肝炎病毒作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表(Abbreviation Index) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验药物及阳性对照 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2.实验方法与结果 |
| 2.1 基于HepG2.2.15细胞模型苦参碱类生物碱抗HBV作用 |
| 2.1.1 实验方法 |
| 2.1.1.1 细胞复苏及培养 |
| 2.1.1.2 药物细胞毒性实验 |
| 2.1.1.3 药物抗HBV药效学实验 |
| 2.1.2 实验结果 |
| 2.1.2.1 细胞毒性实验结果 |
| 2.1.2.2 苦参碱类生物碱对HBsAg的影响 |
| 2.1.2.3 苦参碱类生物碱对HBeAg的影响 |
| 2.1.2.4 苦参碱类生物碱对上清HBV DNA的影响 |
| 2.1.2.5 苦参碱类生物碱对胞内HBV DNA的影响 |
| 2.1.3 小结 |
| 2.2 基于HepG2.2.15细胞模型槐定碱抗HBV代谢组学研究 |
| 2.2.1 实验方法 |
| 2.2.1.1 样本制备 |
| 2.2.1.2 上机条件设置 |
| 2.2.1.3 数据处理 |
| 2.2.1.4 差异化合物筛选 |
| 2.2.2 实验结果 |
| 2.2.2.1 PCA建模分析 |
| 2.2.2.2 PLS-DA建模分析 |
| 2.2.2.3 标志物筛选结果 |
| 2.2.3 小结 |
| 2.3 基于HepG2.A64细胞模型苦参碱类生物碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用 |
| 2.3.1 实验方法 |
| 2.3.1.1 细胞复苏及培养 |
| 2.3.1.2 药物细胞毒性实验 |
| 2.3.1.3 药物抗HBV药效学实验 |
| 2.3.2 实验结果 |
| 2.3.2.1 对HepG2.A64细胞单独用药的TI指数比较 |
| 2.3.2.2 联合用药细胞毒性实验结果 |
| 2.3.2.3 联合用药对HepG2.A64细胞分泌HBsAg的抑制作用 |
| 2.3.2.4 联合用药对耐药HBV DNA的抑制作用 |
| 2.3.3 小结 |
| 2.4 基于HepG2.A64细胞模型氧化苦参碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用机制研究 |
| 2.4.1 实验方法 |
| 2.4.1.1 细胞复苏及培养 |
| 2.4.1.2 引物设计与合成 |
| 2.4.1.3 细胞总RNA提取 |
| 2.4.1.4 逆转录 |
| 2.4.1.5 荧光定量PCR检测 |
| 2.4.1.6 蛋白质免疫印迹法 |
| 2.4.2 实验结果 |
| 2.4.2.1 P38 mRNA的表达 |
| 2.4.2.2 NTCP mRNA的表达 |
| 2.4.2.3 P38、p-P38的蛋白表达 |
| 2.4.2.4 NTCP的蛋白表达 |
| 2.4.3 小结 |
| 3.讨论 |
| 3.1 实验模型的选择 |
| 3.1.1 HepG2.2.15细胞模型 |
| 3.1.2 HepG2.A64细胞模型 |
| 3.2 给药剂量选择 |
| 3.3 实验结果讨论 |
| 3.3.1 四种苦参碱类成分抗HBV作用及槐定碱抗乙肝病毒HBV作用特点 |
| 3.3.2 四种苦参碱类成分联合恩替卡韦抗耐药HBV作用及氧化苦参碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用特点 |
| 3.3.3 氧化苦参碱联合恩替卡韦抗耐药HBV作用机制研究 |
| 4.结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎治疗药物现状 |
| 1.慢性乙型肝炎研究现状 |
| 2.乙型肝炎临床用药药理研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（3）肝靶向马蹄金素衍生物的设计、合成及其抗乙肝病毒活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乙型肝炎现状 |
| 1.2 马蹄金素及其衍生物 |
| 1.3 肝靶向给药系统 |
| 第二章 肝靶向马蹄金素衍生物的设计与合成 |
| 2.1 仪器、主要原料与试剂 |
| 2.2 肝靶向马蹄金素衍生物结构设计 |
| 2.3 肝靶向马蹄金素衍生物的逆合成分析 |
| 2.4 肝靶向马蹄金素衍生物中间体的合成 |
| 2.5 肝靶向马蹄金素衍生物的合成 |
| 第三章 肝靶向马蹄金素衍生物抗HBV活性测试 |
| 3.1 实验仪器及试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 第四章 小鼠体内组织分布实验 |
| 4.1 材料与色谱条件 |
| 4.2 样品的制备 |
| 4.3 实验结果 |
| 第五章 结果与讨论 |
| 5.1 结果 |
| 5.2 讨论 |
| 第六章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 缩写列表 |
| 附录Ⅱ 综述 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅲ 部分目标化合物核磁谱图 |
| 附录Ⅳ 发表的文章 |
| 附录Ⅴ 致谢 |
| 附录Ⅵ 个人简历 |
（4）饿蚂蝗总黄酮抗乙型病毒性肝炎的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略语表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 饿蚂蝗总黄酮的提取纯化及抗HBV活性确认 |
| 实验一 饿蚂蝗总黄酮的提取纯化 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 饿蚂蝗体外抑制HBV的活性部位确认 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 饿蚂蝗总黄酮体外抑制HBV DNA和cccDNA的作用研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 饿蚂蝗总黄酮对鸭乙型病毒性肝炎的作用研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 饿蚂蝗总黄酮对刀豆蛋白A所致小鼠免疫肝损伤的作用研究 |
| 实验一 饿蚂蝗总黄酮对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫肝损伤的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 急性毒性试验 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 饿蚂蝗总黄酮对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白的基因表达和蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 综述 中草药及其提取物抑制HBV的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）苦参碱衍生物WM-108抑制肝癌细胞系Hep3B增殖及侵袭能力的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 苦参碱衍生物WM-108抑制肝癌细胞增殖能力的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 苦参碱衍生物WM-108诱导Hep3B凋亡及抑制其侵袭能力的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 苦参碱衍生物WM-108抑制肝癌细胞增殖及侵袭能力机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 WM-108对Hep3B裸鼠肝癌模型肿瘤生长和转移的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）苦参乌梅汤体内抑制转基因小鼠S抗原和体外抑制HepG2.2.15细胞HBVDNA的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1 苦参乌梅汤最佳组方能够明显抑制HBV转基因小鼠血清中HBsAG的表达 |
| 2 苦参乌梅汤对HEPG2.2.15细胞的毒性与其浓度之间无明显相关性 |
| 3 苦参乌梅汤能明显抑制HEPG2.2.15细胞外HBV DNA的复制 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：中药抗HBV感染研究概况 |
| 1 抗乙肝病毒作用 |
| 2 调节免疫作用 |
| 2.1 调节Th1/Th2细胞的平衡 |
| 2.2 影响树突状细胞(DC)递呈 |
| 2.3 活化核因子NF-κB |
| 3 保肝作用 |
| 4 其它作用 |
| 4.1 促信号转导 |
| 4.2 促细胞凋亡 |
| 4.3 抗氧化应激 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）苦参碱引起内质网应激的机制及相关药效的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一部分：MAT引起内质网应激的机制 |
| 1 MAT对细胞增殖的影响 |
| 2 MAT诱导细胞凋亡的现象 |
| 2.1 MAT诱导染色体凝集 |
| 2.2 MAT诱导细胞凋亡 |
| 2.3 MAT诱导细胞内ROS升高 |
| 2.4 MAT引起细胞内线粒体膜电位降低 |
| 2.5 MAT对凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.6 MAT抑制ERK和AKT激酶的磷酸化 |
| 3 MAT抑制细胞自噬的机制 |
| 3.1 MAT诱导细胞自噬的特征 |
| 3.2 MAT抑制自噬晚期过程 |
| 3.3 MAT抑制自噬并引起细胞凋亡 |
| 3.4 MAT诱导的膜泡与典型自噬泡的关系 |
| 4 MAT引起内质网应激的机制 |
| 4.1 衣霉素诱导的内质网应激 |
| 4.2 MAT激活内质网应激 |
| 4.3 MAT激活内质网应激信号通路激酶 |
| 4.4 MAT诱导的内质网应激、凋亡和自噬的关系 |
| 4.5 自噬晚期抑制剂CQ不诱导内质网应激 |
| 4.6 下调CHOP增强MAT的凋亡诱导作用 |
| 4.7 内质网应激抑制剂4-PBA对MAT诱导内质网应激的影响 |
| 第二部分：影响MAT敏感性的因素及其它结构类似物的药效作用 |
| 1 不同细胞中p53和GRP78的表达差异 |
| 2 敲低GRP78的表达增强MAT的敏感性 |
| 3 敲低p53的表达增强MAT的细胞毒性作用 |
| 4 苦参碱结构类似物对膜泡和自噬的作用 |
| 5 MAT增效抗肿瘤药物的药效 |
| 第三部分 ：MAT阻断细胞G_1期的机制 |
| 1 MAT诱导细胞G_1期周期阻滞 |
| 2 MAT对HepG2细胞周期相关蛋白表达的影响 |
| 3 MAT诱导的周期阻滞不引起细胞衰老 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 非论文综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）中药抗乙型肝炎病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 多糖类 |
| 1.1猪苓多糖 |
| 1.2钝顶螺旋藻多糖 |
| 1.3黄芪多糖 |
| 1.4香菇多糖 |
| 1.5当归多糖 |
| 2 黄酮类 |
| 2.1黄芩素 |
| 2.2荔枝核黄酮类 |
| 2.3水芹黄酮类 |
| 2.4广西藤茶中提取的总黄酮 |
| 2.5淫羊藿总黄酮 |
| 3 生物碱 |
| 4 皂苷 |
| 4.1黄芪甲苷 |
| 4.2土贝母皂甙 |
| 4.3赤芍总苷 |
| 4.4六月青总皂苷 |
| 4.5太白楤木总皂苷 |
| 5 其他 |
| 6 问题与展望 |
（9）氧化苦参碱调控ADMA/一氧化氮通路抑制大鼠慢性心力衰竭的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
（10）GM-CSF抗流感病毒机制及恩替卡韦黄芩苷组合物抗乙肝病毒药效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 GM-CSF抗流感病毒作用机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 实验总体流程 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 小鼠分组、造模及给药 |
| 2.2 样本取材及保存 |
| 2.3 统计学分析 |
| 二、结果 |
| 1. 各组小鼠的肺指数情况 |
| 2. 各组小鼠肺大体病变情况 |
| 三、讨论 |
| 第二节 GM-CSF对模型小鼠肺细胞因子和免疫细胞的调控作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 ELISA法检测小鼠肺细胞因子 |
| 2.2 流式细胞术检测小鼠肺免疫细胞 |
| 二、结果 |
| 1. 小鼠肺TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-10水平变化情况 |
| 2. 小鼠肺中性粒细胞、单核/巨噬细胞和NK细胞数量占比变化情况 |
| 三、讨论 |
| 第三节 GM-CSF对模型小鼠肺组织病毒载量的抑制 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 Trizol法提取肺组织RNA |
| 2.2 RT-PCR将mRNA反转录为cDNA |
| 2.3 real time PCR定量分析的质粒对照品的构建 |
| 2.4 real time PCR检测肺组织样品中流感病毒M基因的表达 |
| 二、结果 |
| 1. 流感病毒M基因及GAPDH质粒对照品质量鉴定 |
| 2. real time RT-PCR 检测肺组织流感病毒载量的变化情况 |
| 三、讨论 |
| 第四节 GM-CSF对模型小鼠肺组织NF-κB信号途径的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 real time RT-PCR检测小鼠肺组织NF-κB、IRF3和IRF7基因的表达水平 |
| 2.2 Western blot检测小鼠肺组织NF-κB及相关蛋白表达 |
| 2.3 免疫组化检测小鼠肺组织磷酸化NF-κB的表达 |
| 二、结果 |
| 1. GM-CSF对模型小鼠肺组织NF-κB基因表达的影响 |
| 2. GM-CSF对模型小鼠肺组织IRF3和IRF7基因表达的影响 |
| 3. GM-CSF对模型小鼠肺组织NF-κB及相关蛋白表达的影响 |
| 4. GM-CSF对小鼠肺组织磷酸化的NF-κB表达的影响 |
| 三、讨论 |
| 第五节 GM-CSF对模型小鼠肺组织内细胞凋亡的抑制作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 real time RT-PCR检测模型小鼠肺组织凋亡相关基因的表达 |
| 2.2 Western blot检测小鼠肺组织caspase 3、bax和bcl-2蛋白的表达 |
| 2.3 免疫组化检测模型小鼠肺组织cleaved caspase 3的表达 |
| 二、结果 |
| 1. GM-CSF对模型小鼠肺细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 2. GM-CSF对模型小鼠肺组织caspase 3、cleaved caspase3、bax和bcl-2蛋白表达的影响(Western blot) |
| 3. GM-CSF对模型小鼠肺组织cleaved caspase3表达的影响(IHC) |
| 三、讨论 |
| 第一部分 小结 |
| 第一部分 参考文献 |
| 第二部分 恩替卡韦黄芩苷组合物抗乙肝病毒药效研究 |
| 前言 |
| 第一节 黄芩苷抗HBV作用及机制初步研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 HepG2 2.2.15细胞的培养和传代 |
| 2.2 黄芩苷对HepG2 2.2.15细胞的细胞毒性检测 |
| 2.3 黄芩苷体外抗HBV活性检测 |
| 2.4 HepG2 2.2.15细胞内的肝细胞核因子表达水平的检测 |
| 二、结果 |
| 1. 黄芩苷对HepG2 2.2.15细胞生长的影响 |
| 2. 黄芩苷对HepG2 2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制 |
| 3. 黄芩苷对HepG2 2.2.15细胞上清HBV DNA的抑制 |
| 4. 黄芩苷对HepG2 2.2.15细胞内HBV RNA的抑制 |
| 5. 黄芩苷对HNF1α、HNF3 β和HNF4α表达的影响 |
| 三、讨论 |
| 第二节 恩替卡韦黄芩昔组合物(ETV+BA)体外抗野生型HBV作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 ETV+BA组合物对HepG2 2.2.15细胞毒性的检测 |
| 2.2 ETV+BA组合物抗HBV活性检测 |
| 二、结果 |
| 1. ETV+BA组合物对HepG2 2.2.15细胞生长的影响 |
| 2. ETV+BA组合物对HepG2 2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用 |
| 3. ETV+BA组合物对HepG2 2.2.15细胞上清HBV DNA的抑制作用 |
| 三、讨论 |
| 第三节 HBV拉米夫定耐药细胞模型的构建及恩替卡韦黄芩苷组合物体外抗拉米夫定耐药突变HBV作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 HBV rtM204V+rtL180M突变和建立HBV拉米夫定耐药细胞模型 |
| 2.2 履替卡韦黄芩合物体外抗HBV rtM204V+rtL180M突变株活性检测 |
| 二、结果 |
| 1. HBV rtM204V+rtL180M突变质粒的测序鉴定 |
| 2. rtM204V+rtL180M突变HBV在转染细胞内的复制活性 |
| 3. ETV+BA组合物体外抗HBV rtM204V+rtL180M突变株作用 |
| 三、讨论 |
| 第四节 恩替卡韦黄芩苷组合物在鸭乙肝模型中的抗DHBV作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 鸭乙肝模型的构建 |
| 2.2 分组、给药及标本取材 |
| 2.3 斑点杂交(Dot blot)检测鸭血清中DHBV DNA水平 |
| 2.4 Southern blot检测鸭肝DHBV DNA |
| 二、结果 |
| 1. DHBV探针的质量鉴定 |
| 2. ETV+BA组合物对鸭乙肝模型血清DHBV DNA的抑制作用 |
| 3. ETV+BA组合物对鸭乙肝模型肝组织DHBV DNA的抑制作用 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 展望 |
| 第二部分参考文献 |
| 在学期间的科研成果 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 第一部分中构建的real time PCR定量用质粒对照品测序结果 |
| 附录二 第二部分中构建的real time PCR定量用质粒对照品测序结果 |
| 附录三 pHBV3.8突变前和rtM204V+rtL180M双突变后的碱基序列比较 |
四、氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞中HBVDNA表达量的影响（论文参考文献）
- [1]苦参碱对肝细胞肝癌的抑制作用及其作用机制研究[D]. 周武元. 山东大学, 2017(08)
- [2]苦参碱类生物碱抗乙型肝炎病毒作用及其机制研究[D]. 陈佳欣. 成都中医药大学, 2016(05)
- [3]肝靶向马蹄金素衍生物的设计、合成及其抗乙肝病毒活性研究[D]. 徐广灿. 贵阳中医学院, 2016(04)
- [4]饿蚂蝗总黄酮抗乙型病毒性肝炎的作用及其机制研究[D]. 刘舒凌. 广西医科大学, 2015(08)
- [5]苦参碱衍生物WM-108抑制肝癌细胞系Hep3B增殖及侵袭能力的作用及其机制的研究[D]. 阎龙. 第二军医大学, 2015(07)
- [6]苦参乌梅汤体内抑制转基因小鼠S抗原和体外抑制HepG2.2.15细胞HBVDNA的实验研究[D]. 朱振红. 中国中医科学院, 2014(07)
- [7]苦参碱引起内质网应激的机制及相关药效的研究[D]. 欧秀元. 北京协和医学院, 2014(01)
- [8]中药抗乙型肝炎病毒研究进展[J]. 郑丁,朱晓宁,彭昭宣,汪静. 山西中医, 2014(04)
- [9]氧化苦参碱调控ADMA/一氧化氮通路抑制大鼠慢性心力衰竭的作用[D]. 王洋. 宁夏医科大学, 2014(03)
- [10]GM-CSF抗流感病毒机制及恩替卡韦黄芩苷组合物抗乙肝病毒药效研究[D]. 黄海. 复旦大学, 2013(01)